NO894709L - Diagnosefremgangsmaater og -systemer for kvantifisering avapo ai. - Google Patents

Description

Teknisk område

Foreliggende oppfinnelse vedrører antistoffer og polypeptider som kan anvendes til immunologisk bestemmelse av mengden av Apo AI i en karvæskeprøve.

Bakgrunn

Lipoproteiner er hovedbærerne av plasmakolesterol. De er micellære lipidproteinkomplekser (partikler) med en over-flatefilm, som består av ett eller flere proteiner forbundet med polare lipider, som omgir en kolesterolholdig kjerne. Lipoproteiner ble opprinnelig klassifisert på grunn-lag av deres oppdriftsdensiteter målt ved hjelp av ultrasentrifugering. Følgelig er fire hoveddensitetklasser blitt anerkjent: chylomikroner, lipoproteiner med svært lav densitet (VLDL), lipoproteiner med lav densitet LDL og lipoproteiner" med høy densitet (HDL).

Mange undersøkelser har nå fastlagt en omvendt korrelasjon mellom plasma-HDL-kolesterolnivåer og risiko for kransarteriesykdom (CAD). Det vil si at forhøyede nivåer av plasmakolesterol funnet i HDL-partikler samsvarer med en redusert risiko for CAD.

Likeledes har mange undersøkelser nå vist at plasma-nivåer av apolipoprotein AI (Apo AI), hovedproteinkom-ponenten i HDL, også er omvendt relatert til risikoen for CAD. I tillegg har Weisweiler et al., Clin. Chem., 27:348

(1981) rapportert at kjennskap til nivåer for Apo AI kan

øke den prediktive verdi for HDL-kolesterol.

På grunn av dens omvendte korrelasjon med CAD, har

det vært en utstrakt forskning på oppbygningen og virkningen av Apo AI i lipidmetabolisme. Funksjonelt antas Apo AI nå

å formidle fjerningen av kolesterol fra vev og aktivere

LCAT.

Strukturelt er renset Apo AI. beskrevet som å inneholde en stor andel (55%) alfa-heliks, som øker til 70%

når det er forbundet med fosfolipider, slik som i HDL-partikkelen. De lipidbindende egenskaper til Apo AI synes å være en funksjon av en serie etter hverandre plasserte, gjentatte segmenter av 22 aminosyrerester for det meste avbrudt av prolinrester som er alfa-heliske og amfofile.

Aminosyrerestsekvensen til Apo AI bestemt ved hjelp av Edman-nedbrytning av cyanbromid- og trypsinfragmenter av intakt Apo AI, er blitt beskrevet av Brewer et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 80:623-630 (1978). Ifølge Brewer et al. ga cyanbromid-spalting (CNBr-spalting) av Apo AI fire hovedfragmenter betegnet CNBrl, CNBr2, CNBr3 og CNBr4, i den rekkefølge de opptrer langs Apo AI-sekvensen fra aminoende til carboxylende.

Det bør legges merke til at CNBrl, CNBr2, CNBr3 og CNBr4 er polypeptider med homoserinlacton i sine carboxyl-ender som et resultat av at methioninresten i den stillingen brytes ned under CNBr-spaltingsprosessen.

Immunokjemisk karakterisering av naturlig forekommende Apo AI, dvs. Apo AI slik det finnes på HDL-partikler, har vært problematisk på grunn av at det er antigent hetero-gent og ustabilt. Den antigene heterogenitet til Apo AI synes å være resultatet av noen epitoper som er maskert ved hjelp av lipider i det intakte HDL, eller den antistoff-bindende evne hos noen epitoper som er avhengige av konfor-masjoner hos Apo AI påvirket av lipider eller andre HDL-forbundne proteiner. Den antigene ustabilitet av Apo AI, slik den kommer til uttrykk ved dets skiftende immunoreaktivitet over tid med bestemte antisera, synes å skyldes slike fenomener som selv-binding og deamidering, som begge er blitt påvist å opptre in vitro.

Den antigene heterogenitet og ustabilitet av Apo AI har gjort det vanskelig å fremstille analysesystemer for kvantifisering av Apo AI i karvæskeprøver fra pasienter. Dette skyldes blant annet at slike systemer krever et referansemateriale (en standard) med en immunoreaktivitet for systemets primære anti-Apo AI-antistoff som er i det minste ensartet, og fortrinnsvis ekvivalent med immunoreaktiviteten av det Apo AI som er i pasientens prøve.

I den senere tid har forsøk på å overvinne pro-blemer forbundet med den antigene heterogenitet og ustabilitet av Apo AI blitt fokusert på å bruke monoklonale antistoffer (MAB) for å identifisere epitoper på naturlig forekommende Apo AI hvis ekspresjon er ensartet eller "kon servert" under spesifikke isolerings- og lagringsbetingelser. Slike epitoper, her henvist til som " konserverte naturlig forekommende epitoper", er videre definert som Apo AI-epitoper hvis ekspresjon på HDL ikke påvirkes i betydelig grad, dvs. ikke økes eller reduseres i betydelig grad, som et resultat av bearbeiding eller lagring som resulterer i deamidering .

En eksempelvis konservert naturlig forekommende Apo AI-epitop, betegnet epitop A, er blitt definert av Milthorpe et al., Arterio., 6:285-296 (1986), som å være den del av Apo AI CNBrl som reagerer immunologisk med MAB 4H1. Ifølge Milthorpe et al. forblir ekspresjonen av epitop A konstant over tid i pasientserumprøver lagret ved temperaturer som varierer fra 4°C til -80°C. Dette er i motsetning til epitoper betegnet C, C og C", alle lokalisert i CNBr2-området av Apo AI, og som alle ble funnet å være "ikke-konserverte" epitoper, dvs. epitoper hvis ekspresjon ble betydelig økt eller redusert etter lagring ved et lignende temperaturområde.

Kort oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse vedrører et Apo AI-polypeptid som i det vesentlige består av ikke mer enn ca. 40 aminosyrerester og, som en del av aminosyrerestsekvensen, har en sekvens med formelen

Også omfattet er et monoklonalt antistoff som inneholder anti-Apo AI-antistoffmolekyler som reagerer immunologisk med:

(a) Apo AI/HDL

(b) isolert Apo AI

(c) Apo AI CNBrl og

(d) polypeptidet DEPPQSPWDRVKDLA,

men som ikke reagerer immunologisk med:

(e) Apo AI CNBr2,

(f) Apo AI CNBr3,

(g) Apo AI CNBr4,

(h) polypeptidet DEPPQSPWDR og

(i) polypeptidet QSPWDRVKDLA.

Ved en annen utførelsesform vedrører foreliggende oppfinnelse et diagnosesystem i settform som omfatter, i en tilstrekkelig mengde til å utføre minst én analyse, et Apo

.AI-polypeptid bestående hovedsakelig av ikke mer enn ca. 40 aminosyrerester og som, som en del av aminosyrerestsekvensen, har en sekvens med formelen:

Et diagnosesystem i settform som omfatter, i en tilstrekkelig mengde til å utføre minst én analyse, et monoklonalt antistoff som inneholder anti-Apo AI-antistoffmolekyler som reagerer immunologisk med:

(a) Apo AI/HDL

(b) isolert Apo AI

(c) Apo AI CNBrl og

(d) polypeptidet DEPPQSPWDRVKDLA,

men som ikke reagerer immunologisk med:

(e) Apo AI CNBr2,

(f) Apo AI CNBr3,

(g) Apo AI CNBr4,

(h) polypeptidet DEPPQSPWDR og

(i) polypeptidet QSPWDRVKDLA,

er også omfattet.

Enda ytterligere omfattet er en fremgangsmåte for å analysere mengden av Apo AI i en karvæskeprøve som omfatter følgende trinn: (1) dannelse av en immunoreaksjonsblanding ved å blande en karvæskeprøve med: (a) et anti-Apo AI monoklonalt antistoff med antistoffmolekyler som reagerer immunologisk med:

(i) Apo AI/HDL

(ii) isolert Apo AI

(iii) Apo AI CNBrl og

(iv) polypeptidet DEPPQSPWDRVKDLA,

men som ikke reagerer immunologisk med:

(v) Apo AI CNBr2

(vi) Apo AI CNBr3

(vii) Apo AI CNBr4

(viii) polypeptidet DEPPQSPWDR og

(ix) polypeptidet QSPWDRVKDLA og

(b) et Apo AI-polypeptid bestående hovedsakelig av ikke mer enn ca. 40 aminosyrerester og som har, som en del av aminosyrerestsekvensen, en sekvens med formelen:

(2) opprettholdelse av immunoreaksjonsblandingen i

et tidsrom som er tilstrekkelig til å danne et Apo AI-holdig immunoreaksjonsprodukt, og

(3) bestemmelse av mengden av produkt dannet i trinn (2), og derved mengden av Apo AI i karprøven. Ved foretrukne analysefremgangsmåter er anti-Apo AI-MAB ifølge trinn (1) (a) MAB AI-16 og polypeptidet ifølge trinn (1) (b) et polypeptid valgt fra gruppen bestående av:

(i) DEPPQSPWDRVKDLA og

(ii) DEPPQSPWDRVKDLATVYVDV.

Kort beskrivelse av tegningene

Tegningene som utgjør en del av denne beskrivelse, viser: Figur 1 amonosyrerestsekvensen til Apo AI CNBrl, som rapportert av Brewer et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 80:623-630 (1978), fra og med reststilling 1 til 86.

Apo AI CNBrl som dannes ved spalting i methioninresten (M) lokalisert i stilling 86, svarer i sekvens til stillingene fra og med 1 til og med 86 idet carboxylende-methioninet omdannes til homoserinlacton. Stillingene til de fire fragmentene fremstilt etter trypsinspalting av CNBrl, betegnet Tl - T4, og stillingen til det ene fragment fremstilt etter spalting av fragment T3 med BNPS-skatol, betegnet Sl, er også angitt.

Figur 2 viser evnen til Apo AI/HDL, HDL som er til stede i friskt plasma og polypeptid AIl-15 når det gjelder kompetitivt å hemme MAB AI-16-binding til Apo AI/HDL. Pro- teinkonsentrasjon ble bestemt ifølge fremgangsmåten til Markwell et al., Anal. Biochem., 87:206-220 (1978). De logaritmiske omdannede data for Apo AI (A), plasma (0) og polypeptid AIl-15 (#) ga hellinger på henholdsvis -1,96, -2,47 og -2,60.

Figur 3 viser immunoreaktiviteten [molar (M) mengde av peptid påkrevet for 50% hemming (ID^q) av antistoff-binding i den fastfase kompetitive RIA beskrevet i eksempel 6] til hvert av peptidene AIl-10, AIl-15, AI1-21 og AI5-15 for MAB AI-16. ID^-ene ble oppnådd etter lineær regresjonsanalyse av de logaritmisk omdannede kurver for konkurranse og er vist i den øvre del av figuren. Affiniteten til MAB AI-16 for peptider AIl-15 og AI1-21 ble fastslått å være i det vesentlige identiske ettersom hellingene til de logaritmisk omdannede linjene fremstilt ved hjelp av disse peptidene var henholdsvis -2,60 og -2,57. Konsentrasjonen av peptid-konkurrent er vist i mol pr. liter (MM) bestemt som beskrevet i figur 2.

Nærmere beskrivelse av oppfinnelsen

A. Definisjoner

Aminosyre: Alle aminosyrerester som her er identi-fisert, er i den naturlige L-konfigurasjon. Idet man holder seg til standardpolypeptidnomenklatur, J. Biol. Chem., 243: 3557-59, (1969), er forkortelsene for aminosyrerester som vist i den følgende samsvarsfortegnelse:

Det bør legges merke til at alle aminosyrerestsek-venser her er vist ved hjelp av formler med en venstre-til-høyre-orientering som er i den vanlige retning fra aminoende til carboxylende. Videre bør det legges merke til at en prikk ved begynnelsen eller slutten av en aminosyrerestsekvens indikerer en binding til en ytterligere sekvens med én eller flere aminosyrerester opp til i alt ca. 50 rester i polypeptidkjeden.

Apo AI/ HDL: Betegner Apo AI når det er til stede på HDL-partikler.

Delipidert Apo AI: Henviser til Apo AI som er i det

vesentlige fritt for tilknyttede lipider.

Isolert Apo AI: Betegner Apo AI som er i det vesentlige fritt for både tilknyttede lipider og andre proteiner, som f.eks. de, slik som Apo All, som vanligvis finnes på

HDL i tillegg til Apo AI.

Polypeptid og peptid: Polypeptid og peptid er uttrykk som her brukes vekselvis for å betegne en rettkjedet serie av ikke mer enn ca. 40 aminosyrerester hvor den ene er bundet til den neste ved hjelp av peptidbindinger med mellom alfa-amino- og carboxylgrupper i naborester.

Protein: Protein er et uttrykk som her brukes for å betegne en rettkjedet serie av mer enn ca. 50 aminosyrerester hvor den ene er bundet til den neste som i et polypeptid.

B. Polypeptider

Slik det her er brukt, henviser uttrykket "Apo AI polypeptid" til et polypeptid med aminosyrerestsekvens som er homolog (lik i struktur) med en del av Apo AI-molekylet.

Ved en utførelsesform består et Apo AI-polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse hovedsakelig av minst ca. 15 og ikke mer enn ca. 40, og fortrinnsvis ikke mer enn ca. 25, aminosyrerester, og har som en del av sin sekvens, en sekvens med formelen:

Ved en annen utførelsesform består et Apo AI-polypeptid ifølge oppfinnelsen hovedsakelig av minst ca. 15 og ikke mer enn ca. 25, fortrinnsvis ikke mer enn ca. 21 aminosyrerester, og har som en del av sin sekvens, en sekvens med formelen:

Foretrukne Apo AI-polypeptider er vist i tabell 1.

Fortrinnsvis er et Apo AI-polypeptid ifølge oppfinnelsen videre kjennetegnet ved sin evne til immunologisk å etterligne en epitop (antigen determinant) uttrykt av Apo AI på hovedsakelig all HDL.

Et -Apo AI-polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse, her også henvist til som et emnepolypeptid, kan syntetiseres ved hvilken som helst av de teknikker som er kjent for fagfolk innen polypeptidteknikken, inkludert teknikker med re-kombinant DNA. Teknikker med syntetisk kjemi, slik som en fastfasesyntese av Merrifield-type, er foretrukket av slike grunner som renhet, antigen spesifisitet, frihet fra uønskede biprodukter, "fremstillingsletthet og lignende. En utmerket oppsummering av de mange teknikkene som er tilgjengelige,

kan finnes i J.M. Steward og J.D. Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969;

M. Bodanszky et al., "Peptide Synthesis", John Wiley&Sons, 2. utg., 1976 og J. Meienhofer, "Hormonal Proteins and Peptides", vol. 2, s. 46, Academic Press (New York), 1983

for fastfase-peptidsyntese, og E. Schroder og K. Kubke, "The Peptides", vol. 1, Academic Press (New York) 1965 for klassisk oppløsningssyntese. Passende beskyttelsesgrupper som kan brukes i slike synteser, er beskrevet i den ovenfor nevnte litteratur og i J.F.W. McOmie, "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, New York, 1973.

Generelt omfatter de fastfase-syntesefremgangsmåter

som det her er tenkt på, sekvensvis addisjon av én eller flere aminosyrerester eller passende beskyttende aminosyrerester til en voksende peptidkjede. Normalt er enten amino-eller carboxylgruppen i den første aminosyrerest beskyttet

ved hjelp av en egnet, selektivt fjernbar beskyttelses-gruppe. En forskjellig, selektivt fjernbar beskyttelses-gruppe benyttes til aminosyrer som inneholder en reaktiv sidegruppe, slik som lysin.

Når det anvendes en fastfasesyntese som eksempel, festes den beskyttede eller derivatiserte aminosyre til en inert fast bærer gjennom sin ubeskyttede carboxyl- eller aminogruppe. Beskyttelsesgruppen på amino- eller carboxylgruppen fjernes så selektivt og den neste aminosyre i sekvensen hvor den komplementære (amino- eller carboxyl-) gruppe er passende beskyttet, tilblandes og omsettes under betingelser som er egnet for dannelse av amidbindingen med resten som allerede er festet til den faste bærer. Beskyttelsesgruppen på amino- eller carboxylgruppen fjernes så

fra denne nytilsatte aminosyrerest, og den neste aminosyre (passende beskyttet) tilsettes så osv. Etter at alle de ønskede aminosyrer er blitt bundet i den korrekte rekke-følge, fjernes eventuelle gjenværende ende- og sidegruppe-beskyttelsesgrupper (og fast bærer) sekvensvis eller sam-tidig, hvorved sluttpolypeptidet fås.

Det skal forstås at et emnepolypeptid ikke behøver å være identisk med aminosyrerestsekvensen til Apo AI, så lenge det omfatter den påkrevde sekvens og er i stand til å reagere immunologisk med antistoffer som reagerer immunologisk med Apo AI. Substitusjoner av en aminosyre med en annen, enten konservative eller ikke-konservative, når slike endringer gir visse fordeler ved bruk, er omfattet. Konservative substitusjoner er de hvor én aminosyrerest er-stattes av en annen, biologisk lik rest. Eksempler på konservative substitusjoner omfatter substitusjonen av en hydrofob rest, slik som isoleucin, valin, leucin eller methionin, med en annen, eller substitusjonen av en polar rest med en annen, slik som mellom arginin og lysin, mellom glutamin- og asparaginsyre eller mellom glutamin og aspara-gin, og lignende. Uttrykket "konservativ substitusjon" omfatter også bruken av en substituert aminosyre i stedet for en usubstituert moderaminosyre, forutsatt at et slikt polypeptid også utviser den påkrevde bindingsaktivitet.

Når et polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse

har en sekvens som ikke er identisk med sekvensen til et Apo AI fordi én eller flere konservative eller ikke-konservative substitusjoner er blitt gjort, er vanligvis ikke mer enn 30 antallsprosent, mer vanlig ikke mer enn 20 antallsprosent og fortrinnsvis ikke mer enn 10 antallsprosent, av aminosyrerestene substituert, bortsett fra at prolinresten i stilling 99 ikke kan være substituert eller fjernet når ytterligere rester er blitt addert i en av endene for det formål å tilveiebringe en "linker" hvorved polypeptidene ifølge oppfinnelsen passende kan festes til en markør eller fast matriks, eller bærer, danner linkerrestene ikke Apo AI-epitoper, dvs. er ikke lik i struktur med Apo AI. Markører, faste matrikser og bærere som kan brukes sammen med polypeptidene ifølge oppfinnelsen, er beskrevet nedenfor.

Aminosyrerestlinkere er vanligvis minst én rest og kan være 40 eller flere rester, oftere 1-10 rester, men danner ikke Apo AI-epitoper. Typiske aminosyrerester som brukes for binding er tyrosin, cystein, lysin, glutamin-

og asparaginsyre, eller lignende. I tillegg kan et emnepolypeptid adskille seg, med mindre annet er angitt, fra den naturlige sekvens til Apo AI ved at sekvensen er blitt modifisert ved hjelp av ende-NI^-acylering, f. eks. acety-lering, eller thioglycolsyreamidering, ved endecarboxyl-amidering, f.eks. med ammoniakk, methylamin og lignende.

Når det er koblet til en bærer for å danne det som innen teknikken er kjent som et bærer-hapten-konjugat, kan et Apo AI-polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse indusere antistoffer som reagerer immunologisk med Apo AI, fortrinnsvis Apo AI når det er del av en HDL-partikkel (Apo AI/HDL). På bakgrunn av det godt fastlagte prinsipp med immunologisk reaktivitet, omfatter foreliggende oppfinnelse derfor antigent beslektede varianter av polypeptidene i tabell 1. En "antigent beslektet variant" er et emnepolypeptid som inneholder minst ca. 15, og ikke mer enn ca. 40, aminosyrerester, inkludert aminosyrerestsekvensen DEPPQSPWDRVKDLA, og som kan indusere antistoffmolekyler som reagerer immunologisk med et polypeptid fra tabell 1 og

Apo AI.

C. Antistoffer og monoklonale antistoffer

Uttrykket "antistoff" i sine forskjellige grammatikalske former brukes her som et fellessubstantiv som henviser til en populasjon av immunoglobulinmolekyler og/eller immunologisk aktive deler av immunoglobulinmolekyler, dvs. molekyler som inneholder et antistoffbindende sete eller en paratop.

Et "antistoffbindende sete" er den strukturelle del av et antistoffmolekyl som består av variable og hyper-variable områder med tung og lett kjede som spesifikt binder antigen.

Uttrykket "antistoffmolekyl" i sine forskjellige grammatikalske former omfatter slik det her er brukt, både et intakt immunoglobulin og en immunologisk aktiv del av et immunoglobulinmoleky1.

Eksempler på antistoffmolekyler er intakte immunoglobulinmolekyler, i det vesentlige intakte immunoglobulinmolekyler og de deler av et globulinmolekyl som inneholder paratopen, inkludert de delene som er kjent innen teknikken som Fab, Fab<1>, F(ab')2 og F(v).

Fab- og F (ab')2-deler av antistoffet fremstilles ved hjelp av den proteolytiske reaksjon til henholdvis papain og pepsin på i det vesentlige intakte antistoffer ved hjelp av fremgangsmåter som er godt kjent. Se f.eks. US patentskrift nr. 4.342.566. Fab<1->antistoffdeler er også godt kjent og fremstilles fra F(ab 1)2~deler etterfulgt av reduksjon av disulfidbindingene som binder sammen de to tunge kjede-delene, f.eks. mercaptoethanol, og etterfulgt av alkylering av det resulterende proteinmercaptan med et slikt reagens som jodacetamid. Et antistoff som inneholder intakte antistoffmolekyler er foretrukket, og benyttes her som illustrasjon.

Et polyklonalt antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse er kjennetegnet ved at det er istand til å reagere immunologisk med 1) et emnepolypeptid inneholdende ikke mer enn 25 aminosyrerester, og 2) Apo AI/HDL. Et polyklonalt antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse er videre kjennetegnet ved at det er i det vesentlige fritt for antistoffmolekyler som reagerer immunologisk med Apo AI CNBr2, CNBr3 og CNBr4.

Uttrykket "monoklonalt antistoff" i sine forskjellige grammatikalske former henviser til en populasjon av antistoffmolekyler som inneholder bare én art av antistoff-bindende sete som er i stand til å reagere immunologisk med et bestemt antigen. Et monoklonalt antistoff utviser således typisk en enkel bindingsaffinitet til hvilket som helst antigen som det reagerer immunologisk med. Et monoklonalt antistoff kan derfor inneholde et antistoffmolekyl med flere antistoffbindende seter som hvert er immunologisk spesifikt for et annet antigen, f.eks. et bispesifikt monoklonalt antistoff.

Et "monoklonalt antistoff (MAB) ifølge foreliggende oppfinnelse (emne-MAB) er kjennetegnet ved at det reagerer immunologisk med:

(a) Apo AI/HDL,

(b) isolert Apo AI

(c) Apo AI CNBrl og

(d) polypeptid AIl-15,

men at det ikke reagerer immunologisk med:

(e) Apo AI CNBr2,

(f) Apo AI CNBr3,

(g) Apo AI CNBr4,

(h) polypeptid AIl-10 og

(i) polypeptid AI5-15.

Et foretrukket MAB ifølge foreliggende oppfinnelse reagerer immunologisk med Apo AI/HDL, og har således et forhold mellom immunoreaktiviteter for Apo AI/HDL og polypeptid AIl-15 i området fra ca. 1:5 til ca. 5:1, fortrinnsvis ca. 1:2,5 til ca. 2,5:1, og helst ca. 1,5:1 til ca. 1:15.

Slik det her er brukt, henviser uttrykket "immunologisk reaktivitet" i sine forskjellige grammatikalske former til konsentrasjonen av antigen som er påkrevet for å oppnå en 50% hemming av den immunologiske reaksjon mellom en bestemt mengde av antistoffet og en bestemt mengde av Apo AI/ HDL. Det vil si at immunologisk reaktivitet er den konsentra sjon av antigen som er påkrevet for å oppnå en B/BQ-verdi på 0,5 når Bo er den maksimale mengde antistoff bundet i fravær av konkurrerende antigen, og det er mengden av antistoff bundet i nærvær av konkurrerende antigen, og både Bq og B er blitt justert for bakgrunnsverdi. Se Rodbard, Clin. Chem., 20:1255-1270 (1974).

Helst har et monoklonalt antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse identiske (uskjelnbare) affiniteter for naturlig forekommende Apo AI/HDL og polypeptid AIl-15. Det vil si at et foretrukket monoklonalt antistoff har en affinitet for polypeptid AIl-15 som, når den bestemmes separat, er ikke skjelnbar (ekvivalent med) ved hjelp av stati-stisk analyse innenfor en pålitelighetsgrense på p<0,l, fortrinnsvis p<0,05, helst p<0,01.

Fremgangsmåter for bestemmelse av affiniteten av et monoklonalt antistoff for et antigen og for sammenligning av disse affinitetene med hensyn på ekvivalent, er godt kjent innen teknikken. Se f.eks. Muller, J. Immunol. Meth., 34:345-352 (1980) og Sokal et al., Biometry, W.H. Freeman & Co., (1981). En foretrukken fremgangsmåte for bestemmelse

av affinitet hos monoklonalt antistoff, er ved likevekts-konkurrerende inhiberingsanalyse. Ved den fremgangsmåten bestemmes evnen til Apo AI/HDL og polypeptid AIl-15 når det gjelder å konkurrere med Apo AI/HDL med hensyn på binding til det monoklonale antistoff som karakteriseres, separat og sammenlignes med hensyn på ekvivalent. Se Tsao et al.,

J. Biol. Chem., 257:15222-15228 (1982).

F.eks. kan bestemmelse av hvorvidt affinitetene utvist av monoklonalt antistoff med hensyn på Apo AI/HDL og polypeptid AIl-15 er identiske (ikke skjelnbare), utføres på følgende måte: (a) Prosenten av en kjent mengde av det monoklonale antistoff bundet til fastfase Apo AI/HDL i nærvær av polypeptid AIl-15 som er til stede som væskefasekonkurrent, bestemmes ved forskjellige kjente konkurrentkonsentrasjoner. Den logaritmiske transformasjon av hver bestemmelse av prosent bundet plottes så mot konsentrasjon av konkurrent (væskefase-polypeptid). [Logaritme (Y)=log (Y/1-Y) , hvor

Y er prosent binding av monoklonalt antistoff i nærvær av

en bestemt mengde konkurrent].

(b) Ved å bruke den samme mengde monoklonalt antistoff som i trinn (a), bestemmes prosenten av antistoff bundet til fastfase Apo AI/HDL i nærvær av Apo AI/HDL som er til stede som væskefasekonkurrent, ved de samme konsentrasjoner som konkurrenten i trinn (a). Den logaritmiske transformasjon av hver prosent bundet plottes så mot konsentrasjon av konkurrent (væskefase Apo AI/HDL). (c) Lineær regresjonsanalyse utføres på hvert av plottene oppnådd i trinnene (a) og (b) for å komme frem til deres respektive helninger. (d) Helningene oppnådd for Apo AI/HDL og helningen oppnådd for polypeptid AIl-15, sammenlignes så ved å bruke en test for likhet mellom helninger, slik som den som er beskrevet av Sokal et al., supra, s. 485, rute 14.5.

Et monoklonalt emneantistoff, vanligvis inneholdende hele antistoffmolekyler, kan fremstilles ved å bruke den poly-peptidinduserte hybridomteknikk beskrevet av Niman et al., Proe. Nati. Sei., U.S.A., 80:4949-4953 (1983). For å danne hybridomet hvorfra blandingen med monoklonalt antistoff fremstilles, fusjoneres i korte trekk et myelom eller annen selv-forevigende cellelinje med lymfocytter erholdt fra milten til et pattedyr som er nyperimmunisert med et polypeptid ifølge oppfinnelsen.

Det er foretrukket av myelomcellelinjen er fra den samme art som lymfocyttene. Vanligvis er en mus av stammen 129 GlX<+>det foretrukne pattedyr. Egnede musmyelomer for bruk ved foreliggende oppfinnelse omfatter de hypoxanthin-aminopterin-thymidin-sensitive (HAT) cellelinjene P3X63-Ag8.653 og Sp2/0-Agl4 som er tilgjengelige fra the American Type Culture Collection, Rockville, MD, under be-tegnelsene henholdsvis CRL 1580 og CRL 1581.

Splenoeytter fusjoneres vanligvis med myelomceller under anvendelse av polyethylenglycol (PEG) 1500. Fusjonerte hybrider velges ut etter sin sensitivitet for HAT. Hybridomer som produserer et monoklonalt antistoff ifølge oppfinnelsen, identifiseres ved å bruke den radioimmunologiske

analyse (RIA) som er beskrevet i eksempel 6.

Et monoklonalt antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles ved å initiere en monoklonal hybridom-kultur som omfatter et næringsmedium inneholdende et hybridom som utskiller antistoffmolekyler med den passende poly-peptidspesifisitet. Kulturen holdes under betingelser og i et tidsrom som er tilstrekkelig til at hybridomet utskiller antistoffmolekylene i mediet. Det antistoffholdige medium samles så opp. Antistoffmolekylene kan så isoleres ytterligere ved hjelp av godt kjente teknikker.

Anvendbare medier for fremstillingen av disse bland-ingene er både godt kjent innen teknikken og kommersielt tilgjengelig, og omfatter syntetiske dyrkningsmedier, inn-avlede mus og lignende. Et eksempel på et syntetisk medium er Dulbeccos "minimal essential medium" (DMEM; Dulbecco et al., Virol., 8 :396 (1959)) supplert med 4,5 g/liter glukose, 20 mM glutamin og 20% kalvefosterserum. Et eksempel på inn-avlet musestamme er Balb/c.

Det monoklonale antistoff fremstilt ved hjelp av fremgangsmåten ovenfor kan f.eks. brukes ved diagnostiske og terapeutiske anvendelsesmåter hvor dannelse av et Apo AI-holdig immunoreaksjonsprodukt ønskes.

Et hybridom som kan anvendes ved fremstilling av et monoklonalt emneantistoff, dvs. MAB AI-16, er hybridom H131E4, som er deponert etter krav ifølge Budapest-konven-sjonen ved American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD 20852, U.S.A., 29. mars 1988 og gitt ATCC-betegnelsen HB 9677. Det bør legges merke til at hybridom ATCC

HB 9677 kan brukes, noe som er godt kjent innen teknikken, til å fremstille andre udødelige cellelinjer som produserer et monoklonalt emneantistoff, og følgelig er fremstilling av et monoklonalt emneantistoff ikke avhengig av å dyrke hybridom ved hjelp av ATCC HB 9677 per se.

D. Diagnosesystemer

Et diagnosesystem i settform ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter i en mengde som er tilstrekkelig til minst én analyse, et Apo AI emnepolypeptid og/eller et monoklonalt emneantistoff, samt separat pakkede immunokjemiske reagenser. Instruksjoner for bruk av et emballert immunokjemisk reagens er også vanligvis inkludert.

Slik det her er brukt, henviser uttrykket "pakning" til en fast matriks eller et slikt materiale som glass, plast, papir, folie og lignende som kan holde et polypeptid, polyklonalt antistoff eller monoklonalt antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse innenfor bestemte grenser. Således kan en pakning f.eks. være en glassampulle brukt til å inneholde milligrammengder av et aktuelt polypeptid, eller den kan være en mikrotiterplatebrønn hvori mikrogrammengder av et aktuelt polypeptid er blitt operativt festet, dvs. bundet slik at det er i stand til å bli immunologisk bundet ved hjelp av et antistoff.

"Bruksanvisninger" omfatter vanligvis en konkret an-givelse som beskriver reagenskonsentrasjonen eller i det minste én analysefremgangsmåteparameter, slik som de relative mengder av reagens og prøve som skal blandes sammen, oppbe-varingstidsrom for reagens/prøve-blandinger, temperatur, bufferbetingelser og lignende.

Ved foretrukne utførelsesformer omfatter et diagnosesystem ifølge foreliggende oppfinnelse videre en markør eller indikasjonsmiddel som kan signalisere dannelsen av et kompleks som inneholder et polypeptid- eller antistoffmolekyl ifølge foreliggende oppfinnelse.

Ordet "kompleks" henviser slik det her er brukt, til produktet av en spesifikk bindingsreaksjon, slik som en antistoff/antigen- eller reseptor/ligand-reaksjon. Eksempler på komplekser er immunoreaksjonsprodukter.

Slik de her er brukt, henviser uttrykkene "markør" og "indikasjonsmiddel" i sine forskjellige grammatikalske former til enkeltatomer og -molekyler som enten er direkte eller indirekte involvert i fremstillingen av et påvisbart signal for å indikere tilstedeværelsen av et kompleks. Enhver markør eller ethvert indikasjonsmiddel kan være bundet til eller inkorporert i et uttrykt protein, polypeptid eller antistoffmolekyl som er del av en antistoff- eller monoklonal anti-stof f blanding ifølge foreliggende oppfinnelse, eller brukes separat, og disse atomene eller molekylene kan brukes alene eller sammen med ytterligere reagens. Slike markører er i seg selv velkjent innen klinisk diagnosekjemi og utgjør en del av oppfinnelsen bare i den utstrekning de benyttes sammen med ellers nye proteiner, fremgangsmåter og/eller systemer.

Markørmidlet kan være et fluorescerende markørmiddel

som bindes kjemisk til antistoffer eller antigener uten å denaturere dem slik at det dannes fluorochrom (fargestoff)

som er en effektiv immunofluorescerende indikator. Egnede fluorescerende markørmidler er fluorochromer, slik som fluoresceinisocyanat (FIC), fluoresceinisothiocyanat (FITC), 5-dimethylamin-l-nafthalensulfonylklorid (DANSC), tetra-methylrhodaminisothiocyanat (TRITC), lissamin, rhodamin 8200 sulfonylklorid (RB 200 SC) og lignende. En beskrivelse av immunofluorescensanalyseteknikker finnes i DeLuca, "Immuno-fluorescence Analysis", i Antibody As a Tool. Marchalonis et al., red. John Wiley&Sons, Ltd. 189-231 (1982).

Ved foretrukne utførelsesformer er indikatorgruppen et enzym, slik som pepperrotperoxidase (HRP), glukoseoxidase eller lignende. I slike tilfeller hvor hovedindikatorgruppen er et enzym, slik som HRP eller glukoseoxidase, er det påkrevet med ytterligere reagens for å visualisere det faktum at et reseptor/ligand-kompleks (immunoreaktant) er blitt dannet. Slike ytterligere reagenser for HRP omfatter hydro-genperoxyd og en oxydasjonsfargestofforløper, slik som di-aminobenzidin. Et ytterligere reagens som kan brukes sammen med glukoseoxidase, er 2,2'-azino-di-(3-ethy1-benzthiazolin-G-sulfonsyre) (ABTS).

Radioaktive grunnstoffer er også effektive markørmidler og brukes her som illustrasjon. Et eksempel på radioaktivt markørmiddel er et radioaktivt grunnstoff som gir gamma-stråle-emisjoner. Grunnstoffer som i seg selv sender ut gamma-.... ,124T 125T 128T 132T 51„ ..^ stråler, slik som I, I, I, I og Cr, utgjør en klasse av gammastråleemisjons-givende indikasjonsgrupper

125

med radioaktivt grunnstoff. Særlig foretrukket er I. En annen gruppe av effektive markørmidler er de grunnstoffene, slik som<11>C, 18 F, 150og<13>N, som i seg selv sender ut positroner. De således emitterte positroner gir gammastråler

etter å ha støtt på elektroner som er til stede i dyrets kropp. Effektiv er også en beta-emitter, slik som "'""'"^indium, av<3>H.

Bindingen av markører, dvs. merking av polypeptider og proteiner, er godt kjent innen teknikken. F.eks. kan antistoffmolekyler fremstilt ved hjelp av et hybridom merkes ved metabolsk inkorporering av radioisotopholdige aminosyrer tilveiebragt som en bestanddel i dyrkningsmediet. Se f.eks. Galfre et al., Meth. Enzymol., 73:3-46 (1981). Teknikkene med proteinkonjugering eller -kobling gjennom aktiverte fusjonerte grupper er særlig anvendbare. Se f.eks. Aurameas et al., Scand. J. Immunol., vol. 8, Suppl. 7:7-23 (1978), Rodwell

et al., Biotech., 3:889-894 (1984) og US patentskrift nr. 4.493.795.

Diagnosesystemene kan også omfatte, fortrinnsvis som

en separat pakning, et spesifikt bindingsmiddel. Et "spesifikt bindingsmiddel" er en molekylenhet som kan binde selektivt en reagensart ifølge foreliggende oppfinnelse eller et kompleks som inneholder en slik art, men som ikke selv er et polypeptid eller en antistoffmolekylblanding ifølge foreliggende oppfinnelse. Eksempler på spesifikke bindingsmidler er sekundære antistoffmolekyler, komplementproteiner eller fragmenter derav, S. aureus protein A og lignende. Fortrinnsvis bindes det spesifikke bindingsmiddel til reagens-arten når arten er til stede som en del av et kompleks.

Ved foretrukne utførelsesformer er det spesifikke bindingsmiddel merket. Når diagnosesystemet omfatter et spesifikt bindingsmiddel som ikke er merket, brukes imidlertid midlet vanligvis som et forsterkningsmiddel eller -reagens. Ved disse utførelsesformene kan det merkede spesifikke bindingsmiddel bindes spesifikt til forsterkningsmidlet når forsterkningsmidlet er bundet til et reagensart-holdig kompleks.

Diagnosesettene ifølge foreliggende oppfinnelse kan brukes i et "ELISA"-format for å påvise mengden av Apo AI

i en karvæskeprøve, slik som blod, serum eller plasma. "ELISA" henviser til en enzymbundet immunosorbentanalyse hvor det anvendes et antistoff eller antigen bundet til en fast fase og et enzym/antigen- eller enzym/antistoff-kon-

jugat for å påvise og kvantifisere mengden av et antigen som er til stede i en prøve. En beskrivelse av ELISA-teknikken finnes i kapittel 22 av 4. utgave av Basic and Clinical Immunology av D.P. Sites et al., utgitt av Lange Medical Publications of Los Altos, CA i 1982 og i US patentskrifter nr. 3.654.090, 3.850.752 og 4.016.043.

Ved foretrukne utførelsesformer kan således et Apo AI-polypeptid eller et monoklonalt antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse festes til en fast matriks, hvorved det dannes en fast bærer som utgjør en pakning i de foreliggende diagnosesystemer.

Et reagens festes vanligvis til en fast matriks ved adsorpsjon fra et vandig medium, selv om andre festemåter som er anvendbare proteiner og polypeptider, og som er godt kjent for fagfolk innen teknikken, kan brukes.

Anvendbare faste matrikser er også godt kjent innen teknikken. Slike materialer er vannuoppløselige og omfatter det kryssbundne dextran som er tilgjengelig under varemerket Sephadex<®>; agarose, kuler av polystyren fra ca. 1 mikro-meter til ca. 5 mm i diameter; polyvinylklorid, polystyren, kryssbundet polyacrylamid, nitrocellulose- eller nylon-baserte vevninger, slik som ark, strimler eller padler; eller rør, plater eller brønnene i en mikrotiterplate, slik som de som er laget av polystyren eller polyvinylklorid.

Reagensartene, det merkede spesifikke bindingsmiddel eller forsterkningsreagenset i hvert diagnosesystem som her er beskrevet, kan tilveiebringes i oppløsning, som en flytende dispersjon eller som et i det vesentlige tørt pulver, f.eks. i lyofilisert form. Når indikasjonsmidlene er et enzym, kan enzymets substrat også være tilveiebragt i en separat pakning i et system. En fast bærer, slik som den tidligere beskrevne mikrotiterplate, og én eller flere buffere kan også være tatt med som separate pakningsele-menter i dette diagnostiske analysesystem.

Pakningsmaterialene som her er omtalt i forbindelse med diagnosesystemer, er de som vanligvis benyttes i diagnosesystemer. Slike materialer omfatter glass- og plast- (f.eks. polyethylen, polypropylen og polycarbonat) flasker, ampuller,

plast- og plastfolielaminerte hylser og lignende.

E. Analysefremgangsmåter

Foreliggende oppfinnelse vedrører forskjellige immunologiske analysefremgangsmåter for bestemmelse av mengden av Apo AI i en biologisk væskeprøve ved å bruke et polypeptid, et polyklonalt antistoff eller monoklonalt antistoff ifølge oppfinnelsen som et immunokjemisk reagens for dannelse av et immunologisk reaksjonsprodukt i en mengde som står i forhold, enten direkte eller indirekte, til mengden av Apo AI i prøven. Fagfolk innen teknikken vil forstå at det er flere godt kjente klinisk-diagnostiske kjemiske fremgangsmåter hvor et immunokjemisk reagens ifølge oppfinnelsen kan brukes til å danne et immunologisk reaksjonsprodukt i en mengde som står i forhold til mengden av Apo AI som er til stede i en kroppsprøve. Selv om det her er beskrevet eksem-pelvise analysefremgangsmåter, er oppfinnelsen således ikke begrenset til disse.

Forskjellige heterogene og homogene fremgangsmåter, enten kompetitive eller ikke-kompetitive, kan anvendes ved utførelsen av analysefremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. F.eks. omfatter foreliggende oppfinnelse en kompetitiv fremgangsmåte for analysering av mengden av Apo AI i en kar-væskeprøve som omfatter følgende trinn: (a) Dannelse av en immunologisk reaksjonsblanding ved å blande en karvæskeprøve med: (i) et monoklonalt antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse, fortrinnsvis AI-16, og (ii) et Apo AI-polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse, fortrinnsvis AIl-15 eller AI1-21.

Karvæskeprøven tilveiebringes fortrinnsvis som en kjent mengde blod, eller et blodavledet produkt, slik som serum eller plasma. Uansett type prøve som brukes, tilveiebringes den fortrinnsvis fra en person som har fastet minst ca. 12 timer, noe som er kjent innenfor teknikken. En slik prøve henvises til som en "faste"-prøve. Det bemerkes også at når serum eller plasma brukes som prøven, trenger den prøven ikke å underkastes den behandling med denaturerings- eller chaotropisk middel for det formål å endre ekspresjonen av Apo AI-epitopen som analyseres.

Fortrinnsvis er den mengde monoklonalt antistoff som tilblandes, kjent. Ytterligere foretrukket er utførelses-former hvor det monoklonale antistoff er merket, dvs. operativt bundet til et indikasjonsmiddel, slik som et enzym, radionuklid og lignende.

Fortrinnsvis er Apo AI-polypeptidet til stede som en del av en fast bærer, dvs. operativt bundet til en fast matriks, slik at den immunologiske reaksjonsblanding som dannes, har en fast og en flytende fase. Ytterligere foretrukket er utførelsesformer hvor mengden av polypeptid som er til stede i den immunologiske reaksjonsblanding, er en tilstrekkelig mengde til å danne et overskudd av epitoper i forhold til antallet antistoff-bindende seter som er til stede i den immunologiske reaksjonsblanding som er i stand til å reagere immunologisk med disse epitopene. (b) Den immunologiske reaksjonsblanding holdes under biologiske analysebetingelser i et forutbestemt tidsrom, slik som ca. 10 minutter til ca. 16 - 20 timer, ved en temperatur på ca. 4°C til ca. 45°C, idet dette tidsrom er tilstrekkelig til at Apo AI som er til stede i prøven, får reagere immunologisk med (bindes immunologisk til) en del av de anti-Apo AI-antistoff-bindende seter som er til stede på det monoklonale antistoff, hvorved det dannes et Apo AI-holdig immunologisk reaksjonsprodukt.

Biologiske analysebetingelser er de som opprettholder den biologiske aktivitet til de immunokjemiske reagensene ifølge oppfinnelsen og Apo AI som søkes analysert. Disse betingelsene omfatter et temperaturområde fra ca. 4°C til ca. 45°C, et pH-verdiområde på ca. 5 til ca. 9, og en ione-styrke som varierer fra ionestyrken til destillert vann og til ionestyrken til ca. 1 molar natriumklorid. Fremgangsmåter for optimalisering av slike betingelser er godt kjent innen teknikken. (c) Mengden av Apo AI-holdig immunologisk reaksjonsprodukt som ble dannet, bestemmes, og derved mengden av Apo AI i prøven.

Bestemmelse av mengden av det Apo AI-holdige immunologiske reaksjonsprodukt, enten direkte eller indirekte, kan utføres ved hjelp av analyseteknikker som er godt kjent innen teknikken, og avhenger vanligvis av den anvendte type indikasjonsmiddel.

Ved foretrukne kompetitive analysefremgangsmåter relateres produktmengden bestemt i trinn (c) til mengden av immunologisk reaksjonsprodukt dannet på lignende måte og bestemmes ved å bruke en kontrollprøve i stedet for karvæske-prøven hvor kontrollprøven inneholder en kjent mengde av et emnepolypeptid, fortrinnsvis AIl-15 eller AI1-21.

Ved en annen utførelsesform vedrører foreliggende oppfinnelse en dobbeltantistoff- eller "sandwich"-immunoana-lyse som omfatter følgende trinn: (a) Dannelse av en første immunologisk reaksjonsblanding ved å blande en karvæskeprøve med et første antistoff, fortrinnsvis et monoklonalt antistoff, hvor antistoffet og Apo AI/HDL som er til stede i prøven, er i stand til å danne et første immunologisk reaksjonsprodukt som kan reagere immunologisk med et monoklonalt emneantistoff, fortrinnsvis MAB AI-16. Fortrinnsvis er det første antistoff operativt bundet til en fast matriks. (b) Opprettholdelse av den således dannede, første immunologiske reaksjonsblanding under biologiske analysebetingelser i et tidsrom som er tilstrekkelig til å danne det første immunologiske reaksjonsprodukt. Fortrinnsvis skilles så det første immunologiske reaksjonsprodukt fra prøven. (c) Dannelse av en andre immunologisk reaksjonsblanding ved å blande det første immunologiske reaksjonsprodukt med: (i) et monoklonalt antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse, fortrinnsvis MAB AI-16, og (ii) et Apo AI-polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse, fortrinnsvis AIl-15 eller AI1-21. Fortrinnsvis utføres trinn (ii) før trinn (i) eller i det vesentlige sam-tidig med det, dvs. innen ca. 5-10 minutter, fortrinnsvis innen ca. 1-2 minutter.

(d) Opprettholdelse av den således dannede, andre immuno-

logiske reaksjonsblanding under biologiske analysebetingelser i et nøyaktig tidsrom som er tilstrekkelig til å danne det andre eller "sandwich" immunologiske reaksjonsprodukt. (e) Bestemmelse av mengden av andre immunologiske reaksjonsprodukt som ble dannet, og derved mengden av Apo AI i prøven.

Fortrinnsvis merkes det monoklonale emneantistoff ifølge trinn (c) (i), fortrinnsvis med et enzym, og det andre immunologiske reaksjonsprosukt som dannes, er et merket produkt.

Ved foretrukne dobbeltantistoff-analysefremgangsmåter relateres mengden av immunologisk reaksjonsprodukt bestemt i trinn (e) av dobbeltantistoff-fremgangsmåten, til mengden av immunologisk reaksjonsprodukt dannet på lignende måte og bestemt ved å bruke en kontrollprøve i stedet for karvæske-prøven, hvor kontrollprøven inneholder en kjent mengde av et emnepolypeptid, fortrinnsvis AIl-15 eller AIl-21.

Eksempler

De følgende eksempler illustrerer, men begrenser ikke, foreliggende oppfinnelse.

1. Fremstilling av antigener

A. Polypeptider

Polypeptidene AIl-10, AIl-15, AIl-21 og AI5-15 ble syn-tetisert ved å bruke den klassiske fastfaseteknikken beskrevet av Merrifield, Adv. Enzymol., 32:221-96 (1969) til-passet for bruk sammen med et Modell 430A automatisert pep-tidsynteseapparat. Polypeptidresiner ble spaltet ved hjelp av hydrogenfluorid, ekstrahert og analysert med hensyn på renhet ved hjelp av væskekromatografi med høy yteevne under anvendelse av en reversfase C18-kolonne.

Aminosyrerestsekvensene til polypeptidene AIl-15 og AIl-21 er ovenfor blitt vist i tabell 1. Sekvensene til polypeptidene AIl-10 og AI5-15 er vist i tabell 2 nedenfor.

B. Fremstilling av Apo AI/ HDL

HDL ble isolert fra plasma erholdt ved plasmaforese av blod fra normal fastende donor ved den lokale blodbank (San Diego Plasma Center, San Diego, CA). For det formål ble derved erholdt plasma justert slik at det inneholdt en sluttkonsentrasjon på 5 millimol (mM) benzamidin, 1 mM di-isopropylfluorfosfat, 10 mM ethylendiamintetraeddiksyre (EDTA), 10 milligram pr. milliliter (mg/ml) soyabønnetryp-sininhibitor og 10.000 enheter pr. ml aprotinin. HDL-et ble så isolert fra dette justerte plasma ved hjelp av sekvensvis ultrasentrifugering under anvendelse av fast kaliumbromid (KBr) for densitetsregulering.

Først ble det regulerte plasma sentrifugert ved ca. 2.000.000 x g i 18 - 24 timer og bunnlaget av den resulterende supernatant ble utvunnet. Fast KBr ble blandet til bunnlaget inntil densiteten var større enn 1,063 gram pr; milliliter (g/ml). Den resulterende blanding ble så plassert i et lag under en 0,1% EDTA-oppløsning inneholdende KBr ved en densitet på 1,063 g/ml og sentrifugert ved 200.000 x g i mer enn 4 8 timer. Bunnlaget ble på nytt utvunnet og til det ble det blandet fast KBr inntil densiteten var regulert til mer enn 1,21 g/ml. Det regulerte lag ble plassert under en 0,1% EDTA-oppløsning inneholdende KBr ved en densitet på 1,21 g/ml, og ble sentrifugert ved 200.000 x g i mer enn 48 timer.

Topplaget ble så utvunnet og fast KBr ble tilblandet inntil densiteten var større enn 1,063 g/ml. Det regulerte topplag ble plassert under en 0,1% EDTA-oppløsning inneholdende KBr ved en densitet på 1,063 g/ml, og ytterligere sentrifugert ved 200.000 x g i mer enn 48 timer.

Midtlaget ble utvunnet og fast KBr tilblandet til det inntil densiteten var regulert til mer enn 1,21 g/ml. Det regulerte midtlag ble plassert under en 0,1% EDTA-oppløsning inneholdende KBr ved en densitet på 1,21 g/ml og sentrifugert ved 300.000 x g i mer enn 48 timer. Det resulterende HDL-holdige topplag, med en densitet lik med 1,063 - 1,21 g/ml, ble utvunnet. Det utvundne HDL ble dialysert mot lipo-protein-buffer (LLB; vann inneholdende 0,15 mM NaCl, 0,3 mM EDTA og 0,005% alfa-tocoferol) og det resulterende Apo AI/ HDL ble lagret under sterile betingelser og brukt innen 3 dager.

C. Fremstilling av delipidert Apo AI

Delipidert Apo AI ble fremstilt ved å ekstrahere lipi-dene organisk fra Apo AI/HDL. En prøve av Apo AI/HDL fremstilt i eksempel IB ble først dialysert mot 0,01% EDTA med en pH-verdi på 7,5 over natten (omtrent 18 timer), så dialysert mot 0,003 prosent EDTA i omtrent 12 timer, og deretter lyofilisert ved 10 - 20 mg protein pr. rør. Til hvert rør ble det tilblandet 35 ml absolutt ethanol:vannfri ether (1:1) ved 4°C. Etter blanding ble oppløsningen holdt i 20 minutter ved -20°C. Oppløsningen ble så sentrifugert i 30 minutter ved 1000 x g ved 0°C, supernatanten ble helt av og den Apo AI-holdige pellet beholdt.

Ethanoletherekstraksjon som beskrevet ovenfor ble ut-ført to ganger til i i alt tre ekstraksjoner. Deretter ble 35 ml vannfri ether ved 4°C tilblandet prøven. Blandingen ble holdt i 30 minutter ved -20°C, sentrifugert ved 1000 x g i 30 minutter ved -20°C, og den Apo AI-holdige pellet ble utvunnet og tørket under anvendelse av nitrogengass, hvorved delipidert Apo AI ble dannet. Det bør legges merke til at delipidert Apo AI inneholder ikke bare Apo AI, men også andre proteiner forbundet med HDL, slik at Apo AI.

D. Fremstilling av isolert Apo AI

Apo AI ble isolert fra delipidert Apo AI ved størrelse-fraksjonering under anvendelse av høytrykksvæskekromatografi (HPLC) ved å følge fremgangsmåtene til Kinoshita et al.,

J. Biochem., 94:615-617 (1983). Ca. 300 mg delipidert Apo AI ble oppløst i 200 mikroliter (ul) 0,1% natriumdodecylsulfat

(SDS), 0,1 M natriumfosfat (pH 7,0) og størrelsefraksjonert på Spherogel - TSK 3000 SW HPLC-kolonner. Fraksjoner inneholdende det isolerte Apo AI ble lagret ved -20°C. Apo AI ble også isolert ved delipidering og elektroforese på polyacrylamid som her beskrevet.

E. Fremstilling av polyacrylamid- HDL

HDL ble immobilisert i polyacrylamid ved å tilblande de følgende angitte mengder av separat fremstilte oppløs-ninger, hvorved det ble dannet en kryssbindings-reaksjonsblanding :

(a) 4,3 ml LLB inneholdende 50 mg HDL,

(b) 1,25 ml vann inneholdende 28% (vekt/volum) acryl-amid, (c) 2,5 ml vann inneholdende 2% (vekt/volum) N,N'-methylen-bis-acrylamid,

(d) 1,25 ml LLB og

(e) 1,2 ml vann inneholdende 1% (vekt/volum) ammonium-persulfat.

Kryssbindingsreaksjonen fikk fortsette i ca. 16 timer ved 37°C. Ettersom kryssbinding ikke oppsto, ble TEMED (N,N,N',N, 1 -tetramethyl-ethylen-diamin) deretter tilblandet, noe som ga kryssbinding innen ca. 90 minutter ved 37°C.

Den resulterende polyacrylmasse ble homogenisert mekanisk

i nærvær av 20 ml LLB og så vasket med LLB ved sentrifu-geringsfiltrering, hvorved det ble dannet polyacrylamid-HDL.

2. Frembringelse av monoklonale antistoffer

Balb/c ByJ-mus ble immunisert intraperitonealt (i.p.) med 50 pg polyacrylamid-HDL som immunogen i komplett Freunds adjuvans (CFA) og 500 enheter interferon-gamma etterfulgt av en andre og en tredje immunisering, hver ca. tre uker fra hverandre, i ukomplett Freunds adjuvans (IFA) uten interferon. Omtrent ni måneder etter den siste adjuvans-holdige immunisering fikk musene en forsterkningsinjeksjon av 50 yg naturlig forekommende HDL intravenøst (i.v.) i normal saltoppløsning 4 dager før fusjon og en andre lik perfusjons-forsterknning én dag senere.

De således behandlede dyr ble avlivet og milten til hver mus tatt ut. En miltcellesuspensjon ble så fremstilt. Miltceller ble så ekstrahert fra miltcellesuspensjonen ved sentrifugering i ca. 10 minutter ved 1000 rpm, ved 23°C. Etter fjerning av supernatant ble cellepelleten på nytt oppslemmet i 5 ml kald NH^Cl lysebuffer, og ble inkubert i ca. 10 minutter.

Til den lyserte cellesuspensjon ble det blandet 10 ml Dulbeccos modifisert Eagle-medium (DMEM) og HEPES [4-(2-hydroxyethyl)-1-piperidinethansulfonsyre], og den blandingen ble sentrifugert i ca. 10 minutter ved 1000 rpm ved 23°C.

Supernatanten ble dekantert, pelleten på nytt oppslemmet i 15 ml DMEM og HEPES, og ble sentrifugert i ca. 10 minutter ved 10 0 0 "rpm ved 23°C. Fremgangsmåten ovenfor ble gjentatt.

Pelleten ble så på nytt oppslemmet i 5 ml DMEM og HEPES. En aliquot av miltcellesuspensjonen ble så fjernet for telling. Fusjoner ble utført på den følgende måte under anvendelse av den ikke-utskillende musmyelomcellelinje P3X63Ag8.653.1, en subklon av linje P3X63Ag 8.653 (ATCC 1580). Ved å bruke et forhold mellom myelom og miltcelle på ca. 1-10 eller ca. 1-5, ble en tilstrekkelig mengde myelomceller sentrifugert til en pellet, vasket to ganger i 15 ml DMEM og HEPES, og sentrifugert i 10 minutter ved 1000 rpm ved 23°C.

Miltceller og myelomceller ble slått sammen i rund-bunnede 15 ml-rør. Celleblandingen ble sentrifugert i 10 minutter ved 1000 rpm ved 23°C og supernatanten fjernet ved utsuging. Deretter ble 200 yl 50% (vekt pr. volum) vandig polyethylenglykol med molekylvekt 40 00 (PEG; ATCC Baltimore, MD) ved ca. 37°C tilblandet under anvendelse av en 1 ml-pipette med kraftig omrøring for å bryte opp pelleten, og cellene ble forsiktig blandet i ca. 15-30 sekunder. Celleblandingen ble sentrifugert i 4 minutter ved 700 rpm.

Ved ca. 8 minutter før tidspunktet for tilsetning av PEG, ble 5 ml DMEM pluss HEPES-buffer sakte blandet med pelleten uten å bryte opp cellene. Etter 1 minutt ble den resulterende blanding brudt opp med en 1 ml-pipette, og ble inkubert i ytterligere 4 minutter. Denne blandingen ble sentrifugert i 7 minutter ved 1000 rpm. Supernatanten ble dekantert, 5 ml HT-medium (hypoxanthin/thymidin) ble sakte blandet med pelleten og blandingen holdt uforstyrret i 5 minutter. Pelleten ble så brudt opp i store skiver, og den endelige cellesuspensjon plassert i T75-kolber (2,5 ml pr. kolbe) hvori 7,5 ml HT-medium var blitt plassert tidligere. Den resulterende, cellesuspensjon ble inkubert ved 37°C for

å dyrke de fusjonerte cellene. Etter 245 timer ble 10 ml HT-medium tilblandet kolbene, etterfulgt 6 timer senere av tilblanding av 0,3 ml 0,04 mM aminopterin. 48 timer etter fusjon ble 10 ml HAT-medium (hypoxanthin/aminopterin/thymi-din) tilblandet i kolbene.

Tre dager etter fusjonen ble levedyktige celler platet ut i 96-brønners vevkulturplater ved ca. 2 x 10 4 levedyktige celler pr. brønn (totalt 7 68 brønner) i HAT-buffer-medium som beskrevet i Rennett et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 81:77 (1978). Cellene ble tilført HAT-medium 7 dager etter fusjonen og deretter tilført HT-medium ved omtrent 4-5 dagers mellomrom etter behov. Veksten ble fulgt mikroskopisk og kultursupernatanter ble samlet opp ca. 2 uker senere, og analysert med hensyn på tilstedevær-else av HDL-spesifikt antistoff ved hjelp av fastfase-radioimmunologisk analyse (RIA) hovedsakelig som beskrevet i Curtiss og Edgington J. Biol. Chem., 257: 15213-15221

(1982).

I korte trekk ble 50 yl PBS inneholdende 5 yg/ml Apo AI/HDL tilsatt i brønnene i mikrotiterplater. Platene ble holdt over natten (ca. 16 timer) ved 4°C for å la Apo AI/ HDL feste seg til brønnveggene. Etter vasking av brønnene fire ganger med SPRIA-buffer (2,68 mM KC1, 1,47 mM KH2P04, 137 mM NaCl, 8,03 mM Na2HP04, 0,05% Tween<®->20, 0,1 KIU/ml

'Traysol" , 0,1% BSA, 0,015% NaN^) ble 200 yl SPRIA-buffer inneholdende 3% normalt geitserum (NGS) og 3% bovint serum-albumin (BSA) tilsatt til hver brønn for å blokkere overskudd av proteinbindende seter. Platene ble holdt i 30 minutter ved 20°C, brønnene ble tømt ved rysting og tørket ved hjelp av trekkpapir, hvorved det ble dannet en fast

bærer, dvs. en fast matriks som Apo AI/HDL ble festet effek-tivt til.

Til hver brønn ble det så tilsatt 50 yl hybridomvev-kultursupernatant, hvorved det ble dannet en immunologisk reaksjonsblanding med fast og flytende fase. Blandingen ble holdt i 2 timer ved 37°C for å la dannelse av immunologiske reaksjonsprodukter i fast fase skje. Etter vasking av brønn-125

ene som tidligere beskrevet, ble 50 yl I-merket geit-anti-mus-IgG tilsatt ved 0,25 yg protein pr. ml til hver brønn, hvorved det ble dannet en markør-reaksjonsblanding. Denne blandingen ble holdt i 1 time ved 37°C for å la

125

dannelse av I-merkede immunologxske reaksjonsprodukter x fast fase skje. Etter vasking av brønnene som tidligere be-125

skrevet ble mengden av I-merket produkt bundet til hver brønn bestemt ved hjelp av gamma-scintillasjon.

Hybridom AI-16 ble valgt ut blant ca. 16 hybridomkul-turer som skilte ut anti-HDL-antistoffer i dyrkningsmediene sine. Hybridom AI-16 ble bestemt til å ha en IgG~ z a tung immunoglobulinkjede og ble viderekarakterisertsom her beskrevet .

3. Rensing av et monoklonalt antistoffpreparat

Ascites-væsker ble erholdt fra 10 uker gamle Balb/c-mus som var blitt forbehandlet med 0,3 ml mineralolje og injisert intraperitonealt med 5 x 10^ hybridomceller. Den gjennomsnittlige tid for utvikling av ascites var 9 dager. Etter klaring ved sentrifugering ved 15.000 x g i 15 minutter ved 23°C ble ascitesvæsker produsert ved hjelp av hybridom H135D3 slått sammen og lagret nedfryst ved -20°C.

Renset AI-16 monoklonalt antistoff fra hvert av fem hybridomer ble fremstilt ved hjelp av hurtig protein-væskekromatografi (FPLC) under anvendelse av en Pharmacia Mono Q HR5/5 anionbytterkolonne under anvendelse av en O - 0,5 mol (M) NaCl-gradient i 10 mM Tris, pH 8,0, idet retningslinjer som fulgte med kolonnen ble fulgt. Rensede Mab-er ble opp-konsentrert under anvendelse av en Amicon omrørt ultra-filtreringscelle (PM 30 membran) til en konsentrasjon på

1 mg/ml, dialysert til PBS (fosfatbufret saltoppløsning,

pH 7,2) og lagret ved -70°C.

4. Radiojodering

Radiojodering av HDL, Apo AI og immunokjemisk renset geit-anti-mus-Ig ble utført enzymatisk under benyttelse av "Enzymo-bead"-joderingsfremgangsmåten og "Enzymobeads". "Enzymobeads"-jodering ble benyttet til å karakterisere antigenene og anti-stoffene for fastfase-radioimmunoanalysen som omtalt nedenfor .

5. Apo AI- cyanbromid- fragment- spesifisitet

Apo AI-CNBr-fragment-spesifisiteten til MAB AI-16 ble bestemt ved hjelp av "Western blot"-analyse ifølge fremgangsmåten til Curtiss et al., Proceeding of the Workshop on Lipo-protein Heterogeneity, red. av Lippel, NIH Publication nr. 87-2646, sider 363-377 (1987). I korte trekk ble CNBr-fragmentering utført på isolert Apo AI oppløst i 90% maur-syre. CNBr ble tilsatt i et 13.000 molart overskudd og reak-sjonsblandingen holdt ca. 15 timer ved ca. 20°C. Etter lyo-filisering ble de resulterende CNBr-fragmenter oppløselig-gjort i 1% SDS, 0,01 m Tris, pH 8,2, og underkastet iso-elektrisk fokusering i 6% polyacrylamidplategeler inneholdende 8 M urea og 2% ampholin (pH 4 - pH 6) som beskrevet av Curtiss et al., J. Biol. Chem., 260: 2982-93 (1985). Elek-troforetisk separerte proteiner ble overført til nitrocellulose for immunologisk reaksjon med MAB AI-16. Fremstilling av immunologiske reaksjonsprodukter ble påvist ved hjelp av radiojodert geit-anti-mus-Ig etterfulgt av autoradio-grafi .

Resultatene av disse undersøkelsene indikerer at MAB AI-16 ikke reagerer immunologisk med Apo AI-CNBr-fragmentene CNBr2, CNBr3 og CNBr4, men reagerer immunologisk med CNBrl. Det bør også legges merke til at disse resultatene indikerer at MAB AI-16 reagerer immunologisk med isolert Apo AI.

6. MAB AI- 16 immunoreaktivitet

Immunoreaktiviteten til MAB AI-16 for naturlig forekommende Apo AI/HDL, deamidert Apo AI/HDL og forskjellige polypeptider ble undersøkt ved hjelp av en kompetitiv RIA utført på følgende måte: 100 yl PBS (0,15 M NaCl, 0,01 M NaPC>4, pH 7,2) inneholdende 10 yg/ml Apo AI/HDL ble tilsatt brønnene i mikrotiterplater. Platene ble holdt i 1 time ved 20°C på en roterende plattform for å la Apo AI/HDL feste til brønnene og danne faste bærere. Etter avsuging av overskudd væske fra brønnene ble 200 yl blokkeringsoppløsning (3% BSA, 3% NGS i PBS) tilsatt hver brønn og brønnene ble holdt i 30 minutter ved 20°C på en roterende plattform. Deretter ble blokkeringsoppløsningen fjernet ved avsuging og brønnene ble vasket tre ganger med SPRIA-buffer. ■

Til hver brønn ble det så tilsatt først 50 yl PBS inneholdende 3% BSA og forskjellige konsentrasjoner av kon-kurrentantigen, dvs. Apo AI/HDL, eller peptid, og deretter 50 yl MAB AI-16 i form av klarede ascites fortynnet l:l,25xl05 i PBS inneholdende 3% BSA, hvorved det ble dannet kompetitive immunoreaksjonsblandinger. I kontrollbrønner ble enten konkurrerende antigen eller antistoff erstattet med PBS inneholdende 3% BSA.

Immunoreaksjonsblandingene ble holdt ca. 16 timer ved 4°C på en roterende plattform for å la dannelse av fastfase-immunoreaksjonsprodukter skje. Etter vasking av

125

brønnene som tidligere beskrevet, ble 100 yl I-merket

125 geit-anti-mus-Ig ( I-geit-anti-mus-Ig fortynnet til 2 x 10 5 trikloreddiksyre-utfellbare nedbrytninger pr. minutt pr. 100 yl i PBS inneholdende 3% BSA) tilsatt i hver brønn. De derved dannede markør-immunoreaksjonsblandinger ble holdt i 4 timer ved 4°C på en roterende plattform. Deretter ble brønnene vasket med SPRIA som tidligere beskrevet, og

125

mengden av dannet I-merket fastfase-immunoreaksjonsprodukt bestemt.

Evnen til MAB AI-16 når det gjelder å reagere immunologisk med Apo AI/HDL, HDL i friskt plasma og polypeptidene AIl-15, ble sammenlignet ved å bruke hver som en konkurrent i den ovenfor beskrevne RIA. Resultatene av denne under-søkelsen er vist i figur 2. Helningene til de Apo AI/HDL, plasma-HDL og polypeptid AIl-15 logaritmisk transformerte data ble funnet å være -1,96, -2,42 og -2,60. MAB AI-16 ut-viste hovedsakelig identisk affinitet for plasma-HDL og peptid AIl-15, noe som indikerer at ekspresjon av epitopen gjenkjent av MAB AI-16 på plasma-HDL og peptidet er lik,

om ikke identisk. Affiniteten til MAB AI-16 for delipidert Apo AI var imidlertid betydelig mindre, noe som indikerer

at aminoendedelen i Apo AI endres ved delipidering.

For å sammenligne immunoreaktiviteten til MAB AI-16

for polypeptidene vist i tabellene 1 og 2, ble en standard-oppløsning av hver fremstilt ved en konsentrasjon på 10 ug/ml. Femti mikroliter av standarden eller 2-ganger serie-fortynninger av standarden ble brukt som konkurrent i RIA beskrevet i dette eksempel. Resultatene av denne undersøkelse, grafisk illustrert i figur 3, indikerer at peptidene AIl-10 og AIl-15 ikke var i stand til å hemme bindingen av MAB ÅI-

16 til fastfase Apo AI/HDL. Begge peptidene AIl-15 og AIl-

21 var imidlertid gode konkurrenter. Dessuten indikerte helningsanalyse av de logaritmisk transformerte kurver at affiniteten til MAB AI-16 for peptidene AIl-15 og AIl-21 var den samme.

Beskrivelsen ovenfor, inkludert de bestemte utførelses-formene og eksemplene, er ment å være illustrerende for foreliggende oppfinnelse og skal ikke tas som begrensende.

Et stort antall andre variasjoner og modifikasjoner kan ut-føres uten å fjerne seg fra den samme ånd og omfang av foreliggende oppfinnelse.

Claims (15)

1. Apo AI polypeptid, karakterisert ved at det består hovedsakelig av ikke mer enn 40 aminosyrerester og har som en del av sin aminosyrerestsekvens, en sekvens med formelen

2. Polypeptid ifølge krav 1, karakterisert ved at polypeptidet har en aminosyrerestsekvens med en formel valgt fra gruppene bestående av: a) DEPPQSPWDRVKDLA og b) DEPPQSPWDRVKDLATVYVDV.

3. Monoklonalt antistoff, karakterisert ved at det inneholder anti-Apo AI-antistoffmolekyler som reagerer immunologisk med: (a) Apo AI/HDL (b) isolert Apo AI (c) Apo AI CNBrl og (d) polypeptidet DEPPQSPWDRVKDLA, men ikke reagerer immunologisk med: (e) Apo AI CNBr2, (f) Apo AI CNBr3, (g) Apo AI CNBr4, (h) polypeptidet DEPPQSPWDR og (i) polypeptidet QSPWDRVKDLA.

4. Monoklonalt antistoff ifølge krav 3, karakterisert ved at antistoffmolekylene er de som fremstilles av hybridomet med ATCC-betegnelsen HB 9677.

5. Diagnosesystem i settform, karakterisert ved at det omfatter i en mengde som er tilstrekkelig til å utføre minst én analyse, et Apo AI polypeptid med en formel valgt fra gruppen bestående av: (a) DEPPQSPWDRVKDLA og (b) DEPPQSPWDRVKDLATVYVDV.

6. Diagnosesystem ifølge krav 5, karakterisert ved at polypeptidet er operativt bundet til en fast matriks.

7. Diagnosesystem ifølge krav 5, karakterisert ved at det videre 'omfatter, i en mengde som er tilstrekkelig til å utføre minst én analyse, et monoklonalt antistoff inneholdende anti-Apo AI antistoffmolekyler som reagerer immunologisk med: (a) Apo AI/HDL (b) isolert Apo AI (c) Apo AI CNBrl og (d) polypeptidet DEPPQSPWDRVKDLA, men som ikke reagerer immunologisk med: (e) Apo AI CNBr2, (f) Apo AI CNBr3, (g) Apo AI CNBr4, (h) polypeptidet DEPPQSPWDR og (i) polypeptidet QSPWDRVKDLA.

8. Diagnosesystem ifølge krav 7, karakterisert ved at antistoffmolekylene er de som fremstilles av hybridomet med ATCC-betegnelsen HB 9677.

9. Diagnosesystem ifølge krav 7, karakterisert ved at antistoffmolekylene er operativt bundet til et enzym-indikasjonsmiddel.

10. Diagnosesystem i settform, karakterisert ved at det omfatter, i en mengde som er tilstrekkelig til å utføre minst én analyse, et monoklonalt antistoff inneholdende anti-Apo AI anti stoffmolekyler som reagerer immunologisk med: (a) Apo AI/HDL (b) isolert Apo AI (c) Apo AI CNBrl og (d) polypeptidet DEPPQSPWDRVKDLA, men som ikke reagerer immunologisk med: (e) Apo AI CNBr2, (f) Apo AI CNBr3, (g) Apo AI CNBr4, (h) polypeptidet DEPPQSPWDR og (i) polypeptidet QSPWDRVKDLA.

11. Diagnosesystem ifølge krav 10, karakterisert ved at antistoffmolekylene er de som kan fremstilles ved hjelp av hybridomet med ATCC-betegnelsen HB 9677.

12. Diagnosesystem ifølge krav 11, karakterisert ved at antistoffmolekylene er operativt bundet til et enzym-indikasjonsmiddel.

13. Fremgangsmåte for analysering av mengden av Apo AI i i en karvæskeprøve, karakterisert ved følgende trinn: (a) dannelse av en immunoreaksjonsblanding ved å blande en karvæskeprøve med: (i) et anti-Apo AI monoklonalt antistoff fremstilt ved hjelp av hybridomet med ATCC-betegnelsen HB 9677, og (ii) et Apo AI polypeptid valgt fra gruppen bestående av: a) DEPPQSPWDRVKDLA og b) DEPPQSPWDRVKDLATVYVDV, (b) opprettholdelse av immunoreaksjonsblandingen i et tidsrom som er tilstrekkelig til å danne etA po AI-holdig immunoreaksjonsprodukt, og (c) bestemmelse av mengden av produkt dannet i trinn (b), og derved mengden av Apo AI i karvæskeprøven.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at polypeptidet er operativt bundet til en fast matriks, antistoffet er operativt bundet til en enzymmarkør og det dannede produkt i trinn (b) er et merket immunoreaksjonsprodukt.

15. Hybridom, karakterisert ved at det produserer antistoffmolekyler som kan reagere immunologisk med Apo AI/HDL og polypeptidet DEPPQSPWDRVKDLA, og har ATCC-betegnelsen HB 9677.