NO902405L - Vevplasminogenaktivatorderivat, dna-sekvens og ekspresjonsplasmid, samt fremgangsmaate for fremstilling av plasmidet. - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører et nytt t-PA-derivat, en DNA-sekvens som koder for det nye t-PA-derivat, ekspresjons-plasmider som har en DNA-sekvens som koder for t-PA-derivatet, et ekspresjonsplasmid med en DNA-sekvens som koder for t-PA-derivatet, samt en fremgangsmåte for fremstilling av plasmidet, en fremgangsmåte for fremstilling av t-PA-derivatet og et middel for koagulasjonsoppløsning som inneholder t-PA-derivatet .

Koagulert blod inneholder polymert fibrin som hoved-bestanddel i proteinmatriksen. Fibrin oppløses ved hjelp av et fibrinolytisk system under fysiologiske betingelser i en reaksjonskaskade som ligner blodkoagulering. Den sentrale reaksjon er her aktiveringen av plasminogen til plasmin som bevirkes f.eks. ved hjelp av vevplasminogenaktivatoren t-PA (vevtype-plasminogenaktivator). Plasmin oppløser igjen fibrin som er hovedbestanddelen i proteinmatriksen til koagulert blod. Den enzymatiske aktivitet av naturlige t-PA eller t-PA som er utvunnet genteknologisk fra eukaryoter, nemlig den katalytiske aktivering av plasminogen til plasmin, er i fravær av fibrin eller fibrinogenspaltingsprodukter svært liten, men kan imidlertid tydelig øke ved tilstedeværelse av dette proteinet, nemlig med en faktor på mer enn 10.

t-PA spaltes i blod gjennom tilstedeværende proteaser i en A- og en B-kjede. Begge delkjedene bindes over en cystein-bro. Stimulerbarheten av aktiviteten til t-PA er en avgjørende fordel i forhold til andre kjente plasminogenaktivatorer som f.eks. urokinase eller streptokinase (jf. f.eks. M. Hoylaerts et al., J. Biol. Chem., 257 (1982), s. 2912-2919; W. Nieuwen-huizen et al., Biochem. Biophys. Acta, 755 (1983), s. 531-533).

Virkningsmekanismen til t-PA in vivo er eksempelvis beskrevet i Korniger og Coilen, Thromb. Haemostasis, 46 (1981), s. 561-565. Den på fibrinoverflaten fokuserte aktivitet av enzymet får det til å fremstå som et egnet middel for be-kjempelse av patologiske åretilstopninger (f.eks. ved hjerte-infarkt), noe som for den største del kan bekreftes gjennom kliniske forsøk (Coilen et al., Circulation, 70 (1984),

s. 1012; Circulation, 73 (1986), s. 511).

Den hurtige reduksjon i plasmakonsentrasjonen (fjerningshastighet) må imidlertid anses som en ulempe ved t-PA. Følgen av dette er at en forholdsvis stor mengde t-PA er nødvendig for å oppnå en effektiv lysering av tromber in vivo. De høye behandlingsdosene har dessuten bivirkninger, som f.eks. blødninger, til følge.

I EP 0 196 920 er det beskrevet et naturlig nedbrytningsprodukt av t-PA som bare inneholder kringel 2- og proteaseområdene til t-PA og deres N-terminale aminosyre alanin 160, som er aminosyresekvensen beskrevet av Pennica et al., Nature, 301 (1983), s. 214-221. Fjerningshastigheten for dette t-PA-nedbrytningsprodukt er imidlertid ikke vesentlig forskjellig fra fjerningshastigheten til det naturlige t-PA. Først gjennom en kjemisk modifikasjon av det katalytiske område ved plassering av en blokkerende gruppe kan det her oppnås en forbedring.

Formålet ved oppfinnelsen er således å forandre t-PA på en slik måte at det oppståtte derivat oppviser en sterkt redu-sert fjerningshastighet og dermed en forlenget halveringstid i blodplasma. Derved skulle den trombelyserende virkning samt

stimulerbarheten ved hjelp av fibrin oppnås.

Gjenstand for oppfinnelsen er således en vevplasmino-genaktivator (t-PA-derivat, i eksemplene også kalt K1K2P), som er kjennetegnet ved at den ikke er glykosylert og har den følgende aminosyresekvens:

Overraskende ble det fastslått at delesjonen av det øvrige område som er til stede i naturlig forekommende t-PA, ikke har noen innflytelse på den trombolytiske aktivitet av proteinet, og at den fibrinavhengige stimulerbarhet av muteinet er helt lik med den hos naturlig forekommende t-PA.

En ytterligere gjenstand for oppfinnelsen er en DNA-sekvens som koder for t-PA-derivatet ifølge oppfinnelsen, og som inneholder den følgende sekvens:

DNA-sekvensen ifølge oppfinnelsen tjener til ekspresjon av t-PA-derivatet ifølge oppfinnelsen når den foreligger på et ekspresjonsplasmid. Et slikt ekspresjonsplasmid er en ytter- - ligere gjenstand for oppfinnelsen, likeså vel som et ekspresjonsplasmid som har en DNA-sekvens som avviker, men som like-vel koder for t-PA-derivatet ifølge oppfinnelsen. På grunn av den genetiske kodes degenerering er også sekvenser som avviker fra den angitte DNA-sekvens egnet.

Ekspresjonsplasmidet inneholder, foruten en replikasjonsopprinnelse ("origin of replication"), fortrinnsvis ved siden av sekvensen som koder for t-PA-derivatet i tillegg nok en regulerbar promoterstruktur (f.eks. tac-promoter), en effektiv terminator (f.eks. fd), en seleksjonsmarkør (f.eks. p-laktamase-gen).

En ytterligere gjenstand for oppfinnelsen er plasmidet pA33. Fremstillingen av dette plasmidet er beskrevet i eksempel 1; det inneholder en DNA-sekvens som koder for t-PA-derivatet ifølge oppfinnelsen.

Videre er en ytterligere gjenstand for oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av et ekspresjonsplasmid ifølge oppfinnelsen som er kjennetegnet ved at man innfører en DNA-sekvens som koder for t-PA-proteinet ifølge oppfinnelsen eller et derivat derav, som i tillegg til kringel I-, kringel II- og proteaseområdene også oppviser ytterligere områder i t-PA-proteinet i et plasmid og fjerner de områdene som koder for aminosyrer som ikke er til stede i t-PA-derivatene ifølge oppfinnelsen, ved hjelp av styrt mutagenese.

Utvelgelsen av plasmidet, hvor DNA-sekvensen som koder for t-PA-derivatet ifølge oppfinnelsen innføres, er avhengig av vertcellene som senere anvendes til ekspresjon av derivatet. Egnede plasmider samt minimumsbetingelsene som stilles til et slikt plasmid (f.eks. replikasjonsopprinnelse, restrik-sjonsspaltingssted), er kjent for fagmannen. Innenfor opp-finnelsens ramme kan det imidlertid i stedet for plasmid også anvendes et kosmid, den replikative, dobbeltstrengede form av fager (A., M13), og andre vektorer som er kjent for fagmannen. Fremgangsmåten med den styrte mutagenese (stedrettet mutagenese) er beskrevet av Morinaga et al., Biotechnology, 21

(1984), s. 634, og utføres hovedsakelig som der beskrevet.

Videre er en ytterligere gjenstand for oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av et t-PA-derivat ifølge oppfinnelsen som er kjennetegnet ved at man uttrykker et plasmid ifølge oppfinnelsen i egnede vertceller og utvinner produktet fra dyrkingsmediet, eller etter dekomponering av vertcellene, fra væsken hvor dekomponeringen ble gjennomført (f.eks. buffer eller også dyrkingsmediet). Fortrinnsvis anvendes for fremstilling av t-PA-derivatet ifølge oppfinnelsen prokaryote celler som vertceller. Her er det dessuten særlig foretrukket at man først skyller de derved dannede såkalte "inklusjonslegemer" (uoppløselige proteinaggregater) fra de oppløselige cellepartikler, oppløseliggjør de t-PA-holdige inklusjonslegemer ved behandling med guanidin-hydroklorid, derivatiserer dem deretter med oksygenert glutation og til sist renaturerer t-PA-derivatet ved tilsetning av L-arginin og guanidin-hydroklorid. Nøyaktige forskrifter for aktivering av t-PA fra "inklusjonslegemer" er eksempelvis åpenbaret i patentsøknadene EP-A 0 219 874 og EP-A 0 241 022. Hvilke som helst andre frem-gangsmåter for utvinning av det aktive protein fra "inklusjonslegemer" kan imidlertid likeså anvendes ifølge oppfinnelsen.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen gjennomføres fortrinnsvis i nærvær av L-arginin, særlig i en konsentrasjon på 25-1000 mmol/1.

Separasjonen av fremmedprotein ifølge oppfinnelsen ved hjelp av en affinitetskromatografering gjennomføres ved en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen over en ETI (erytrina-trypsin-inhibitor)-adsorpsjonskolonne. ETI er da fiksert på et bærermateriale (adsorpsjonsmiddel), som f.eks. BrCN-"Sepharose". Rensingen over en ETI-adsorpsjonskolonne har den fordel at ETI-adsorpsjonskolonnematerialet kan fylles direkte på den konsentrerte reoksidasjonsblanding til og med i nærvær av så høye argininkonsentrasjoner som 0,8 mol/l arginin. En aggregering av p-t-PA som kan finne sted ved lavere arginin konsentrasjoner under 25 mmol/1, unngås derved. Særlig foretrukket skjer rensingen av p-t-PA-preparatet over en ETI-adsorpsjonskolonne i nærvær av 0,2-1,0 M, fortrinnsvis 0,5-1,0 M, arginin. Den KlK2P-/proholdige oppløsning har fortrinnsvis en pH på mer enn 6,5, særlig foretrukket mer enn 7.

Elueringen av ETI-kolonnen skjer ved hjelp av pH-reduk-sjonen eller av arginin under betingelser som muliggjør en god oppløselighet av t-PA, som uttrykkes i prokaryoter. Fortrinnsvis ligger pH ved elueringen i det sure område, særlig foretrukket i området fra 4 til 6.

Et KlK2P-/propreparat fremstilt ifølge oppfinnelsen har en spesifikk t-PA-aktivitet på > 0,4-IO<6>IU/mg, fortrinnsvis S 0,6-IO<6>IU/mg, idet stimulerbarheten gjennom fibrinogen-spaltingsproduktet (aktivitet i nærvær av fibrinogenpeptider/- aktivitet uten fibrinogenpeptider) er større en 10 ganger, fortrinnsvis større enn 20 ganger. Renheten til preparatet ifølge oppfinnelsen er mer enn 90 % og fortrinnsvis mer enn 95 %, særlig mer enn 98 %.

t-PA-derivatet ifølge oppfinnelsen er således særlig egnet for anvendelse i et legemiddel for koagulasjonsoppløs-ning, som igjen er en ytterligere gjenstand for oppfinnelsen.

Det følgende eksempel belyser oppfinnelsen nærmere i forbindelse med figurene.

Figur 1 viser skjematisk fremstillingen av plasmidet pA33,

figur 2 viser tidsforløpet for t-PA-aktivitet-plasma-konsentrasjon etter intravenøs bolusinfeksjon av kommersielt erholdt t-PA ("Actilyse") sammenlignet med t-PA-derivatet ifø-lge oppfinnelsen i lineær fremstilling, og

figur 3 viser konsentrasjonsforløpet i logaritmisk fremstilling.

Eksempel 1

Konstruksjon av plasmidet pA33

Som utgangsplasmid tjente plasmidet pePa 133, som er beskrevet i EP patentsøknad 0 242 836. Alle forsøkstrinn for spesifikk mutagenese, dvs. for delesjon av områdene F og E fra pePa 133 (se figur 1), ble gjennomført hovedsakelig under anvendelse av fremgangsmåten til Morinaga et al., Biotechnology,

21 (1984), s. 634. Det ble således fremstilt to spaltings-blandinger av pePa 133. Blanding A ble spaltet med EcoRl og det største fragmentet isolert. Blanding B ble spaltet med Xhol og produktet så linearisert. For heterodupleksdannelse ble det følgende oligonukleotid tilsatt:

Ved kolonihybridisering med det ovenfor nevnte muta-geneseoligonukleotid ble det funnet frem til de klonene som inneholdt det søkte plasmid pA33. Dette plasmidet blekarakterisert vedhjelp av restriksjonsanalyse og kontrollert på feilen i Sspl-restriksjonsspaltingsstedet som ligger i den delen av t-PA-ekspresjonskassetten som koder for finger-området.

Eksempel 2

Fremstilling av aktiv KlK2P/ pro fra E. coil

a) Cellelyse og fremstilling av inklusjonsleqemer ( IB- er) 1.6 kg fuktig cellemasse (E. coil, DSM 3689), transformert med plasmidet pA33, ble oppslemmet i 10 1 0,1 mol/l tris-HCl, 20 mmol/1 EDTA, pH 6,5, 4°C. Til dette ble 2,5 g lysozym tilsatt, og det ble inkubert i 30 min ved 4°C; deretter ble fullstendig celleoppslutning gjennomført ved hjelp av høytrykksdispersjon. Til dekomponeringsoppløsningen ble det tilblandet 5 1 0,1 mol/l tris-HCl, 20 mmol/1 EDTA, 6 % "Triton X100" og 1,5 mol/l NaCl, pH 6,5, og det ble inkubert videre i 30 min ved 4°C. Deretter fulgte fraskillelsen av de uoppløse-lige bestanddelene (IB-er) ved sentrifugering.

Pelleten ble oppslemmet i 10 1 0,1 mol/l tris-HCl,

20 mmol/1 EDTA, pH 6,5, det ble inkubert i 30 min ved 4°C og IB-preparat isolert ved påfølgende sentrifugering.

b) Oppløseliqqjøring av IB- er

8.7 g IB-er (våtvekt) ble oppslemmet i 100 ml 0,1 M

tris, 6 M guanidin, 0,1 M DTE, pH 7,5, og det ble omrørt i 30 min ved 25°C.

Etter innstilling av pH-verdien på pH 3 med HC1 (25 %) ble det gjennomført en dialyse mot 4 mol/l guanidin-HCl, pH 2,5 (3x3 1, 24 timer, 4°C).

c) Derivatisering

Det ovenfor nevnte lysat ble innstilt med oksidert

glutation (GSSG) på 50 mmol/1 og med tris på 100 mmol/1, og pH-verdien ble titrert til 7,5 med 5 mol/l NaOH. Blandingen ble inkubert ved 25°C i 90 min. Etter innstilling av pH-verdien på pH 3 med HC1 (25 %) ble det gjennomført en dialyse mot 10 mmol/1 HC1 (3 x 100 1, 48 timer, 4°C).

d) Naturering

En 10-liters reaksjonsbeholder ble fylt med 0,8 mol/l

Arg/HCl, pH 8,5, 1 mmol/1 EDTA, 1 mmol/1 GSH (glutation). Natureringen ble gjennomført ved 20°C gjennom 3-gangers tilsetning av 100 ml av det tidligere mot 6 mol/l guanidin-HCl, pH 2,5, dialyserte derivat ved tidsavstand på 24 timer.

Etter natureringen fikk man et materiale med en spesifikk aktivitet på 50-75 KU/mg (test ifølge H. Lill, Z. Gesamte Inn. Med. Ihre Grenzgeb. (1987), 42, s. 478-486).

e) Konsentrering av renatureringsblandingen

Renatureringsblandingen kan konsentreres etter behov

over en hemodialysator.

Eksempel 3

Rensing av KlK2P/ pro fra E. coli

Rensingen av KlK2P/pro fra E. coil skjedde ved hjelp av affinitetskromatografi på erytrina-trypsin-inhibitor (ETI)-"Sepharose".

Natureringsblandingen ble konsentrert over en hemodialysator ("Asahi AM 300") 1:5, dialysert over natten mot 0,8 mol/l Arg/HCl, pH 7,5, og sentrifugert. En med 0,8 mol/l Arg/HCl, pH 7,5, ekvilibrert ETI-"Sepharose"-kolonne (120 ml) ble påfylt 1,8 1 dialysat (4 kolonnevolumer (SV)/time) og vasket med buffer (0,8 mol/l Arg/HCl, pH 7,5, 0,5 mol/l NaCl) inntil absorpsjonen av eluatet ved 280 nm nådde tomverdien til bufferen. Etter en andre vasking med 5 SV 0,3 mol/l Arg/HCl, pH 7,0, fulgte elueringen med 0,3 mol/l Arg/HCl, pH 4,5.

Eksempel 4

Karakterisering av renset KlK2P/ pro fra E . coli

a) Proteinkjemisk karakterisering - SDS-PAGE og reversfase-HPLC

Homogeniteten av materialet som ble renset ved hjelp av affinitetskromatografi på ETI-"Sepharose", ble bestemt ved hjelp av SDS-PAGE og ved hjelp av reversfase-HPLC (RP-HPLC). Etter elektroforetisk analyse av det rensede materiale ble det beregnet fra den relative forskyvningen for K1K2P fra E. coli en tilsynelatende molekylvekt på 50.800 Da ± 2000 Da. Den densitometriske evaluering gav en renhet på > 90 %.

RP-HPLC er basert på den forskjellige, vekselvirkning av proteiner med hydrofobe matriser. Denne egenskapen ble anvendt som analytisk metode for kvantifisering av renhetsgraden.

Analysen av det rensede KlK2P/pro fra B. coli skjedde over en "Nucleosil 300"-separasjonskolonne ved hjelp av en trifluoreddiksyre-/acetonitrilgradient (buffer A: 1,2 ml trifluoreddiksyre i 1000 ml H20; buffer B: 300 ml H20, 700 ml acetonitril, 1 ml trifluoreddiksyre; 0-100 %. Integrasjonen av den kromatografiske analyse gav en renhet på > 95 %.

- N-endesekvens

N-endeaminosyresekvensen ble bestemt med et "ABI 470" sekvensanalyseapparat med standardprogram og tilkoblet PTH-deteksjon. Den funne sekvens, S1-Y2-Q3-V4-I5-D6-T7-R8-A9-T10-C11-Y12-E13-D14, stemmer overens med den sekvens som var å forvente ut fra den utledede DNA-sekvens.

b) Aktivitetsbestemmelse

In vitro-aktiviteten av KlK2P/pro fra E. coli ble

bestemt ifølge H. Lill, Z. Gesamte Inn. Med. Ihre Grenzgeb.

(1987), 42, s. 478-486. Den spesifikke aktivitet (SA) utgjorde 650.000 IU/mg ± 200.000 IU/mg. Stimulerbarheten av KlK2P/pro fra E. coli ved hjelp av BrCn-fragmenter av fibrinogen (aktivitet i nærvær av fibrinogenfragmenter dividert med aktivitet uten fibrinogenfragmenter) var i dette testsystemet 25-30.

c) In yitro- bindinq til fibrin

In vitro-bindingen av KlK2P/pro til fibrin ble bestemt

etter den av Higgins og Vehar beskrevne fremgangsmåte (Higgins, D.L. og Vehar, G.A. (1987), Biochem., 26, s. 7786-7791) .

Det viste seg da at KlK2P/pro, i motsetning til tPA fra CHO-celler, ikke oppviste noen nevneverdig fibrinbinding.

Eksempel 5

Farmakokinetikk av KlK2P/ pro på kaniner

KlK2P/pro ble med hensyn på farmakokinetiske egenskaper sammenlignet med "Actilyse" på hvite New Zealand-kaniner. Begge fibrinolytika ble injisert intravenøst i en dose på 200.000 IU/kg kroppsvekt (KG) i løpet av 1 min. Plasmaprøver ble tatt ut før og til definerte tidspunkter etter injek-sjonen. t-PA-aktiviteten i plasma ble målt med en spektro-fotometrisk test ifølge J.H. Verheijen et al. (Thromb. Haemostas., 48, s. 266, 1982), modifisert etter H. Lill, Z. Ges. Inn. Med., 42, s. 478, 1987).

For beregning av farmakokinetiske parametrer ble det benyttet et datamaskinprogram med ikke-lineær regresjon, modifisert ifølge H.Y. Huang (Aero-Astronautics Report, 64, Rice University, s. 1-30, 1969). Ved kurvetilpasning ble det indi-viduelt forskjellig satt ned en 1- eller 2-områdemodell. Før beregningen ble hver gang verdien av det kroppsegne grunnspeil trukket fra de etterfølgende verdier.

KlK2P/pro ble eliminert bare hos to av seks dyr med en hurtig a- og en langsom p-fase. Hos disse to dyrene utgjorde a-faseandelen av totalelimineringen 53 %. Derimot oppviste alle dyrene i "Actilyse"-gruppen en hurtig a-fase som utgjorde mer enn 70 % av totalelimineringen. KlK2P/pro ble hovedsakelig eliminert med bare en halvverditid som utgjorde 15,1 ±

3,1 min. "Actilyse" oppviste derimot en hurtig halveringstid på 1,63 min og en langsom halveringstid på 10,1 min (tabell 1). Totalplasmafjerningen av KlK2P/pro utgjorde 6,3 ±

1,5 ml/kg/min og er derved vesentlig lavere enn ved "Actilyse"

(Cltot= 22,9 ± 9,1 ml/kg/min).

Til sammen presenterte KlK2P/pro seg som en t-PA-mutant, som sammenlignet med "Actilyse" som teknikkens stand, oppviste en betydelig forbedret farmakokinetisk profil (figurene 2 og 3).

Eksempel 6

Farmakodvnamikk av KlK2P/ pro på kaniner

For utprøving av den trombolytiske effektivitet ble den av D. Coilen et al. etablerte kaninmodell med jugularvenetrombose anvendt (J. Clin. Invest., 71, s. 368, 1983). Fibrinolytika hhv. oppløsningsmidlet ble injisert som bolus intravenøst i løpet av 1 min. Deretter ble trombolysehastig-heten beregnet og utvalgte parametrer i koagulasjonssysternet, samt trombocyttantallet, bestemt (tabell 2).

Ved like doser (200.000 IU/kg KG) gav KlK2P/pro etter intravenøs bolusinjeksjon en statistisk signifikant høyere trombolyserate på 50,7 ± 6,5 % enn "Actilyse" (24,1 + 3,7 %). Den med hensyn til trombolyseeffektivitet med KlK2P/pro sammenlignbare dose av "Actilyse" utgjorde 800.000 IU/kg KG (tabell 2).

Ved ekvipotent dosering av KlK2P/pro sammenlignet med "Actilyse" fikk man i forhold til oppløsningsmiddelgruppen liten effekt på koagulasjonsparametrene fibrinogen, plasminogen og alfa2-antiplasmin, som imidlertid ikke atskilte seg med hensyn til effekten av en ekvipotent dose av "Actilyse".

KlK2P/pro er således en t-PA-mutant som oppviser en trombolytisk virkning etter bolusinjeksjon ved kaninmodellen med jugularvenetrombose, og som sammenlignet med "Actilyse" er vesentlig forøkt. KlK2P/pro har således fått sin fibrinspesi-fisitet i en utstrekning som også inntreffer for "Actilyse".

Eksempel 7

Optimalisert ekspresjon i E . coli

For økning av ekspresjonsutbyttet ble sekvensen som koder for KlK2P-genet omklonet til et plasmid med høyere kopi-antall. Til dette ble det benyttet det i tysk patentsøknad P 39 31 933.4 beskrevne plasmid pePa 126.1. Dette plasmidet er hovedsakelig sammensatt av vektoren pKK223-3 og den kodende sekvens for t-PA, slik det er beskrevet i patentsøknaden EP-A-0 242 835.

I dette plasmidet ble deretter sekvensen for en fd-terminator integrert. Så ble plasmidet pePa 126.1 linearisert med restriksjonsenzymet Hind III. Det således spaltede plasmid ble gelelektroforetisk separert og utvunnet preparativt. Plasmidet pLBUl (Gentz et al. (1981), PNAS 78(8):4963) ble begrenset med Hind III og et ca. 360 basepar stort Hind III-fragment som inneholdt fd-terminatoren, fremstilt preparativt ved hjelp av gelelektroforese og geleluering. Det lineariserte plasmid pePa 126.1 og det 360 basepar store Hind Ill-fragment fra pLBUl ble ligert. Ligeringsblandingen ble kotransformert med det i tysk patentsøknad P 39 31 933.4 beskrevne plasmid pUBS 500 i E. coli, DSM 2102. Blant klonene ble de utvalgt som inneholdt det ønskede plasmid pePa 126 fd, som atskilte seg fra utgangsplasmidet pePa 126.1 ved at det inneholdt et andre Hind III-spaltingssted.

Fra plasmidet pePa 126 fd ble to fragmenter utvunnet: et 3,4 kb stort BamHI-/PvuI-fragment og et ca. 1,3 kb stort PvuI-/XmaI-fragment. Begge de nevnte fragmenter ble ligert med et ca. 1,6 kb stort BamHI-/XmaI-fragment fra plasmidet pA33 og transformert med plasmidet pUBS 500 i E. coli. Det resul-terende plasmid fikk navnet pA33 fd og kan skjelnes fra pePa 126 fd ved at ved en restriksjonsblanding med EcoRI foreligger det nest minste EcoRI-fragment fra pePa 126 fd med ca. 610 bp 1 lengde, forkortet i pA33 fd med ca. 250 bp.

Claims (15)

1. Vevplasminogenaktivator(t-PA)-derivat, karakterisert ved at det ikke er glykosylert og har den følgende aminosyresekvens:

2. DNA-sekvens, karakterisert ved at den koder for et t-PA-derivat ifølge krav 1 og inneholder den følgende sekvens:

3. Ekspresjonsplasmid, karakterisert ved at det har DNA-sekvensen ifølge krav 2, eller en innenfor rammene av degene-rasjonen til den genetiske kode derfra forskjellig DNA-sekvens som koder for et protein ifølge krav 1.

4. Plasmid pA33.

5. Fremgangsmåte for fremstilling av et ekspresjonsplasmid ifølge et av kravene 3 og 4, karakterisert ved at man innfører en DNA-sekvens som koder for hele t-PA-proteinet eller for et derivat derav, som ut over kringel I-, kringel II- og proteaseområdene oppviser ytterligere områder i t-PA-proteinet, og fjerner de områdene som koder for aminosyrer som ikke foreligger i t-PA-derivatet ifølge krav 1, ved hjelp av styrt mutagenese.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at man som DNA-sekvens for t-PA-proteinet eller et derivat derav anvender den til-svarende c-DNA.

7. Fremgangsmåte for fremstilling av et t-PA-derivat ifølge krav 1, karakterisert ved at man innfører et plasmid ifølge et av kravene 3 og 4 i egnede vertceller og utvinner ekspresjonsprodukter fra dyrkingsmediet eller etter oppslutning av vertcellene.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at det som vertceller anvendes prokaryotceller, særlig E. coli.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at man forø kning av utbyttet av aktivt protein fraskiller dannede "inklusjonslegemer", opplø seliggjø r disse ved behandling med guanidin-hydroklorid, deretter derivatiserer med oksidert glutation og til sist renaturerer t-PA-derivatet ved tilsetning av L-arginin og GSH.

10. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 5-9, karakterisert ved at det til kromato-grafisk rensing anvendes en ETI-adsorpsjonskolonne.

11. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 5-10, karakterisert ved at det arbeides i nærvær av 25-1000 mmol/1 L-arginin.

12. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 5-11, karakterisert ved at den kromatografiske rensing gjennomføres over en ETI-adsorpsjonskolonne med konsentratet av reaktiveringsblandingen som inneholder 25-1000 mmol/1, fortrinnsvis 200-1000 mmol/1, L-arginin.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert ved at det for kromato-grafisk rensing anvendte konsentrat innstilles på en pH-verdi på mer enn 7,0.

14. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 5-13, karakterisert ved at elueringen gjennom-føres ved en pH-verdi på 4-6.

15. Middel for opplø sning av blodkoagulasjoner, karakterisert ved at det inneholder et t-PA-derivat ifølge krav 1.