NO964758L - Anvendelse av von Willebrand-faktor og farmasöytiske preparater - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører et farmasøytisk preparat inneholdende et biologisk aktivt FVIII:C/vWF-kompleks, så vel som en ny anvendelse av et von Willebrand faktorpreparat og et diagnostisk sett for bestemmelse av en defekt ved hemostase hos en pasient.

vWF er til stede i humant plasma i form av en heterogen homomultimer med en molekylvekt fra 450 kD til mer enn 10 000 kD. vWF tjener som et bærerprotein for koaguleringsfaktor VIII og bidrar til adhesjon av blodplater til endotelet i skadede blodårer.

Ved hemofili er blodkoagulasjon forstyrret som følge av en mangel på visse plasmatiske blodkoaguleringsfaktorer. Ved hemofili A skyldes tendensen til blødning mangel på faktor VIII og/eller mangel på vWF. Hemofili A behandles ved erstatning av den manglende koaguleringsfaktor ved hjelp av faktorkonsentrater av oppbevart blod, for eksempel ved hjelp av intravenøs infusjon av faktor VIII, et vWF/faktor VIII-kompleks eller vWF.

Det er flere syndromer som er forbundet med underproduksjonen eller overproduksjon av von Willebrand-faktor. En overproduksjon av vWF fører således for eksempel til en økt tendens til trombose, mens en utilstrekkelig tilføring av vWF resulterer i en økt tendens til blødning eller i forlenget blødningstid.

Von Willebrands syndrom kan manifistere seg på forskjellige måter. Alle former er adskilt ved en forlenget blødningstid som kan forklares med en absolutt mangel på en funksjonell vWF. Mangelen på vWF kan også forårsake en fenotypisk hemofili A, ettersom vWF er en essensiell bestanddel av det funksjonelle faktor VIII-komplekset. I disse tilfeller er halveringstiden til faktor VIII redusert på en slik måte at den ikke kan utføre sine spesifikke funksjoner ved blodkoagulering.

Pasienter med vW-sykdom har en mangel på funksjonelt aktiv vWF som årsak til blødninger. For behandling av vW-sykdom er fremfor alt terapeutiske plasmakonsentrater inneholdende vWF foreslått. vWF opprinnelig fra plasma (pdvWF), har imidlertid en forandret multimerfordeling. Multimerene med høy molekylvekt nedbrytes i løpet av fremstillingsprosessen og dette er trolig grunnen til redusert hemostatisk virkning av plasmakonsentratene. Oppløselige proteaser og/eller proteaser bundet til blodplater eller leukocytter, er antatt primært å være ansvarlige for nedbrytningen av høymolekylære vWF-multimerer (Mannucci et al.

Blood 83, 3018-3027 (1994))

For forebyggelse av problemer forbundet med fremstillingen av pdvWF, er fremstillingen av rekombinant vWF (rvWF) ved hjelp av fermentering av rekombinante celler, allerede foreslått. Fischer et al. (FEBS Letters 351, 345-348

(1994) ) beskriver ekspresjonen av villtype-vWF i CHO-celler. cDNA for vWF er beskrevet i EP 0197592. Den fremstilte rvWF ble undersøkt med hensyn til molekylstrukturen. En gelelektroforeseundersøkelse viste at den multimere struktur til rvWF tilsvarer den ideelle struktur til pdvWF, hvorved den høymolekylære struktur også kunne påvises. Det ble imidlertid funnet at rvWF ikke er separert til triplettstrukturen, noe som er karakteristisk for pdvWF. Denne triplettstruktur omfatter et dominerende hoved bånd og to eller flere satelittbånd som oppstår i et kompleks sammen med det dominerende hovedbåndet av pdvWF.

Fremstilling av rvWF, i stor skala, er beskrevet av Schlokat et al. (Thrombosis og Haemostasis 73, abstr. 993

(1995) ). rvWF fremstilt i CHO-celler ble kromatografisk renset, hvorved ingen reduksjon av spesifikk

ristocetinkofaktoraktivitet oppstod. Bearbeidelsen av forløperproteinet til fullt utviklet rvWF ble oppnådd ved koekspresjon av enzymet furin. Den erholdte

ristocetinkofaktoraktivitet var relativt høy for alle undersøkte kloner, for eksempel 70 enheter pr. enhet vWF-antigen.

Ristocetinkofaktoraktiviteten til vWF bestemmes vanligvis ifølge instruksjonene til Weiss et al. (Journal of Clinical Investigation 52, 2708-2716 (1973)). Derved undersøkes aktiviteten til vWF i form av en kofaktor for den ristocetininduserte aggregering av blodplater.

Denne aktivitet tjener som et mål for effektiviteten av vWF ved behandling av vW-sykdom. Fra Fricke et al.

(Thrombosis og Haemostasis 70, 351-356 (1993)) ble det funnet et meget høyt forhold på 0,92, med hensyn til ristocetinkof aktoraktivitet (RCoF) i forhold til vWF-antigen (vWF:Ag), for faktor VIII og vWF i en plasmastandard fra World Health Organization (WHO).

vWF-preparatene beskrevet på fagområdet, inneholder vWF i proteolytisk nedbrutt form. Av denne grunn er stabiliteten til disse preparater begrenset. Forsøk på å forebygge proteolyse etter tapping av blodprøver, ved tilstedeværelse av egnede inhibitorer, førte dessuten ikke til en vWF med intakt struktur.

Alle vWF-konsentrater som er erholdt ved rensing av proteinet fra humant blodplasma, eller som er separert i forbindelse med biologisk materiale fra pattedyr, har i tillegg potensielt sett risiko for å inneholde patogene molekyler fra plasmadonorer, for eksempel slik som vira.

Et ytterligere problem ved teknikkens stand, er at

vWF-preparater har kort halveringstid med hensyn til vWF etter administrering til en pasient. I denne forbindelse ble også en redusert halveringstid for FVIIIrC påvist. Halveringstiden for eksogent FVIII:C ligger generelt under den til endogent

FVIIIrC, når det gjelder plasmatisk FVIIIrC er denne vanligvis omtrent 10 timer, og når det gjelder rekombinant FVIIIrC er den ikke mer enn ca. 12 timer.

Halveringstiden for et FVIII:C/vWF-konsentrat fra Centre Regional de Transfusion Sanguine de Lille (Frankrike) ligger, ifølge produktbeskrivelsen fra 1992, således på 10 til 14 timer; etter administrering av dette preparat kunne en økning i endogen FVIII:C på utelukkende 1 til 3 enheter pr. milliliter, observeres etter 24 timer. For et annet FVIII:C/vWF-inneholdende preparat (Haemate HS Behring), er halveringstiden angitt som 7 timer ved type 3 vW-sykdom, 12,3 timer ved type 2A og 13,8 timer ved type 1.

Målsettingen med foreliggende oppfinnelse er å utvide indikasjonsspektret for vWF og å oppnå forbedret farmakokinetikk for faktor VIII in vivo.

Problemet er løst ved hjelp av sakens gjenstand ifølge patentkravene.

Det ble overraskende funnet at FVIII:C in vivo kan være særlig godt stabilisert, og stabilisert på en langtidsvirkende måte når vWF med halveringstid på mer enn 20 timer, fortrinnsvis minst 30 timer, er anvendt. Ikke bare nativ human vWF, men også funksjonelle analoger, derivater, fragmenter og mutanter kan tilveiebringes i form av effektive komponenter. Fortrinnsvis anvendes rekombinant vWF (rvWF) ifølge foreliggende oppfinnelse. Det er dessuten foretrukket å tilveiebringe en vWF-fraksjon i preparatet ifølge den foreliggende oppfinnelse. vWF kan fraksjoneres ved hjelp av kromatografiske rensingsmetoder, særlig ved ionebytte-og/eller affinitetskromatografi, hvorved fraksjoner som fremviser en lang halveringstid og/eller varighet og vedvarende økning av faktor Vlll-nivået in vivo, kan isoleres.

Det er overraskende blitt fastslått at FVIII:C stabiliseres, ikke bare ved administrering av vWF med forlenget halveringstid, men også at FVIII:C induseres endogent på en vedvarende måte. Induksjonen av endogentFVIIIrC spiller fremfor alt en rolle når organismen ikke bør utsettes for eksogent FVIIIrC. Når det gjelder en vW-sykdom er en mangel på FVIIIrC ofte funnet samtidig, selv om pasienten ikke lider av hemofili A (pseudo-hemofili). Av denne grunn vil administrerig av FVIIIrC ikke være absolutt nødvendig dersom tilstrekkelig endogent FVIIIrC produseres ved administreringen av vWF.

Én type av pseudohemofili er kjennetegnet ved mutasjoner i vWF-molekylet, i området mellom 1 og 272, som influerer negativt på bindingen av FVIIIrC. For eksempel når det gjelder vWF Normandi, er en punktmutasjon ansvarlig for fraværet av bindingskapasitet for FVIIIrC.

Som følge av dette er en vWF med en forlenget halveringstid egnet for anvendelse ifølge foreliggende oppfinnelse, til en human pasient med medfødt eller ervervet mangel på funksjonell vWF. I henhold til foreliggende oppfinnelse behandles spesifikt følgende sykdommer og/eller tilstander forårsaket av sykdommene i henhold til klassifiseringen til Sadler et al., Thromb.Haemostasis 74r 161-166 (1995). Alle vWF-sykdommer i tilfellet med mutasjoner i vWF-molekylet, men også vWF-sykdommer av type 1, 2 og 3, som erkarakterisert veden mangel på vWF, er finnes blant disse. Disse sykdommer er innordnet under begrepet funksjonelle vWF-forstyrrelser.

I en særlig utførelsesform behandles sykdomstilstander forbundet med fremkomsten av antistoffer mot vWF og/eller FVIIIrC. En ytterligere foretrukken utførelsesform vedrører behandlingen av en pasient som lider av fenotypisk hemofili A.

Behandlingen kan på den ene side utføres profylaktisk og på den annen side terapeutisk. Et preparat omfattende vWF med en forlenget halveringstid, er spesielt egnet for forebyggende behandling, for eksempel før en mulig skade på pasienten eller før en operasjon som varer i flere timer.

Administreringen av vWF kan derved kombineres med eller uten administrering av FVIIIrC, avhengig av sykdomstypen. Innhold av FVIIIrC i det farmasøytiske preparat er ønskelig, fremfor alt når en akutt blødning skal lindres raskt. Ettersom økningen av endogent FVIIIrC-innhold i blodet til pasienten kun er relevant etter flere timer er en innledningsvis administrering av FVIIIrC sammen med vWF foretrukket.

Tilveiebringelsen av et farmasøytisk preparat omfattende FVIIIrC og vWF for anvendelse ifølge foreliggende oppfinnelse, har fordelen av at FVIIIrC ikke bare er stabilisert in vivo, men også in vitro. Kombineringen med FVIIIrC i form av et nativt protein eller et egnet funksjonelt middel,et derivat, en analog eller mutanter er særlig fordelaktig, spesielt i tilfellet av rvWF. Stabiliteten til det anvendte preparat er av betydning, fremfor alt ved infusjon av preparater som kan tilføres i en pasient over en periode på flere timer, uten risiko for forandring av preparatet og behovet for skifte av doseringsplan.

Det er overraskende blitt fastslått at vWF med en forlenget halveringstid betydelig forbedrer de farmakokinetiske egenskaper til FVIIIrC. I henhold til foreliggende oppfinnelse kan således et preparat også tilveiebringes omfattende biologisk aktivt FVIIIrC/vWF- kompleks, med forbedrede farmakokinetiske egenskaper, slik som en høy in vivo gjenvinning (gjenvinning eller biologisk tilgjengelighet) og/eller en økt halveringstid in vivo med hensyn til FVIIIrC, skyldes fremfor alt innholdet av vWF med en forlenget halveringstid. FVIIIrC/vWF-preparatet ifølge foreliggende oppfinnelse utviser generelt en biologisk halveringstid for FVIIIrC på mer enn 13 timer, spesielt mer enn 17 timer, hvorved halveringstider på mer enn 25 timer er mulig. In vivo-gjenvinningen av preparatet ifølge foreliggende oppfinnelse, er vanligvis i et område fra 90 til 100 % i plasma.

FVIIIrC-økningen etter administrering av vWF med økt halveringstid kan indusere opp til 6 enheter pr. milliliter eller mer, mens det kan bekreftes i kontrollerte eksperimenter at bare 3 enheter pr. milliliter ble erholdt ved administrering av Haemate HS Behring i dyreforsøk.

For anvendelsen ifølge den foreliggende oppfinnelse, er den fullt utviklede form av vWF, som i stor grad prosesseres proteolytisk, fremfor alt egnet. Fortrinnsvis anvendes rvWF, som prosesseres proteolytisk minst 80 %, mest foretrukket mer enn 90 opp til 100 %, ved kontakt med en protease, for eksempel som furin eller en protease av subtilisintypen.

I henhold til foreliggende oppfinnelse administreres vWF på en måte og i en konsentrasjon slik at FVIIIrC stabiliseres in vivo over en periode på minst 48 timer, fortrinnsvis mer enn 72 timer. FVIIIrC-innholdet in vivo anses som stabilt når minst 0,1, fortrinnsvis mer enn 0,3 enheter pr. milliliter blod oppbevares til tross for eliminering av endogent og/eller eksogent FVIIIrC. Dette minimale innhold av FVIIIrC garanterer en minimal beskyttelse av pasienten mot uønskede blødninger.

I overensstemmelse med den langtids- og vedvarende virkning av vWF in vivo, kan den innledende dose reduseres slik at det farmasøytiske preparat ifølge foreliggende oppfinnelse kan administreres til en pasient uten bivirkningsreaksjoner, slik som trombosedannelse, trombocyttaktivering eller trombocytopeni.

Preparatet kan administreres flere ganger,

hvorved større intervaller er mulig som følge av den lange halveringstid av vWF, for eksempel intervaller på mer enn 12 timer, fortrinnsvis ca. 24 timer (daglig administrering). Den effektive vWF-mengde i det farmasøytiske preparatet anvendt ifølge foreliggende oppfinnelse, leder fortrinnsvis til en konsentrasjon av vWF på mer enn 2 enheter/ml blod i løpet av en tidsperiode på mer enn 24 timer, fortrinnsvis mer enn 48 timer, for eksempel målt som et antigen med en egnet ELISA. Dessuten bør den effektive mengde av vWF normalisere blødningskarakteristikaen, det vil si at blødningsintensiteten bør klart reduseres og blødning bør stoppes i løpet av så kort tid som mulig etter en skade, særlig i løpet av mindre enn 15 minutter, fortrinnsvis mindre enn 10 minutter.

For å forebygge overføringen av mulig tilstedeværende vira, må det passes på at det fortrinnsvis anvendes farmasøytiske preparater som er behandlet for inaktivering eller utvinning av vira.

For inaktivering av vira er en varmebehandling i løsning og/eller i fast tilstand, som på en pålitelig måte kan inaktivere vira med lipidkappe, såvel som uten lipidkappe, særlig egnet. Preparatet ifølge foreliggende oppfinnelse varmebehandles for eksempel ifølge EP 0159311 i en fast, fuktig tilstand. Andre fremgangsmåter for virusinaktivering omfatter også behandling med detergenter eller kaotrope stoffer, slik som i henhold til EP 0519901, WO 94/13329, DE 4434538, EP 0131740 og WO 90/15613.

vWF anvendes fortrinnsvis i form av et meget rent protein erholdt ved hjelp av en kromatografisk rensingsprosess. Den kromatografiske rensing utføres særlig ved hjelp av ionebyttekromatografi og/eller

affinitetskromatografi. Materialer for anionutbytting kan anvendes for dette formål, blant disse er syntetiske bærermaterialer eller bærere basert på karbohydrater med ligander, slik som DEAE-, TMAE-, QAE, Q- eller aminoalkylgrupper, og/eller bærere med immobiliserte stoffer som har en spesifikk affinitet for vWF. Egnede affinitetsmaterialer inneholder for eksempel heparin. Denne renselsesprosess er fremfor alt egnet for isolering av rvWF i

stor skala. Man bør være oppmerksom på det faktum at vWF i preparatet ifølge foreliggende oppfinnelse, har en tilstrekkelig motstandsdyktighet mot proteolytisk nedbryning, slik at tilsetning av vanlige stabilisatorer kan unngås. I særlige tilfeller kan imidlertid en egnet proteaseinhibitor også tilsettes i løpet av fremstillingsprosessen, for å oppnå den intakte struktur. For ytterligere støtte av stabiliteten til vWF kan det farmasøytiske preparat inneholde en polyalkylenglykol, slik som PEG eller polypropylenglykol eller glyserol, i en konsentrasjon der vWF ikke utfelles og som er farmasøytisk akseptabel.

Fremstillingen av preparatet anvendt ifølge foreliggende oppfinnelse, kan utføres på en kjent og alminnelig måte, for eksempel ved hjelp av salter og, eventuelt aminosyrer, men også ved tilstedeværelsen av tensider. Fortrinnsvis anvendes salter, for eksempel slik som natriumklorid eller kalsiumklorid, og en pH i området 6-8 velges. Glysin eller lysin er foretrukket som aminosyrer. En farmasøytisk akseptabel buffer kan likeledes velges. Som følge av den høye stabilitet til vWF, kan anvendelsen av stabilisatorer, som bærerproteiner eller inhibitorer, vanligvis unngås i preparatet.

Fortrinnsvis anvendes en rvWF i et preparat, som har multimerbånd i fravær av satelittbånd ved

elektroforeseanalyser. Dette tilsvarer strukturen til vWF, i form av et ikke-fragmentert, det vil si intakt protein. Fortrinnsvis har rvWF i det farmasøytiske preparat det fulle spektrum av multimerer, lignende den native multimerfordeling, særlig de til vWF med høy molekylvekt.

Et ytterligere foretrukket preparat inneholder imidlertid en vWF-fraksjon særlig bestående av vWF med lav molekylvekt. Det har vist seg at vWF med en slik lav molekylvekt, som ikke inneholder det fullstendige spektrum av multimerer, er relevant i preparatet ifølge foreliggende oppfinnelse. En vWF-fraksjon satt sammen av dekamerer og mindre oligomerer, særlig en blanding av di- til heksamerer, er foretrukket. En slik vWF-fraksjon kan erholdes ved fraksjonering av en vWF-inneholdende løsning etter molekylvekten og/eller affiniteten til ulike kromatografiske

I

mterialer, hvorved separeringen av vWF med lav molekylvekt er mulig.

vWF-fraksjonen med lav molekylvekt i henhold til EP 0705846, erholdes for eksempel ved affinitetskromatografi av rvWF ved anvendelse av immobilisert heparin. Likeledes er det mulig å anvende funksjonelle mangelfulle multimerer i henhold til produktet med lav molekylvekt til Wagner et 1., The Journal of Cell Biology 101, 112-120 (1985).

Fordelen med vWF-fraksjonen med en molekylvekt lavere enn 5 mil. dalton, fortrinnsvis lavere enn 3 mil. dalton, inneholdt i preparatet ifølge foreliggende oppfinnelse, består i stabiliseringen av faktor VIII in vivo, hovedsakelig uten influering på blodplateaggregering og, derved på hemostatiske og/eller tromboseprosesser. Et slikt preparat er særlig egnet for vedvarende stabilisering av faktor VIII in vivo hos en pasient som ikke burde belastes med ytterligere vWF-aktivitet og blodplateaggregeringsaktivitet. I en spesielt foretrukken utførelsesform anvendes en vWF-fraksjon, som praktisk talt ikke har noen blodplatebindende aktivitet, tilsvarende et forhold lavere enn 5 enheter ristocetinkofaktor aktivitet pr. 100 enheter antigen, fortrinnsvis lavere enn 3 enheter pr. 100 enheter.

Det har blitt vist at for eksempel rvWF-fraksjonen med lav molekylvekt induserte et faktor Vlll-nivå som var to ganger større enn nivået i en hund som manglet vWF, der virkningen var vedvarende i løpet av en periode på minst 48 timer. Samtidig var det ingen forandring i vWF-plasmaaktiviteten.

I henhold til en foretrukken utførelsesform, erholdes rvWF i en form som opprettholder multimermønstret med en enhetlig ("singulet") struktur etter administrering til et pattedyr. En proteolytisk dekomponering av det enhetlige ("singulet") til satelittbånd er derved fraværende.

Den foretrukne konsentrasjon av vWF i den administreringsklare løsning er i området fra 1 til 100 enheter/ml. Som følge av preparatets høye renhet kan dette også utarbeides i konsentrasjoner på opp til 1000 U/ml. Aktiviteten karakteriseres ved ristoctin-mediert blodplateaggregering og gis i form av ristocetinkof aktoraktivitet (RCoF) (for dette, se Journal of Clinical Investigation 52, 2708-2716, 1973). Den vanlige dose av vWF ligger i området fra 40 til 80 RCoF enheter/kg i intervaller på 6-48 timer. Som en innledende dose kan en forhøyet dose opp til 200 RCoF også velges.

I en særlig utførelsesform inneholder det anvendte farmasøytisk preparat ifølge foreliggende oppfinnelse, vWF som eneste viktige bestanddel. Derved omfatter i hovedsak dette preparat høyrenset vWF.

For fremstilling av de farmasøytiske preparater kan vWF renses fra plasma eller en plasmafraksjon, hvorved den samtidige anriking eller uttømming av FVIII:C er egnet, avhengig av formålet. Dersom man går ut fra en cellekultursupernatant, kan vWF også renses og konsentreres ved tilstedeværelse eller fravær av FVIII:C. I dette tilfelle kan enten FVIII:C tilsettes til cellekulturmediet og/eller uttrykkes samtidig fra cellene.

Ifølge den foreliggende oppfinnelse er et diagnostisk sett for bestemmelse av en fenotypisk hemofili A, ytterligere tilveiebragt, som omfatter

a) vWF i en farmasøytisk akseptabel form og

b) et middel for bestemmelse av FVIII:C-aktiviteten i en

blodprøve fra pasienten.

Fortrinnsvis anvendes vWF med forlenget halveringstid, særlig vWF med en halveringstid på mer enn 20 timer. rvWF er særlig egnet til dette formål ettersom denne kan tilveiebringes fritt for FVIII:C-aktivitet. Hos en human-pasient med fenotypisk hemofili A forårsaker administrering av et humant vWF-preparat økning av endogent FVIII:C-innhold. Denne økning er mer signifikant dersom vWF stabilisererFVIII:C in vivo ifølge foreliggende oppfinnelse. Når pasienten imidlertid lider av en hemostasesvikt forårsaket av en mangel på FVIII:C, slik som hemofili A, eller i tilfellet hvor pasienten har antistoffer mot FVIII:C, noe som forårsaker en mangel på funksjonelt aktivt FVIII:C, er økningen av endogent FVIII:C fraværende. Derved kan vWF med den forlengede halveringstid anvendes for fremstillingen av et diagnostisk preparat som muliggjør differensieringen mellom en vW-sykdom og en vW-sykdom med en samtidig inntreden av en genomdefekt med effekten av en mangel på FVIII:C, særlig hemofili A.

Midlet omfatter fortrinnsvis et reagens som inneholder en aktivator for blodkoagulering og et middel for påvisning av blodkoagulering.

Midlet for bestemmelse av FVIII:C-aktivitet er enten et middel for påvisning av blodkoaguleringsaktivitet, hvorved blodkoaguleringstiden måles (førstetrinns-analyse eller andretrinns-analyse), eller en kromogen test og/eller en test for påvisning av aktive blodkoaguleringsenzymer, som virker avhengig av FVIII:C-aktiviteten i en prøven. En kromogen test for bestemmelsen av FVIII:C-aktivitet i en plasma- eller serumprøve utføres fortrinnsvis i henhold til EP 0496723. Som et kromogent substrat anvendes et substrat for faktor Xa i dette tilfelle.

Det er imidlertid også mulig å bestemme FVIII:C-aktiviteten ved hjelp av en aPTT (aktivert partiell tromboplastintid) ved anvendelse av faktor VIII-manglende plasma. aPTT er et eksempel på en test som induserer aktiveringen av koagulering med en egnet aktivator, hvorved nivået av blodkoagulering påvises med et egnet middel. Nivået av blodkoagulering kan for eksempel påvises ved registrering av koaguleringstid (endepunktsbestemmelse) eller kinetikk ved blodkoagulering.

Foreliggende oppfinnelse er nærmere beskrevet ved de følgende eksempler, som ikke begrenser oppfinnelsen.

Figurer

Figur 1

Forløp av koaguleringsparametrene hos en von Willebrand-manglende gris etter behandling med vWF-preparatet ifølge foreliggende oppfinnelse.

Figur 2

Forløp av koaguleringsparametrene hos en von Willebrand-manglende gris etter behandling med et plasmatisk vWF/FVIII konsentrat.

Figur 3

Behandlingsskjerna for en von Willebrandfaktor-immunuttømt mus.

Figur 4

Blødningskarakteristika til von Willebrand-faktormanglende mus, etter behandling med plasmatisk von Willebrand-faktor og preparatet ifølge foreliggende oppfinnelse, h<y>er med 100 U/RCoF/kg kroppsvekt; sammenlignet med normale mus og ubehandlede von Willebrand-faktormanglende immunuttømte mus.

Figur 5

Behandlingsskjema for en von Willebrand-faktor immunuttømt mus fra eksempel 6.

Figur 6

Blødningsadferd hos von Willebrand-faktormanglende, immunuttømte mus etter behandling med rekombinant von Willebrand-faktor og rekombinant faktor VIII, sammenlignet med normale mus og ubehandlede von Willebrand-faktormanglende immunuttømte mus.

Figur 7

Virkning av LMW-rvWF hos en vWF-manglende hund

Eksempel 1

Fremstilling av en rekombinant von Willebrand-faktor fra CHO-celler

En CHO-celleklon produserende rekombinant von Willebrand-faktor ble fremstilt som beskrevet i Fischer et al. FEBS. Lett. 351:345-348, 1994. Cellelinjen bringes til koekspresjon av humant furin ved hjelp av transfeksjon med en vektor kodende for humant furin-cDNA (van den Ouweland et al., Nucleic Acids Res. 18:664, 1990). Stabile cellekloner av denne type ble fermentert på mikrobærere i perfusjonsreaktorer i stor skala (Bluml et al., i Spier RE, Griffith JB, Berthold W, Eds. Animal cell technology, Oxford, London: Butterworth-Heinemann, 1994:267-269).

Rensingen ble utført ved en totrinns kromatografisk fremgangsmåte ifølge Thromb. Haemost. 73:1160, 1995. Fraksjonen som ble utskilt ved eluering med

natriumkloridløsning ble isolert og rebufret ved gelfiltrering over Sephadex G25 (Pharmacia) i en buffer inneholdende 5 g/ml Na3/sitrat • 2H20, 2 g/l NaCl, 5 g/l glysin, 5 g/l L-lysin- HC1 og 0,62 g/l CaCl2-2H20, pH 7,0. Preparatet blekarakterisertved hjelp av et von Willebrand-faktorantigeninnhold på 36,4 U/ml, målt med en vanlig von Willebrand-faktor ELISA (Boeringer Mannheim) og ved en von Willebrand-faktoraktivitet på 13,8 U/ml, målt ved hjelp av ristocetinformidlet blodplateaggregering (Evans et al., Brit. J. Haematol. 37:289-294, 1977).

Eksempel 2

In vivo-aktivitet av og farmakokinetikk til rekombinant von Willebrand-faktor i en homozygot von Willebrand-faktormanglende gris sammenlignet med von Willebrand-faktor fra gris

For forsøket ble von Willebrand-manglende dyr anvendt, for eksempel slik som von Willebrand-homozygotmanglende griser som beskrevet av Roussi et al., Brit. J. Haematol. 90:661-668, 1995. En fire måneder gammel, 37 kg, hunngris, homozygot med hensyn til von Willebrand-mangel, ble anvendt i denne testen. Denne blekarakterisertved en blødningstid på over 30 minutter, målt i henhold til øreblødningsmetoden til Samama et al., Thromb. Haemostas. 71:663-669, 1994, og et von Willebrand-faktorplasmanivå under påvisningsnivået bestemt ved hjelp av antigen-ELISA, så vel som ved ristocetin-kofaktoraktiviteten. Faktor VIII-aktiviteten målt til ca. 1 U/ml, målt i form av human faktor VIII i førstetrinns-koaguleringsanalysen (Immuno), andretrinns-koaguleringsanalysen (Immuno) eller kromogen faktor VIII-analysen (Immunokrom FVIII;C, Immuno).

Et preparat ifølge foreliggende oppfinnelse, som ble erholdt som beskrevet i eksempel 1, ble injisert i en dose på 34 RCoF U/kg kroppsvekt inn i grisen under narkose. Umiddelbart før innføringen så vel som 30 min, 1, 2, 3, 6, 9, 12, 24 og 32 timer etter tilføring, ble blodprøver tatt, sitrert plasma ble fremstilt derfra og von Willebrand-faktorantigen, ristocetin-kofaktoraktivitet og faktor VIII, ble bestemt fra disse prøver ifølge de tre ovennevnte testmetoder. Resultatene er vist i Fig. 1. Det ble vist at etter ca. 24 timer, på et tidspunkt der ristocetinkof aktoraktivitet av det injiserte preparat ikke lenger var påviselig ex vivo, oppstod en vedvarende 5 ganger økning av faktor VIII i plasmanivået. For vWF-antigenet ble en biologisk halveringstid på 32,4 timer beregnet.

Som en kontroll ble et plasmatisk von Willebrand-faktorpreparat fra gris gitt i en dose på 45 RCoF U/kg kroppsvekt til den samme gris umiddelbart etter at den siste blodprøve ble tatt. Etter tilsetningen av preparatet ifølge den foreliggende oppfinnelse, ble blodprøver tatt 30 minutter, 1, 2, 3, 6, 9, 12, 24 og 32 timer etter tilføring, plasma ble fremstilt fra disse og de korresponderende faktor VIII/von Willebrand-faktorspesifikke koaguleringsparametre ble bestemt. Det ble vist at en induksjon av faktor VIII også skjedde her, som imidlertid kun oppnådde en to gangers verdiøkning i forhold til utgangsverdien etter ca. 10 timer og også avtok igjen raskere. Den plasmatiske von Willebrand-faktor fra gris viste en halveringstid på ca. 10 timer. Som en makroskopisk parameter for normaliseringen av det forstyrrede koaguleringssystem i det mangelende dyr, ble en blødningstid bestemt som kunne rettes fra 30 minutter før infusjon av von Willebrand-faktor til ca. 13 minutter etter infusjon, hvorved denne effekt også var påviselig 32 timer etter tilføringen. Tilføringen av plasmatisk von Willebrand-faktor ledet likeledes til en korrigering av blødningstiden til ca. 15 minutter, mens blødningstiden allerede tilsvarte utgangsverdien 24 timer etter tilføringen av plasmatisk von Willebrand-faktorpreparat, dvs. ingen reduksjon kunne oppnås.

Eksempel 3

Farmakokinetikk til multimerene av rekombinant von Willebrand-faktor i gris

Fra plasmaprøvene fra testen i eksempel 2, ble strukturen til von Willebrand-faktormultimerene bestemt ved hjelp av SDS-agaroseelektroforese i en 2 % agarosegel ifølge fremgangsmåten til Ruggeri et al., Blood 57:1140-1143. Von Willebrand-faktormultimerene ble derved gjort synlige ved hjelp av en immunoenzymatisk farging i henhold til Aihara et al., Thromb. Haemostas. 55:263-267, 1986. Som et primært antistoff ble et anti-von Willebrand-faktorantiserum fra kanin (Dakopatts, Glostrup, Danmark) anvendt i en fortynning på 1:5000. Alkalisk fosfatase-konjugert affinitetsrenset geite-anti-kanin-IgGH+L-antistoff (Axell, Accurate Chemical and Scientific Corp., NY) i en fortynning på 1:1000 tjente som et sekundært antistoff. Fargingen av proteinbåndene oppsto ved hjelp av nitroblått-tetrazoliumklorid-bromindolylfosfatsubstratsystemet.

Før behandling med preparatet ifølge foreliggende oppfinnelse kunne det ikke påvises noen von Willebrand-faktor hos grisen. Etter administrering av preparatet ble det påvist en atypisk struktur for den native tilstand av et multimert mønster omfattende enheter ("singulets"), som kan spores tilbake til en ikke-proteolytisk nedbrutt von Willebrand-faktor. Denne strukturelle egenskap forble uforandret i løpet av hele observasjonstidsperioden, dvs. det skjedde ingen proteolytisk nedbrytning av preparatet. Preparatet ble imidlertid suksessivt eliminert fra blodomløpet i overenstemmelse med farmakokinetikken. Multimerer i form av den laveste molekylvekt forble påvisbare opp til 32 timer etter innsprøyting av preparatet.

Eksempel 4

In vivo-aktivitet og farmakokinetikk til et plasmatisk von Willebrand/faktor Vlll-konsentrat i en homozygot vonWillebrand-faktormanglende gris

Analogt til eksempel 2 ble humant plasmatisk FVIII/vWF-konséntrat, HAEMATE HS 1000 (Fa. Behring), gitt i en dose på 34 RCoF U/kg kroppsvekt til en 91 kg, homozygot, vWF-manglende hunngris. Dette preparat er et faktor VIII- og von Willebrand-faktor-inneholdende konsentrat. Tilsvarende ble en dose på 17 IU FVIII/kg kroppsvekt administrert til grisen, sammen med administrasjonen av von Willebrand-faktoren. Umiddelbart før tilføring såvel som 30 minutter, 1, 2, 3, 6, 9, 12, 24 og 32 timer etter tilføringen ble blodprøver tatt, sitrert plasma ble fremstilt og von Willebrand-faktorantigen, ristocetinkofaktoraktivitet og faktor VIII ble bestemt fra disse prøver i henhold til testmetodene beskrevet i eksempel 2. Resultatene er angitt i Fig. 2. Det ble vist at ca. 12 timer etter tilføringen av preparatet, på et tidspunkt der et målbart plasmanivå av von Willebrandfaktor-ristocetinkofaktoraktivitet fortsatt var målbar, ble FVIII-plasmakonsentrasjonen økt 2,8 ganger. Ved ekstern overføring av faktor VIII økte FVlII-nivået umiddelbart etter tilføringen med omtrent 0,4 U/ml plasma. Dette tilsvarer en teoretisk gjennvinningsgrad på 94 % av den injiserte faktor VIII.

For vWF-antigen ble en biologisk halveringstid på 7,5 timer bestemt. Dermed ble det vist en klart kortere biologisk halveringstid for human plasmatisk von Willebrand-faktor, sammenlignet med den rekombinante von Willebrand-faktor i eksempel 2.

Multimerstrukturen til von Willebrand-faktor i griseplasmaprøven ble analysert tilsvarende som i eksempel 3. Den raskere eliminering fra blodomløpet enn av den rekombinante von Willebrand-faktor kunne også påvises her og kunne sammenlignes med antigenkonsentrasjonene gitt i Fig. 2. Preparatet oppviste triplettstrukturen som er vanlig for von Willebrand-faktor, som kan tilskrives en proteolytisk nedbrytning.

Eksempel 5

Sammenligning av in vivo-aktivitet av et plasmatisk vonWillebrand-faktor/faktor Vlll-konsentrat og en rekombinant vonWillebrand-faktor i en temporær von Willebrand-faktormanglende mus

Hunn- NMRI-mus (ca. 20-30 g) ble anvendt og bedøvet ved administrering av 65 mg/kg pentobarbital. Dernest ble blødningskarakteristikaene bestemt med en modifisert metode i henhold til Novak et al., Brit. J. Haemotol. 69:371-378, 1988 ved en nærmere bestemt skade i haletuppen. Blodet som kom frem fra den arteria-venøse skade i haletuppen, ble samlet på filtere (Pipetman P5000 beskyttelsesfilter, Gilson) på en slik måte at blodet kunne dryppe direkte på filteret uten å trekkes opp av kapillærkrefter i filteret, for å forebygge ødeleggelse av en klump av størknet blod som var under dannelse. Filterenhetene ble byttet hvert annet minutt og blodet som kom frem ble samlet i fraksjoner. Blodoppsamlingen ble utført i løpet av 16 minutter. Deretter ble såret etset dersom blødningen ikke hadde stoppet. Bekreftelsen av blødningskarakteristikaene foregikk ved ekstraksjon av det samlede blod i fraksjoner på filtrene, hver med 5 ml 0,4 % ammoniumhydroksidløsning i løpet av 5 timer. Derved ble erytrocyttene som ble samlet med blodet i filteret lysert. Hemoglobinet ble ekstrahert ved en 10 minutters ultrasonisk behandling (Sonorex RK100, Bandelin Electronic, Berlin) og kvantitativt bestemt fotometrisk ved 416 mm mot en kalibreringskurve. En slik kurve kan estimeres ved pipettering av museblodvolumer mellom 10 pl og 1 ml på det andre filter, ekstrahering av disse som beskrevet ovenfor og fotometrisk påvisning av tilsvarende hemoglobin ved 416 nm. Følgelig kan lineære kalibreringskurver opptegnes, som tillater en direkte overføring av hemoglobinkonsentrasjonen til mengden av blod pr. filter. Blødningskarakteristika ble bestemt ved ytterligere plotting av individuelle blodfraksjoner mot tid.Blødningsstrømningen hos en frisk mus blekarakterisertunder disse betingelser, ved at intet ytterligere blod kom ut fra den unaturlig påførte skade i løpet av en observasjonsperiode mellom 6 minutter og slutten av testen, dvs. at blødningen allerede stoppet tidligere. I den grafiske fremstillingen skiller en kurve av denne type seg ut ved sin parallellitet til x-aksen (se Fig. 4).

Så forbehandles musen med en anti-von Willebrand-faktorinhibitor i en dose på 10 ml/kg kroppsvekt. Plasmaet med anti-von Willebrand-faktorinhibitor ble oppnådd ved immunisering av en 1,5 år gammel geit på ca. 50 kg med et von Willebrand-faktorpreparat som følger: 1 g kryopresipitat ble løst i en 35 ml tris/lysinbufret NaCl-løsning (85 mM). Proteiner fra protrombinkomplekset ble fjernet ved adsorpsjon på A10H3og BaS04. I denne forbindelse ble oppløsningen som inneholdt von Willebrand-faktor/faktor VIII inkubert med 0,1 vekt% A10H3i 1 time ved 22 °C.

Dernest ble A10H3-proteinkomplekset separert ved sentrifugering. Den erholdte supernatant ble inkubert ytterligere med 0,1 vekt% BaS04under omrøring og BaS04-proteinkomplekset ble separert på ny ved sentrifugering. Supernatanten ble deretter justert til pH 6,8 og renset ved hjelp av kromatografi over Q-Sepharose FF (Pharmacia). Von Willebrand-faktorkomplekset ble adsorbert til gelen pakket i en kolonne; ikke-bindende proteiner ble fjernet ved vasking med 4 kolonnevolumer av bufferen anvendt i starten. Elueringen av proteinfraksjonen ble utført med en buffer (50 mM Tris/HCl, 500 mM NaCl, pH 6,8). Det erholdte eluat ble fortynnet til en konsentrasjon på 175 mM NaCl med 50 mM Tris/HCl-buffer, pH 6,8, og dernest ytterligere renset ved gelfiltrering på Sepharose CL6B (Pharmacia). Gelfiltreringen ble utført med en lineær strøm på 5,7 cm/h i en kolonne med 26 mm i diameter og en laghøyde på 82 cm. Proteinfraksjonen fra eksklusjonsvolumet ble påvist UV-spektroskopisk ved 280 nm. Proteintoppen av eksklusjonsvolumet ble konsentrert ved ultrafiltrering med et ultrafilter med en tilbakeholdelsesstørrelse på 30000 D. Et von Willebrand-faktor/faktor Vlll-kompleks fremstilt på denne måte hadde en spesifikk aktivitet på 173 ristocetinkofaktor-enheter (U RCoF) vWF/mg protein (bestemt i form av proteinbestemmelse ifølge Bradford, Anal. Biochem. 72:248-254, 1976). Preparatet var fritt for koaguleringsfaktorene II, VII, IX, X, XI og XII.

Mus ble så forbehandlet med anti-von Willebrand-faktorinhibitorplasmaet ifølge skjemaet i Fig. 3. Karakteristikaene ved haletippblødning hos en mus med indusert temporær von Willebrand-mangel av denne type, etter tilføring av fysiologisk natriumkloridløsning, omfatter konstant blødning fra starten av målingsintervallet til slutten av eksperimentet (se Fig. 4). I denne modell av vonWillebrand/Jtirgens-syndrom, ble så et preparat inneholdende plasmatisk von Willebrand-faktor såvel som et preparat ifølge foreliggende oppfinnelse undersøkt med hensyn til deres virkning. I denne forbindelse ble 100 U vWF ristocetinkofaktoraktivitet (RCoF)/kg gitt i begge tilfeller, hver i form av en bolus. Blødningskarakteristikaene er gitt i Fig. 4. Overraskende ble det vist at et von Willebrand-faktorpreparat fremstilt i ifølge eksempel 1 korrigerer blødningskarakteristikaene av von Willebrand-manglende mus til det hos en frisk mus i denne test, mens det plasmatiske von Willebrand-faktorpreparat (IMMUNATE STIM4, Immuno) forårsaker en klar reduksjon i blødningsintensiteten ved den samme dosering, men fører ikke til et opphør av blødning på en slik måte som preparatet ifølge foreliggende oppfinnelse gjør. Etter administrering av det rekombinante von Willebrand-faktorpreparat og bestemmelse av blødningskarakteristikaene ble en blodprøve tatt fra dyrene ved hjertepunktering. Multimersammensetningen av den injiserte vWF ble bestemt ut fra ex vivo plasmaprøver. Det ble vist at den enhetlige ("singulent") struktur også var opprettholdt etter tilføring i løpet av hele målingstidsperioden.

Eksempel 6

Farmasøytisk preparat inneholdende rekombinant vWF/FVIII-kompleks hos en temporær von Willebrand-faktormanglende mus

Hunn-NMRI-mus, ca. 20-30 g, ble behandlet på samme måte som i eksempel 5, med anti vWF-inhibitorplasma som ble erholdt ved immunisering av en geit med en rekombinant vWF. vWF-antiplasmaet resulterende fra immuniseringen, kryssreagerte med muse-vWF in vitro og in vivo. Administrering av anti-vWF-inneholdende anti-plasma i en dose på 10 ml/kg i form av en intravenøs bolusinjeksjon, resulterte i en klar reduksjon av vWF-antigenplasmanivået i musen allerede 1 time etter administrering; FVIII-plasmakonsentrasjonen ble imidlertid først redusert til ca. 50 % av normalverdien i motsetning til en behandling med en anti-vWF-inhibitor fra eksempel 5. Ettersom det anvendte anti-plasma ikke inneholdt antistoffer mot FVIII ble denne virkning en sekundær virkning av vWF-immunuttømming. Når mus ble behandlet med det samme anti-vWF-inhibitorplasma og man holdt seg til en forsinkelse på 24 timer, minsket plasmanivået av vWF til under påvisningsnivået og, som en sekundær virkning av indusert vWF-mangel, ble plasmakonsentrasjonen av FVIII også minsket til mindre enn < 10 av den normale verdi. I denne forbindelse resulterte dette i en signifikant økning av tendensen til blødning, noe som ble målt ved haleblødningskarakteristikaene som i eksempel 5. I grupper med 10 dyr i hver, ble så mus forbehandlet med anti-vWF-anti-plasma på foreliggende måte etter en forsinkelse på 24 timer, enten med buffer som en kontroll eller med rvWF i økende doser på 20, 100, 200 og 400 RCoF U/kg (se behandlingsskjerna, Fig. 5). Likeledes ble mus behandlet med rFVIII (Recombinate, Baxter) i doser på 920 og 1840 U/kg, og mus ble behandlet med et farmasøytisk preparat inneholdende rvWF og rFVIII i doser på 100 vWF RCoF U og 460 FVIII U/kg såvel som 200 vWF RCoF U i kombinasjon med 920 FVIII U/kg. Blødningskarakteristikaene til alle mus sammenlignet med friske mus, ble bestemt som beskrevet i eksempel 5. Resultatene er oppsummert i Fig. 6.

Søylene representerer blødningsintensiteten som ble målt ved haleendeblodstrømningseksperimentene, hvorved blødningsintensiteten ble definert somøkningen i blødningskarakteristikkurvene, slik de er angitt i Fig. 4, i tidsintervaller mellom 6 og 16 min. Rekombinant vWF fører til en klar reduksjon i blødningsintensiteten ved økende doser. I motsetning til det som er beskrevet i eksempel 5, var det imidlertid ingen resulterende normalisering av blødningstilstanden i denne musemodell. Rekombinant FVIII leder likeledes til en klar reduksjon i blødningstilstanden med økende doser, men leder ikke til en fullstendig normalisering av blødningstilstanden. Kun kombinasjonen av rvWF med rFVIII i en dose på 200 vWF RCoF U og 920 FVIII U/kg fører til en fullstendig normalisering av den unormalt økende blødningstilstanden.

Eksempel 7

vWF hos en hund med alvorlig von WiHebrands sykdom

En fraksjon inneholdende rekombinant von Willebrand-faktor med lav molekylvekt (LMW-rvWF) ble erholdt ved kromatografi på immobilisert heparin ifølge EP 0705846. Rekombinant von Willebrand-faktor som beskrevet i Eksempel 1, tjente som et utgangsmateriale. Den resulterende fraksjon av rvWF med lav molekylvekt ble formulert i en buffer inneholdende 5 g/l natriumsitrat • 2H20, 2 g/l NaCl, 5 g/l glysin, 5 g/l 1-lysinhydroklorid, 0,62 g/l kalsiumklorid • 2 H20, pH 7,0. Dette preparat hadde et vWF-antigeninnhold på 200 U/ml og en meget lav vWF-ristocetinkofaktoraktivitet på 3 U/ml. Multimerkarakteriseringen på 2 % agarose SDS-gelelektroforese viste at preparatet hovedsakelig inneholdt di-, tetra- og heksamerer av vWF-monomerene.

En vWF-manglende hunnhund med en kroppsvekt på 9 kg, et vWF-plasmaantigen under påvisningsgrensen og en faktor VIH-plasmaaktivitet på 50 % av den normale verdi, ble bedøvet og tilført von Willebrand-faktorpreparatet med lav molekylvekt i en dose på 450 U/kg kroppsvekt ekvivalent med 45 mg vWF:Ag/kg kroppsvekt. Før tilføring og ved tidspunkter 15 min, 30 minutter, 1, 2, 3, 24 og 48 timer etter tilføring av vWF med den lave molekylvekt, ble plasmaprøver tatt og analysert med hensyn til vWF:Ag, ristocetinkof aktoraktivitet og FVTI IT-aktivitet, målt i totrinns- og kromogenanalysen. Resultatene er vist i Figur 7. Plasmaprøver ble også analysert ved hjelp av agarosegelelektroforese som beskrevet i eksempel 3 og vWF-oligomerene ble overvåket over tid.

vWF-oligomerer ble borte fra blodomløpet idet utgavene med høyere molekylvekt forsvant først. Figur 7 viser at selv om vWF:Ag gradvis ble fjernet fra blodomløpet, økte faktor VIH-aktiviteen og nådde ca. 200 % av utgangsnivået 24 timer etter tilføring, og forble stabil på dette nivå i minst 24 timer, mens vWF:Ag og oligomerer hadde fullstendig forsvunnet fra blodomløpet. Ikke på noen av tidspunktene plasmafraksjoner ble tatt fra dyret, kunne vWF-aktivitet, uttrykt i ristocetin-kofaktorenheter, måles.

Resultatene viste at en vWF som manglet blodplatebindingsaktivitet, hadde muligheten til å stabilisere og indusere plasma FVIH-aktivitet og på denne måte utløse intrinsisk koagulering.

Claims (30)

1. Farmasøytisk preparat for vedvarende økning av nivået av blodkoaguleringsfaktor VIII hos et pattedyr, karakterisert ved at det omfatter von Willebrand-faktor (vWF) og/eller en vWF-fraksjon med en forlenget biologisk halveringstid.

2. Farmasøytisk preparat ifølge krav 1, karakterisert ved at vWF og/eller vWF-fraksjonen har en halveringstid in vivo på mer enn 20 timer.

3. Farmasøytisk preparat ifølge krav 1, karakterisert ved at vWF og/eller vWF-fraksjonen har en multimerstruktur bestående av enheter ("singulets").

4. Farmasøytisk preparat ifølge krav 1, karakterisert ved at vWF og/eller vWF-fraksjonen har det fullstendige spektrum multimerer, lignende den native multimerfordeling, særlig de med høy molekylvekt.

5. Farmasøytisk preparat ifølge krav 1, karakterisert ved at vWF-fraksjonen særlig består av lavmolekylære vWF med en molekylvekt lavere enn 5 millioner dalton, fortrinnsvis lavere enn 3 millioner dalton.

6. Farmasøytisk preparat ifølge krav 1, karakterisert ved at den administreringsklare løsningen inneholder vWF og/eller vWF-fraksjonen i en konsentrasjon i området fra 1 til 1000 U/ml.

7. Farmasøytisk preparat ifølge krav 1, karakterisert ved at vWF og/eller vWF-fraksjonen er kromatografisk renset.

8. Farmasøytisk preparat ifølge krav 1, karakterisert ved at det inneholder rekombinant vWF (rvWF) og/eller en fraksjon av rvWF.

9. Farmasøytisk preparat ifølge krav 1, karakterisert ved at rvWF og/eller rvWF-fraksjonen i det minste er 80 %, fortrinnsvis mer enn 90 til 100 % proteolytisk prosessert som følge av kontakt med en protease.

10. Farmasøytisk preparat ifølge krav 1, karakterisert ved at preparatet i tillegg omfatter FVIIIrC, særlig rekombinant FVIII:C.

11. Farmasøytisk preparat ifølge krav 10, karakterisert ved at vWF og/eller vWF-fraksjonen er i kompleks med faktor VIII.

12. Farmasøytisk preparat ifølge krav 10, karakterisert ved at faktor VIII er biologisk aktiv og er et nativt protein og/eller et funksjonelt middel, en mutant eller et derivat.

13. Farmasøytisk preparat ifølge krav 10, karakterisert ved at FVIII:C har en in vivo halveringstid på mer enn 13 timer, fortrinnsvis mer enn 17 timer.

14. Fremgangsmåte for stabilisering av blodkoaguleringsfaktor VIII (FVIIIrC) hos et pattedyr, karakterisert ved at den omfatter administrering av et farmasøytisk preparat ifølge ethvert av kravene 1 til 13 til nevnte pattedyr.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at preparatet er egnet for økning av endogent innhold av FVIIIrC.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at pattedyret er en pasient med medfødt eller ervervet mangel på funksjonell vWF.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at pattedyret er en pasient som lider av funksjonelle vWF-forstyrrelser, særlig von Willebrands sykdom.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at pattedyret er en pasient som har antistoffer mot vWF og/eller FVIIIrC.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at pattedyret er en pasient som lider av fenotypisk hemofili A.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at preparatet administreres gjentatte ganger til pattedyret i intervaller på mer enn 12 timer, fortrinnsvis daglig.

21. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at preparatet administreres i kombinasjon med et FVIIIrC-preparat.

22. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at preparatet er egnet for stabilisering av FVIIIrC-innholdet over en tidsperiode på minst 48 timer.

23. Fremgangsmåte for fremstilling av et preparat for påvisning av fenotypisk hemofili A, karakterisert ved at preparatet fremstilles ved anvendelse av vWF og/eller en vWF-fraksjon.

24. Fremgangsmåte ifølge krav 23, karakterisert ved at preparatet omfatter vWF og/eller en vWF-fraksjon, særlig rvWF, med en halveringstid på minst 20 timer.

25. Fremgangsmåte ifølge kravene 23 eller 24, karakterisert ved at nevnte preparat har evne til å skjelne von Willebrands sykdom fra en sykdom med samtidig tilstedeværelse av en genomdefekt som resulterer i en mangel på FVIII:C, særlig hemofili A.

26. Diagnostisk sett for påvisning av fenotypisk hemofili A, karakterisert ved at det omfatter a) vWF og/eller en vWF-fraksjon i en farmasøytisk akseptabel form og b) et middel for påvisning av FVIII:C-aktivitet i en blodprøve fra en pasient.

27. Diagnostisk sett ifølge krav 26, karakterisert ved at vWF og/eller vWF-fraksjonen ikke har FVIII:C-aktivitet.

28. Diagnostisk sett ifølge krav 26, karakterisert ved at det inneholder vWF og/eller vWF-fraksjonen, særlig rvWF med halveringstid på minst 20 timer.

29. Diagnostisk sett ifølge krav 26, karakterisert ved at midlet for påvisning av FVIII:C-aktivitet omfatter et reagens inneholdende en aktivator av blodkoagulering og et middel for påvisning av blodkoagulering.

30. Diagnostisk sett ifølge krav 26, karakterisert ved at midlet for påvisning av blodkoagulering omfatter et kromogent substrat som er spesifikt for faktor Xa.