PL102506B1 - Sposob otrzymywania bakteryjnej biomasy bialkowej - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania bialkowej biomasy bakteryjnej z metanolu, majacej zas¬ tosowanie w przemysle paszowym jako dodatek do pasz.

Fermentacyjny sposób syntezy bialka przy zastoso¬ waniu odpowiednio wyselekcjonowanych szczepów aero- bowych, prowadzony w roztworach wodnych, zawiera¬ jacych metanol, jako jedyne zródlo wegla i energii oraz inne skladniki wzrostu, jest znany od dawna. Znane do¬ tychczas pozywki o bardzo róznym skladzie ilosciowym i jakosciowym, stosowane do róznych szczepów bakterii, metabolizujacych metanol, pozwalaja jednak uzyskiwac stosunkowo niskie stezenia komórek w plynie hodowla¬ nym.

I tak na przyklad w „Appl. Microbiol." nr 23/72, s. 135—140 opisany jest sposób biosyntezy bialka z meta¬ nolu przy zastosowaniu pozywki, która pozwala na uzys¬ kiwanie stezenia komórek bakterii w granicach 2—3 g/l.

Przy uzyciupozywki,której sklad opisanyjestw„Biotechnol.

Bioeng. nr 11/69, s. 1042—1054 w warunkach niekon¬ trolowanego w czasie doplywu jej skladników, uzyski¬ wano stezenie komórek bakterii okolo 7 g/l.

Zwiekszenie stezenia komórek starano sie uzyskac poprzez stosowanie dozowania pozywki w trakcie hodo¬ wli tak, aby wzajemne proporcje pierwiastków byly nie¬ zmienne. Podstawa do opracowania tego sposobu bylo stwierdzenie, ze najwazniejsze skladniki sa pobierane w stalych proporcjach do szybkosci zuzycia azotu. Z tego wzgledu 1 M NH4OH zastosowano do regulacji pH sro¬ dowiska hodowlanego i jednoczesnie jako czynnik, wy¬ równujacy stezenie azotu. Pozostale skladniki pozywki doprowadzano w odpowiedniej proporcji do azotu, za¬ wartego w jednomolowym NH4OH.

Opisany wyzej sposób nie gwarantuje jednak pozada¬ nych wyników, gdyz uniemozliwia zachowanie warunków chemostatowych i uzyskiwanie wyzszych stezen komórek ze wzgledu na stosunkowo niska zawartosc azotu w IM NH4OH w odniesieniu do objetosci plynu hodowlanego.

Zastosowanie wyzszych stezen amoniaku stwarza pro¬ blem przygotowania roztworu pozostalych soli mineral¬ nych, w odpowiedniej do stezen azotu proporcji, które podczas przygotowania i sterylizacji nie tworzylyby nie¬ rozpuszczalnych i nieprzyswajalnych przez bakterie zwiaz¬ ków chemicznych.

Celem wynalazku jest opracowanie optymalnego skladu pozywki oraz ustalenie warunków prowadzenia biosyn¬ tezy, które pozwolilyby na uzyskiwanie jak najwyzszego stezenia komórek bakterii w plynie hodowlanym, to jest powyzej 18 g/l przy zastosowaniu szczepu bakterii ZB18 J26 Mut-15 nalezacego do rodzaju Pseudomonas, zdepo¬ nowanego w Instytucie Przemyslu Fermentacyjnego.

W sposobie wedlug niniejszego wynalazku hodowle szczepu ZB 18 J26 Mut-15 prowadzi sie w warunkach aerobowych w pozywce cieklej, zawierajacej metanol jako jedyne zródlo wegla oraz nastepujace subsi$nqe nieorganiczne: — 0,25—0,4% — 0,25—0,4% — 0,6—1,0% — 0,06—0,01% — 0,01—0,015% (NH4)2S04 NH4OH (do regul. pH) Na2HP04.12H20 NaH2P04.H20 KC1 102 506X 102 506 MgS04.7H20 — 0,03—0,08% CaCl2.6H20 — 0,01—0,03% FeS04.7H20 — 0,001—0,003% CuS04.5H20 — 0,003—0,005% ZnS04.7H20 — 0,0005—0,001% 5 MnS04.4H20 — 0,0001—0,0004 Na2Mo04.2H20 — 0*000008—0,000012% CoGl2.6H20 — 0,000012—0,000016% H3BO3 — 0,000008—0,000012% Najwieksze stezenie komórek bakterii w opisanym wy- 10 nalazku uzyskuje sie przez dodawanie metanolu i innych skladników podloza podczas hodowli w takich ilosciach, które nie inhibituja wzrostu bakterii w sposób, zapew¬ niajacy najkorzystniejsza wydajnosc komórek z zasto¬ sowanych substratów. Metanol moze byc dodawany 15 w sposób ciagly lub periodyczny do podloza podczas ho¬ dowli. Jednakze ilosc dodawanego metanolu nie moze inhibitowac wzrostu mikroorganizmu.

Zalecane jest, aby stezenie metanolu w pozywce nie przekraczalo 1% (v/v). Doplyw pozostalych-skladników 20 pozywki, uzupelniajacej zawartosc odpowiednich soli nieorganicznych do wymaganego poziomu w sposobie wedlug wynalazku jest zapewniony przez dobranie ste¬ zenia, szybkosci doplywu wodnego roztworu soli i wody amoniakalnej odpowiednio do pozadanej wartosci pH. 25 Po zakonczeniu hodowli, suspensja komórek jest wstep¬ nie zageszczona, wirowana i plukana w celu uzyskania biomasy bakteryjnej, przeznaczonej na cele paszowe.

Sposób wedlug wynalazku wyjasnia blizej przyklad: Przyklad. Naczynie fermentacyjne, stosowane do ho- 30 dowli zapewnia nastepujace warunki: objetosc calkowita 6 litrów objetosc robocza 3 litry ilosc obrotów mieszadla 1500/min. iloscpowietrza 21/l/min. 35 W naczyniu fermentacyjnym przygotowuje sie i wyja¬ lawia 2,8 litrów pozywki o nastepujacym skladzie: (NH^SO, -9,2g Na2HP04.12H20 — 4,7 g NaH2P04.H20 — 0,4g 40 KC1 — 0,02 g MgS04.7H20 — 0,1 g CaCl2.6H20 — 0,06 g FeS04.7H20 — 0,06 g CuS04.5H20 — 0,01g 45 ZnS04.7H20 — 0,002 g MnS04.4H20 — 0,0006 g Na2Mo04.2H20 — 0,2.10-4 g CoCl2.6H20 — 0,3.10-4 g H3B03 — 0,2.10-4g 50 wodauzdatniona — 2800 ml Do wysterylizowanej i ochlodzonej pozywki dodaje sie 8,8 ml metanolu. Inokulum — wyhodowane na wytrzasar¬ ce — o zawartosci komórek okolo 1,5 mg/l dodaje sie w ilosci, równej 4—6% objetosci pozywki. Hodowle pro- 55 wadzi sie z napowietrzaniem i mieszaniem w tempera¬ turze 31 °C, z regulaqa pH w zakresie 6,55±0,05 i przy stezeniu metanolu 0,25%, oraz. z iloscia rozpuszczonego tlenu, przekraczajaca 10% wartosci nasycenia w tej tem^ peraturze. Do automatycznej regulacji pH stosuje sie 60 3 M roztwór amoniaku w ilosci 200 ml. Z ta sama szyb¬ koscia dozuje sie roztwór soli mineralnych o nastepuja¬ cym skladzie: Na2HP04.12H20 — 20,0 g NaH2P04.H20 — 2,0g 65 KC1 MgS04.7H20 CaCl^óH^ FeS04.7H20 CuS04.5H20 ZnS04.7H20 MnS04.4H20 Na2Mo04.2H20 CoCl2.6H20 H3BO3 woda uzdatniona 4 -0,27g — 1,33 g — 0,46g — 0,003 g — 0,10 g — 0,02 g — 7,0.10-3g — 3,0.10-4g — 4,0.10-4g — 3,0.10-4g — 200 ml Sposób przygotowania roztworu mikroelementów po¬ lega na rozpuszczeniu fosforanów w 3 M roztworze NH4OH.

Pozostale skladniki w roztworach wodnych miesza sie w nastepujacej kolejnosci: kwas borny, molibdenian sodu, chlorek kobaltu, siarczan manganu, siarczan cynku, chlo¬ rek potasu, chlorek wapnia, siarczan magnezu. Nastepnie ustala sie pH do wartosci 7,8 i wówczas dodaje sie roz¬ tworu siarczanu miedziowego i siarczanu zelazowego.

Przygotowany roztwór o wartosci pH= 6*5 poddaje sie sterylizacji. Powyzszy sposób gwarantuje uzyskanie roz¬ tworu soli mineralnych w formie rozpuszczalnej.

Po 36 godzinach hodowli otrzymuje sie 20 g suchych komórek w 1 litrze plynu hodowlanego z ogólnie doda¬ nego metanolu w ilosci 20%. Wyhodowane komórki wy¬ dziela sie z plynu hodowlanego metoda wirówkowa. Wy¬ suszone bakterie zawieraja ponad 70% bialka (Nx6525) o nastepujacym skladzie aminokwasowym (g/i00 g su- cnej masy komórek): -5,4 — 4,2 -3,4 -2,9 — 4,7 — 2,2 -2,7 — 0,04 — 1,9 — 5,5 -4,0 — 3,8 — 1,5 — 1,9 alanina walina glicyna izoleucyna leucyna prolina treonina hydroksyprolina fenyloalanina ' kwas glutaminowy kwas asparaginowy lizyna metionina seryna

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób otrzymywania bakteryjnej biomasy bialko¬ wej na drodze hodowli bakterii szczepu ZB 18 J26 Mut-15,. nalezacego do rodzaju Pseudomonas, w plynnej pozyw¬ ce, zawierajacej metanol jako jedyne zródlo wegla i ener¬ gii, znamienny tym, ze stosuje sie pozywke zawiera¬ jaca 0,25—0,4% (NH4)2S02, 0,25—0,4% NH4OH, 0,6— —1,0% Na2HP04.12H20, 0,06—0,1% NaH2P04.H20, 0,01—0,015% KC1, 0,03—0,08% MgS04.7H20, 0,01— —0,03% CaCl2.6H20, 0,001—0,003% FeS04.7H2Or 0,003—0,005% CuS04.5H20, 0,0006—0,001% ZnS04. .7H20, 0,0001^-0,0004% MnS04.4H20, 0,000008— -0,000012% Na2Mo04. 2H20, 0,000012—0,000016% CoCl2.6H20, 0,000008—0,000012% H3B03, przy czym proces prowadzi sie przy pH, ustalonym w granicach 6—8 i temperaturze 25—35 °C, a skladniki mineralne dozuje sie proporqónalnie do azotu, zawartego w trój- molowym roztworze amoniaku, stosowanym do regula— eji pH srodowiska hodowlanego. LZG Z-d 3 zam. 213-79 nakl. 90+20 eg?. Cena 45 zi