PL102636B1 - Sposob wytwarzania bacytracyny do celow paszowych - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania bacy¬ tracyny do celów paszowych metoda mikrobiologiczna.

Bacytracyna jest antybiotykiem polipeptydowym wy¬ twarzanym przez szczepy z rodzaju Bacillus. Antybiotyk ten znalazl szerokie zastosowanie w zywieniu zwierzat jako dodatek do pasz. W medycynie ludzkiej i weterynaryj¬ nej stosowany jest w malym zakresie, przede wszystkim w leczeniu miejscowym. Niewielka ilosc-^bacytracyny do¬ dana do pasz dla drobiu, trzody chlewnej i bydla umozliwia w tym samym czasie przy uzyciu tej samej, a nawet mniej¬ szej ilosci paszy uzyskanie zwiekszonego przyrostu wagi ciala zwierzat.

Znane sa sposoby wytwarzania bacytracyny na drodze fermentacji glebinowej przy uzyciu szczepów Bacillus subtilis i Bacillus licheniformis. Szczepy wykorzystywane w produkqi charakteryzuja sie wysoka zdolnoscia wytwa¬ rzania bacytracyny, lecz wada ich jest tworzenie endospor w czasie biosyntezy antybiotyku oraz wrazliwosc wobec bakteriofagów, które przenikacja przez filtry bakteryjne niszcza komórki drobnoustroju, wytwarzajacego antybio¬ tyk.

W przemysle antybiotycznym wystepuja dwa rodzaje inwazji bakteriofagowej: ostra i chroniczna. Pierwsza wywolywana jest przez bakteriofagi zjadliwe (wirulentne), powodujace gwaltowna lize (rozpuszczenie) komórek szczepur produkcyjnego, wskutek czego nie uzyskuje sie w ogóle antybiotyku w plynie fermentacyjnym. Inwazja chroniczna wywolywana jest przez bakteriofagi lagodne, które niszcza tylko pewna czesc komórek, wytwarzajacych ;antybiotyk, co pociaga za soba znaczne obnizenie wydajnosci procesu biosyntezy antybiotyku. Inwazje bakteriofagowe ostre, a przede wszystkim chroniczne zaklócaja rytm dzia¬ lalnosci produkcyjnej i powoduja duze straty w produkqi antybiotyków, wytwarzanych przez drobnoustroje rodzaju Bacillus (S. G. Bradley: Bacteriophages, their indu stria significance, Progress in Industrial Microbiology, 1968 str. 42).

Powszechnie stosowana metoda otrzymywania prepara¬ tów antybiotyku do celów paszowych polega na suszeniu calej hodowli drobnoustroju w suszarce rozpylowej. W przy¬ padku bacytracyny, która jest wytwarzana przez szczepy z rodzaju Bacillus, preparaty paszowe, otrzymane wyzej wspomniana metoda, zawieraja zywe przetrwalniki (endo- spory) szczepu produkcyjnego. Przetrwalniki bakteryjne odznaczaja sie wyjatkowa opornoscia na czynniki fizyko- -chemiczne. Sa one najbardziej wytrzymalymi na podwyz¬ szona temperature ukladami zywymi, znoszacymi tempera¬ tury powyzej 100°C. W procesie suszenia hodowli bakte¬ ryjnej, zawierajacej bacytracyne, stosuje sie temperatury, które zabijaja formy wegetatywne szczepu produkcyjnego, lecz nie dzialaja lub tylko w nieznacznym stopniu dzialaja na formy cieplooporne (endospory). Zastosowanie podczas suszenia wyzszych temperatur nie jest wskazane ze wzgledu na termolabilnosc biologicznie czynnej substancji. W celu zabicia form przetrwalnych szczepu produkcyjnego, wy¬ stepujacych w produkcie finalnym, zachodzi potrzeba stosowania dodatkowych kosztownych operacji, takich jak np. naswietlanie promieniami y.

Obecnie stwierdzono, ze bacytracyne mozna wytwarzac przy uzyciu szczepów fagoopornych, odznaczajacych sie 102 636102 636 3 wysoka aktywnoscia antybiotyczna i równoczesnie nie¬ zdolnych w ogóle do tworzenia przetrwalników bakteryj¬ nych.

Celem wyizolowania takich mutantów zawiesine szczepu produkcyjnego, otrzymanego sposobem opisanym w opisie patentowym nr 90102, poddaje sie dzialaniu czynników mutagennych, np. promieni UV i nastepnie inkubuje z do¬ datkiem zawiesiny bakteriofaga, wyizolowanego znanymi metodami z hodowli produkcyjnej. Sposród pojedynczych kolonii, wyroslych na podlozu agarowym w miejscach wy¬ stapienia lizy bakterii wrazliwych, wyosabnia sie mutanty o wlasciwosciach wyzej podanych.

Szczepy fagooporne i równoczesnie asporogenne, odzna¬ czaja sie duza zdolnoscia wytwarzania antybiotyku. Asporo- gennosc u tych szczepów jest wynikiem mutacji, polegajacej na wypadnieciu polinukleinowych odcinków genomu, kontrolujacych proces sporulacji. Takie mutacje charakte¬ ryzuja sie miedzy innymi niezdolnoscia do rewersji. Po¬ twierdzily to wyniki setek wysiewów hodowli, ogrzewanych w temperaturze 75 °C w ciagu 15 minut oraz ujemne próby otrzymania rewertantów przy uzyciu róznych czynników mutagennych.

Nieoczekiwana zaleta otrzymanych mutantów jest wytwa¬ rzanie duzych ilosci bacytracyny na prostych i tanich pozywkach. W hodowli kolbowej na trzesawce wydajnosc procesu biosyntezy jest rzedu 500 j/ml bacytracyny.

Zastosowanie w produkcji bacytracyny mutantów fago- opornych, niezdolnych w ogóle do tworzenia, endospor, zapobiega z jednej strony inwazji bakteriofagowej, z drugiej calkowicie eliminuje wystepowanie endospor we wszystkich etapach produkcyjnych. Ulatwia to proces wytwarzania bacytracyny i przyczynia sie do. obnizenia kosztów produk¬ cji. Dalsze korzysci, chociaz niewymierne, zwiazane sa z usunieciem niebezpiecznego zródla zakazen dla innych procesów mikrobiologicznych, prowadzonych równoczesnie w zakladzie produkcyjnym (np. wytwarzanie hormonów, witamin, aminokwasów, antybiotyków) oraz niebezpieczne¬ go rozsiewania sie duzej liczby przetrwalników bakteryjnych tego samego drobnoustroju do naturalnego srodowiska czlowieka.

Glebinowe hodowle szczepu produkcyjnego, nie zawiera¬ jace w ogóle przetrwalników bakteryjnych, sa dogodnym materialem do otrzymywania preparatów bacytracyny do celów paszowych. Za pomoca prostej metody suszenia calej hodowli bakteryjnej, która nie daje scieków i odpadów, otrzymuje sie bez dodatkowych kosztownych operacji pro¬ dukt, nie zawierajacy w ogóle for/n przetrwalnych szczepu produkcyjnego.

Otrzymane przez nas szczepy fagooporne i asporogenne, niezdolne do rewersji, wykazuja stabilnosc pod wzgledem cechy wytwarzania antybiotyku, latwa jest ich hodowla i sa uzyteczne w produkcji bacytracyny. Kilkakrotne pasa- zowanie i przechowywanie hodowli w formie wegetatywnej w temperaturze 2 °—4°C w ciagu kilkunastu dni oraz prze¬ chowywanie w postaci zliofilizowanej nie wywieralo ujem¬ nego wplywu na aktywnosc antybiotyczna i inne wlasci¬ wosci, korzystne dla produkcji. Otrzymane mutanty mozna rozmnazac na podlozu agarowym, zawierajacym rózne zródla azotu, np. pepton, wyciag miesny i inne wyciagi roslinne i zwierzece. Zródlem wegla moga byc cukry proste lub wielocukry. Ponadto podloze agarowe moze zawierac dodatki soli mineralnych i soli kwasów organicznych oraz mikroelementy.

Wedlug wynalazku sposób wytwarzania bacytracyny do celów paszowych prowadzi sie przy uzyciu szczepów fago- 4 opornych i asporogennych, niezdolnych do rewersji, nale¬ zacych do rodzaju Bacillus, na pozywkach plynnych, za¬ wierajacych przyswajalne zródlo wegla i azotu oraz sole mineralne i kwasy organiczne, w temperaturze ponizej 40°C, korzystnie w temperaturze 31 °—35 °C, przy równoczesnym mieszaniu i napowietrzaniu, w czasie potrzebnym do wy¬ tworzenia bacytracyny w hodowli, do której dodaje sie nastepnie substancje stabilizujaca aktywnosc antybiotyczna bacytracyny, taka jak np. siarczan cynkowy, po czym cala hodowle suszy sie w suszarce rozpylowej, otrzymujac preparat bacytracyny do celów paszowych, nie zawierajacy w ogóle endospor szczepu produkcyjnego.

W plynnych pozywkach produkcyjnych jako zródlo azotu stosuje sie odtluszczona make sojowa, wyciagi i hydrolizaty z maki sojowej, make z nasion slonecznikowych, make z orzeszków ziemnych, make rzepakowa, make rybna, drozdze, wyciag namokowy kukurydzy i/lub siarczan amonowy i azotany.

Sposród zródel wegla stosuje sie rozpuszczalne i nie¬ rozpuszczalne weglowodany, np. glukoze techniczna, sacharoze i inne cukry proste lub ich mieszaniny, skrobie, make ziemniaczana lub ich mieszaniny z wymienionymi uprzednio cukrami prostymi. Ponadto pozywki plynne wzbogaca sie róznymi solami mineralnymi, i kwasami organicznymi, takimi jak kwas mlekowy, kwas octowy, kwas glukonowy, oraz mikroelementami.

Wyjsciowym materialem szczepiennym do procesu wy¬ twarzania bacytracyny sa hodowle szczepu produkcyjnego, np. szczepu U 3/F 3, inkubowane w temperaturze 34 °C w ciagu 42 godzin na skosnym agarze lub liofilizaty szczepu, przygotowane w odpowiednich nosnikach, np. mleku od¬ tluszczonym. Pozywke produkcyjna szczepi sie hodowla posiewowa, przygotowana na pozywce plynnej. W zaleznosci od potrzeby objetosc inoculum zwieksza sie, prowadzac dwu- lub wiecej stopniowa hodowle posiewowa. Biosynteze bacytracyny prowadzi sie w pozywkach plynnych w apara¬ turze, powszechnie stosowanej w przemysle fermentacyj¬ nym. 40 Dalsze szczególy, dotyczace sposobu postepowania, znajduja sie w przykladzie, który sluzy do objasnienia, ale nie ogranicza wynalazku.

Przyklad. Stadium posiewowe I. Kolby Erlenmayera 45 o pojemnosci 500 ml, zawierajace po 30 ml pozywki posie- wowej „K" lub pozywki produkcyjnej „P" o skladach nizej podanych, szczepi sie dwudniowa hodowla, zebrana z agaru skosnego szczepu fagoopornego i asporogennego, niezdol¬ nego do rewersji, np. szczepu LK3/F-3 i stawia na trzesawke 50 obrotowa o 240 obr./min. Inkubacja~trwa 18 godzin w tem¬ peraturze 33 °C. Otrzymana w ten sposób hodowla sluzy jako inoculum dla stadium posiewowego II.

Sklad pozywki posiewowej „Kff: maka ziemniaczana drozdze paszowe kwas mlekowy CaC03 KH2P04 (NH4)2S04 MgS04.7H20 MnS04.5H20 woda wodociagowa 2,0% 0,5% 0,9% 0,3% 0,02% 0,2% 0,02% 0,01% do 100 ml102 636 Sterylizacja: 117°C w ciagu 30 minut, pH = 6,7—6,9 po sterylizacji.

Sklad pozywki produkcyjnej „Pfc: odtluszczona maka sojowa 4,8% maka ziemniaczana 2,0% CaC03 0,3% kwas mlekowy 1*1% KH2P04 0,01% MgS04.7H20 0,03% MnS04.5H20 0,01% (NH4)2S04 0,2% woda wodociagowa do 100 ml Sterylizacja: 117°C w ciagu 30 minut, pH = 6,8—7,0 po sterylizacji.

Stadium posiewowe II. Do kolb Erlenmayera o po¬ jemnosci 500 ml, zawierajacych po 30 ml pozywki pro¬ dukcyjnej „Pff lub pozywki posiewowej „K-2" o skladzie nizej podanym, dodaje sie po 0,3 ml hodowli stadium po- siewowego. I Inkubacje prowadzi sie w temperaturze 34 °C na trzesawce obrotowej o 240 obr./min. w ciagu 16 godzin.

Sklad pozywki posiewowej „K-2Cf: maka sojowa odtluszczona 3,0% maka ziemniaczana 2,0% kwas mlekowy - 1>0% CaC03 0,3% KH2P04 0,01% MgS04.7H20 0,03% MnS04.5H20 0,01% (NH4)2S04 0,2% woda wodociagowa do 100 ml Sterylizacja: 117CC w ciagu 30 minut, pH = 6,7—7,0 po sterylizacji.

Stadium produkcyjne. Do kolb Erlenmeyera o pojem¬ nosci 500 ml, zawierajacych po 30 ml pozywki produkcyjnej „P", dodaje sie 0,4 ml hodowli stadium posiewowego II.

Biosynteze bacytracyny prowadzi sie w temperaturze 34 °C na trzesawce obrotowej o 240 obr./min. Po zakonczeniu fermentacji odpowiednio koryguje sie wartosc pH hodowli i dodaje substancji stabilizujacej aktywnosc antybiotyczna bacytracyny, np. ZnS04.7 H20 w takiej ilosci, aby stezenie cynku w preparacie wynosilo 3,5—8,0%, i miesza. Cala hodowle razem z substancja stabilizujaca suszy sie w su¬ szarce rozpylowej, stosujac temperature na wylocie 80— —95 °C. Otrzymany w ten sposób preparat cynk-bacytra- cyny do celów paszowych nie zawiera praktycznie zywych komórek szczepu produkcyjnego.

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania bacytracyny do celów paszo wych 20 nie zawierajacej endospor, przy uzyciu szczepów z rodzaju Bacillus, znamienny tym, ze proces biosyntezy bacytra¬ cyny prowadzi sie przy uzyciu mutantów fagoopornych i asporogennych, niezdolnych do rewersji, na plynnych pozywkach, zawierajacych przyswajalne zródla azotu i we- 25 gla pochodzenia roslinnego i/lub zwierzecego oraz sole mineralne i kwasy organiczne, w temperaturze ponizej 40°C, korzystnie w temperaturze 31—35 °C, przy równo¬ czesnym mieszaniu i napowietrzaniu, w czasie potrzebnym do wytwarzania bacytracyny w hodowli, do której dodaje 30 sie nastepnie substancji stabilizujacej, takiej jak siarczan cynkowy, po czym hodowle suszy sie w suszarce rozpylowej