PL102801B1 - Sposob otrzymywania a-nor-steroidow - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywa¬ nia na drodze mikrobiologicznej 4a-chloro-3|3-hy- droksy-chlorohydryn z szeregu androstanu oraz ich przeksztalcanie chemiczne do A-nor-steroidów.

Znane sa nieliczne mikrobiologiczne metody otrzymywania chlorohydryn steroidowych w piers¬ cieniu A, lecz chlorohydryny te nie stanowia bez¬ posrednich substratów do syntezy A-nor-steroidów.

Jednym ze znanych przykladów jest transformo¬ wanie mikrobiologiczne 4a-chloro-17a-metylo-l,4- -and)rioistaindienHl7(pjOil-a-oinu do chlorohydryny za¬ wierajacej jednakze niezredukowane wiazanie 1,2 (K. Schubert i inni, -Jounnal of Steroid Bioche- mistry t. 1/1970, s. 229), które redukowano dalej chemicznie. Otrzymanego produktu nie próbowano przeksztalcac dalej w kierunku A-nor-steroidów.

Równiez istnieje szereg publikacji, w których omawia sie stereochemie kontrakcji pierscienia zarówno w zwiazkach niesteroidowych (M. Mousse- ron i inni, Comptes rendus t. 246/1958 s. 2200) jak i w steroidach (F. Winternitz i inni, Bulletin de la Societe Chimiaue de France 1960, s. 1460; A. Crates de Paulet i inni, Bulletin de la Societe Chimiaue de France 1960, s. 500). Wsród tych ostatnich opisano kontrakcja w pierscieniu A, pro¬ wadzaca do A-nor-steroidów, lecz z innymi grupa¬ mi funkcyjnymi i w innym ich polozeniu w tym pierscieniu.

W opisanej w sposobie wg wynalazku metodzie zastosowany jest do otrzymywania chlorohydryn nie uzywany dla takich przeksztalcen mikroorga¬ nizm. Powstale w sposobie wg wynalazku w prze¬ ksztalceniu mikrobiologicznym chlorohydryny zo¬ staja bezposrednio poddane kontrakcji pierscienia A metoda chemiczna stosowana dla nich do innych rodzajów reakcji.

Zgodnie z istota wynalazku uzyskane na drodze reakcji mikrobiologicznej ze szczepem z gatunku Rhodotorula mucilaginosa odpowiednio 4a-chloro- -5a-androstan-3»|3-ol-17-on z 4-chlcro-androsten-4-3, 17-dionu i 4 -chloro-androsten-4-17|3-ol-3-onu ogrzewane z me¬ tanolowym roztworem wodorotlenku potasu, na skutek kontrakcji w pierscieniu A, daja wlasciwe A-nor-steroidy.

Oba uzyskane sposobem wedlug wynalazku A-nor-steroidy naleza do grupy zwiazków, które zgodnie z literatura fachowa wykazuja aktywnosc hormonalna w zakresie dzialania androgennego, na- bolicznego lub antyandrogennego.

Sposób otrzymywania A-nor-steroidów wedlug wynalazku uwidoczniono na rysunku w postaci przebiegu transformacji mikrobiologicznej obu sub¬ stratów (1,2) prowadzacy do chlorohydryn (3,4), które w przeksztalceniu z roztworem wodorotlenku potasu daja odpowiednio A-nor-steroidy (5,6).

Sposób wedlug wynalazku dotyczacy etapu tran¬ sformacji mikrobiologicznej polega na wprowadze¬ niu do 3—5 dniowej wodnej kultury szczepu w ga¬ tunku Rhodotorula mucilaginosa 4-chloro-andro- 102 801102 801 sten-4-3, 17-dionu (1) lub 4-chloro-androsten-4-17(3- -ol-3-onu (2). Czynnik transformujacy oba ma¬ terialy wyjsciowe stanowi uklad enzymatyczny za¬ warty w zywych komórkach Rhodotorula mucila- ginósa. ! 5 Wodna kulture szczepu Rhodotorula mucilagino- sa stanowi kulturaf rosnaca na pozywce sporzadzo¬ nej przez rozpuszczenie w 1 litrze wody 20 g wy¬ ciagu slodowego o zawartosci 72°/oi maltozy, 2°/o dekstryn, 4*/o substancji bialkowych, 1%>; soli mine- io ralnych i 18% wody. Sama fermentacje prowadzi sie przez okres 10—20 dni od momentu dodania substratu w temperaturze 22—28°C i przy pH = = 4,5—6,0. Zarówno przygotowanie kultury mikro¬ organizmu jak i nastepujaca po nim fermentacja 15 dodanego substratu przebiega przy wstrzasaniu re¬ agujacych mieszanin. Uzyskana w wyniku fermen¬ tacji mieszanine poddaje sie ekstrakcji produktów chloroformem, a nastepnie rozdziela chromatogra¬ ficznie. 20 W drugim etapie postepowania obie chlorohy- dryny (3) lub (4) poddaje sie kontrakcji w pier¬ scieniu A w warunkach zasadowych otrzymuja: odpowiednio A-nor-steroidy (5) i (6).

W przypadku [przeksztalcania chloirohydryny (3) 25 ogrzewa sie ja z 5°/oj roztworem metanolowym wo¬ dorotlenku potasu i jako glówny produkt otrzy¬ many w wyniku kontrakcji powstaje 3a-formylo- -A-nor-5 Natomiast w drugim przypadku kontrakcja zwia¬ zku (4) poprzedzona jest oddzieleniem poprzez ace- tylacje i chromatografie z mieszaniny fermenta¬ cyjnej materialu wyjsciowego (2). Powstaly w wy¬ niku takiego postepowania octan chlorohydryny (4) ogrzewa sie z 5% roztworem metanolowym wo¬ dorotlenku potasu i w wyniku otrzymuje 3a-for- mylo-A-nor-5a-androstan-17p-ol (6). Budowe otu chlorohydryn (3) jak i oibu A-mor-steroidów (5, 6) udowodniaja jednoznacznie dane spektralne i re¬ akcje chemiczne.

Przyklad I. W dwóch kolbach o pojemnosci 2,1 kazda zawierajacych po 1 1 sterylnej pozywki mal¬ tozowej, otrzymanej przez rozpuszczenie ekstrak¬ tu slodowego o skladzie wyzej podanym zaszcze¬ pia sie opisany szczep Rhodotorula mucilaginosa.

Po 4 dniach wzrostu szczepu przy wstrzasaniu w temperaturze 27°C i przy pH = 5 dodaje sie do kazdej kolby po 110 mg 4-chloro-androsten-4-3,17- -dionu (1) rozpuszczonego w 1*5 ml acetonu. Fer¬ mentacje prowadzi sie przy wstrzasaniu w okresie 14 dni. Roztwór metaboliczny zawierajacy zawie¬ sine zarodników wstrzasa sie dodatkowo przez 1 godzine po dodaniu do kazdej kolby 200 ml me¬ tanolu, a nastepnie polaczona zawartosc obu kolb ekstrahuje sie trzykrotnie chilorofoirmem. Po osu¬ szeniu roztworu siarczanem sodu i odparowaniu rozpuszczalnika uzyskuje sie okolo 220 mg mie¬ szaniny produktów fermentacji. Otrzymana mie¬ szanine chromatografuje sie na zelu krzemionko¬ wym eluentem benzen : metanol 10 :1. Na tej dro¬ dze otrzymuje sie 62 mg materialu wyjsciowego (1), 115 mg chlorohydryny (3) i 39 mg mieszaniny dalszych produktów, wsród kótryich jeden jest chllo- rohydryna (4).

Chlorohydryna (3): 4a-chloro-5cc-androstan-3|3-ol- -17-on: Krystalizuje z acetonu-eteru naftowego tt. & 40 45 50 55 60 189—191°C [a] *° + 64 (CHC13 0,9); JR:vcci4 3595, 1745 cm-1; NMR: ó = 3,80 ppm, Kwintet I = 12 Hz, 16 Hz, 6 Hz 1 proton przy C—3; d = 3,7 ppm, mul¬ tiplet — 1 proton przy C—4; d = 1,2 i 1,21 ppm — (protony na C—18 i C—19), MS: M9e 324.

Otrzymywanie A-nor-steroidu (5). mg chlorohydryny (3) ogrzewa sie przez 10 godzin z 20 ml 5%i roztworu metanolowego KOH pod chlodnica zwrotna. W wyniku reakcji otrzy¬ muje sie produkty, które chromatografuje sie na zelu krzemionkowym (5 g) eluentem benzen : oc¬ tan etylu 10 :1 otrzymuje sie w ten sposób 11 mg (44%; wydajnosci) produktu (5) oraz 9 mg produk¬ tów bardziej polarnych.

A-nor-steroid (5): 3a-formylo-A-nor-5a-andro- stan-17-on: [a] 2^ + 15 (CHCL, 0,5); JR: vccl4 2720, 1740, 1720 cm-1; NMR: ó = 9,5 ppm (proton alde¬ hydowy J = 3 Hz); <5 = 0,8; 0,89 ppm (protony grup metylowych na C—18 i C—19).

Przyklad II. Otrzymywanie octanu chlorhy- dryny (4). Transformacje 550 mg 4-chiloiro-andro- sten-4-17(3-ol-3-onu (2) przeprowadza sie w wa¬ runkach opisanych w przykladzie 1. Po ekstrakcji chloroformem uzyskuje sie mieszanine produktów, która poddaje sie acetylowaniu przez dodanie do niej 5 ml bezwodnika octowego i 7 ml pirydyny.

Powstaje 700 mg produktów acetylowania, które chromatografuje sie na 90 g zelu krzemionkowego eluentem benzen : octan etylu 100 :5. W wyniku chromatografii otrzymuje sie 280 mg mieszaniny zawierajacej dwuoctan chloronydryny (4) i tylko jeden z produktów ubocznych. Dalsza frakcja 330 mg stanowi glównie octan materialu wyjsciowe¬ go (2).

Chlorohydrynie (4) przypisuje sie strukture 4a- -chloro-5cc-androstan-3,|3, 17|3-diolu.

Otrzymywanie A-nor-steroidu (6). 280 mg mie¬ szaniny octanów zawierajacej dwuoctan chloro¬ hydryny (4) ogrzewa sie przez 60 godzin z 30 ml % roztworu metanolowego KOH. Po reakcji pro¬ dukty wytraca sie woda i chromatografuje na 30 g zelu krzemionkowego eluentem Benzen : octan ety¬ lu 10 :1. W wyniku otrzymuje sie 23 mg produk¬ tu (6), 160 mg niezmienionego w reakcji produktu fermentacji i 20 mg produktów bardziej polarnych.

A-nor-steroid (6) 3a->formylo-A-norj5a-andirostan- -17|3-ol; tt. 122—135°C [a] 20+22° (CHCL, 0,9); JR: vcci4 3630> 2720> 1725 cm_1; NMR: 0 = 9,5 ppm, J = 3 Hz (proton aldehydowy); 8 = 3,5 ppm sze¬ rokosc polówkowa multipletu 15 Hz (1 proton przy C—17) d = 0,7 i 0,65 ppm (protony grup metylo¬ wych na C—18 i C—19).

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób otrzymywania A-nor-steroidów znamien¬ ny tym, ze uzyskuje sie z 4-chloro-androstendionu o wzorze 1 i 4-chlorotestosteronu o wzorze 2 na drodze reakcji mikrobiologicznej ze szczepem z gatunku Rhodotorula mucilaginosa odpowiednie chlorohydryny: 4a-chloro-5 o wzorze 3 i 4 wzorze 4, które ogrzewane z metanolowym roz¬ tworem wodorotlenku potasu na skutek kontrakcji w pierscieniu A daja odpowiednio A-nor-steroid o wzorze 5 i A-nor-steroid o wzorze 6.102 801 Cl wz ó r A CL »sór 2 Cl wzór 3 Cl wzór n 0, H wzór ^ HZOI