PL104829B1 - Sposob otrzymywania mutantow produkcyjnych streptomyces erythreus,charakteryzujacych sie zdolnoscia wytwarzania glownie erytromycyny a i opornoscia na dzialanie aktynofagow - Google Patents

Description

Opis patentowy opublikowano: 01.12.1979 i 104829 Int.Cl2. Cl2K 1/02 [CZYTELNIA Ur-edu Patentowego fiknij lummw t| iw.-tJ Twórcywynalazku: Barbara Ostrowska-Krysiak, Zbigniew Ruczaj, Barbara Krawczyk, Leonard Karabin, Lidia Pass, Malgorzata Gurkau-Malecha, Jadwiga Wolf, Marlena Lewandowska, Andrzej Miernik, Danuta Sikora, Anna Sokól, Marek Szymczak, Aleksandra Wdowiak, Ewa Zaluska Uprawniony z patentu: Instytut Przemyslu Farmaceutycznego,Warszawa, Polska; TarchominskieZaklady Farmaceutyczne „Polfa", Warszawa (Polska) Sposób otrzymywania mutantów produkcyjnych streptomyces erythreus, charakteryzujacych sie zdolnoscia wytwarzania glównie erytromycyny A i opornoscia na dzialanie aktynofagów Wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania mutantów produkcyjnych, a w szczególnosci prosi ego sposobu selekcji wysokowydajnych mutantów promieniowca Streptomyces erythreus, charakteryzujacych sie zdolnoscia do wytwarzania glównie erytromycyny A i opornoscia na dzialanie aktynofagów.

Dotychczas stosowane metody selekcji promieniowców producentów antybiotyków uwzgledniaja losowa kontrole populacji po dzialaniu czynników mutagennych. Technika ta jest jednak uciazliwa, poniewaz wymaga kazdorazowego przebadania metoda hodowli podpowierzchniowych, duzej liczby 10l I U4 klonów, dajac szanse uzyskania mutantów, zmienionych tylko pod wzgledem jednej cechy, to jest zdolnosci wytwarzania pozadanego antybiotyku.

Znane udoskonalenia tej metody, a wsród nich Stauffefa J.F. i in. Dcvdop, Ind. Microliiol. 104/1966/, Sermonti G. - Genetics of Antibiotic - producing Microorganisms, Wiley liitejsience, London, /IW)/, Wood rufa H.B. - Genetics of Industral Microorganisms, lst Inteinaiional Symposium 10."!/l€>V0/, DKoliuszko i in., opis patentowy nr 87664, nie pozwalaja jednak na selekcjonowanie w sposób ukierunkowany mutantów o cechach, decydujacych o jednorodnosci otrzymanej substancji oraz równoczesnie odpornych na dzialanie aktynofagów.

Dotychczas stosowane w produkcji erytromycyny mutanty wytwarzaja obok erytromycyny A równiez erytromycyne B i erytromycyne C, które sa produktami poslednimi. Pozbycie sie niepozadanej ciytrornycyny U mozliwe jest na drodze doboru odpowiednich warunków procesu fermentacji, natomiast usuniecie erytromycyny C wymaga interwencji genetycznej u Streptomyces erythreus. Wprawdzie wiadome bylo. ze w przeksztalceniu erytromycyny C do erytromycyny A bierze udzial grupa metylowa, której dawca jest metionina, jednak dotychczas nie stosowano w produkcji erytromycyny mutantów o odpowiednio zmienionym metabolizmie metioniny.

W pracach nad uzyskaniem odpowiednich mutantów, zdolnych do wytwarzania erytromycyny A, nie zanieczyszczonej erytromycyna C, okazalo sie wlasciwe prowadzenie selekcji w kierunku melioninozaleznosei2 104 829 szczepów S.erythreus, a nastepnie uzyskanie mutantów powrotnych, u których w wyniku mutacji supresorowej uzyskuje sie ceche zwiekszonej aktywnosci syntezy metioniny, niewrazliwosci na metionine, a takze zwiekszonej zdolnosci do biosyntezy erytromycyny i zwiekszonej zdolnosci do przeksztalcania erytromycyny C do erytromycyny A.

Wprowadzenie do tych mutantów cechy opornosci na niszczace dzialanie aktynofagów umozliwia stosowanie ich równiez w okresach zagrozen infekcjami wirusowymi, niszczacymi hodowle produkcyjne.

Sposób postepowania wedlug wynalazku obejmuje dobór metod, pozwalajacych na selektywny wybór mutantów do produkcji erytromycyny, charakteryzujacych sie wymienionymi wyzej wlasciwosciami.

W sposobie wedlug wynalazku wyróznia sie etapy przygotowania mutantów w nastepujacej kolejnosci: — indukowanie zmiennosci szczepu przy uzyciu czynników mutagenizujacych, — selekcja wsród mutagenizowanej populacji mutantów metioninozaleznych z blokiem metabolicznym w koncowym stadium biosyntezy aminokwasu, — indukowanie mutaqi powrotnych u metionino-zaleznych szczepów — otrzymywanie rewertantów, — selekcja mutantów fagoopornych, majacych wszystkie wymienione wyzej wlasciwosci lacznie z cecha niewrazliwosci na infekcje fagowa.

Dla kazdego z wymienionych etapów postepowania stosuje sie metody kontrolne, a szczególnie w odniesieniu do wlasciwosci uzyskanych mutantów, dotyczacych zdolnosci przeksztalcania erytromycyny C do erytromycyny A, fagoopornosci i wydajnosci procesu biosyntezy.

Sposobem wedlug wynalazku indukowanie zmiennosci prowadzi sie przez poddanie zawiesiny zarodników szczepu macierzystego S.erythreus dzialaniu mutagenów, np. promieni UV i/lub N'-metylo-nitro-N'-nitrozoguani- dyny i zmutagenizowana zawiesine wysiewa sie na podloze, zawierajace zestaw aminokwasów. Po inkubacji wyrosniete kolonie z plytki replikuje sie na analogiczne podloze, nie zawierajace jedynie metioniny. Technika ta pozwala identyfikowac mutanty metionino-zalezne. Kolonie tych mutantów poddaje sie dalszej kontroli, w tym zdolnosci do biosyntezy erytromycyny, wrazliwosci na metionine i zdolnosci jej wykorzystywania oraz przeksztalcania erytromycyny C do erytromycyny A (TabelaI) Tabela I Selekcja metionino-zaleznych auksotrofów Procent przezycia Liczba kolonii Symbol Liczebnosc po dzialaniu UV metioninozaleznych mutanta wybranego populacji wyjsciowej 1,7X108 5 4 S.erythreus met"1 Wybrany w toku postepowania S.erythreus met"1 wytwarzal erytromycyne w granicach do 60% wydajnosci szczepu macierzystego i charakteryzowal sie efektywnym przeksztalcaniem erytromycyny C do erytromycyny A.

Indukowanie mutacji powrotnych prowadzi sie u wybranych metioninozaleznych szczepów na drodze mutagenizacji j/w, selekcjonujac mutanty zdolne do wzrostu na podlozu pozbawionym metioniny. Wsród mutantów tych wystepuja szczepy o pozadanych wlasciwosciach, tzn. o zwiekszonej, w stosunku do szczepów wyjsciowych, zdolnosci biosyntezy antybiotyku, majace aktywny uklad enzymatyczny, katalizujacy przemiane erytromycyny C do erytromycyny A oraz zdolnosc wykorzystywania metioniny do wspomnianego przeksztalca¬ nia.

Tabele II i III wskazuja na przydatnosc wybranego sposobu selekcji dla uzyskania mutantów o zwiekszonej zdolnosci do biosyntezy i efektywnego przeksztalcania erytromycyn.

Tabela II Selekcja rewertantów szczepu metionino-zaleznego Liczebnosc populacji Procent przezycia Liczba rewertantów szczepu metionino-zaleznego po dzialaniu UV ogólem wybranych 1,5X109 10 47 44 104 829 Szczepy otrzymane sposobem wedlug wynalazku np. o symbolach 12/39 i 7/53 w porównaniu ze szczepami wyjsciowymi wykazuja zwiekszona efektywnosc przeksztalcania erytromycyny C do erytromycyny A.

Tabela VI Szczep efektywnosc w % 575 (szczepwyjsciowy) 30 214 (wysoko wydajny szczep wyjsciowy) 70 12/39(mutant) 100 7/53(mutant) 100 c) metoda kontroli zdolnosci przeksztalcania erytromycyny C do erytromycyny A na podstawie efektyw¬ nosci wlaczania i przeksztalcania radioaktywnego zwiazku. (TabelaVII).

Tabela VII aktynofag Szczep 214 wyjsciowy 7/53 fagooporny SE-1 wrazliwy oporny SE-2 wrazliwy oporny SE-3 wrazliwy oporny SEA wrazliwy oporny SE-5 wrazliwy oporny Wyselekcjonowane i skontrolowane w opisany sposób mutanty S.erythreus ocenia sie pod katem ich przydatnosci do wysokowydajnej biosyntezy erytromycyny w skali laboratoryjnej i w fermentorach doswiadczal¬ nych.

Przyklad I. Otrzymywanie mutantów auksotroficznych metionino-zaleznych.

Z hodowli S.erythreus na podlozu o skladzie: wyciag miesny 1,0 g, wyciag drozdzowy 1,0 g, pankreatycz- ny kazeiny 2,0 g, agar 25,0 g, glukoza 1,0 g, woda destylowana 1,0 litr, o pH=7,5, zebrano zarodniki przy pomocy jalowych perelek szklanych i zawieszono w wodzie tak, aby otrzymac zawiesine o mianie 107.

Zawiesine te naswietlano lampa UV, emitujaca promienie UV o dlugosci 260jum w dawce 5000 agarów/mm2.

Odpowiednie rozcienczenia i naswietlanej i zawiesiny wysiewano na plytki Petriego, zawierajace 20 ml pozywki o skladzie podanym powyzej i plytki inkubowano w temperaturze 30°C przez 6 dni. Wsród kolonii, wyroslych na plytkach, identyfikacje metionino-zaleznych auksotrofów prowadzono, replikujac hodowle z plytek macierzys¬ tych przy uzyciu krazków welwetowych na plytki z podlozem minimalnym, wzbogaconym aminokwasami z pominieciem metioniny. Sklad podloza minimalnego: KH2PO4-l,0g, MgSO4-0,5g, (NH4)2S04—3,5 g, DL—asparagina 1,5 g, glukoza 5,0 g, woda destylowana 1,0 litr, po sterylizacji dodawano sole: NaCl i CaCl2 w ilosci0,1 gna litr oraz mikroelementy, a nastepnie wzbogacano aminokwasami w ilosci po lOOmcg/ml. Po dniach inkubacji replik w temperaturze 30°C identyfikowano kolonie metionino-zaleznych auksotrofów na plytce macierzystej i izolowano je na podloze kompletne.

Szczepy metionino-zalezne kontrolowano pod wzgledem ich zdolnosci do biosyntezy erytromycyny i zdolnosci przeksztalcania erytromycyny C do erytromycyny A.

Przyklad II. Otrzymywanie rewertantów.

Z hodowli S.erythreus met"1 na podlozu kompletnym, jak w przykladzie I, zebrano zarodniki, zawieszono je w jalowej wodzie, otrzymujac zawiesine o gestosci*okolo 107 zarodników/l ml. Zawiesine naswietlano promieniami UV w dawce 5000 ergów/mm2 i wysiewano po 0,1 ml naswietlonej zawiesiny na plytke z podlozem minimalnym. Po 12 dniowej inkubacji na podlozu tym wyrastaly tylko kolonie rewertantów. Kolonie rewertantów izolowano z plytek i kontrolowano pod wzgledem ich zdolnosci do biosyntezy erytromycyny A, szczególnie pod wzgledem ich aktywnosci przeksztalcania erytromycyny C do erytromycyny A. Uzyskane rewertanty o aktywnosci 110—120% aktywnosci szczepu wyjsciowego badano pod wzgledem ich zdolnosci do przeksztalcania erytromycyny C do erytromycyny A: 1) w hodowlach na podlozach wzbogaconych metionina Mutanty (rewertanty) posiewano na sektory plytek z podlozem agarowym kompletnym, odpowiednio zawierajacym a) 10 mM propanolu/1 litr podloza oraz b) 10 mM propanolu i 1 mM metioniny/1 litr podloza.104 829 Tabela III Charakterystyka wybranych rewertantów Wytwarzanie erytromycyny Zdolnosc przeksztalcania Szczep w% erytromycyny C do erytromycyny A Wyjsciowy Metionino-zalezny Rewertanty 100 60 110-120 slaba dobra bardzo dobra Kontrole otrzymanych sposobem wedlug wynalazku mutantów prowadzi sie: a) metoda kontroli klonów w tescie plytkowo-chromatograficznym, przy czym sklad podloza na plytkach jest zróznicowany pod wzgledem zawartosci metioniny jako efektora przeksztalcania erytromycyny C do erytromycyny A. Chromatografia odpowiednio przygotowanych hodowli umozliwia kontrole zdolnosci wykorzy¬ stywania metioniny do wytwarzania czystej erytromycyny A. Testem tym mozna jednorazowo przebadac kilkadziesiat klonów, b) metoda kontroli klonów testem kolbowo-chromatograficznym w hodowlach, wzbogaconych erytromy¬ cyna C, w których chromatograficznie kontroluje sie jej zanikanie. Test ten umozliwia jednorazowo przebadanie kilkunastu szczepów i wybranie takich, które przeksztalcaja erytromycyne C w sposób najbardziej efektywny.

W przebadanych 150 mutantach S.erythreus zdolnosc przeksztalcania erytromycyny C do erytromycyny A byla zróznicowana, a uzyskane wyniki pozwalaja na przedstawienie grup badanych szczepów (tabela IV) Tabela IV Ocena efektywnosci przeksztalcania Liczba szczepów erytromycyny C do erytromycynyA % Calkowite przeksztalcenie fi00%) 36 Czesciowe przeksztalcenie(70%) 17 Slabe przeksztalcenie(30%) 17 Brak przeksztalcenia(0%) 30 Tabela V wskazuje na róznice zawartosci erytromycyny C w hodowli mutantów i szczepu wyjsciowego ocenione w oparciu o ilosc prekursorów radioaktywnych wlaczanych w czasie procesu biosyntezy.

Mutant S.erythreus 214 12/39 7/53 Tab Pole erytromycyn impulsy/min/ml 245276 295388 203145 ela V % 100 100 100 Erytromycyna C impulsy/min/ml .55089 15280 9964 % ,4 4,8 Na podstawie przedstawionych w tabeli V wyników stwierdza sie pieciokrotnie zmniejszenie radioaktyw¬ nosci w erytromycynie C, uzyskanej z hodowli mutantów, w porównaniu z hodowla szczepu wyjsciowego, co swiadczy o zwiekszonej zdolnosci metabolizowania erytromycyny C do erytromycyny A.

Przygotowanie mutantów, majacych wymienione wyzej wlasciwosci oraz wlasciwosc opornosci na aktynofagi, prowadzi sie z uzyciem specyficznego fagalizogenizujacego, który dodany do hodowli wybranego mutanta powoduje po okreslonym okresie inkubacji powstanie klonów, charakteryzujacych sie opornoscia na fagi zjadliwe dla S.erythreus. Znaczny procent uzyskanych w ten sposób mutantów fagoopornych zachowalo uprzednio selekcjonowane wlasciwosci. Korzystnymi wlasciwosciami dla produkcji wyróznial sie szczep o symbolu 7/53.

Fagoopornosc szczepu 7/53 w porównaniu do szczepu wyjsciowego 214 przedstawia tabela VI.104 829 5 Plytki z hodowlami inkubowano 5 dni, a nastepnie wycinano z nich bloczki przy pomocy metalowego wyjalowionego korkobora o srednicy 5,5 mm i wysokosci 2,8 mm, które umieszczono na 20 minut na zbuforowanych paskach bibuly Whatman 42 o szerokosci 8 mm i dlugosci 57 cm w odleglosci 5 cm od konca paska. W ciagu 20 minut wytworzony przez badane szczepy antybiotyk dyfunduje z bloczka agarowego z hodowla do bibuly. Po zdjeciu hodowli paski suszono w temperaturze pokojowej, a nastepnie umieszczono je w szklanej komorze chromatograficznej — Chropa (o ksztalcie walca) z ukladem rozwijajacym (bufor fosforanowy nasycony chloroformem, 1% piperydyny, zobojetnionej do pH = 8,0 lodowatym kwasem octowym (w ten sposób, aby konce pasków znajdowaly sie okolo 2 mm ponizej powierzchni ukladu.

Po 18 godzinach rozwijania paski suszono w temperaturze pokojowej. Wywolywanie chromatogramów przeprowadzano metoda mikrobiologiczna, ukladajac paski na plyte o wymiarach 56 cmX46 cm zakrzeplym podlozem agarowym kompletnym, w którym znajdowaly sie zarodniki szczepu testowego Bacillus subtilis ATCC 6638. Po 18 godzinach inkubacji w temperaturze 33°C identyfikowano strefy zahamowania wzrostu szczepu testowego wobec stref, wywolanych.okreslonymi dawkami preparatów erytromycyny A, B i C.

Porównanie chromatogramów mutantów z podloza a, w którym wytwarzane sa erytromycyny A, B i C oraz z podloza b, w którym u mutantów o pozadanych wlasciwosciach brak jest strefy, odpowiadajacej erytromycynie C, pozwala na wybór mutantów, efektywnie wykorzystujacych metionine do przeksztalcania erytromycyny C do erytromycyny A. 2) W hodowlach na podlozach, wzbogaconych erytromycyna C.

Do kolb Erlenmayera, zawierajacych 30 ml podloza hodowlanego, dodano roztwór jalowy erytromycy¬ ny C w takiej ilosci, aby stezenie koncowe wynosilo 75-100 mcg/ml hodowli, a nastepnie dodano 3 ml 48 godzinnej hodowli posiewowej badanego mutanta S.erythreus i kolby inkubowano na trzesawce w temperatu¬ rze 32°C. W 24 i 48 godzinie hodowli pobierano próby, odwirowano i przesacz nanoszono na paski bibuly chromatograficznej w ilosci IOjuL Po rozwinieciu, chromatogram wywolywano biologicznie ha plytach agaro¬ wych. Strefy zahamowania wzrostu, odpowiadajace erytiomycynie C, mierzono planimetrycznie w znany sposób, okreslajac w procentach zmniejszenie sie lub calkowity zanik plamy, odpowiadajacej erytromycynie C, w porównaniu z próba kontrolna hodowli tego samego mutanta, nie zawierajacej dodanej erytromycyny C.

Dodatkowa kontrole stanowi kolba z podlozem, nie szczepionym hodowla, a zawierajacym identyczna ilosc erytromycyny C, jak w próbie wlasciwej. 3) W hodowlach na podlozach wzbogaconych znakowanym 114 C — propionianem.

Do kolbek Erlenmeyera o pojemnosci 50 ml dodano 5 ml hodowli S.erythreus (badanego mutanta), roztwór propionianu sodu, nieznaczoneeo weglem radioaktywnym, w ilosci takiej, aby stezenie koncowe wynosilo 150jLtgs/rnl hodowli oraz roztwór l-14C—propionianu sodu, w ilosci 10/xCi/ml hodowli i próby inkubowano w wytrzasarce pod wyciagiem. Wlaczenie radioaktywnego propionianu kontrolowano w 0,1, 2,4,6, 8 godzinie inkubacji, pobierajac 1 ml próby i natychmiast oziebiono. Do 1 ml oziebionej próby dodano 1 ml buforu weglanowego o wartosci pH=9,5 i natychmiast próbke poddano dzialaniu ultradzwieków w dezintegrato- rze w ciagu 2 minut (aparat o mocy 100 W). Rozbita hodowle ekstrahowano 2 ml octanu amylu przez wytrzasanie w ciagu 15 minut. Ekstrakty octanowe, zawierajace erytromycyny radioaktywne, po odwirowaniu uzywano do badan chromatograficznych: na zelu krzemionkowym i na bibule.

Na plytki, pokryte zelem krzemionkowym (firmy Merck), nanosi sie ekstrakt octanowy w ilosci 50 /ii.

Plytki rozwija sie w ukladzie rozpuszczalników- chlorek metylu: metanol : benzen: formalina (80 :20 : 20 :40). Chromatogramy wywoluje sie przez spryskiwanie brzegów plytki odczynnikiem do wywoly¬ wania erytromycyn, ogrzewajac strumieniem powietrza tylko spryskane fragmenty plytki. Przez zeskrobanie zelu z plytki, zdejmuje sie lacznie erytromycyny A, B i C i ekstrahuje sie je z zelu metanolem (5 razy po 10 ml).

Eluaty zateza sie do objetosci 1 ml i przeprowadza sie w znany sposób pomiar radioaktywnosci wlaczonej do erytromycyn.

Ekstrakty metanolowe, zawierajace erytromycyny A, B i C, rozdziela sie w znany sposób na poszczególne skladniki metoda chromatografii bibulowej (bibula Whatman W 42, buforowana buforem fosforanowym o pH=8,0) w ukladzie, zawierajacym 0,02 M bufor fosforanowy, wysycony mieszanina chloroform : pirydyna : - kwas octowy (500 :5 :3). Poszczególne erytromycyny lokalizuje sie na paskach w znany sposób metoda radioautografii i metoda biologiczna na plytkach agarowych. Fragmenty pasków, odpowiadajace poszczególnym erytromycynom, wycina sie, umieszcza w naczynkach pomiarowych i przeprowadza pomiar radioaktywnosci w znany sposób.

Przyklad III. Wprowadzanie fagoopornosci do wybranych szczepów rewertantów.

Zawiesina zarodników szczepu rewertanta o symbolu R-ll zaszczepiono pozywke o skladzie: wyciag namokowy kukurydzy 30,0 g, sacharoza 30,0 g (NH4)2S04 4,0 g, CaCO36,0g, olej sojowy 2,0 g, woda destylowana 1 litr, pH naturalne. Po 24 godzinach inkubacji na trzesawce obrotowej o 220 rpm w temperaturze6 104 829 33°C hodowla ta, w ilosci 5%, zaszczepiono pozywke Waltona o skladzie: wyciag miesny 10,0 g glukoza 10,0 g, K2HPO4-0,5 g, woda destylowana 1 litr, pH=7,0, dodajac faga P -121 tak, aby stosunek komórek promieniowca do czastek faga wynosil 10 : 1. Po 30 minutach inkubacji z fagiein hodowle odwirowano, zainfekowane komórki promieniowca przeniesiono do swiezego podloza Waltona i inkubowano przez 6 godzin, a nastepnie odwirowano.

Odwirowane zlizogenizowane komórki promieniowca inkubowano z surowica antyfagowa o mianie 105 (dodajac na 1 ml zawiesiny komórek 1 ml surowicy) w temperaturze 37°C przez 30 minut. Nastepnie odpowiednie rozcienczenie zawiesiny komórek wysiewano na podloze agarowe kompletne i inkubowano przez 7 dni w temperaturze 30°C. Wyrosle klony kontrolowano pod wzgledem fagoopornosci, zdolnosci do biosyntezy erytromycyn i zdolnosci do efektywnej konwersji erytromycyn.

Claims (2)

Zastrzezenia patentowe

1. Sposób otrzymywania mutantów* produkcyjnych Streptomyces erythreus, charakteryzujacych sie zdolnoscia wytwarzania glównie erytromycyny A i opornoscia na dzialanie aktynofagów, znamienny tym, ze szczep produkcyjny poddaje sie dzialaniu mutagenów, selekcjonuje mutanty metioninozalezne z blokiem metabolicznym w koncowych stadiach biosyntezy aminokwasu, nastepnie indukuje u nich mutacje powrotne przez mutagenizacje i selekqe mutantów, zdolnych do wzrostu na podlozu pozbawionym metioniny, po czym do otrzymanych rewertantów wprowadza sie ceche fagoopornosci przez lizogenizacje odpowiednim fagiem i przeprowadza nastepna selekcje.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako wskaznik przydatnosci prowadzi sie hodowle mutantów na podlozach, wzbogaconych metionina, erytromycyna C i znakowanym propionianem. Prac. Poligraf. UP PRL naklad 120 + 18 Cena 45 zl