PL105935B1 - Sposob oznaczania aktywnosci gamma-glutamylotranspeptydazy w materiale biologicznym,zwlaszcza w surowicy krwi - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób oznaczania aktywnosci gamma-glutamylotranspeptydazy (GGT) w materiale biologicznym, zwlaszcza w surowicy krwi.

Gamma-glutamylotranspeptydaza (zwana inaczej gamma-glutamylotransferaza, E.C.2.3.2.2.) jest enzymem wystepujacym w wielu narzadach i plynach ustrojowych ludzi i zwierzat a takze w roslinach i niektórych bakteriach. Oznaczanie aktywnosci tego enzymu w surowicy krwi ludzi chorych jest obecnie wykonywane rutynowo w laboratoriach klinicznych a uzyskane wyniki sa wykorzystywane w diagnostyce chorób watroby, trzustki, serca a takze w onkologii i ocenie skutecznosci leczenia alkoholizmu. Ponadto istnieja doniesienia o uzytecznosci oznaczania aktywnosci gamma-glutamylotranspeptydazy w diagnostyce weterynaryjnej a nawet przy róznicowaniu paleczek jelitowych.

Dotychczas znanych jest kilka metod oznaczania aktywnosci gamma-glutamylotranspeptydazy w surowicy, moczu, plynie mózgowo-rdzeniowym i w wyciagach tkanek. Do jednej z pierwszych nalezy metoda stosujaca toksyczny nitryl 7-DL-glutamyloalaniny jako substrat (Szewczuk, Orlowski, Clin. Chim. Acta, 5, 680, 1960), a miara aktywnosci enzymu jest ilosc uwolnionego nitrylu alaniny. Metoda ta nie nadaje sie do rutynowych badan, poniewaz kolorymetryczne oznaczanie tej substancji jest dosc klopotliwe. Równiez nie znalazla szerszego zastosowania metoda wykorzystujaca trudno rozpuszczalny 7-DL-glutamyloanilid (Goldbarg iwspólpr. ArchiK Biochem. Biophys., 91, 61,1960).

W minionym dziesiecioleciu opracowano i zastosowano w laboratoriach klinicznych metode stosujaca 7-L-glutamylo-a-naftyloamid, jako substrat do oznaczania aktywnosci GGT. Ze zwiazku tego pod wplywem GGT uwalnia sie a-naftyloamina, która oznacza sie kolorymetrycznie po zdwuazowaniu i sprzegnieciu z N-(l-naftylo)- etylenodwuamina (Orlowski, Szewczuk, Acta Biochim. Polon., 8, 189, 1961). Pózniej metoda ta zostala uproszczona dzieki zastosowaniu tetraazowanej o-dwuanizydyny, sprzegajacej sie bezposrednio z naftyloamina (Kilhanek, Dimov, Clin. Chim. Acta, 14, 619,1967). Znane jest takze fluorymetryczne oznaczanie a-naftyloami- ny uwolnionej przez GGT (Rieth, Cuilbault, Clin. Chem., 21, 715,1975).2 105 935 W celu szybkiego oznaczenia aktywnosci gamma-glutamylotranspeptydazy w surowicy i moczu stosuje sie równiez krazki bibuly nasycone w odpowiedni sposób 7-glutamylonaftyloamidem lub 7-glutamyloanilidem i buforem (polski opis patentowy nr 84464). Jednak metoda ta nie daje powtarzalnych wyników, poniewaz stosowane w niej substraty sa slabo rozpuszczalne w wodzie.

Szersze zastosowanie znalazla metoda, w której jako substrat do oznaczania aktywnosci GGT stosuje sie 7-L-glutamylo-p- nitroanilid (Orlowski i Meister, J. Biol. Chem., 240, 338, 1965), z którego GGT uwalnia zólto zabarwiona p-nitroaniline. Wada tej metody sa trudnosci w uzyskaniu dokladnych i powtarzalnych wyników, z powodu slabej rozpuszczalnosci substratu w buforowanych roztworach wodnych. Jak wynika z literatury patentowej, zwiekszenie rozpuszczalnosci 7-L-glutamylo-p- nitroanilidu uzyskano przez dodatek niektórych substancji chemicznych o charakterze detergentów (opisy patentowe RFN nr 2032270 i nr 2042829). Innym rozwiazaniem bylo zwiekszenie czulosci metody przez zastosowanie 8-hydroksychinoliny do kolorymetrycznego oznaczania p-nitroaniliny (opis patentowy St. Zjedn. Amer. nr 3892631). Ostatnio zastosowano N-(7-L-glutamy- lo)-3-sulfo-4- nitroanilid jako dobrze rozpuszczalny w srodowisku obojetnym substrat dla GGTP (opis patentowy RFN nr 2333798). Jednak wartosc diagnostyczna i sposób zastosowania tego substratu, w porównaniu z 7-gluta¬ myloanilidem pozostaja nie zmienione (Bernt i wspólpr. Clin. Chem., 21, 996, 1975). Dodatkowym powaznym utrudnieniem stosowania substratów p-nitroanilidowych jest to, ze zólto zabarwione próbki surowic niektórych pacjentów (np. w przypadku zóltaczek lub podczas leczenia niektórymi lekami) interferuja z barwa oznaczonej nitroaniliny lub jej sulfonowanej pochodnej, co znacznie obniza dokladnosc uzyskanych wyników.

Celem wynalazku bylo opracowanie takiego sposobu oznaczania aktywnosci GGT, który nie bylby obarczony wadami dotychczasowych metod. Wyeliminowano przy tym naftyloamidy jako substraty do oznaczania aktywnosci GGT, poniewaz istnieja doniesienia, ze naftyloamina, stanowiaca pólprodukt przy syntezie tych substratów wykazuje wlasciwosci kancerogenne.

Stwierdzono, ze jako substrat do oznaczania aktywnosci GGT nadaja sie kwasy 7-L-glutamyloaminobenzo- esowe, zwlaszcza kwas 7-L-glutamylo-p- aminobenzoesowy. Sa to zwiazki nowe i dotychczas nie opisane w literaturze. Zgodnie z przewidywaniem okazalo sie, ze kwasy te, dzieki obecnosci grupy karboksylowej w pierscieniu aromatycznym wykazuja dobra rozpuszczalnosc w roztworach wodnych o pH> 6. Z drugiej strony stwierdzono doswiadczalnie, ze kwasy 7-L-glutamylo- aminobenzoesowe nie wykazuja dzialania toksycznego lub kancerogennego. Podawanie myszom codziennie dootrzewnowo kwasu 7-L-glutamylo-p- aminóbenzoesowego w ilosci 2 g/kg w okresie wielu tygodni, nie powodowalo jakichkolwiek ujemnych objawów.

Poniewaz sam kwas 7-L-glutamylo-aminobenzoesowy jest bardzo wolno rozkladany przez GGT z nerki wolowej, a sczególnie z surowicy krwi, w celu przyspieszenia procesu enzymatycznego stosuje sie dodatek glicyloglicyny jako znanego akceptora reszty 7-glutamylowej.

Sposobem wedlug wynalazku do badanego materialu biologicznego wprowadza sie wiec kwas 7-L-glutamy¬ lo-aminobenzoesowy z dodatkiem glicyloglicyny, w postaci buforowanego roztworu wodnego o pH = 7,0—8,5, korzystnie o pH = 7,4. Jako bufor korzystnie stosuje sie trójhydroksymetylo-aminometan (Tris) z dodatkiem kwasu solnego, W wyniku reakcji enzymatycznej uwalnia sie kwas aminobenzoesowy, którego ilosc stanowi miare aktywnosci GGT. Zawartosc kwasu aminóbenzoesowego mozna oznaczyc kolorymetrycznie przez pomiar ekstynkcji, po uprzednim przeprowadzeniu go w zwiazek barwny np. na drodze dwuazowania i nastepnego sprzegania z naftolem lub jego pochodnymi.

Oczywiste jest przy tym, ze gdy tworzacy sie barwnik ma zabarwienie zólte, to wyniki pomiarów moga byc nieprawidlowe w przypadkach kiedy badany material, np. surowica krwi pobrana od chorych z zóltaczka, sa zabarwione. Z drugiej strony wiadomo, ze prawidlowy pomiar moze byc dokonany jedynie w tym przypadku, kiedy powstajacy barwnik wykazuje odpowiednia trwalosc oraz intensywne zabarwienie.

Stwierdzono, ze najbardziej odpowiednim zwiazkiem do sprzegania zdwuazowanego kwasu p-aminobenzo- esowego jest kwas H (kwas l-amino-8- hydroksynaftaleno-3,6- dwusulfonowy). W takim przypadku reakcja sprzegania przebiega bardzo szybko, a powstaly barwnik posiada intensywna barwe czerwona (jego ekstynkcja molarna wynosi 35000 przy 535 nm) i jest trwaly przez wiele godzin. Dzieki powyzszemu, zólto zabarwione próbki badanej surowicy, pobrane od pacjentów z silna zóltaczka nie maja wplywu na kolorymetryczne oznaczenie aktywnosci GGT.

Za pomoca reakcji z kwasem H mozna takze oznaczyc kolorymetrycznie kwas antranilowy (o-aminobenzo- esowy) i m-aminobenzoesowy. W obu przypadkach maksimum absorbacji powstajacego barwnika azowego oraz jego ekstynkcja molarna sa bardzo podobne do wartosci uzyskiwanych na kwasie p-aminobenzoesowym.

Sposób wedlug wynalazku, w którym jako substrat do oznaczania aktywnosci GGT stosuje sie kwas 7-L-glutamyloaminobenzoesowy i w którym w celu wywolania reakcji barwnej stosuje sie kwas H, wykazuje powazne zalety w stosunku do metod dotychczasowych. Z uwagi na czulosc metody kolorymetrycznego105935 3 oznaczania uwolnionego kwasu aminobenzoesowego mozna zmniejszyc czas inkubacji enzymatycznej do 10-30 minut. Do zdwuazowania uwolnionego kwasu aminobenzoesowego mozna zastosowac mieszanine kwasu octowego i azotynu sodu, która przemywa reakge enzymatyczna bez wytracania bialka obecnego w badanej surowicy. Dodatkowa zaleta stosowanej mieszaniny jest jej szybkie dzialanie (pelne zdwuazowanie osiaga sie juz po 3 minutach). Równiez kwas H, stosowany w sposobie wedlug wynalazku, sprzega sie bardzo szybko w temperaturze pokojowej i w srodowisku slabo zasadowym ze zdwuazowanym kwasem aminobenzoesowym.

Wszystkie wyzej wymienione zalety, wynikajace z zastosowania odpowiednich odczynników, umozliwiaja szybkie wykonanie oznaczenia aktywnosci GGT, co jest wazne i konieczne przy stosowaniu rutynowych testów diagnostycznych. Ponadto sposób wedlug wynalazku moze byc wykorzystany do automatycznych analizatorów.

Standardowy blad oznaczania aktywnosci GGT sposobem wedlug wynalazku wynosi ±3%.

Dodatkowa zaleta sposobu wedlug wynalazku jest to, ze umozliwia on stosowanie krazków testowych do rutynowych oznaczen aktywnosci GGT i przez to eliminuje koniecznosc czestego sporzadzania roztworów potrzebnych odczynników, skraca czas i znacznie obniza koszty wykonania oznaczenia. Krazki testowe moga byc wykonane z nasiakliwego tworzywa, korzystnie z grubej bibuly filtracyjnej, która nasyca sie wodnym roztworem kwasu 7-L-glutamyloaminobenzoesowego, substratu dla oznaczanego enzymu, glicyloglicyny jako aktywatora . GGT i buforu nielotnego, korzystnie Tris/HCl o pH = 7,0-8,5 korzystnie o pH 7,4. Krazki testpwe przechowy¬ wane w stanie suchym i chlodnym miejscu sa zdatne do uzytku w ciagu wielu miesiecy.

Wykorzystujac krazki testowe opracowano sklad zestawów diagnostycznych dla oznaczenia gamma-gluta- mylotranspeptydazy w surowicy krwi. Zestawy te mozna wykorzystac równiez do badania innych plynów ustrojowych (np. moczu, plynu mózgowo-rdzeniowego), a nawet wyciagów z narzadów ludzkich i zwierzecych lub nawet zawiesiny drobnoustrojów.

Sposób wedlug wynalazku jest objasniony za pomoca nizej przytoczonego przykladu. .

Przyklad. W celu przygotowania krazków testowych do oznaczenia aktywnosci GGT sporzadzono roztwór z 2,4 g (9,0 mmoli) kwasu 7-L-glutamylo-p aminobenzoesowego i 5,9 g (45 mmoli) glicyloglicyny rozpuszczonych w 100 ml 2 M buforu tris-(hydroksymetylo)-aminometanu w HC1 o pH = 7,4.

Roztworem tym nasycono paski z bibuly Whatman Nr 3, które po wysuszeniu w temperaturze pokojowej tnie sie na krazki o srednicy 1 cm.

W celu oznaczenia aktywnosci GGT przygotowano nastepujacy zestaw diagnostyczny: 1. krazki testowe 2. roztwór wzorca, a) podstawowy: 34 mg kwasu p-aminobenzoesowego rozpuszczono w 0,5 ml 0,5 M Na2C03 i nastepnie dodano 9,5 ml 10% Na2C03. b) roboczy:0,2 ml roztworu podstawowego rozcienczono woda do 50 ml. 3. roztwór 15 mg kwasu H (soli sodowej) w 50 ml wody 4. roztwór 70 mg azotynu sodowego w 50 ml wody . roztwór 1,4 ml lodowatego kwasu octowego w 50 ml wody 6. roztwór 21,6 g weglanu sodowego (Na2 C03 f 10H2 O) w wodzie i uzupelniony do 200 ml.

Tuz przed uzyciem sporzadzono: mieszanine azotynu sodowego z kwasem octowym (zmieszano 1 objetosc roztworu 4. z 1 objetoscia roztworu 5) i alkaliczny roztwór kwasu H (zmieszano 1 objetosc roztworu 3 z 2 objetosciami roztworu 6). Przed przystapieniem do oznaczania aktywnosci GGT sporzadzono wykres kalibracyj- ny. Do szeregu probówek odmierzono dokladnie po 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05 i 0,06 ml roztworu wzorca) co odpowiada 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05 i 0,06 mikromola PABA), po czym plyn w probówkach uzupelniono woda do 0,5 ml. Do probówki przeznaczonej na „próbe zerowa", odmierzono 0,5 ml wody. Nastepnie do kazdej probówki dodano 0,5 ml roztworu 0,01 M NaN02 w 0,25 M CH3COOH, zmieszano i odstawiono w temp. pokojowej na 5—45 minut a nastepnie dodano 1,5 ml roztworu wywolywacza (kwas H), zmieszano i odstawiono przynajmniej na 3 minuty w temperaturze pokojowej. Ekstynkcje czerwono zabarwionej próbki odczytano przy 535 nm w kuwetach 1 cm wobec próbki zerowej. Z odczytanych wartosci ekstynkcji i odpowiadajacych im mikromoli kwasu p-aminobenzoesowego sporzadzono na papierze milimetrowym wykres kalibracyjny, stanowia¬ cy linie prosta przechodzaca przez srodek ukladu.

Wykonanie oznaczenia aktywnosci GGT Do oznaczen uzyto surowice otrzymana przez odwirowanie skrzepu ze swiezo pobranej krwi. (Surowice mozna przechowywac w lodówce (4°C) przez tydzien). W czystej probówce umieszczono jeden krazek testowy, dodano 0,4 ml wody, zmieszano i ogrzewano przez 10 minut w lazni wodnej o temperaturze 37°C. Nastepnie dodano 0,1 ml badanej surowicy i ogrzewanie kontynuowano przez 30 minut, po czym probówke usunieto z lazni i reakcje enzymatyczna przerwano przez dodanie 0,5 ml mieszaniny azotynu sodowego z kwasem octowym. Roztwór odstawiono w temperaturze pokojowej na 4 minuty a wreszcie dodano 1,5 ml alkalicznego4 105 935 roztworu kwasu H. Prawie natychmiast powstal czerwony barwnik. Po 3 minutach odczytano ekstynkcje czerwono zabarwionej próbki przy 535 nm wobec próby kontrolnej. Te ostatnio sporzadzono w sposób analogiczny jak próbe wlasciwa z ta jednak róznica, ze próbke surowicy* dodano dopiero po wprowadzeniu roztworu Na N02 zCH3COOH. (Przechowywanie prób w temperaturze pokojowej przez jedna dobe nie powodowalo zmian wartosci odczytywanej ekstynkcji). Na podstawie odczytanej wartosci ekstynkcji poslugujac sie wykresem krzywej kalibracyjnej, wyznaczono ilosc kwasu p-aminobenzoesowego uwolnionego przez GGT.

Aktywnosc GGT w surowicy wyraza sie w miedzynarodowych milijednostkach (m.j.) równych ilosci nanomoli p-aminobenzoesanu (10 "3 mikromoli) uwolnionego w warunkach metody przez 1 ml surowicy w ciagu 1 minuty.

Claims (4)

Zastrzezenia patentowe

1. Sposób oznaczania aktywnosci gamma-glutamylotranspeptydazy w materiale biologicznym, zwlaszcza w surowicy krwi przez kontaktowanie badanego materialu z substratem, z którego w wyniku reakqi enzymatycz¬ nej uwalnia sie aromatyczna amina, której ilosc okreslajaca aktywnosc enzymu oznacza sie kolorymetrycznie przez pomiar ^fcstytikcji po uprzednim przeprowadzeniu tej pochodnej aminowej w zwiazek barwny, zna¬ mienny tym, ze material biologiczny kontaktuje sie z kwasem 7-L-glutamyloaminobenzoesowym jako substratem, stosowanym w postaci roztworu wodnego zawierajacego dodatek glicyloglicyny, a uwolniony przez enzym kwas aminobenzoesowy w celu przeprowadzenia go w zwiazek barwny, dwuazuje sie i nastepnie sprzega z kwasem H.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze material biologiczny kontaktuje sie z kwasem 7-L-glutamyloaminobenzoesowym z dodatkiem glicyloglicyny w buforowanym roztworze wodnym o pH = 7,0-8,5, korzystnie o pH = 7,4.

3. Sposób wedlug zastrz. 1,znamienny tym, ze material biologiczny kontaktuje sie z krazkami testowymi z nasiakUwego tworzywa, korzystnie bibuly, nasyconymi kwasem 7-L-glutamyloaminobenzoesowym z dodatkiem glicyloglicyny i nielotnym buforem o pH = 7,0-8,5, korzystnie 6 pH = 7,

4. Prac. Poligraf. UP PRL. Naklad 120 + 18 Cena 45 zl