Opis patentowy opublikowano: 15.11.1980 107951 Int. Cl.2 C12D 9/14 CZYTELNIA redu Patentowego Twórcy wynalazku: Barbara Ostrowska-Krysiak, Zbigniew Ruczaj, Leonard Kara¬ bin, Barbara Krawczyk, Krystyna Strzezek, Malgorzata Gur- kau-Malecha, Lidia Pass, Jadwiga Wolf, Marek Fabijanski, Marlena Lewandowska, Andrzej Miernik, Danuta Sikora, Miroslawa Socha, Anna Sokól, Romuald Szewczak, Marek Szymczak, Aleksandra Wdowiak, Ewa Zaluska Uprawniony z patentu: Instytut Przemyslu Farmaceutycznego, Warszawa; Tarcho¬ minskie Zaklady Farmaceutyczne „Polfa", Warszawa (Polska) Sposób otrzymywania erytromycyny A przy uzyciu mutanta Streptomyces erythreus Wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania erytromycyny przy uzyciu mutanta produkcyjnego promieniowca Strep¬ tomyces erythreus ATCC 11635 o zwiekszonej zdolnosci selektywnego wytwarzania erytromycyny A.Stwierdzono, ze mutant Streptomyces erythreus nr 5/37, zdeponowany w kolekcji Instytutu Przemyslu Far¬ maceutycznego, w Warszawie, otrzymany sposobem, opisanym w opisie patentowym nr 104829, jest szczepem produkcyjnym zdolnym do zwiekszonego przeksztalcania erytromycyny C do erytromycyny A i opornym na dziala¬ nie aktynofagów. Korzystne wlasciwosci mutanta Str.Tablica I Porównanie wlasciwosci szczepów Wlasciwosci Opornosc na fagi Efektywnosc prze¬ ksztalcania erytro¬ mycyny C do ery¬ tromycyny A 1 Wrazliwosc na metionine Str.erythreus ATCC 11635 (macierzysty) wrazliwy 30% wzrost hamo¬ wany przy stezeniu 500 mcg metioniny w 1 ml Str. erythreus nr 5/37 (mutant) oporny 100% wzrost hamo¬ wany przy stezeniu 4500 mcg metioniny w 1 ml 10 1S 30 erythreus nr 5/37 w porównaniu ze szczepem macierzys¬ tym zestawiono w tablicy I.Erytromycyna jest antybiotykiem, otrzymywanym w ho¬ dowli szczepu Streptomyces erythreus, która w procesie biosyntezy tworzy mieszanine erytromycyny A, B i C.Erytromycyna B rózni sie od erytromycyny A brakiem grupy hydroksylowej przy C12 erytronolidu, natomiast erytromycyna Crózni sieod erytromycyny Abrakiem grupy metylowej przy weglu C-3 obojetnego cukru. Erytromycyna A, ze wzgledu na najlepsze wlasciwosci terapeutyczne, ma najszersze zastosowanie w lecznictwie.Dotychczasowe prace nad udoskonaleniem metod otrzy¬ mywania wylacznie erytromycyny A zmierzaly do elimi¬ nowania tak zwanych zanieczyszczen erytromycyna Bi C przez zmiane pozywek oraz zmiane warunków izolacji, jak opisano w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr nr 2833696 oraz 2823203. Stosowane szczepy Streptomyces erythreus byly równiez wrazliwe na szkodli¬ we dzialanie aktynofagów, mogacych wystepowac w po¬ mieszczeniach produkcyjnych.Stosowanie w produkcji erytromycyny szczepu fago- opornego znane jest wprawdzie z opisu patentowego fran¬ cuskiego nr 1 419 590, jednakze szczep ten nie charaktery¬ zowal sie wysoka zdolnoscia wytwarzania produktu, jak; tez nie wykazywal zwiekszonej efektywnosc} przeksztalca¬ nia erytromycyny C do erytromycyny A. Wedlugopisanych w literaturze procesów produkcyjnych przy uzyciu Strep-1 tomyces erythreus, jako produkt koncowy otrzymuje sie erytromycyne A, zanieczyszczona erytromycynami C i B i o zmniejszonej aktywnosci przeciwbakteryjnej. 107 951197 fSl 3: Erytromycyna C w hodowlach wiekszosci znanych mu¬ tantów produkcyjnych nie jest calkowicie przeksztalcona do erytromycyny A i pozostaje jako niepozadane zanieczysz¬ czenie.Próby zwiekszenieefektywnoscitego przeksztalcenia przez dodanie do pozywki, np. metioniny lub produktów w nia bogatych nie daja wyników pozytywnych ze wzgledu na wrazliwosc szczepów produkcyjnych na ten aminokwas, jak tez nieprzepuszczalnosc blon komórkowych dla tego aminokwasu.Nieoczekiwanie okazalo sie, ze zastosowanie mutanta Streptomyces erythreus nr 5/37 przy utrzymywaniu sta¬ lego wysycenia tlenem hodowli mutanta w granicach 25—50% i przy uzyciu alkoholu propylowego i/lub alko¬ holu amylowego w warunkach odpowiedniego mieszania hodowli prowadzi do selektywnego wytwarzania erytro¬ mycyny A.Wedlug wynalazku proces biosyntezy prowadzi sie przy uzyciu mutanta Streptomyce9 erythreus nr 5/37 o zmniej¬ szonej wrazliwosci na metionine i zwiekszonej zdolnosci przeksztalcania erytromycyny C do erytromycyny A, w warunkach zmiennego mieszania hodowli i zmiennej ilosci wprowadzanego powietrza w róznych razach wzrostu, w warunkach stalego poziomu wysycenia tlenem hodowli mutanta 25%—50%, korzystnie okolo 30%, oraz przy uzyciu alkoholu propylowego i/lub alkoholu amylowego jako stymulatorów biosyntezy, po czym streptomycyne A wyodrebnia sie w znany sposób.Przeksztalcenie erytromycyny B do erytromycyny A wymaga racjonalnego natlenienia hodowli bez koniecznosci specjalnych mutacji szczepu. Natomiast efektywne prze¬ ksztalcanie erytromycyny C do erytromycyny A, zacho¬ dzace z udzialem grupy metylowej, wymaga zmian gene¬ tycznych u szczepu produkcyjnego.W pracach nad poszukiwaniem nowychmetod produkcji, uzyskanie wysokiej wydajnosci pozadanego produktu kon¬ cowego z wyeliminowaniem wystepujacych nie rzadko zakazen fagami, okazalo sie mozliwe przez zastosowanie odpowiedniego mutanta fagoopornego, zdolnego do se¬ lektywnej biosyntezy erytromycyny A przy prowadzeniu procesu ze stalym poziomem wysycenia hodowli tlenem 10 15 30 40 stosujac zmienna ilosc podawanego powietrza i zmienna szybkosc mieszania w zaleznosci od zapotrzebowania szczepów na tlen w róznych razach jego wzrostu.Przez zastosowanie szczepu nr 5/37 z wyspecjalizowanym ukladem enzymatycznym, katalizujacym przemiane ery¬ tromycyny C do erytromycyny A i ze zmniejszona wrazli¬ woscia na metionine i przez odpowiedni dobór warunków fermentacji uzyskano produkt koncowy z wysoka wy¬ dajnoscia o bardzo duzym stopniu czystosci.Istotne znaczenie dla ukierunkowanej biosyntezy erytro¬ mycyny A, przy zastosowaniu odpowiedniego mutanta, ma sposób dozowania alkoholu propylowego i /lub alkoholu amylowego jako stymulatora efektywnej biosyntezy, a prze¬ de wszystkim warunki hodowli, a zwlaszcza odpowiedniego wysyceniatlenem.Okazalo sie, ze istnieje scisla zaleznosc efektywnosci biosyntezy i procentowego skladu koncowego produktu od ilosci podawanego powietrza i mieszania hodowli produk¬ cyjnej, co ilustruje tablica II.Przy zachowaniu jednakowej intensywnosci mieszania i wprowadzenia powietrza, jak to zastosowano w doswiad¬ czeniu A, obserwowano szybkie zmniejszanie sie poziomu rozpuszczonego tlenu w hodowli, zwlaszcza w fazie inten¬ sywnego rozwoju szczepu. Deficyt rozpuszczonego tlenu ma wplyw z jednej strony na obnizenie ogólnej wydajnosci procesu, z drugiej zas na sklad produktu koncowego.W przypadku doswiadczenia B zastosowano stale wy- sycenie hodowli produkcyjnej tlenem, uzyskujac w ten sposób wysoka globalna wydajnosc erytromycyny, jak równiez najbardziej korzystny sklad produktu koncowego.Dalsze zwiekszanie wysycenia tlenem mialo wprawdzie dodatni wplyw na ogólna ilosc syntetyzowanego antybio¬ tyku, jednak w koncowym etapie biosyntezy nie bylo korzystne dla przeksztalcenia erytromycyny C do eryto- mycyny A.Szczególnie wazne dla ekonomii procesu jest nasycenie tlenem we wczesnym okresie hodowli, który jest okresem najwyzszej aktywnosci biosyntetycznej. 48-godzinna ho¬ dowla pobiera 3,5-krotnie wiecej znakowanego stymulato¬ ra w czasie 24 godzinnej inkubacji, anizeli 96-godzinna.Przyklad I. Mutant S. erythreus nr 5/37 hodowano Tablica II Zaleznosc miedzy wysyccniem tlenem hodowli a skladem erytromycyny, wytwarzanej przez mutant S, erythreus nr 5/37 Godziny 1 hodowli | 30 1 48 72 1 96 | 120 | 144 Doswiadczenie A Jednakowa intensywnosc mieszania i wpro¬ wadzania powietrza wysycenie tlenem % 4 4 40 68 68 70 mcg/ml 800 1130 1700 2450 2750 Sklad procentowy erytromycyny A B C nie oznaczano 60 55 60 75 80 40 30 30 20 16 15 10 5 4 Doswiadczenie B I Zmiennaintensywnosc mieszania i wprowadzania powietrza wysycenie tlenem % 30 30 30 30 30 , mcg/ml 775 1850 2760 4100 4500 Sklad procentowy erytromycyny A | B \ C 1 nie oznaczano 60 80 88 94 98 5 5 4 slad slad 15 | 15 | 8 6 | slad |107 951 przez 6 dni w temperaturze 35°C na podlozu o skladzie: wyciagdrozdzowy 1,0 g wyciagmiesny 1,0 g pankreatyczny hydrolizat kazeiny 2,0 g agar 25,0 g glukoza 1,0 g woda destylowana do 1,0 litra wartosc pH = 7,5 Hodowle zmywano jalowa woda z perelkami szklanymi i wprowadzano do kolb stozkowych a 500 ml z lamaczami z przedluzona szyjka, zawierajacych 120 ml pozywki po- siewowej o skladzie: wyciag namokowy kukurydzy (50% suchejmasy) 30 g sacharoza 30 g (NH4)2S04 4,0 g CaCO, 6,0 g woda destylowana do 1,0 litra wartosc pH po sterylizacji 6,5 Zaszczepione kolby umieszczano na trzesawce obrotowej o 225 rpm i mimosrodzie 25 mm, w temperaturze 35 °C na 48 godzin. Po tym czasie otrzymano gesta hodowle barwy kremowej, zawierajaca 15% mokrej odwirowanej masy, wykazujaca przy kontroli na plytkach 10*j.t.k. (Jednostek tworzacych kolonie), charakteryzujaca sie w obrazie mi¬ kroskopowym regularnie rozgaleziona grzybnia, barwiaca aie fioletowo metoda Grama, bez zanieczyszczen innymi drobnoustrojami. Hodowla ta nie ulega lizie po dodaniu do niej fagów w stezeniu 107 czastek na 1 ml hodowli.Przyklad II. Hodowla posiewowa mutanta S. ery- threus nr 5/37 w ilosci 250 ml szczepiono 5 litrów pozywki produkcyjnej o skladzie (na 1 litr wody wodociagowej): maka z wytloków sojowych 30,0 g CaC03 6,0 g skrobia 20,0 g NaCl 5,0 g (NH4),S04 2,0 g glukozatechniczna 50,0 g olejsojowy 8,0 g alkoholpropylowy 9,0 g przy czym glukoze sterylizowano oddzielnie i dodawano po sterylizacji pozywki, a olej sojowy i alkohol propylowy, równiez osobno sterylizowano i dodawano w 3 porcjach w 0,24 i 48 godzinie hodowli.Hodowle produkcyjna prowadzono przez 6 dni w 14 litrowym fermentorze laboratoryjnym typu MP-214 firmy New Brunswik, wprowadzajac powietrze w godzinach od 0—24 w ilosci 0,5 objetosci obj. hodowli/min., przy mie¬ szaniu 600 obr/min., w godzinach od 24—72 w ilosci 1 obj./obj. hodowli/min. przy mieszaniu 900 obr/min. 5 i ostatecznie w godzinach od 72—144 w ilosci 0,5 obj./obj. hodowli/min. przy mieszaniu 900 obr./min. Wysycenie tlenem wahalo sie od 20 do 80% rozpuszczonego tlenu.Po zakonczeniu procesu biosyntezy oddzielano przesacz od masy komórkowej i w przesaczu kontrolowano zawartosc 10 erytromycyny znanymi metodami: mikrobiologiczna, spek- trofotometryczna i biochromatograffczna. Zawartosc ery¬ tromycyny w przesaczu wynosila 4500 mcg/ml, w tym 98% erytromycyny A i sladowe ilosci erytromycyny B i C.Przyklad III. Biosynteze erytromycyny prowadzono 15 przy uzyciu mutanta S. erythreus nr 5/37 w pozywce produkcyjnej o skladzie, podanym w przykladzie II. Olej sojowy i alkohol propylowy sterylizowano osobno i doda¬ wano w trzech porcjach o 0, 24 i 48 godzinie hodowli.Stale wysycenie hodowli tlenem wynosilo 30%. Zawartosc 20 erytromycyny w przesaczu wynosila 4700 mcg/ml, w tym 97% erytromycyny A i sladowe ilosci erytromycyny B i C.Przyklad IV. Biosynteze erytromycyny prowadzono przy uzyciu mutanta S. erythreus nr 5/37 w warunkach, podanych w przykladzie II, stosujac jako stymulator bio- 25 syntezy alkohol propylowy 0,4% wraz z alkoholem amylo- wym 0,3%. Czynniki stymulujace podawano w 3 porcjach w 0, 24 i 48 godzinie hodowli produkcyjnej. Zawartosc erytromycyny w przesaczu wynosila 4600 mcg/ml, w tym 98% erytromycyny A i sladowe ilosci erytromycyny B i C. 30 PL