Przedmiotem wynalazku jest sposób selektywnego wytwarzania hemiketalu 3aa-H-4a-.[3'-propionylo]- -7afl-metyloszesciowodoroindanodionu-l,5 o wzorze 1 na drodze fermentacji.Przeksztalcanie sterydów przez drobnoustroje by¬ lo przedmiotem obszernych badan i wielu publika¬ cji. Najwczesniejszymi byly prace Mamoli i Vercel- lone z roku 1937 opublikowane w Ber. 70, 470 i Ber. 70, 2079. Autorzy ci opisali redukcje 17-ketosterydów do 170-hydroksysterydów przy uzyciu fermentuja¬ cych drozdzy. W okresie pózniejszym, w 1952 roku Peterson i Murray zastrzegli proces lla-hydroksy- lacji progesteronu przeprowadzany przy uzyciu grzybów Rhizopus nigricans (opis patentowy St.Zjedn. Ameryki nr 2602769). Jeszcze pózniej Kraychy i wspólpracownicy w opisie patentowym St. Zjedn.Ameryki nr 3684657 w 1972 roku zastrzegli selek¬ tywny proces mikrobiologicznego rozkladu grupy alkilowej w polozeniu 17 w czasteczce sterydu przez fermentacje sterydu posiadajacego alkilowy lancuch boczny w polozeniu 17 o przynajmniej 8 atomach wegla, przy uzyciu szczepu Mycobacterium sp. NRRL B-3683 w celu uzyskania androsteno-4-dionu-3,17, androstadieno-l,4-dionu-3,17 oraz 20«-hydroksyme- tylopregnadien-l,4-onu-3.Nastepnie Marsheck i jego wspólpracownicy w opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 3759791 w 1973 roku zastrzegli selektywny, mikrobiologicz¬ ny sposób wytwarzania androsteno-4-dionu-3,17 przez fermentacje sterydu z grupy cholestanu lub 15 20 25 30 stigmastanu o przynajmniej 8 atomach wegla w alkilowym lancuchu bocznym w polozeniu 17, przeprowadzanej przy uzyciu szczepu Mycobacte¬ rium sp. NRRL B-3805.W publikacji K. Schuberta, K-H. Bohme i C. Hor- holda pod tytulem: „Wytwarzanie niskoczasteczko- wych produktów rozkladu progesteronu za pomoca drobnoustrojów", Steroids 4, 581—596 (1964) opisa¬ no wytwarzanie trójcyklicznych produktów posred¬ nich w procesie rozkladu progesteronu przy uzyciu szczepu Mycobacterium smegmatis.Szczep stosowany w sposobie wedlug wynalazku, czyli Mycobacterium fortuitum NRRL B-8129 opisa¬ no w równoleglych zgloszeniach patentowych doko¬ nanych w St. Zjedn. Ameryki z dnia 17 listopada 1975 roku i z dnia 26 listopada 1976 roku. Warunki procesu podane w tych zgloszeniach nie zapewniaja jednak optymalnych korzystnych warunków wy¬ twarzania zwiazków o wzorze 1.Z polskiego opisu patentowego nr 106849 znany jest sposób wytwarzania 3aa-H-4ja-(3*-hydroksypro- pylo)-7a|3-metyloszesciowodoroindanu polegajacy na hodowaniu Mycobacterium fortuitum NRRL-8129 W pozywce wodnej w warunkach tlenowych, w obecnosci odpowiedniego steroidu. Jednak ten znany sposób nie zapewnia wysokiej wydajnosci zwiazku o wzorze 1.Nieoczekiwanie stwierdzono, ze bezposredni wplyw na kierunek nastepujacej podczas fermenta- 110 996110 996 3 cji reakcji rozkladu steroidów, ma wartosc pH fer¬ mentujacej pozywki.Sposób selektywnego wytwarzania hemiketalu 3aa-H-4a-[3'-propionylo]-7aP-metyloszesciowodoro- indanodionu-1,5 o wzorze 1 wedlug wynalazku po¬ lega na hodowaniu Mycobacterium fortuitum NRRL B-8129 w wodnej pozywce, w warunkach tlenowych, w obecnosci sterydu zawierajacego ewentualnie al¬ kilowy lancuch boczny o 2—10 atomach wegla w polozeniu 17, przy czym wartosc pH pozywki utrzymuje sie w zakresie okolo 3,0—6,0.Przykladami odpowiednich sterydów sa sitoste- rol, cholesterol, stigmasterol, kampesterol i tym po¬ dobne sterydy posiadajace w polozeniu 17 alkilowy lancuch o 2—10 atomach wegla i androsteno-4-dion- -3,17, androstadieno-l,4-dion-3,17, dehydoroepiandro- steron, testosteron i kwas typu bisnor (kwas 3-keto- bisnorcholeno-4-karboksylowy-22). Te substraty ste¬ rydowe mozna stosowac zarówno w postaci czystej jak i w postaci surowej.W brzeczce fermentacyjnej otrzymuje sie równiez mniejsze ilosci hemiacetalu 3aa-H-4a-[3'-propano- lo»[-5 -1 o wzorze 2. 8-lakton kwasu 3aa-H-4a-{3,-etylenokarboksylo]- -5a-hydroksy-7aP-metyloszesciowodoroindanonu-l o wzorze 3, 3aa-H-4a- [3'-propanolo]5a-hydroksy-7aP-metylo- szesciowodoroindanonu-1 o wzorze 4 i kwasu 3aa-H-4a-,[3'-etylenokarboksylo]-7aP- me- tyloszesciowodoroindanodionu-1,5 o wzorze 5.Podczas selektywnego rozkladu sterydów z lub bez alkilowego lancucha bocznego w polozeniu 17 o 2—10 atomach wegla, prowadzonego przy war¬ tosci pH 3,0—6,0, nastepuje nagromadzanie w brzecz¬ ce fermentacyjnej w ilosci przewazajacej zwiazku o wzorze 1.W celu otrzymania szczepu Mycobacterium fortui¬ tum NRRL B-8129 szczep Mycobacterium fortuitum ATCC 6842 poddawano mutacji i otrzymywano la¬ boratoryjnie zmutowany drobnoustrój. W Katalogu ATCC z roku 1974 pod haslem ATCC 6842 zamie¬ szczono nastepujaca informacje „J. C. Cruz 2. Cold abscess. Acta Med. Rio de Janeiro 1:1 (1936). Me- dium 90 37C". Szczep Mycobacterium fortuitum ATCC 6842 rozklada sterole sposobem nieselektyw- nym do zwiazku o niskim ciezarze czasteczkowym, to znaczy do C02 i H20. Tym samym drobnoustrój ten nie nadaje sie do stosowania jako czynnik selek¬ tywnie rozkladajacy sterydy.Proces mutacji szczepu Mycobacterium fortuitum ATCC 6842 przeprowadzany przy uzyciu nitrozogu- anidyny wytwarza mutant, który selektywnie roz¬ klada sterydy z lub bez alkilowego lancucha bocz¬ nego w polozeniu 17 o 2—10 atomach wegla, przy czym otrzymuje sie zwiazek o wzorze 1 w ilosci do¬ minujacej w brzeczce fermentacyjnej. Ten zmuto¬ wany drobnoustrój Mycobacterium fortuitum uzys¬ kal jak wspomniano NRRL B-8129 w kolekcji Northern Regional Laboratory U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, U.S.A., gdzie go zde¬ ponowano. Podhodowle tego drobnoustroju mozna latwo uzyskac z depozytu. Zrozumiale jest, ze do¬ stepnosc hodowli nie stanowi zgody na stosowanie w praktyce sposobu wedlug wynalazku, w zakresie 4 uszczuplajacym prawa wynikajace z patentu i za¬ gwarantowane przepisami panstwowymi.Morfologia i wrazliwosc na leki szczepu Myco¬ bacterium fortuitum NRRL B-8129 sa nierozróznial- 5 ne z odpowiednimi cechami szczepu rodzicielskiego Mycobacterium fortuitum ATCC 6842. Obydwie ho¬ dowle Mycobacterium fortuitum sa odporne na dzialanie kwasu, sa nieruchliwe i nie wytwarzaja zarodników oraz naleza do rodziny Mycobacteria- ceae do rzedu Actinomycetales. Zgodnie z klasyfi¬ kacja Runyona (Runyon E.H., 1959, Med. Clin. North America 43, 273) naleza do niechromogennej IV gru¬ py Mycobacterium, to znaczy wzrastaja szybko w niskiej temperaturze i daja niezabarwione kolonie na stosunkowo prostej pozywce.Szczepy Mycobacterium fortuitum ATCC 6842 i Mycobacterium fortuitum NRRL B-8129 wyraznie róznia sie miedzy soba dzialaniem na czasteczki ste¬ rydów. Jak wspomniano powyzej szczep Mycobac¬ terium fortuitum ATCC 6842 rozklada sterydy, pod¬ czas gdy szczep Mycobacterium fortuitum NRRL B-8129 rozklada je selektywnie, a szczególnie przy wartosci pH 3,0—6,0. Ta wlasciwosc szczepu My¬ cobacterium fortuitum NRRL B-8129, jak wspom¬ niano powyzej, czyni go wysoce uzytecznym.Proces mutacji szczepu Mycobacterium fortuitum ATCC 6842 do szczepu Mycobacterium fortuitum NRRL B-8129 przeprowadza sie przy uzyciu nitro- zoguanidyny. Chociaz sposoby przeprowadzania mu¬ tacji sa zwykle znane, to jednak nie jest znany sposób pozwalajacy przewidziec lub chocby suge¬ rowac typ mutanta( jesli on powstanie, po przepro¬ wadzeniu wybranego sposobu mutacji.Selektywny sposób wytwarzania zwiazku o wzo¬ rze 1 wedlug wynalazku przeprowadza sie we wzrastajacej hodowli szczepu Mycobacterium for¬ tuitum NRRL B-8129 przez dodanie do hodowli w czasie inkubacji wybranego sterydu lub przez wprowadzenie sterydu do podloza hodowlanego przed zaszczepieniem. Steryd mozna dodac poje¬ dynczo lub w kombinacji z innym sterydem..Korzystnie, lecz nie wylacznie, steryd stosuje sie w hodowli w stezeniu okolo 0,1 do okolo 100 gra¬ mów/litr. Hodowla wzrasta na pozywce wzrostowej zawierajacej zródlo wegla, na przyklad, przyswa¬ jalne weglowodany oraz zródlo azotu, na przyklad, przyswajalny zwiazek azotu lub substancje bial¬ kowate.Jako korzystne zródlo wegla stosuje sie gliko- koze, brunatny cukier, sacharoze, gliceryne, skro¬ bie kukurydziana, laktoze, dekstryne, melasy i tym podobne. Jako korzystne zródla azotu stosu¬ je sie namok kukurydziany, drozdze, rozlozone drozdze browarnicze ze stalymi substancjami z mle¬ ka, make sojowa, make z ziaren bawelny, make ku¬ kurydziana, stale substancje z mleka, pacnkreatyno- wy wyciag z kazeiny, maczke rybna, mocznik, sta¬ le odpady gorzelnicze, ciekly pepton zwierzecy, od¬ pady miesne i kostne, sole amoniowe i tym podobne.Mozna stosowac dowolne kombinacje wymienio¬ nych zródel wegla i azotu. Do pozywki fermenta¬ cyjnej nie nalezy dodawac sladowych ilosci meta¬ li, na przyklad, cynku, magnezu, manganu, kobaltu, zelaza i tym podobnych, poniewaz jako skladniki pozywki stosuje sie wode wodociagowa i inne sklad- 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60110 996 6 niki w stanie nieoezyszczonym. Przed wyjalowie¬ niem wartosc pH pozywki doprowadza sie do okolo 6,5. Wartosc pH nastawia sie przy uzyciu mocnej zasady, na przyklad, wodorotlenku sodowego, wo¬ dorotlenku potasowego i tym podobnych.Jak wspomniano cecha sposobu wedlug wynalaz¬ ku jest utrzymanie wartosci pH w czasie przepro¬ wadzania fermentacji na poziomie okolo 5,5 lub nizszym w celu uzyskania zwiazku o wzorze 1 w ilosci przewazajacej. Wartosc pH utrzymuje sie praktycznie w zakresie od okolo 3,0 do okolo 6,0.Utrzymywanie tej wartosci pH osiaga sie sposoba¬ mi dobrze znanymi w tej dziedzinie, na przyklad, przy uzyciu CaCOs lub buforu fosforanowego, które zawarte sa w pozywce lub przez ustalenie wartosci pH przy uzyciu zasady, na przyklad wodorotlenkiem sodowym, wodorotlenkiem amonowym lub podob¬ nym albo przy uzyciu kwasu, na przyklad kwasu solnego, kwasu siarkowego lub tym podobnych.Ponadto wartosc pH mozna utrzymywac na po¬ zadanym poziomie przy uzyciu nadmiaru skladni¬ ków pozywki, które w wyniku rozkladu metabolicz¬ nego powoduja obnizenie wartosci pH. Przyklady takich zwiazków obejmuja rozpuszczalne sole amo¬ nowe, weglowodany, takie jak glikoza i inne jedno- lub dwucukry, skrobie i inne wielocukry oraz oleje i tluszcze, takie jak smalec i olej sojowy.Proces przeprowadzi sie w ciagu okolo 72 godzin do 15 dni. W czasie procesu przeksztalcania stosuje sie temperature w zakresie 25—37°C, korzystnie na poziomie 31°C. Zawartosc naczynia, w którym prze¬ prowadza sie przeksztalcenie, napowietrza sie- wy¬ jalowionym powietrzem i miesza, w celu ulatwienia wzrostu drobnoustroju i zwiekszenia skutecznosci procesu przeksztalcenia.Po zakonczeniu przeksztalcenia, co stwierdza sie za pomoca chromatografii cienkowarstwowej przy uzyciu plytek pokrytych zelem krzemionkowym (E. Merck, Darmstadt) i ukladu rozwijajacego zlozo¬ nego z octanu etylu i cykloheksanu w stosunku obo¬ jetnym 2:3, przeksztalcony steryd wydziela sie spo¬ sobami dobrze znanymi w tej dziedzinie.Na przyklad, fermentacyjna mieszanine reakcyjna po przeksztalceniu, zawierajaca ciecz fermentacyj¬ na i komórki, mozna ekstrahowac nie mieszajacymi sie z woda rozpuszczalnikami sterydów. Odpowied¬ nimi rozpuszczalnikami sa chlorek metalenu, który jest korzystny, chloroform, czterochlorek wegla, chlorek etylenu, trójchloroetylen, eter, octan amylu, benzen i tym podobne.Sposobem alternatywnym, fermentacyjna ciecz i komórki, w pierwszym etapie mozna rozdzielac znanymi sposobami, na przyklad, przez saczenie lub wirowanie, po czym oddzielnie ekstrahowac odpo¬ wiednimi rozpuszczalnikami. Komórki mozna eks¬ trahowac zarówno mieszajacym jak i nie mieszaja¬ cym sie z woda rozpuszczalnikiem. Ciecz fermenta¬ cyjna uwolniona od komórek mozna ekstrahowac rozpuszczalnikami nie mieszajacymi sie z woda.Nastepnie ekstrakty saczy sie przez ziemie okrzemkowa i pod zmniejszonym cisnieniem oc- destylowuje sie przesacz w celu otrzymania suchej pozostalosci. Pozostalosc te zawierajaca przeksztal¬ cony steryd, nastepnie rozpuszcza sie w mieszani¬ nie 10% chloroformu w rozpuszczalniku Skellysolve B i chromatografuje na zelu krzemionkowym przy uzyciu rozpuszczalnika Skellysolve B (mieszanina izomerycznych heksanów i jego mieszaniny ze 5 wzrastajaca iloscia octanu etylu, jako rozpuszczal¬ nika rozwijajacego. W ten sposób eluuje sie wytwa¬ rzany zwiazek. Po krystalizacji z octanu etylu otrzymuje sie mieszanine dwóch epimerów w sto¬ sunku 1:1 zwiazku o wzorze 1, o temperaturze top- io nienia 100—112°C. Krystaliczny produkt otrzymuje sie przy zastosowaniu, na przyklad octanu etylu ja¬ ko rozpuszczalnika. Przeksztalcony steryd mozna równiez uzyskac przez oddestylowanie rozpuszczal¬ nika z cieczy otrzymanej po dekantacji. 15 Zwiazek o wzorze 1 jest uzytecznym produktem posrednim stosowanym w chemicznej syntezie ste¬ rydów. Na przyklad, mozna go przeprowadzic w substancje wyjsciowa dla procesu znanego z opi¬ su patentowego St. Zjedn. Ameryki nr 3880884, 20 w którym opisano sposób przeprowadzania totalnej syntezy uzytecznych 19-norsterydów. Przeksztalce¬ nie w substancje wyjsciowe przeprowadza sie spo¬ sobami opisanymi w J.A.C.S. 85, 2135-2137.Nastepujace przyklady ilustruja sposób wedlug wynalazku. Wszystkie procenty sa procentami wa¬ gowymi, a wszystkie propozycje w mieszaninach rozpuszczalników sa objetosciowe, jesli nie zazna¬ czono, ze jest inaczej. 30 Przyklad I. Wytwarzanie mutanta szczepu Mycobactericum fortuitum NRRL B-8129 ze szczepu Mycobacterium fortuitum ATCC 6842 a) Mutageneza nitrozoguanidynowa Komórki szczepu Mycobacterium fortuitum 35 ATCC 6842 poddaje sie wzrostowi w temperaturze 28°C, w wyjalowionej pozywce posiewowej o naste¬ pujacym skladzie: 40 bulion odzywczy (Difce) 8 g/litr ekstrakt z drozdzy 1 g/litr propionian sodowy 0,5 g/litr woda destylowana do 1 litra Wartosc pH mieszaniny doprowadza sie do 7,0 45 roztworem wodorotlenku sodowego, po czym calosc wyjalawia sie w temperaturze 121°C w ciagu 20 mi¬ nut.Komórki wzrastaja do gestosci okolo 5X108/ml, po czym oddziela sie je przez wirowanie, przemywa 50 równa objetoscia wyjalowionego 0,1 m roztworu cy¬ trynianu sodowego o wartosci pH 5,6. Przemyte ko¬ mórki ponownie zawiesza sie w takiej samej ilosci buforu cytrynianowego i próbke zawiesiny pobiera w celu oznaczenia liczby komórek, a nastepnie do- 55 daje sie nitrozoguanidyne w takiej ilosci by jej koncowe stezenie wynosilo 50 M-g/ml. Zawiesine ko¬ mórek inkubuje sie w temperaturze 37°C w lazni wodnej w ciagu 30 minut, po czym ponownie pobie¬ ra sie próbke w celu oznaczenia. 60 Nastepnie przez wirowanie oddziela sie komórki, przemywa je równa objetoscia wyjalowionego 0,1 m roztworu fosforanu potasowego o wartosci pH 7,0.Na koniec komórki zawiesza sie w pozywce o mini¬ malnej zawartosci soli, pozbawionej zródla wegla, 65 o nastepujacym skladzie:110 996 NH4NOs K2HP04 MgS04-7H20 NaCl FeS04-7H20 1,0 g/litr 0,25 gAitr 0,25 g/litr 0,005 g/litr 0,001 g/litr woda destylowana do 1 litra Wartosc pH mieszaniny doprowadza sie do 7,0 i n roztworem kwasu solnego, po czym calosc wyjala¬ wia sie w temperaturze 121°C w ciagu 20 minut.Nastepnie komórki wylewa sie na plytki w celu wy¬ brania mutantów. b) Wybieranie i izolowanie mutanta Mycobacte- rium fortuitum NRRL B-8129 Zmutowane komórki, uzyskane sposobem opisa¬ nym powyzej, rozciencza sie i rozsiewa na plytkach zawierajacych pozywke o nastepujacym skladzie: (zmodyfikowana pozywka Fransera i Jorrela, 1963 J. Biol. Chem. 205, str. 291—295): gliceryna NA2HP04 KH2P04 NH4C1 MgS04-7H20 FeCl8-CH20 10,0 8,4 4,5 2,0 0,3 0,05 g/litr g/litr g/litr g/litr g/litr g/litr woda destylowana do 1 litra Nastepnie dodaje sie agar w ilosci 15 gAitr i calosc wyjalawia sie w autoklawie w temperaturze 121°C w ciagu 30 minut, po czym wylewa na wyjalowione plytki Petriego.Prowadzenie hodowli na takiej pozywce pozwala na wyeliminowanie wiekszosci zywieniowych au- ksetrofów, wytwarzanych w procesie mutagenezy, na przyklad pozadanych witamin, czynników wzrostu i tym podobnych, które usuwa sie stosujac okreslona pod wzgledem chemicznym pozywke. Po inkubacji w temperaturze 28°C w ciagu 7 dni uzys¬ kane kolonie przenosi sie na plytki testowe nada¬ jace sie do przeprowadzania wybierania mutanta i nastepnie ponownie przenosi sie na plytki kon¬ trolne zawierajace pozywke glicerynowa.Plytki testowe przygotowuje sie sposobem opisa¬ nym przez G. E. Petersona, M. L. Lewisa i J. R.Davisa w 1962 w artykule „Preparation of uniform dispersions of cholesterol nad other water-insoluble carbon sources in agar media" J. Lipid Nesearch 3, 275—276. Pozywke o minimalnej zawartosci soli za¬ warta na takich plytkach opisano powyzej w czesci a) przykladu.Nastepnie dodaje sie agar w ilosci 15 gAitr i od¬ powiednie zródlo wegla w ilosci 1,0 gAitr, takie jak sitosterol lub androstenodión (AD), po czym uzys¬ kana zawiesine wyjalawia sie w autoklawie w tem¬ peraturze 121°C w ciagu 30 minut. Wyjalowiona, go¬ raca mieszanine wylewa sie do wyjalowionego mie¬ szalnika, miesza sie w ciagu kilku minut, po czym wylewa sie na wyjalowione plytki Petriego.Poniewaz w procesie tym problemem jest sklon¬ nosc do pienienia, mozna te sklonnosc ograniczyc stosujac mieszanie w czasie gdy mieszanina jest go¬ raca i nastepnie przez ogrzewanie plomieniem po¬ wierzchni stopionych plytek agarowych. Tym spo¬ sobem uzyskuje Sie jednorodne zawiesiny nieroz- 10 15 25 35 40 45 50 55 60 65 8 puszczalnych w wodzie zródel wegla, co pozwala uzyskac jednakowe lecz opalizujace plytki agarowe.Kolonie, które wzrastaja na kontrolnych plytkach, lecz nie wzrastaja na plytkach testowych zawiera¬ jacych AD jako jedyne zródlo wegla, oczyszcza sie droga wysiewu kreskowego na plytkach zawieraja¬ cych pozywke agarowa. Po wzroscie w temperatu¬ rze 28°C poszczególne klony wybiera sie z plytek zawierajacych pozywke agarowa wyjalowiona lo¬ patka dentystyczna i ponownie bada sie za pomoca wysiewu na pokratkowanych plytkach zawieraja¬ cych AD jako zródlo wegla. Oczyszczone izolaty, które wykazuja fenotyp rózny od hodowli rodzi¬ cielskiej sprawdza sie nastepnie w wytrzasanych kolbach. c) Sprawdzanie w wytrzasanych kolbach W kolbach trzasawkowych o pojemnosci 500 ml umieszcza sie 100 ml pozywki do przeksztalcania o nastepujacym skladzie: gliceryna Na2HP04 KH2P04 NH4C1 MgS04-7H20 FeCls-6H20 woda destylowana 10,0 8,4 4,5 2,0 0,3 0,05 do g/litr g/litr gAitr gAitr gAitr gAitr 1 litra Do mieszaniny dodaje sie make sojowa w ilosci 1 g/litr miesza i nastepnie dodaje sie sitosterol w ilosci 10 gAitr i równiez miesza. Kolby wyjalawia sie w autoklawie, w temperaturze 121°C w ciagu 20 minut, oziebia sie do temperatury 28°C i zasz¬ czepia 10 ml hodowli posiewowej uzyskanej naste¬ pujacym sposobem: Oczyszczone izolaty uzyskane sposobem opisanym w czesci b) poddaje sie wzrostowi na skosach aga¬ rowych w temperaturze 28°C. Oczko czy komórka pobrana ze skosa stosuje sie do zaszczepiania kolby o pojemnosci 500 ml zawierajacej 100 ml wyjalo¬ wionej pozywki posiewowej o nastepujacym skla¬ dzie: bulion odzywczy (Difco) 8 gAitr ekstrakt z drozdzy 1 gAitr gliceryna 5 g/litr woda destylowana do 1 litra Wartosc pH doprowadza sie do 7,0 1 n roztworem wodorotlenku sodowego, po czym kolby wyjalawia sie w autoklawie w temperaturze 121°C w ciagu 20 minut. Nastepnie kolby szczepi sie i inkubuje w tem¬ peraturze 28° w ciagu 72 godzin.Jak podano powyzej do kazdej kolby o pojemnos¬ ci 500 ml dodaje sie 100 ml wyjalowionej pozywki do przeprowadzania przeksztalcenia i szczepi sie *10 ml pozywki wzrostowej. Kolby inkubuje sie w temperaturze 28—30°C, wytrzasa na trzesawce obrotowej i w róznych okresach czasu pobiera sie z nich próbki. Pobrane próbki o objetosci 10 ml pod¬ daje sie ekstrakcji przez wytrzasanie z trzema por¬ cjami chlorku metylenu. Porcje ekstraktu poddaje sie analizie metoda chromatografii cienkowarstwo¬ wej przy uzyciu zelu krzemionkowego i ukladu roz¬ puszczalników opisanego powyzej, na przyklad przy uzyciu mieszaniny octanu etylu i cykloheksanu w110 996 10 stosunku objetosciowym 2:3 oraz za pomoca chro¬ matografii gazowo-cieczowej. Obecnosc zwiazków 0 wzorze 1 i 5 potwierdza selektywny rozklad sito- sterolu za pomoca nowego mutanta uzyskanego ze szczepu rodzicielskiego Mycobacterium fortuitum ATCC 6842.Przyklad II. Przeksztalcanie sitosterolu w zwiazek o wzorze 4.Stosuje sie taka sama pozywke jak w przykladzie 1 punkt c), z ta róznica, ze wartosc pH doprowadza sie do 6, 5, 4 n roztworem wodorotlenku sodowego.Uzyskana pozywke wyjalawia sie przez ogrzewanie w temperaturze 121°C w ciagu 30 minut, po czym oziebia sie do temperatury 28°C i zaszczepia 10 czes¬ ciami hodowli posiewowej mutanta Mycobacterium fortuitum NRRL B-8129, uzyskanego sposobem opi¬ sanym w przykladzie I punkt c). Zaszczepiona mie¬ szanine inkubuje sie w temperaturze 28°C w ciagu 168 godzin, mieszajac, w celu zapewniania wzrostu glebinowego.Pozadane jest utrzymywanie wartosci pH na po¬ ziomie okolo 5,0 przez dodanie wodorotlenku sodo¬ wego lub kwasu, na przyklad kwasu solnego. Postep bioprzeksztalcenia sledzi sie metoda chromatogra¬ ficzna na plytkach pokrytych zelem krzemionko¬ wym, stosujac jako uklad rozpuszczalników mie¬ szanine cykloheksanu i octanu etylu w stosunku objetosciowym 3:2.Po zakonczeniu bioprzeksztalcenia otrzymany pro¬ dukt izoluje sie w nastepujacy sposób. Mieszanine ekstrahuje sie chlorkiem metylenu. Uzyskany ekstrakt saczy sie przez warstwe ziemi okrzemko¬ wej i z przesaczu oddestylowuje sie calkowicie roz¬ puszczalnik. Sucha pozostalosc przesaczu umieszcza sie w 10% roztworze chloroformu w rozpuszczalni¬ ku Skellysolve B i poddaje sie chromatografii na zelu krzemionkowym, przy uzyciu jako ukladu roz¬ wijajacego mieszaniny rozpuszczalnika Skellysolve B ze stopniowo wzrastajaca iloscia octanu etylu.Tym sposobem wymywa sie zwiazek o wzorze 1, po¬ siadajacy wartosc Rf=0,37 oznaczona metoda chro¬ matografii cienkowarstwowej przy uzyciu jako ukladu rozpuszczalników mieszaniny cykloheksanu i octanu etylu w stosunku 3:2. Zwiazek o wzorze 1 ma temperature topnienia 100—112°C. 10 Przyklad III. Stosujac cholesterol zamiast si¬ tosterolu i postepujac sposobem opisanym w przy¬ kladzie II otrzymuje sie zwiazek o wzorze 1.Przyklad IV. Stosujac stigmasterol zamiast 5 sitosterolu i postepujac sposobem opisanym w przy¬ kladzie I otrzymuje sie zwiazek o wzorze 1.Przyklad V. Stosujac-kampesterol zamiast si¬ tosterolu i postepujac sposobem opisanym w przy¬ kladzie II otrzymuje sie zwiazek o wzorze 1.Przyklad VI. Stosujac lacznie z sitosterolem kpmbinacje któregokolwiek ze steroli wymienionych w przykladach II—V lub zamiast sitosterolu i po¬ stepujac sposobem opisanym w przykladzie II 15 35 otrzymuje sie zwiazek o wzorze 1.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób selektywnego wytwarzania hemiketalu 20 3aa-4-4a-[3*-propionylo]-7a|3-metyloszesciowodoro- indanodionu-1,5 o wzorze 1 polegajacy na hodowa¬ niu Mycobacterium fortuitum NRRLB-8129 w wod¬ nej pozywce, w warunkach tlenowych, w obecnosci sterydu ewentualnie zawierajacego alkilowy lancuch 25 boczny o 2-^10 atomach wegla, znamienny tym, ze wartosc pH pozywki utrzymuje sie w zakresie okolo 3,0—6,0. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako steryd stosuje sie sitosterol, cholesterol, stig- 30 masterol, kampesterol, androsteno-4-dion-3,17, an- drostadieno-l,4-dion-3,17, dehydoroepiandrosteron, testosteron lub kwas typu bisnor. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze szczep Mycobacterium fortuitum NRRL B-8129 ho¬ duje sie w wodnej pozywce, w warunkach tleno¬ wych, w obecnosci mieszaniny dwóch lub wiekszej liczby sterydów. 4. Sposób wedlug zastrz. 3, znamienny tym, ze 40 jako mieszanine sterydów stosuje sie mieszanine sterydów takich jak sitosterol, cholesterol, stigma¬ sterol, kampesterol, androsteno-4-dion-3,17, andro- stadieno-l,4-dion-347, dehydoroepiandrosteron, tes¬ tosteron i kwas typu bisnor. 45 5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie pozywke o wartosci pH 5,0.110 996 Wzór 1 LDA. Zaklad 2. Zam. 587/81. Naklad 110 egz.Cena 45 zl PL PL PL PL