PL113855B1 - Method of isolation of tetracyclines - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób izolacji te¬ tracyklin, powstalych w wyniku biosyntezy, z bul¬ ionu po oddzieleniu go od biomasy badz z lugów po wytraceniu zasad technicznych. Tetracykliny stanowia grupe antybiotyków pokrewnych pod wzgledem chemicznym i o zblizonych wlasnosciach fizycznych. Antybiotyki te maja czteropierscie- niowy uklad oparty na szkielecie tetracykliny, jest to uklad typu naftacenu. Róznice w budowie che¬ micznej tetracyklin dotycza wegli 5,6,7, pierscienia naftacenowego. Podstawowymi antyniotykami tej grupy sa: tetracyklina, oksyteracyklina i chloro- tetracyklina.Tetracykliny wytwarzane sa na drodze biosyn¬ tezy przez szereg drobnoustrojów z grupy promie¬ niowców jak: Streptomyces aureofaciens, Strepto- myces rimosus, Streptomyces armillatus badz ich mutanty. Odpowiednio wyhodowane kultury pro¬ mieniowców wprowadza sie do tanków produk¬ cyjnych do zloza pozywki. W okresie fermentacji wymagajacej odpowiedniego czasu i temperatury w.zaleznosci od uzytego szczepu i skladu pozywki, powstaje odpowiedni antybiotyk.Tetracykliny tworza podczas procesu fermentacji trudno rozpuszczalne w wodzie sole z jonami wap¬ nia i magnezu znajdujacymi sie w brzeczce. W cza¬ sie procesu biosyntezy zwiazki te okludowane sa na grzybni tak, ze ich stezenie w plynie fermenta¬ cyjnym nie jest zbyt wysokie. Po zakonczeniu fer¬ mentacji, w celu zwolnienia antybiotyku w sól 10 15 25 30 rozpuszczalna w wodzie, brzeczke zakwasza sie kwasem szczawiowym lub siarkowym do pH ok. 2 i poddaje odsaczeniu od biomasy, najczesciej na filtrach obrotowych. Po odsaczeniu od biomasy uzyskuje sie klarowna ciecz, zwana bulionem, za¬ wierajaca rozpuszczalne w wodzie sole antybiotyku.Istnieje obecnie kilka metod wydzielania tetra¬ cyklin z bulionu i nastepnie ich oczyszczania. Sto¬ sowane sa metody ekstrakcyjne, wymiany jonowej oraz metody straceniowe. W przemysle najczesciej stosuje sie metody straceniowe, obejmujace dwa sposoby izolacji (wydzielania). Sppsób pierwszy polega na wytraceniu nierozpuszczalnego kom¬ pleksu tetracyklin. W tym celu cjp ^u^iofiu dodaje sie 0,5—1% soli czwartorzedowej zasady amoniowej np. bromku centylopirydynowego i soli magnezu.Wytraca sie osad zawierajacy zwiazek komplekso¬ wy antybiotyku, który odsacza sie i po przemyciu woda, rozpuszcza w roztworze kwasu szczawiowego i solnego, oczyszcza weglem aktywnym i wytraca techniczna zasade podwyzszajac pH roztworu do wartosci 4,0—4,5, dodajac wodnego roztworu amo¬ niaku.Inny sposób straceniowy polega na bezposrednim wytraceniu zasady z bulionu. Metoda ta wymaga jednak wczesniejszego usuniecia bialek, barwni¬ ków oraz wapnia, co osiaga sie przez traktowanie bulionu zelazocyjankiem potasu i siarczanem cyn- k\i, a takze kwasem szczawiowym. Nastepnie, po odsaczeniu powstalych osadów, wytraca sie zasade 113 8553 podnoszac pH roztworu do 4,0—5,0 woda amonia¬ kalna.Otrzymana surowa zasada rozpuszcza sie pow¬ tórnie w kwasie i znów wytraca celem dodatko¬ wego oczyszczania. Omówiona metoda, poza ko¬ niecznoscia stosowania szeregu klopotliwych ope¬ racji technologicznych, posiada bardzo powazna zasadnicza wade, cechuje sie mianowicie znacznymi stratami antybiotyku. Lugi po wytraceniu i odsa¬ czeniu surowych tetracyklin zawieraja przecietnie od 1000 do 1500 jd/cm8 (jednostek miedzynarodo¬ wych na cm8) antybiotyku, jest to ilosc siegajaca niekiedy 25% zawartosci antybiotyku w brzeczce.Znane sa równiez metody izolacji tetracyklin na wymieniaczach jonowych.Metody jonitowe bazuja na tym, ze tetracykliny posiadaja charakter amfoteryczny. Sa one wychwy¬ tywane na grupach funkcyjnych silnie kwasnych kationitów. Izolacja tetracyklin na wymieniaczach jonowych przebiega z dobra wydajnoscia. Metody jonitowe maja jednak dwie zasadnicze wady. Tetra¬ cykliny sa nietrwale zarówno w srodowisku silnie kwasnym jak i zasadowym. Czasteczki tetracyklin zasorbowane na grupach funkcyjnych silnie kwas¬ nych kationitów ulegaja czesciowo procesowi odbu¬ dowy glównie do dehydrotetracyklin. Proces de¬ sorpcji tetracyklin z kationitu wymaga przemy¬ wania zloza wodnymi badz niewodnymi roztwo¬ rami wodorotlenków, co z kolei powoduje alka¬ liczny rozklad czasteczki. Opisane trudnosci sa po¬ wodem, ze metody izolacji tetracyklin na wymie¬ niaczach jonowych nie zostaly w wiekszej skali zastosowane w przemysle.W wyniku szeregu przeprowadzonych prac stwier¬ dzono, ze podczas procesu biosyntezy poza tetra- cyklinami powstaja, ogólnie biorac dwie grupy produktów ubocznych. Pierwsza grupa to wielo- czasteczkowe substancje barwne o niezidentyfiko¬ wanej budowie trudno rozpuszczalne w wodzie albo dosc dobrze rozpuszczalne w wodnych roztworach tetracyklin. Sa to substancje stanowiace glównie zródlo zanieczyszczen tetracyklin, trudnych do usuniecia zarówno przy stosowaniu metod ekstrak¬ cyjnych, wytraceniowych jak i jonitowych.Druga grupa produktów ubocznych to substancje maloczasteczkowe bedace czesciowo produktami odbudowy tetracyklin a takze nieprzeferrrientotyine skladniki pozywki. Istnieje caly szereg adsorben¬ tów zarówno naturalnych jak i syntetycznych wy¬ kazujacych dr:e zdolnosci adsorbowania tetra¬ cyklin. Niestety jak stwierdzono, wszystkie dostep- v ne i przebadane adsorbenty wykazujace duge po¬ winowactwo do czasteczki tetracyklin równiez bardzo dobrze adsorbuja produkty uboczne a w szczególnosci wielkoczasteczkowe substancje barw¬ ne. Eluaty uzyskiwane z takich adsorbentów na drodze desorpcji sa bardzo silnie zanieczyszczone i wydzielenie z nich antybiotyków jest bardzo trudne, poza tym wydzielone antybiotyki sa rów¬ niez silnie zanieczyszczone. Próby selektywnej desorpcji daly efekty bardzo nieznaczne.W trakcie przeprowadzanych prób, stwierdzono jednak nieoczekiwanie, ze slabozasadowe zywice anionowymienne zastosowane w formie zabloko¬ wanych grup funkcyjnych np. typu Wofatyt AD-41 o 855 l "" lub Acyberlist AD-21 wykazuja bardzo niewielka zdolnosc adsorpcji tetracyklin, natomiast silnie adsorbuja zanieczyszczenia, glównie wielkoczastecz¬ kowe substancje barwne. Na tych stwierdzeniach s oparty zostal sposób wedlug wynalazku. Polega on na tym, ze bulion po odfiltrowaniu biomasy w sro¬ dowisku kwasnym przy pH 1,5—5,6 zawierajacy rozpuszczony chlorek badz siarczan tetracyklin i produkty uboczne (zanieczyszczenia) przepuszcza i© sie przez uklad co najmniej dwóch kolumn pracu¬ jacych szeregowo, z których pierwsza wypelniona jest anionitem, którego grupy funkcyjne sa zablo¬ kowane anionem kwasu mineralnego, na przyklad w formie chlorkowej lub siarczanowej, natomiast 13 nastepna badz nastepne kolumny wypelnione sa makroporowata zywica adsorpcyjna, do której tetracykliny wykazuja duze powinowactwo.Zasorbowana tetracykline z kolumny wypelnio¬ nej zywica adsorpcyjna desorbuje sie przez prze- 2Q mywanie 15—40% roztworem acetonu lub meta¬ nolu zakwaszonym kwasem mineralnym do pH okolo 1—5. W takich warunkach desorpcji ulegaja prawie wylacznie tetracykliny, które wydziela sie z eluatów znana metoda stosujac zmiane pH. 25 Nastepnie zloze zywicy adsorpcyjnej przemywa sie acetonem bezwodnym lub czystym metanolem badz wodnymi ich roztworami o zawartosci wody nie wiekszej jak 40% w celu usuniecia zasorbowa- nych zanieczyszczen i przygotowania kolumny do 33 nastepnego cyklu pracy.Desorpcje zanieczyszczen z kolumny anionitowej przeprowadza sie podobnie jak zanieczyszczen z zywic adsorpcyjnych stosujac czyste rozpuszczal¬ niki niewodne badz tez rozpuszczalniki z niewielka 35 iloscia wody, przy czym korzystne jest zakwasze¬ nie roztworu.Stwierdzono nieoczekiwanie, ze zloze anionitu zablokowane anionem kwasu mineralnego adsor- buje wiekszosc zanieczyszczen, glównie wielkocza- 40 steczkowych substancji barwnych; nieznaczne ilosci zanieczyszczen, byc moze o innej budowie cza¬ steczki badz o mniejszym ciezarze czasteczkowym, przechodza przez zloze kolumny anionitowej i zos¬ taja zasorbowane razem z tetracyklinami na zywicy 45 adsorpcyjnej. Stwierdzono jednak, ze substancje te sa bardzo slabo desorbowane przez zakwaszone wodne roztwory rozpuszczalników organicznych, takich jak na przyklad aceton czy metanol.Jako zywice adsorpcyjna stosuje sie korzystnie 50 niepolarna, hydrofobowa, syntetyczna zywice ad- ) sorpcyjna o duzej powierzchni wlasciwej typu Amberlit XAD-4 lub XAD-2. Ze wzgledu na amfo¬ teryczny charakter tetracyklin mozna je adsorbo- wac równiez na adsorbentach hydrofilowych sred- nio badz silnie polarnych jednakze wówczas naste¬ puje równiez sorbowanie znacznych ilosci niskocza- steczkowych produktów ubocznych.Sposób wedlug wynalazku moze byc stosowany samodzielnie do izolacji tetracyklin z bulionu uzys- eo kanego z brzeczki po oddzieleniu biomasy, badz tez jako metoda uzupelniajaca przy istniejacych . innych .metodach izolacji do wychwytywania i wy¬ dzielania resztek antybiotyków z lugów i scieków ppotlukcyjnych. Stosowanie jej umozliwia osiag¬ ne niecie wysokich wydajnosci izolacji i oczyszczania.113 8W 5 Przyklad I. Bulion po biosyntezie oksytetra¬ cykliny (po odsaczeniu biomasy) o pH 1,9 zawiera¬ jacy 5670 jd/cm3 antybiotyku przepuszczano przez uklad trzech kolumn. Pierwsza kolumna wypel¬ niona byla makroporowata zywica anionowymien- na w formie chlorkowej (typ: Wofatyt AD-41).Dwie pozostale kolumny wypelnione byly makropo¬ rowata syntetyczna zywica sorpcyjna o wlasci¬ wosciach hydrofobowych (Amberlit XAD-4). Lugi przepuszczano przez uklad kolumn z predkoscia 4 objetosci na objetosc zloza na godzine.Po przepuszczeniu przez kolumny okolo 25 obje¬ tosci cieczy liczac na objetosc zloza jednej kolumny, stwierdzono, ze wyciek po kolumnie 2 zawieral 4900 jd/cm8 antybiotyku, natomiast wyciek po ko¬ lumnie 3—85 jd/cm8. W tym momencie cykl sorpcji uznano za zakonczony i kolumne, która pracowala jako druga poddano desorpcji w celu odzysku oksy¬ tetracykliny oraz zregenerowaniu powierzchni ad¬ sorbentu. Desorpcje antybiotyku oraz regeneracje powierzchni absorbentu przeprowadzono w sposób nastepujacy: Przez zloze kolumny przepuszczono od góry wodny roztwór acetonu o zawartosci 30% acetonu zakwaszony kwasem siarkowym do pH 1,5.Po odebraniu okolo 2 objetosci cieczy rozpoczeto odbieranie wlasciwej frakcji eluatu. Roztwór wod- no-acetonowy przepuszczono z predkoscia 1,5 obje¬ tosci zloza na godzine. Ogólem przez zloze prze¬ puszczono 1,5 objetosci roztworu wodno-acetono- wego liczac na objetosc zloza w kolumnie.Nastepnie zloze przemywano acetonem bezwod¬ nym w ilosci 1 objetosc na objetosc zloza w celu usuniecia zanieczyszczen. Ciemno zabarwiony wy¬ ciek acetonowy odbierano osobno i kierowano do odzysku acetonu. Z frakcji eluatu zawierajacego oksytetracykline wydzielano antybiotyk przez pod¬ wyzszenie pH znana metoda. Kolumne pierwsza za¬ wierajaca anionit w formie chlorkowej regeneruje sie po stwierdzeniu, ze zloze nie sorbuje juz za¬ nieczyszczen barwnych. Regeneracje taka przepro¬ wadza sie po 3—4 cyklach sorpcji.Regeneracje zloza anionitu przeprowadzano w sposób podobny z ta róznica, ze przemywano je acetonem o zawartosci 20°/§ wody zakwaszonym do pH ok. 2. Przez zloze przepuszczano 2 objetosci acetonu i caly wyciek kierowano do odzysku ace¬ tonu znana metoda. Po przemyciu zloza acetonem, zarówno w przypadku regeneracji kolumny pierw¬ szej jak i- drugiej zloze przemywano nastepnie woda w ilosci 4 objetosci na objetosc zloza w celu odmycia acetonu.Przyklad II. Przez uklad trzech kolumn po¬ dobnie jak w przykladzie I przepuszczano lugi po wytraceniu technicznej tetracykliny o zawartosci r.ntybiotyku 810 jd/cm8. Lugi przepuszczano z pred¬ koscia 5 objetosci na objetosc zloza na godzine do chwili, kiedy po drugiej kolumnie stezenie anty- 5 biotyku wynosilo 520 jd/cm8. Nastapilo to po prze¬ puszczeniu 150 objetosci cieczy, po czym druga kolumne odlaczono do odzysku antybiotyku.Desorpcje tetracykliny prowadzono w sposób po¬ dobny jak w przykladzie I z ta róznica, ze stoso- 19 wano wodno-acetonowy roztwór o zawartosci 20% acetonu zakwaszony kwasem solnym do pH 1,5.Przyklad III. Przez uklad kolumn podobnie jak w przykladzie I i II przepuszczano lugi po wytraceniu technicznej oksytetracykliny (metoda 1S wytraceniowa) o pH 5,2 i zawartosci antybiotyku 1100 jd/cm8.Lugi przepuszczano z predkoscia 4 objetosci po¬ dobnie jak w przykladzie I do chwili kiedy wyciek po drugiej kolumnie zawieral 850 jd/cm8 antybio- 20 tyku. Nastapilo to po przepuszczeniu 150 objetosci cieczy. Desorpcje antybiotyku prowadzono w spo¬ sób podobny jak w przykladzie I z ta róznica, ze stosowano wodno-metanolowy roztwór o zawar¬ tosci 25% metanolu, zakwaszony kwasem siarko- u wym do pH 3,5.Regeneracje zloza anionitu przeprowadzono rów¬ niez w sposób podobny jak w przykladzie I z tym, ze zamiast acetonu stosowano alkohol metylowy o zawartosci 10% wody, zakwaszony kwasem siar- M kowym do pH 2.Zastrzezenie patentowe Sposób izolacji tetracyklin z wodnego roztworu M soli tych zwiazków znajdujacych sie w bulionie lub w lugach uzyskanych po wytraceniu tetra¬ cyklin technicznych przy uzyciu zywic sorpcyjnych i jonowymiennych, znamienny tym, ze wodny roz¬ twór soli tetracyklin majacy odczyn kwasny o pH 1,5—5,6 przepuszcza sie przez zloze slabozasado- wego anionitu, którego grupy funkcyjne sa zablo¬ kowane anionem kwasu mineralnego, nastepnie z wycieku antybiotyk sorbuje na zlozu mafcroporo- watej zywicy sorpcyjnej, po czym desorbuie prze- mywajac^ zloze 15—40% wodnym roztworem ace¬ tonu lub metanolu zakwaszonym cfo pH 1—3 i z eluatu wydziela sie czysty zwiaze^ znanym * sposobem, a zloze anionitu i makroporowatej zy¬ wicy sorpcyjnej przemywa sie acetonem bezwod¬ nym lub metanolem badz wodnym roztworem tych substancji o zawartosci powyzej 60% acetonu lub metanolu, przy czym korzystne jest zakwaszenie roztworu.CZYTELNIA PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób izolacji tetracyklin z wodnego roztworu M soli tych zwiazków znajdujacych sie w bulionie lub w lugach uzyskanych po wytraceniu tetra¬ cyklin technicznych przy uzyciu zywic sorpcyjnych i jonowymiennych, znamienny tym, ze wodny roz¬ twór soli tetracyklin majacy odczyn kwasny o pH 1,5—5,6 przepuszcza sie przez zloze slabozasado- wego anionitu, którego grupy funkcyjne sa zablo¬ kowane anionem kwasu mineralnego, nastepnie z wycieku antybiotyk sorbuje na zlozu mafcroporo- watej zywicy sorpcyjnej, po czym desorbuie prze- mywajac^ zloze 15—40% wodnym roztworem ace¬ tonu lub metanolu zakwaszonym cfo pH 1—3 i z eluatu wydziela sie czysty zwiaze^ znanym * sposobem, a zloze anionitu i makroporowatej zy¬ wicy sorpcyjnej przemywa sie acetonem bezwod¬ nym lub metanolem badz wodnym roztworem tych substancji o zawartosci powyzej 60% acetonu lub metanolu, przy czym korzystne jest zakwaszenie roztworu. CZYTELNIA PL