Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania 1-N-alkilowanych pochodnych kanamycyny o ogól¬ nym wzorze 1, w którym R oznacza grupe amino¬ wa albo hydroksylowa, a R1 oznacza nizszy rodnik alkilowy, w którym dowolny atom wegla, za wy¬ jatkiem atomu wegla zwiazanego z atomem azotu, moze byc ewentualnie podstawiony grupa hydro¬ ksylowa lub aminowa.Przyklady 1-N-alkilowanych pochodnych kana¬ mycyny sa znane z brytyjskiego opisu patentowe¬ go nr 1464 401 i z belgijskiego opisu patentowego nr 855 709. Przy wytwarzaniu tych zwiazków z la¬ two dostepnej kanamycyny wytwarzanej droga fermentacji, pozadane jest zabezpieczenie wszys¬ tkich grup aminowych za wyjatkiem grupy ami¬ nowej w pozycji 1, gdyz to umozliwia nastepnie alkilowanie przede wszystkim w pozycji 1, dzieki czemu upraszcza sie znacznie ostateczne wyosob¬ nianie produkcji podstawionego przy atomie azotu w pozycji 1.Wynalazek umozliwia wytwarzanie 1-N-podsta- wionych pochodnych kanamycyny z nowych po¬ chodnych kamycyny, w których atomy azotu sa selektywnie zabezpieczone.Zgodnie z wynalazkiem, zwiazki o ogólnym wzo¬ rze 1, w którym R i R1 maja wyzej podane zna¬ czenie, wytwarza sie w ten sposób, ze alkiluje sie zwiazek o ogólnym wzorze 2, w którym R2 ozna¬ cza grupe formylowa. R3 oznacza grupe alkanokar- bonylowa o 2—4 atomach wegla lub grupe benzo- 10 15 20 25 ilowa, a R" oznacza grupe hydroksylowa lub grupe o wzorze —NHR3 w którym R3 ma wyzej podane znaczenie, po czym w otrzymanym zwiazku o ogól¬ nym wzorze 3, w którym R1, R2, R8 i R4 maja wy¬ zej podane znaczenie, odszczepia sie grupy zabez¬ pieczajace R2 i R3 i wyosobnia zwiazek o wzo¬ rze 1.Stosowane tu okreslenie „nizszy rodnik alkilowy" oznacza rodnik alkilowy o 1—6 atomach wegla i o ladunku prostym albo rozgalezionym. Szcze¬ gólnymi przykladami podstawionych nizszych rod¬ ników alkilowych sa grupy takie jak grupa /S/-4- -amino-2-hydroksybutylowa i 1,3-dwuhydroksypro- pylowa-2. Grupa zabezpieczajaca R8 korzystnie oznacza grupe acetylowa.Proces wytwarzania zwiazków o wzorze 1 obej¬ muje poczatkowe stadium alkilowania zwiazku o wzorze 2 w celu wprowadzenia podstawnika R1 do grupy aminowej w pozycji 1. Reakcje te pro¬ wadzi sie licznymi, znanymi sposobami, np. droga redukcyjnego alkilowania przy uzyciu odpowied¬ niego aldehydu albo ketonu.Drugie stadium procesu stanowi usuwanie grup zabezpieczajacych R8 z grupy 2'-aminowej, jezeli taka grupa jest obecna i z grup aminowych w po¬ zycjach 6' i 3", jak równiez usuwanie grupy for¬ mylowej z grupy aminowej w pozycji 3. Jezeli podstawnik przy atomie azotu w pozycji 1 jest pod¬ stawiony grupa aminowa, wówczas moze byc po¬ zadane zabezpieczac te grupe podczas procesu, 114 954114 954 a nastepnie dopiero usuwac równiez i te grupe za¬ bezpieczajaca w koncowym stadium procesu. Znane sa rózne sposoby calkowitego usuwania grup za¬ bezpieczajacych grupy aminowe, zaleznie od ich charakteru i srodowiska, w którym znajduje sie 5 amina z grupami zabezpieczajacymi. Srodowisko to moze byc bezWO(JTjE^lub zawierac wode, a niekiedy moze byc w róznym stopniu kwasne albo zasa¬ dowe. Na przyklad,* grupe benzylowa mozna od- szczepiac droga kalklityczn^j hydrogenolizy, pro- 10 wadzonej znanymi* sposobami w obecnosci palla¬ dowego katalizatora*: Zabezpieczajace grupy alka- nokarbonylowe i grupe benzoilowa mozna, ogólnie biorac, odszczepiac przez hydrolize w srodowisku lagodnie zasadowym, np. dzialajac rozcienczonym 15 wodorotlenkiem sodowym w temperaturze 65°C w ciagu kilku godzin.Przykladem zastosowania procesu wedlug wyna¬ lazku jest wytwarzanie l-N-/S/-4-amino-2-hydro- ksybutylo/-kanamycyny A. W tym przypadku, 20 wyjsciowa pochodna kanamycyny o wzorze 2, w którym R4 oznacza grupe hydroksylowa i R8 ozna¬ cza grupe acetylowa, poddaje sie redukujacemu alkilowaniu, stosujac np. odpowiedni aldehyd. Tak np. 3-benzylo-6-/S/-dwuhydroksymetyloczterowodo- 25 ro-l,3-oksazynon-2 mozna alkilowac redukujaco za pomoca wodorku borosodowego lub korzystnie cyjanoborowodorku sodowego jako srodka reduku¬ jacego. W celu uzyskania pewnosci, ze reakcja z wolna grupa aminowa w pozycji 1 zajdzie cal- 30 kowicie, mozna stosowac nadmiar aldehydu lub innego zwiazku alkilujacego oraz srodka reduku¬ jacego. Odpowiednimi rozpuszczalnikami sa uwod¬ niony metanol i uwodniony dioksan, ale mozna tez stosowac dwumetyloformamid lub sulfotlenek dwu- metylu. Reakcje prowadzi sie zwykle w tempera¬ turze pokojowej, przy czym dobiega ona konca w ciagu 5—6 godzin.Surowy produkt reakcji wyosobnia sie przez odparowanie rozpuszczalnika i w razie potrzeby oczyszcza przez przekrystalizowanie lub chromato¬ graficznie. Przewaznie jednak surowy produkt pod¬ daje sie drugiemu etapowi procesu, a mianowicie, rozpuszcza sie go w rozcienczonym wodorotlenku sodowym i utrzymuje w temperaturze 65°C w ciagu okolo 5 godzin, w celu usuniecia grup za¬ bezpieczajacych, to jest formylowej i acetylowej.Po zobojetnianiu produkt korzystnie oddziela sie od substancji nieorganicznych i poddaje w zwykly sposób katalitycznemu uwodornianiu, w celu usu¬ niecia zabezpieczajacej grupy benzylowej. Do cal- °° kowitego usuniecia tej grupy wystarcza zwykle prowadzenie reakcji w ciagu 4—5 go.dzin w tem¬ peraturze 60°C i pod cisnieniem 425 • 104 Pa po czym produkt poddaje sie zwyklej obróbce i w razie potrzeby oczyszcza sie chromatograficznie. 55 Poniewaz w wyjsciowym produkcie o wzorze 2 jest tylko jedna grupa aminowa zdolna do reakcji, przeto produkt koncowy jest praktycznie wylacz¬ nie izomerem podstawionym w pozycji 1, totez unika sie trudnego rozdzielania izomerów.Opisany wyzej proces mozna tez prowadzic ana¬ logicznie stosujac 2', 3", 6'-trój-N-aeetylo-3-formy- iokanamycyne B, przy czym otrzymuje sie odpo¬ wiednia pochodna kanamycyny B podstawiona przy atomie azotu w pozycji 1. 35 40 45 60 65 Proces alkilowania mozna takze prowadzic sto¬ sujac aldehyd lub keton podstawiony grupa hydro¬ ksylowa i otrzymujac pochodne kanamycyny pod¬ stawione przy atomie azotu w pozycji 1 grupa hydroksyalkilowa, znane z belgijskiego opisu pa¬ tentowego nr 855 709. Tak np. stosujac 1,3-dwuhy- droksyaceton otrzymuje sie zwiazek o wzorze 1, w którym R1 oznacza grupe 1,3-dwuhydroksypro¬ pylowa-2.Zwiazki o wzorze 2 sa zwiazkami nowymi, które wytwarza sie z 3", 6'-dwu-N-acylokanamycyny A lub z 2', 3", 6'-trój-N-acylokanamycyny B o wzo¬ rze 2a formylujac najpierw nie podstawione grupy aminowe w pozycjach 1 i 3, a nastepnie prowa¬ dzac selektywna hydrolize, która, jak nieoczeki¬ wanie stwierdzono, powoduje tylko usuniecie grupy formylowej przy grupie aminowej w pozycji 1, bez naruszenia grupy formylowej w pozycji 3.Wytwarzanie odpowiednich pochodnych acylo- wych kanamycyny majacych w grupach amino¬ wych w pozycjach 3" i 6' w kanamycynie A i o- prócz tego w grupie aminowej w pozycji 2' w ka¬ namycynie B podstawniki w postaci grup alkano- karbonylowych o 2—4 atomach wegla lub w po¬ staci grupy benzoilowej, jest znane z belgijskiego opisu patentowego nr 853 564. W opisie tym poda- ' na np. wytwarzanie 3", 6'-dwu-N-acetylokanamy- cyny A droga selektywnej migracji grupy acety¬ lowej od atomu tlenu do atomu azotu. Inne po¬ chodne mozna wytwarzac w podobny sposób.Stosujac jako produkt wyjsciowy 3", 6'-dwu-N- -acetylokanamycyne A otrzymuje sie zwiazki o wzorze 2, w którym R8 oznacza grupe acetylowa i R4 oznacza grupe hydroksylowa, a podobnie z 2', 3", 6'-trój-N-acetylokanamycyny B mozna wytwa¬ rzac zwiazki o wzorze 2, w którym R4 oznacza grupe o wzorze —NHR8, w którym R8 oznacza grupe acytylowa.Wspomniana w przykladach analize metoda chromatografii cienkowarstwowej przy uzyciu ply¬ tek krzemionkowych i okreslonego kazdorazowo ukladu rozpuszczalników. Plamy uwodornia sie po wysuszeniu plytek i zroszeniu ich 5% roztworem podchlorynu III — rzed, butylu w cykloheksanie, a nastepnie wysuszeniu w przewietrzanej suszarce w temperaturze 100°C w ciagu 10 minut, ochlo¬ dzeniu i zroszeniu roztworem skrobia-jodek po¬ tasowy.Próby metoda cienkowarstwowej elektroforozy prowadzi sie na plytkach krzemionkowych o wy¬ miarach 20 cm, przy róznicy potencjalu 900 wolt stosowanej w ciagu 45 minut. Jako elektrolit sto¬ suje sie mieszanine kwasu mrówkowego z kwasem octowym, która daje wartosc pH 2, a wykrywanie prowadzi sie jak opisano wyzej. „Amberlita" i „Sephadex" sa to zarejestrowane jako znaki to¬ warowe nazwy zywicznych wymieniaczy jonowych.Przyklad I. Wytwarzanie l-N-/S/-4-amino-2- -hydroksybutylo/-kanamycyny A. 0,21 g cyjanoborowodorku sodowego w 40 ml wody dodaje sie w ciagu 5 godzin do 2,0 g 3", 6'-dwu-N-acetylo-3-N-formylokanamycyny A, 2,32 g 3-benzylo-g-(/S/-dwuhydroksymetyloczterowodoro- -2H-l,3-oksazynonu-2 i 0,1 siarczanu miedzi w 66 ml wody i 322 ml metanolu, po czym odparowuje sie mieszanine do sucha pod zmniejszonym cisnie-5 114 954 6 niem. Do pozostalosci dodaje sie 25 ml wody i 25 ml chlorku metylenu, faze wodna odparowuje do sucha i pozostalosc ogrzewa z 20 ml 3n roztworu wodorotlenku sodowego w temperaturze 65—70°C w ciagu 4 godzin. Nastepnie roztwór chlodzi sie i zobojetnia stezonym kwasem solnym pod wy¬ ciagiem /pary HCN/, po czym wprowadza na ko¬ lumne z 600 ml zywicznego wymieniacza jonowe¬ go Amberlita CS—50 /postac NH+4/, eluujac sub¬ stancje nieorganiczne woda i substancje amino- glikazylowe 0,2 n roztworem wodorotlenku amonu Frakcje aminoglikozylowe odparowuje sie do sucha, pozostalosc rozpuszcza w mieszaninie 13 ml metanolu, 13 ml kwasu octowego i 13 ml wody i uwodornia w obecnosci 0,4 g 5% palladu na we¬ glu drzewnym w. ciagu 4 godzin w temperaturze 60°C i pod cisnieniem 425 • 104 Pa. Nastepnie od¬ sacza sie katalizator, przesacz odparowuje do sucha i pozostalosc rozpuszczona w 20 ml wody chroma- tografuje na kolumnie z 200 ml zywicznego wy¬ mieniacza jonowego Amberlita CC—50 /postac NH+4/, eluujac roztworem wodorotlenku amono¬ wego o stezeniu 0,25—1,0 m/. Po odparowaniu glównych frakcji otrzymuje sie 0,75 g /37% wy¬ dajnosci teoretycznej/ 1-N-/ /S/-4-amino-2-hydro- ksybutylo/-kanamycyny A. Badania ^ia' drodze chromatografii cienkowarstwowej i cienkowarstwo¬ wej elektroforazy wykazuja, ze produkt jest iden¬ tyczny z próbka tego zwiazku otrzymanego zna¬ nym sposobem.Przyklad II. Wytwarzanie l-N-/l,3-dwuhydro- ksypropylo-2/-kanamycyny B.Do roztworu 8,8 g 2', 3", 6'-trój-N-acetylo-3-N- -formylokanamycyny B w 880 ml metanolu i 176 ml wody dodaje sie 4,0 -g. 1,3-dwuhydroksyacetonu i 3,9 g cyjanoborowodorku sodowego i wartosc pH roztworu doprowadza sie za pomoca 5 n kwasu solnego do 6,5. Roztwór utrzymuje sie nastepnie w stanie wrzenia pod chlodnica zwrotna w ciagu 18 godzin, chlodzi, dodaje dalsza porcje 4,0 g 1,3-dwu¬ hydroksyacetonu i 3,9 g cyjanoborowodorku sodo¬ wego, zakwasza ponownie kwasem solnym do war¬ tosci pH 5,5 i utrzymuje w stanie wrzenia pod chlodnica zwrotna w ciagu 6 godzin. Nastepnie odparowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem me¬ tanol i stezony roztwór wodny chromatografuje na kolumnie z zywicznego wymieniacza jonowego Amberlita 200 /postac NH+4/, eluujac woda. Frak¬ cje zawierajace zadana 2', 3", 6'-trój-N-acetylo-3- -N-formyló-l-N-/l,3-dwuhydroksypropylo-2/-kana- mycyne B laczy sie, steza do objetosci 40 ml, do¬ daje 40 ml 10 n roztworu wodnego wodorotlenku sodowego i utrzymuje na lazni parowej w ciagu 16 godzin. Ochlodzony roztwór zobojetnia sie ste¬ zonym kwasem solnym, dodaje wody do objeto¬ sci 1 litra i chromatografuje mieszanine na kolum¬ nie z 3 litrów zywicznego wymieniacza jonowego Amberlita 200 /postac NH+4/. Kolumne plucze sie woda, w celu usuniecia substancji nieorganicznych i nastepnie 1 n roztworem wodorotlenku amono¬ wego, w celu eluowania substancji aminoglikozy- dowych. Surowy produkt chromatografuje sie po¬ wtórnie na kolumnie z 2 litrów zywicznego wymie- 5 niacza jonowego Amberlita CG—50 /postac NH4+/, eluujac woda, 0,05 n wodnym roztworem wodoro¬ tlenku amonowego i ostatecznie 0,1 n wodnym roz¬ tworem wodorotlenku amonowego. Po odparowaniu glównych frakcji otrzymuje sie 3,2 g l-N-/l,3-dwu- 10 hydroksypropylo-2/-kanamycyny B. Badanie me¬ toda chromatografii cienkowarstwowej wykazuje, ze produkt jest identyczny z próbka tego zwiazku otrzymanego droga inna. 15 Zastrzezenia patentpwe 1. Sposób wytwarzania 1-N-alkilowanych po¬ chodnych kanamycyny o ogólnym wzorze 1, w któ¬ rym R oznacza grupe aminowa albo hydroksylowa, 20 a R1 oznacza nizszy rodnik alkilowy, w którym do¬ wolny atom wegla, za wyjatkiem atomu wegla zwiazanego z atomem azotu, moze byc ewentualnie podstawiony grupa hydroksylowa lub aminowa, znamienny tym, ze alkiluje sie nowy zwiazek o o- 25 gólnym wzorze 2, w którym R2 oznacza grupe for- mylowa, R8 oznacza grupe alkanokarbonylowa o 2—4 atomach wegla lub grupe benzoilowa, a R4 oznacza grupe hydroksylowa lub grupe o wzorze —NHR8, w którym R8 ma wyzej podane znacze- 30 nie, po czym w otrzymanym zwiazku o ogólnym wzorze 3, w którym R1, R2, R8 i R4 maja wyzej podane znaczenie, odszczepia sie grupy zabezpie¬ czajace R2 i R8 i wyosobnia zwiazek o wzorze 1. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze 35 w zwiazku o wzorze IR1 oznacza korzystnie grupe /S/-4-amino-2-hydroksybutylowa. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w zwiazku o wzorze IR1 oznacza korzystnie grupe l,3-dwuhydroksypropylowa-2. ^ 4. Sposób wedlug zastrz. 1 albo 2 albo 3, zna¬ mienny tym, ze w zwiazku o wzorze IR oznacza korzystnie grupe acetylowa. 5. Sposób wedlug zastrz. 4, znamienny tym, ze jako zwiazek o wzorze 2 stosuje sie 3", 6'-dwu-N- 45 -acetylo-3-N-formylokanamycyne A. 6. Sposób wedlug zastrz. 4, znamienny tym, ze jako zwiazek o wzorze 2 stosuje sie 2', 3", 6'-trój- -N-acetylo-3-N-formylokanamycyne B. 7. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w zwiazek o wzorze 2 alkiluje sie na drodze alkilo¬ wania redukujacego. 8. Sposób wedlug zastrz. 7, znamienny tym, ze alkiluje sie redukujaco 3-benzylo-6-/S/-dwuhydro- ksymetyloczterowodoro-l,3-oksazon-2. 55 9. Sposób wedlug zastrz. 7, znamienny tym, ^ze alkiluje sie redukujaco 1,3-dwuhydroksyacetonem. 10. Sposób wedlug zastrz. 7, znamienny tym, ze jako srodek redukujacy stosuje sie borowodorek sodowy lub cyjanoborowodorek sodowy.114 954 HO ^ CH2NH2 HO V yf " H- o HO H0_^c: ch2oh H,N O 2IN 3 H°v NHR1 WZÓR 1 HO^^ CH2NHR \NUo O WZdR 2a HO^, 9H2NHR -O CH9NHR3 NHR1 WZÓR 2 WZÓR 3 Bltk 367/82 r. 90 egz. A4 Cena 100 zl PL PL PL PL PL PL PL