Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania no¬ wego peptydu.Peptydy znajduja zastosowanie do wytwarzania srod¬ ków o dzialaniu terapeutycznym.Sposobem wedlug wynalazku wytwarza sie peptydy o wzorze ogólnym 1, w którym R1 oznacza atom wodoru, rodnik metylowy, allilowy, dwumetyloallilowy, propargi- lowy, cyklopropylometylowy, cyklobutylometylowy lub fenetylowy, B oznacza grupe -NH-CR3H-CO- o konfigu¬ racji D, w której R3 oznacza rodnik alkilowy o 1—6 ato¬ mach wegla lub grupe CqH2qYC, H2r+i, w której q oznacza liczbe 1—2, r oznacza liczbe 0—1, a Y oznacza atom tlenu, siarki, grupe SO lub S02, D oznacza grupe -NR5-CR6H-CO- o konfiguracji L, w -której R5 oznacza atom wodoru lub rodnik metylowy, R6 oznacza grupe aryloalkilowa o 1—3 atomach wegla w grupie alkilowej, R8 oznacza atom wodoru, rodnik alkilowy o 1—5 atomach wegla, rodnik arylowy lub aryloalkilowy o 1—2 atomach wegla, Rx oznacza grupe (CH2)~X, w której s oznacza liczbe 2^, a X oznacza grupe NHR9, N+R»R«R», NR9COR". NR»COORn, NR9CONH2, NR9CONRi°Rn, N(0)nRuRi2, COOR9, CONR9R10 lub OCONR9Ri°, w lctórej R9 oznacza atom wodoru, rodnik alkilowy o 1—3 atomach wegla, grupe arylowa lub arylo-CH2-, R10 oznacza atom wodoru lub grupe alkilowa o 1—3 atomach wegla, R11 oznacza grupe alkilowa o 1—3 atomach wegla, grupe arylowa lub arylo-CH2-, R12 oznacza rodnik alkilowy o 1—3 atomach wegla, R13 oznacza rodnik alkilowy o 1—3 atomach wegla, a n oznacza liczbe 0 lub 1 albo grupa o wzorze 2 oznacza grupe o wzorze 3, w której m oznacza liczbe 1—3, a Q oznacza grupe SO, S02, CO, CHOH, N + MeR11 lub N(0)Rn, grupa arylowa oznacza rodnik fenylowy, ewentualnie podstawiony atomem chloru, gru¬ pa metylowa, hydroksylowa lub metoksylowa oraz ich 5 sole addycyjne z kwasami.Jako przyklady grup (B) mozna wymienic: D-alanine, kwas D-a-aminomaslowy, D-waline, D-norwaline, D- -leucyne, D-norleucyne, D-seryne, D-treonine, D-me- tionine i sulfotlenek D-metioniny. io Jako przyklady grup D mozna wymienic: L-fenyloalanine i N-metylo-L-fenyloalanine.Korzystnie sposobem wedlug wynalazku wytwarza sie zwiazki o wzorze 1, w których R1 oznacza atom wodoru, rodnik metylowy, allilowy, dwumetyloallilowy, propar- 15 gilowy, cyklopropylometylowy, cyklobutylometylowy lub fenetylowy, B oznacza grupe -NH-CR3H-CO- o konfi¬ guracji D, w której R3 oznacza grupe alkilowa o 1—6 ato¬ mach wegla lub grupe CqH?qYCrH2r+i, w której q ozna¬ cza liczbe 1—2, r oznacza liczbe 0—1, a Y oznacza atom 20 tlenu, siarki, grupe SO lub S02, D oznacza grupe -NR5- -CR6H-CO-, o konfiguracji L, w której R5 oznacza atom wodoru lub grupe metylowa, R6 oznacza grupe aryloalki¬ lowa o 1—3 atomach wegla, R8 oznacza atom wodoru lub rodnik alkilowy o 1—5 atomach wegla, Rx oznacza 25 grupe (CH2)s-X, w której s oznacza liczbe 2—4, a X ozna¬ cza grupe NHR9, NR9COR", NR9CONH2, NR9CONR"Rn, N(0)nRnR12, COOR9, CONR9R1G, NR9COOR" lub OCONR9R10, w której R9 oznacza atom wodoru lub grupe alkilowa o 1—3 atomach wegla, R10 oznacza atom wpdoru 30 lub grupe alkilowa o 1—3 atomach wegla, Rli oznacza 114 981114 981 grupe alkilowa o 1—3 atomach wegla, R12 oznacza grupe alkilowa o 1—3 atoniach wegla, a n oznacza liczbe 0 lub 1, Ar oznacza grupe fenylowa, ewentualnie podstawiona atomem chloru, grupe metylowa, hydroksylowa lub me- toksylowa oraz ich sole addycyjne z kwasami. « 5 Symbole stosowane ponizej dla pochodnych aminokwa¬ sów sa powszechnie uzywane w chemii peptydów; opi¬ sane sa w publikacji w Biochem, J. 126, 773 (1972).Wszystkie reszty aminokwasów maja konfiguracje natu¬ ralna lub L, chyba, ze zaznaczono inaczejk 10 Zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wynalazku sto¬ suje sie do wytwarzania srodków o dzialaniu terapeutycz¬ nym zawierajacych wymienione zwiazki w postaci wolnej lub w postaci soli addycyjnych z kwasami w polaczeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym rozcienczalnikiem lub 15 nosnikiem. Odpowiednimi solami sa chlorowodorki, fos¬ forany, cytryniany ioctany. ~ Zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wynalazku wy¬ kazuja aktywnosc' farmakologiczna. Tak np. badania in vitro wykazaly, ze posiadaja one powinowactwo do re- 20 ceptorów dia leków makowcowych i dzieki temu mozna je stosowac jako srodki znieczulajace, przeciwnarkotycz- ne i przeciwbiegunkowe.Badanie stosowane do wykrywania aktywnosci anta- gonistycznej w miejscach receptorowych w stosunku do 25 leków makowcowych polega na stosowaniu preparatu z jelita kretego swinki morskiej stymulowanego przez scianki opisanego przez Kosterlitz'a i in. Brit. J. Pharmacol and Chemotherapy, 33, 266—276 (1968). ...' Zwiazki wytwarzane sposobem wedlug, wynalazku wy- 30 kazywaly tez dzialanie znieczulajace przy badaniu in vivo • np. w tescie fenylo-chinonowym anfy-skurczowym na myszach, opisanym przez Hendershota i in. J. Pharmac.Exp. Ther. 125, 237 (1959) oraz w tescie szarpniecia ogona na szczurach (przy podawaniu dozylnym), opi- 35 sanym przez Jansena i in. w Arzneim, Forsch. 13, 266 (1963). - Sposobem wedlug wynalazku wytwarza sie zwiazki o wzorze 1 na drodze kolejnego sprzegania odpowiednio zabezpieczonych i aktywowanych aminokwasów albo 40 stosujac konwencjonalne metody w roztworach lub w fazie stalej, albo na drodze sprzegania fragmentów, skladaja- . cych sie z odpowiednio zabezpieczonych peptydów.Stosowane techniki sa znane w chemii peptydów. Szcze¬ góly dotyczace wyboru grup zabezpieczajacych i sposobów 45 ich wbudowania ora2 odpowiednich warunków reakcji przy wytwarzaniu^ wiazan amidowych (peptydowych) oraz sposobów usuwania grup zabezpieczajacych opisane sa w nastepujacych publikacjach: Houben Weyl, „Metho- * den de Organischen Chemie", t. 16, Cz. I i II, Syntheses 50 von Peptiden (Thieme 1974), Schroder & Lubke „The Peptides" Academie Press (1965).Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze zwiazek o wzorze ogólnym Y-Mi-OH, W którym Y oznacza odpo¬ wiednia grupe zabezpieczajaca, a Mi oznacza odpowiednio 55 zabezpieczona reszte aminokwasu lub peptydu konden- suje sie ze zwiazkiem o wzorze 4, w którym Rx i R» maja wyzej podane znaczenie, a M2 oznacza odpowiednio za¬ bezpieczona reszte aminokwasu lub peptydu, przy czym Mi i M2 lacznie oznaczaja grupe -Tyr-B-Gly-D-lub jej 60 zabezpieczona pochodna, przy czym B i D maja wyzej podane znaczenie, a nastepnie usuwa sie grupy zabezpie¬ czajace.Laczenie zwiazku o wzorze Y-Mi-OH i zwiazku o wzo¬ rze 4 przeprowadza sie standardowymi metodami w syn- 65 tezie peptydów, ewentualnie z wyodrebnieniem aktywo¬ wanego skladnika odpowiadajacego zwiazkowi o wzorze Y-Mi-OH. Korzystnie, zabezpieczony dwupeptyd sprze¬ ga sie z amidem dwupeptydu z grupa C-terminalna lub zabezpieczony trójpeptyd z grupa N-terminalna sprzega sie z amidem aminokwasu z grupa C-terminalna, a nas¬ tepnie w kazdym przypadku usuwa sie grupy zabezpiecza¬ jace.Korzystna grupa zabezpieczajaca dla grupy NH- jest grupa IH-rzed.butyloksykarbonylowa, a szczególnie ko¬ rzystna grupa zabezpieczajaca dla grupy OH- jest rodnik III-rzed.biitylowy; obie te grupy mozna usuwac chloro¬ wodorem w rozpuszczalniku takim jak octan etylu lub kwas octowy lub kwas trójfluorpoctowy.Zwiazki o wzorze 1, w którym R^oznacza grupe (CH2)s- -X, a. X oznacza grupe N(0)RnR12 mozna tez wytwarzac z analogicznych zwiazków, w których X oznacza grupe NR11R12 przez utlenianie ich np. nadtlenkiem wodoru w rozpuszczalniku takim jak kwas octowy lub metanol.Podany sposób utleniania równiez stosuje sie do wy¬ tworzenia posrednich amidów aminokwasów lub amidów dwupeptydów zawierajacych grupe N(0)RnR12.Wynalazek ilustruja przyklady; (temperatury w przy¬ kladach podane sa w °C). W przykladach zastosowano nastepujace skróty: BOC — III-rzed.-butyloksykarbonyl Bu1 — III-rzed.butyl IBCF .— izobutylochloromrówczan Z — benzylooksykarbonyl DCCI — dwucykloheksylokarbodwuimid DCU — dwucykloheksylomocznik HONSu —N-hydroksysukcynimid NMM — D-metylomorfolina DMF — dwumetyloformamid DME — 1,2-dwumetoksyetan THF — czterowodorofuran • Rózne zwiazki i pólprodukty badano chromatografia cienkowarstwowa (t.l.c.) na plytkach z zelu krzemionko¬ wego (Kieselgel GF254) stosujac nastepujace mieszaniny: 1E —metanol, chloroform 1:2 1F — metanol, chloroform 1:19 2B — chloroform, metanol, kwas octowy 19:9:1- 3A — chloroform, metanol, kwas octowy, woda 60:18:2:3 3B — chloroform, metanol, kwas octowy, woda 30:18:4:6 3C — chloroform, metanol, kwas octowy, woda 90:27:2:3 3D — chloroform, metanol, kwas octowy, woda 30:20:2:3 4A — izobutanol, octan etylu, kwas octowy, woda 1:1:1:1 5B —izobutanol, kwas octowy, woda 3:1:1 7B — octan etylu, pirydyna, kwas octowy, woda 60:20:6:11 7C — octan etylu, pirydyna, kwas octowy woda 120:20:6:11 7D —octan etylu, pirydyna, kwas octowy- woda 240:20:6:11 7F — octan etylu, pirydyna, kwas octowy woda 480:20:6:11 8A —chloroform, izopropanol 3:1 8B —chloroform, izopropanol 9:1 Przyklad I. Wytwarzanie L-tyrozylo-Chalanilogli- cylo-L-fenyloalanino-2-acetamido-etyloamidu. Zwiazek ten5 wytwarzano sposobem przedstawionym na schemacie 1. 1) BOC-Phe-NHCH2CH2NHCOCH3.BOC-Phe-OH (2,65 g) rozpuszczono w CH2CI2 (20 ml), . roztwór ochlodzono do —20°C, po czym dodano NMM (1,01 g) i IBCF (1,37 g), a nastepnie H2NCH2CH2NH..COCH3 (1,2 g) po 2 minutach. Mieszanine reakcyjna doprowadzono do temperatury pokojowej i mieszano 21 godzin, nastepnie odparowano rozpuszczalnik i gumo¬ wata pozostalosc rozpuszczono w chloroformie. Roztwór przemyto nasyconym roztworem NaHC03, 10% wodnym kwasem cytrynowym i woda do odczynu obojetnego, a w koncu nasyconym roztworem solanki. Faze organiczna wysuszono (Na2S04) i odparowano do uzyskania stalego produktu, który krystalizowano z octanu etylu. Otrzymano amid (1), 3,0 g Rf 7F 0,35. 2) Cl-H +Phe-NHCH2CH2NHCOCH3.BOC-Phe-NHCH2CH2NHCOCH3 (3 g) rozpuszczono w 5 M HCl w octanie etylu (20 ml) i 2,6 M HC1 w kwasie octowym (5 ml) i mieszano 30 min, w temperaturze po¬ kojowej. Rozpuszczalnik odparowano i pozostalosc roz¬ cierano kilkakrotnie z suchym eterem etylowym. Otrzy¬ mano chlorowodorek (2) w postaci higroskopijnego ciala stalego (0,45 g) Rf 3 B 0,5. 4) BOC-Gly-PheNHCH2CH2NHCOCH3. Zwiazek otrzy¬ mano jedna z nastepujacych metod: a) BOC-Gly-Phe-OH (1,0 g) i H2NCH2CH2NHCOCH3 (0,4 g) rozpuszczono w DMF i ochlodzono w kapieli sól/lód, z dodatkiem HONSu (0,78 g) i DCCI (0,668 g).Mieszanine reakcyjna doprowadzono do temperatury pokojowej i mieszano przez noc, nastepnie usunieto DCU przez filtracje i odparowano rozpuszczalnik. Pozostalosc rozpuszczono w CHC13, przemyto nasyconym roztworem kwasnego weglanu sodu (2x50 ml), 10% wodnym kwa¬ sem cytrynowym (2 x 50 ml) i woda do odczynu obojet¬ nego, a nastepnie nasyconym roztworem solanki. Faze organiczna wysuszono (Na2S04) i odparowano. Pozos¬ talosc chromatografowano na kolumnie z zelu krzemion¬ kowego (45 cm x 2,4 cm). Kolumne najpierw eluowano mieszanina CHCl3/izopropanol (19:1), nastepnie mie¬ szanina CHCl3/izopropanol(4:l). Zwiazek tytulowy otrzy¬ mano w postaci gumy (0,60 g) Rf 8 B 0,4, Rf 7F 0,2. b) BOC-Gly-OH (1,072 g) rozpuszczono w CH2CI2 i oziebiono w kapieli staly CO2/CCI4, po czym dodano NMM (0,618 g) i IBCF (0,836 g). Po 2 min. w tej tem¬ peraturze dodano Cl"H^.Ph-NHCH2-CH2NHCOCH3 (1,75 g) i NMM (0,618), po czym temperature dopro¬ wadzono do temperatury pokojowej. Reakcja byla za¬ konczona po calonocnym mieszaniu, wedlug opisu (1) powyzej. Pozostalosc oczyszczano wedlug (a) powyzej.Otrzymano produkt w postaci gumy (0,65 g) Rf 8B 0,4, Rf7F0,2. 5) BOC-Tyr (BuO-D-Ala-Gly-Phe-NHCH.CH.NHCO CH3. (i) BOC-Gly-Phe-NHCH2CH2NHCOCH3 (0,64 g) traktowano 5,5 M HC1 w octanie etylu (6 ml) i 2,6 M HCl w kwasie octowym (5 ml) w temperaturze pokojowej Po 45 min. rozpuszczalnik odparowano i pozostalosc roz¬ cierano z eterem etylowym. Chlorowodorek dwupeptydu otrzymano w postaci higroskopijnego stalego produktu (0,54 g) Rf 3D 0,45. (ii) BÓC-Tyr-(But)-D-Ala-OH (0,6 g) oraz Cl"H+ Gly-Phe-NHCH2CH2NHCOCH3 (0,5 g) rozpuszczono w DMF (3 ml) i ochlodzono w kapieli sól/lód, po czym dodano HONSu (0,355 g) i DCCI (0,303 g), a nastepnie NMM (1,48 g w DMF, 1,5 ml). Mieszanine doprowadzo- 4 981 6 no do temperatury pokojowej i mieszano przez noc. Nas¬ tepnie odsaczono DCU, odparowano rozpuszczalnik i po¬ zostalosc rozdzielono pomiedzy octan etylu i wode. War¬ stwe organiczna przemyto nasyconym, wodnym roztwo- 5 rem kwasnego weglanu sodu (2x50 ml), 10% wodnym kwasem cytrynowym (2x50 ml), woda do odczynu obo¬ jetnego i w koncu nasyconym roztworem solanki. Faze organiczna suszono (Na2S04) i odparowano. Czteropep- tyd otrzymano w postaci gumy (0,65 g). Rf 7C 0,65 Rf 10 3D 0,8. 6) H-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-NHCH2CH2NHCOCH3.BOC-Tyr(BuO-D-Ala-Gly-Phe-NHCH^H.NHCOCTh (0,65 g) traktowano nadmiarem 2,6 M HCl w kwasie oc¬ towym w ciagu 45 minut w temperaturze pokojowej. 15 Rozpuszczalnik odparowano i pozostalosc chromatogra¬ fowano na kolumnie z zelu krzemionkowego (50 cmx x2,5 cm) mieszanine rozpuszczalników 3A. Otrzymana gume liofilizowano do otrzymania tytulowego produktu (0,45 g) Rf 3A 0,3 [a] d — 6,95°. 20 Przyklad II. Wytwarzanie L-tyrozylo-D-alanilogli- cylo-N-metylo- L-fenyloalanino-3-dwumetyloaminopropy- loamidu. Zwiazek ten wytwarzano sposobem przedsta¬ wionym na schemacie 2. 1) BOC-MePhe-NHCH2CH2CH2NMe2.N-IIIrz.-butyloksykarbonylo-N-metylofenyloalanine (2,79 g) i NMM (1,01 g) rozpuszczono w dwuchlorome- tanie (20 ml) i mieszajac, ochlodzono roztwór do —20°.Nastepnie dodano IBCF (1,37 g) i mieszanine mieszano w ciagu 5 minut przed dodaniem NH2CH2CH2CH2NMe2 (1,02 g). Roztwór mieszano 1 godz. w temperaturze —20°, nastepnie 12 godz. w temperaturze pokojowej.Mieszanine odparowano, pozostalosc rozpuszczono w oc¬ tanie etylu (50 ml) i wodnym nasyconym roztworze kwas¬ nego weglanu sodu (50 ml). Warstwe octanu etylu prze¬ myto wodnym nasyconym roztworem kwasnego weglanu sodu (50 ml), woda (2x50 ml) i 10% wodnym kwasem cytrynowym (2x50 ml). Ekstrakty kwasu cytrynowego polaczono, zalkalizowano nasyconym roztworem kwas¬ nego weglanu sodu i ekstrahowano octanem etylu (3 x x50 ml). Ekstrakty octanu etylu polaczono, wysuszono (Na2S04) i odparowano otrzymujac zwiazek tytulowy w postaci oleju, Rf 1E 0,24 Rf 3A 0,37. 2) H-MePhe-NHCH2CH2CH2NMe2 .ZHC1. 45 Olej otrzymany w czesci (1) powyzej rozpuszczono w octanie etylu (10 ml) oraz dodano HCl w kwasie octowym (2,63 M, 6 ml) i HCl w octanie etylu (5,7 M, 6 ml). Roz¬ twór mieszano 2 godz. i odparowano do uzyskania zada¬ nego chlorowodorku (2,2 g) w postaci stalej, Rf 1E 0,02, .50 Rf3A0,03. 3)BOC-Gly-MePhe-NHCH2CH2CH2NMe2.Illrzed.-butyloksykarbonyloglicyne (1,05 g) i NMM (0,606 g) rozpuszczono w dwuchlorometanie (12 ml) i mieszany roztwór ochlodzono do —20°. Dodano IBCF 55 (0,819 g, 6 mM) i mieszanine mieszano 5 min. przed do¬ daniem substancji (2) opisanej powyzej, (2,02 g) w DMF (5 ml). Roztwór mieszano 1 godz. w —20° i 12 godz. w temperaturze pokojowej, a nastepnie odparowano. Po¬ zostalosc rozpuszczono w octanie etylu (50 ml) i w wod- 60 nym roztworze kwasnego weglanu sodu (10%, 50 ml).Faze organiczna oddzielono, przemyto wodnym roztwo¬ rem kwasnego weglanu sodu (10%, 3x50 ml) i woda (3x50 ml). Roztwór w octanie etylu suszono (Na2SÓ4) i odparowano otrzymujac tytulowy zwiazek w postaci 65 etylu. Rf 1E 0,21; Rf 3A 0,37.114 981 7 4) H-Gly-MePhe-NHCH2CH2CH2NMe2.2^CL Zabezpieczony dwupeptyd (3) traktowano sposobem opisanym w etapie (2) powyzej otrzymujac zadany dwu- chlorowodorek (4) (2,0 g) w postaci stalego, bialego pro¬ duktu. Rf 1E 0,03, Rf 3A 0,03. 5) BOC-TyrCBu^-D-Ala-OH (1,22 g).H-Gly-MePhe-NHCH2CH2CH2NMe2.2HCl (1,18 g), HONSu (0,345 g) i NMM (0,30 g) rozpuszczono w su¬ chym DMF (20 ml), po czym roztwór ochlodzono do 0°. Dodano DCCI (0,680 g) i mieszanine mieszano 18 godzin przed odparowaniem. Pozostalosc rozpuszczono w octanie etylu (50 ml) i przemyto wodnym roztworem kwasnego weglanu sodu (10%, 2x50 ml), woda (2x x 50 ml), nastepnie suszono (Na^SCM i odparowano do suchosci. Pozostalosc rozpuszczono w metanolu, prze¬ puszczono przez kolumne z zelu krzemionkowego (35 x x2 cm) i eluowano mieszanina rozpuszczalników 1F.Frakcje polaczono, odparowano i pozostalosc rozpuszczono w octanie etylu (100 ml). Ekstrakty w octanie etylu prze¬ myto wodnym roztworem kwasnego weglanu sodu (10%. 3x100 ml); wysuszono i odparowano otrzymujac tytu¬ lowy czteropeptyd (5) w postaci bialego, stalego produktu Jlf 1E 0,18, Rf 3A 0,39. 6) H-Tyr-D-Ala-Gly-MePhe-NH CH2CH2CH2NMe2.Zabezpieczony czteropeptyd (5) (500 mg) rozpuszczono w octanie etylu (5 ml) i do mieszanego roztworu dodano roztwór chlorowodoru w octanie etylu (5,7 M, 2,5 ml).Po 1 godzinie mieszanine reakcyjna odfiltrowano i pozos¬ talosc przemyto eterem naftowym, wysuszono i liofili¬ zowano z wody, otrzymujac staly bialy produkt (380 g).Rf 4A 0,27, Rf 3B 0,47. [a]52728+23,6 (c= l; 0,1 M HC1).Przyklad IJI^ Wytwarzanie N-tlenku L-tyrozylo- -D-alaniloglicylo-N-metylo-L-fenyloalanino-2-dwumetylo- aminppropyloamidu. . 1) BOC- Tyr(BuO-D-Ala-Gly-MePhe-NH CH2CH2CH2 N(0)Me2.BOC-Tyr(Bu^-D-Ala-Gly- MePhe-NHCH2CH2CH2N Me2 (500 mg) rozpuszczono w metanolu (10 ml) i dodano wodny roztwór nadtlenku wodoru (30%, 0,16 ml). Roz¬ twór mieszano 48 godz. w temperaturze pokojowej, od¬ saczono i odparowano, otrzymujac zadany N-tlenek w postaci gumy Rf 1E 0,08;-Rf 3A 0,41. 2) H-Tyr-D-Ala-Gly-MePne-NHCH2CH2CH2N(0)Me2.Gume otrzymana w etapie (1) rozpuszczono w octanie etylu (5 ml) i dodano roztwór HC1 w octanie etylu (2,63 M, 1 ml). Roztwór mieszano 1 godz. odsaczono, staly produkt wysuszono i liofilizowano z wody, otrzymujac zadany bialy, staly produkt (240 mg) Rf 4A 0,56; Rf 3B 0,52; [a]57!=+18,8° (c =l; 0,1 M HC1).Przyklad IV. Wytwarzanie L-tyrozylo-D-alanilogli- cylo-N-metylo-L-fenyloamino-2-dwumetyloaminoetylo- amidu. Zwiazek wytworzono sposobem przedstawionym na schemacie 3. 1) BOC-MePhe-NHCH2CH2NMe2.BOC-MepHe-OH i N,N-dwumetyloetylenodwuaminy sprzega sie sposobem opisanym w przykladzie I (1) otrzy¬ mujac zadany amid w postaci oleju. 2) HMePhe-NHCH2CH2NMe2.2HC1. _Z N-zabezpieczonego amidu z etapu (1) powyzej usu¬ wano grupe; zabezpieczajaca sposobem opisanym w przy- , kladzie I (2) otrzymujac zadany chlorowodorek w postaci oleju. 3) BOC-Tyf-(But)-D-Ala-Gy-MePhe-NHCH2CH2N Me2. 8 BOC-Tyr(But)-D-Ala-Gly-OH (700 mg, 1,5 mM) rozpuszczono w suchym DMF (7,5 ml) i dodano NMM (152 mg, 1,5 mM). Roztwór oziebiono do —15°, miesza¬ jac i dodano IBCF (205 mg, 1,5 mM). Po 5 min. dodano* 5 roztwór ' 2HC1 .H-MePhe-NHCH2CH2NMe2 (568 mg, 1,5 mM), a nastepnie NMM (303 mg, 3 mM). Po 18 go¬ dzinach mieszanine reakcyjna odparowano, a pozostalosc rozdzielono pomiedzy octan etylu (50 ml) i nasycony wodny roztwór kwasnego weglanu sodu (15 ml). War- 10 stwe octanu etylu oddzielono, przemyto nasyconym wod¬ nym roztworem kwasnego weglanu sodu (50 ml), woda (2x50 ml) i solanka (50 ml), wysuszono (Na2S04) i odparowano. Pozostalosc chromatografowano na zelu krze¬ mionkowym stosujac mieszanine rozpuszczalników 7B. 15 Odpowiednie frakcje zbierano i odparowywano, otrzy¬ mujac zadany amid czteropeptydu (700 mg) w postaci szklistego ciala stalego. 4) 2HC1 .H-Tyr-D-Ala-Gly-MePhe-NHCH2CH2NMe2.Z zabezpieczonego peptydu otrzymanego w etapie (3) 20 usuwano grupe zabezpieczajaca sposobem opisanym w przykladzie II (6), otrzymujac zadany produkt. Po liofi¬ lizacji otrzymano amid czteropeptydu (200 mg) w postaci bialego, stalego produktu. Rf 7.B .0,04, Rf 3A 0,07, Rf 4A 0,23 [a]2D=—24,2° (c=0,50 DMF). 25 Przyklad V. Wytwarzanie S-tlenku L-tyrozylo-D- -alaniloglicylo-L-fenyloalaninotiomorfolinoamidu. 1) Zwiazek o wzorze 5, BOC-Phe-OH (1,32 g) i IBCF (680 mg) w DME ¦ (10 ml) oziebiono do —20° i dodano NMM (520 . mg) do mieszanego i chlodzonego roztworu. Po 2 min. dodano zimna zawiesine chlorowodorku tiomorfoliny (690 mg) i NMM (520 mg) w DMF (8 ml). Mieszano dalej 30 min. w —20° i nastepnie w temperaturze pokojo¬ wej przez noc. Po odparowaniu* rozpuszczalnika pozos¬ talosc rozdzielono pomiedzy octan etylu i nasycony wodny roztwór kwasnego weglanu sodu. Warstwe octanu etylu ekstrahowano trzykrotnie nasyconym roztworem kwas¬ nego weglanu sodu, dwukrotnie 10% roztworem kwasu Mt% cytrynowego w wodzie, nastepnie woda i w koncu nasy- 40 conym roztworem chlorku sodu.. Roztwór w octanie ety¬ lu wysuszono (Na2SC4) i odparowano otrzymujac tio- morfolinoamid w postaci gumy (1,56 g). 2) Zwiazek o wzorze 6. 45 Roztwór zwiazku o wzorze 5 (1,05 g) w kwasie octo¬ wym (3, ml) traktowano, mieszajac, w temperaturze po¬ kojowej roztworem chlorowodoru w kwasie octowym (2,6 M, 3 ml) a nastepnie w odstepach 2 godz. dalszymi dwoma porcjami po 3 ml. Po odparowaniu rozpuszczal¬ no nika i chlorowodoru pozostalosc rozcierano z suchym ete¬ rem etylowym, eter dekantowano i pozostalosc rozciera¬ no ze swiezym suchym eterem, uzyskujac fenyloalanino- tiomorfolinoamid w postaci stalej (7,38 g). 3) Zwiazek o wzorze 7. 55 "* BOC-Gly-OH (784 mg) sprzegano ze zwiazkiem o wzorze 8 (572, mg) sposobem stosowanym powyzej, dla zwiazku o wzorze 5, 2 uzyciem IBCF (258 mg) i NMM (424 mg ilosc calkowita). Otrzymano 774 mg amidu dwu- peptydu. 60 4) Zwiazek o wzorze 9.Zwiazek o wzorze 7 (697 mg) mieszano z wodnym kwa¬ sem trójfluorooctowym (H2O.CF3CO2H 1:9,9 ml) w ciagu 11/2 godz. Kwas odparowano, a pozostalosc rozcierano z etef"em etylowym, otrzymujac proszek, który rozpuszczo- 65 no w suchym DMF (5 ml) i nastawiono za pomoca NMM114 981 9 10 do wartosci pH = 8 (papierek wskaznikowy na mokro).Dodano BOC-Tyr-CBu^-D-Ala-OH (680 mg) i HONSu (211 kg) w DMF (3 ml), a nastepnie DCCI-(377 mg) i mieszanine mieszano przez noc w temperaturze pokojo¬ wej. Staly produkt odsaczono, a przesacz odparowano do uzyskania gumy, które rozdzielono pomiedzy octan etylu i nasycony wodny roztwór kwasnego weglanu sodu. War¬ stwe octanu etylu przemyto dwukrotnie nasyconym wod¬ nym roztworem kwasnego weglanu sodu, nastepnie trzy¬ krotnie 10% roztworem kwasu cytrynowego w wodzie, nastepnie woda i nasyconym roztworem chlorku sodu.Po suszeniu (NazSCM i odparowaniu otrzymano zabez¬ pieczony tiamorfolinoamid czteropeptydu (1,09 g). 5) Zwiazek o wzorze 10.Zabezpieczony tiomorfolinoamid czteropeptydu (1,0 g) mieszano w wodnym kwasie trójfluorooctowym (H2O: CF3CO2H 1:9, 9 ml) w ciagu 11/2 godzin. Po odparowa¬ niu i rozcieraniu z eterem etylowym otrzymano staly produkt, oczyszczony chromatograficznie na zelu krze¬ mionkowym (CHCl3:CH3OH:AcOH:H20 60:18:1:1,5), a nastepnie chromatografia jonowymienna (zywica Sep- hadex SP, postac pirydyniowa, stosujac gradient od 2% pirydyny w wodzie do 5 % pirydyny, 1 % kwasu octowego w wodzie); Produkt liofilizowano, otrzymujac tiomorfo¬ linoamid (495 mg). 6) Zwiazek o wzorze 11.Zwiazek o wzorze 10 (100 mg) w etanolu (50 ml) trak¬ towano trzema kolejnymi porcjami nadtlenku wodoru o stezeniu 20% objetosciowym (kazda 0,3 ml) w odstepach co 45 min. Po dalszym mieszaniu 1 godz. roztwór odparo¬ wano do suchosci, rozpuszczono w" wodzie - (20 ml) i lio¬ filizowano otrzymujac biale stale produkty (98 mg). Rf 3A 0,25; Rf 1C 0,06; Rf 5B 0,38 [a]5895= +53,1° (c = 0,47 i w 0,1 NHC1).Przyklad VI. Wytwarzanie L-tyrozylo-D-alanilo- glicylo-N-metylo-L-fenyloalanino-2-aminoetyloamidu.Tyr-D-Ala-Gly-MePhe-NHCH2CH2NHZ (wytworzona sposobem z przykladu IV) (350 mg) rozpuszczono w MeOFL (20 ml) i dodano do zawiesiny 10% palladu na weglu drzewnym (100 mg) w wodzie (10 ml). Przez mie¬ szanine przepuszczano za pomoca belkotki w ciagu 4 go¬ dzin w 22°C. Katalizator odsaczono, a rozpuszczalniki usuwano pod zmniejszonym cisnieniem. Pozostalosc roz¬ puszczono w malej ilosci 1 % pirydyny w wodzie i prze¬ puszczono przez kolumne wypelniona zywica SP Sep- hadex(eluowana przy gradiencie 1 % wodna pirydyna 1 % wodny octan pirydyny 5 % wodny octan pi¬ rydyny). Odpowiednie frakcje polaczono i rozpuszczal¬ nik usunieto przez odparowanie pod zmniejszonym cis¬ nieniem. Produkt (220 mg) suszono ze stanu zamrozo- 22 20 30 40 50 nego z wody. Rf 3B 0,45, Rf 4A 0,56, [a]589=+22,22° (c=0,98; 0,1 M HC1).Przyklad VII. Wytwarzanie octanu L-tyrozylo-D- -alaniloglicylo-N-metylo-L-fenyloalanino-3-trójmetyloamo- niopropylamidu. 1) BOC-Tyr-(But)-D-Ala-Gly-MePhe-NHCH2CH2CH2 N + -Me3OAC—.BOC-Tyr-(But)-D-Ala-Gly-MePheNHCH2CH2CH2 NMe2 (640 mg) rozpuszczono w etanolu (5 ml). Doda¬ no jodek metylu (572 mg) po czym roztwór mieszano w temperaturze pokojowej 48 godz. Roztwór odparowano, pozostalosc rozpuszczono w octanie etylu i przepuszczono przez kolumne wypelniona zelem krzemionkowym (40 X x2 cm) i eluowano mieszanina octan etylu: pirydyna: :kwas octowy:woda 90:20:6:11. Frakcje zawierajace za¬ dany zwiazek polaczono i odparowano do uzyskania sta¬ lego produktu (320 mg). Rf 3A 0,17, Rf 3B, 0,74, Rf 4A 0,47. 2) Octan H-Tyr-D-Ala-Gly-MePhe-NHCH2CH2CH2 NMe3.Powyzszy zabezpieczony czteropeptyd (300 mg) roz¬ puszczono w octanie etylu (10 ml) i do mieszanego roz¬ tworu dodano roztwór HC1 w octanie etylu (3,9 M, 4 ml).Po 1 godzinie roztwór odparowano i pozostalosc rozpusz¬ czono w wodzie, nastepnie przepuszczono przez kolumne celulozowa CM 52 (35x3 cm) i eluowano z zastosowa¬ niem liniowego gradientu stezen od 0,05% wodnej piry¬ dyny do 1 % wodnego octanu pirydyny. Frakcje zawiera¬ jace zadany zwiazek polaczono, odparowano, a pozosta¬ losc liofilizowano z wody uzyskujac zadany staly bialy produkt (110 mg). Rf 3B 0,17, Rf 4A, 0,13, Rf 5B 0,05 [a]52829= _37,75° (c = 0,5 DMF).Przyklad VIII. Wytwarzanie N-tlenku L-tyro- zylo-D-metionilo-(sulfotlenek)-glicylo-N-metylo-L-feny- loalanino-2-dwumetyloaminoetyloamidu.HCl.H-Tyr-D-met-Gly-MePhe-NH(CH2)2N(0)Me2 (418 mg) rozpuszczono w etanolu (150 ml) i dodano nad¬ tlenek wodoru o stezeniu 100% objetosciowych (1,46 ml).Roztwór mieszano w 21 ° 24 godz., po czym rozpuszczalnik usuwano pod zmniejszonym cisnieniem i otrzymana po¬ zostalosc oczyszczono chromatograficznie na celulozie CM, stosujac eluowanie z gradientem od 0,1% wodnej pirydyny do 1,5% wodnego octanu pirydyny. Substancje otrzymana z~ kolumny kilkakrotnie suszono ze stanu za¬ mrozenia z HCl, otrzymujac zadany chlorowodorek (354 mg). Rf 3B 0,32, Rf 4A 0,43, Rf 5B 0,32, [a] d = +9,16° (c= l,05, 0,1 NHC1).W tablicy 1 przedstawiono szczególowe informacje dotyczace dalszych zwiazków o wzorze 1, wytwarzanych sposobami opisanymi w powyzszych przykladach.Przyklad nr 1 1 IX X XI Tabl Zwiazek 2 H-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-NH(CH2)3CONH2 H-Tyr-D-Ala-Gly-MePhe-NH(CH2)3CONMe2 H-Tyr-D-Ala-Gly-MePhe-NH(CH2)2NHCOCH3 i ca 1 [a] 3 [a]1?)5 =+52,8 (c =l,04, 0,1 N HCl) [a] 2^=43,3 (c= l,DMF) [a]1?)5 =+26,1 (c= l,0, 0,1N"HC1)* Rf N 4 3C 0,35 4A 0,60 IF 0,15 3A 0,17 4A 0,53 3A 0,19 3B 0,85 Sposób 5. 1 2 2114 981 11 12 c.d. tablicy 1 1 XII XIII XIII XV XVI XVII XVIII XIX XX XXI XXII XXIII XXIV xxv XXVI XXVII XXVIII XXIX xxx XXXI XXXII XXXIII XXXIV 2 H-Tyr-D-A]a-Gly-MePhe-NH(CH2)3C02Me H-Tyr-D-Ala-Gly-MePhe-NH(CH2)3C02H H-Tyr-D-Ala-Gly-MePhe-NH(CH2)3CONH2 H-Tyr-D-Ala-Gly-MePhe-NH(CH2)3NHCOCH3 H- Tyr-D-Ala-Gly-MePhe-NH(CH2)3CONHMe zwiazek o wzorze 12 H-Tyr-D-Ala-Gly-MePhe-NH(CH2)3CONMePh H-Tyr-D-Ala-Gly-MePhe-NH(CH2)4CONMe2 H-Tyr-D-Ala-Gly-MePheNH(CH2)2CONMe2 H-Tyr-D-Ala-Gly-MePhe-NH(CH2)2N (0)Me2 H-Tyr-D-Ala-Gly-MePhe-N(Me) (CH2)3CONMe2 zwiazek o wzorze 13 zwiazek o wzorze 14 - zwiazek o wzorze 15 H- Tyr-D-Ala-Gly-MePheNH(CH2)3NH2 zwiazek o wzorze 16 H- Tyr-D-Ala-Gly-MePheNH(CH2)2NMePh H- Tyr-D-Ala-Gly-MePheNH(CH2)2N (O)M ePh MeTyr-D-Ala-Gly-MePheNH(CH2)2NMe2 MeTyr-D-Ala-Gly-MePheNH(CH2)2N(0)Me2 H-Tyr-D-Nva-Gly-MePheNH(CH2)2NMe2 H- Tyr-D-Nva-Gly-MePheNH(CH2)2N(O) Me2 H-Tyr-D-Ser-Gly-MePheNH(CH2)2NMe2 *. 3 [a]1^5 =+23,0 (c =0,86, 0,1N HCI) [a] 1g5=+25,5 (c = l,07, 0,1N HCI) [a] ^+23,1 (c= l,0, 0,1N HCI) Md -+4,8 (c = l, DMF) [a]2D=+17,4 (c=0,52, 0,1N HCI) [a] ^^+59,1 (c=0,44, 0,1N HCI) [a] £=+16,2 (c=0,54, 0,1N HCI) [a] £=+17,3 (c=0,52, 0,1NHC1) [a]2D=+17,0 (c=0,50, 0,1N HCI) [a] £ = -42,1 (c = 0,50, DMF) [a] £=+2,2 (c=0,51, 0,1N HCI) [a] £=+11,9 (c =0,57, H20) [a] £ =-2,0 (c =0,50, 0,1N HCI) [«]2D = -0,8 (c =0,50, 0,1N HCI) [a] £=—42 (c = l, DMF) [a] £ = -68,2 (c= l, DMF) Wd = -46,8 (c =l, DMF) [a] £ =-40,2 (c = l, DMF) [a [£=+21,1 (c =1,0,1NHC1) [a] £=+25,5 (c=0,94, 0,1N HCI) [a] £=+28,5 (c=0,91, 0,1N HCI) [a] £=+26,2 (c=0,91, 0,1NHC1) [a] £=+5,4 (c=0,97, 0,1N, HCI) 4 | 3A 3B 3A 3B 3A 3B 3B 4A 7B 4A 7B 3A 5B 7C 3A 4A 3A 7B 4A 7B 3A 3B 4A 3A 7B 3A 4A 3B 4A 3A 4A 3B 4A 3A 3B 4A 3A 4A 7B 3B 4A 7A 3B 4A 5B 3B 4A 5B 3B 4A 5B 3B 4A ' 5B 3B 4A 1 5B 0,41 0,62 0,22 0,49 0,31 0,32 0,76 0,64 0,24 0,60 0,22 0,17 0,36 0,05 0,36 0,69 0,60 0,11 0,58 0,22 0,05 0,54 0,55 0,51 0,42 0,48 0,40 0,36 0,45 0,22 0,35 0,44 0,48 0,19 0,69 0,58 0,35 0,70 0,39 0,63 0,53 0,12 0,33 0,25 0,12 0,36 0,35 0,15 0,39 0,38 0,18 0,41 0,48 0,25 0,23 0,21 0,12 5 1 2 a b 4 2 5 2 2 4 3 4 1&3 4 3 6 1&3 4 3 4 3 4 3 4114 981 13 14 c.d. tablicy 1 1 1 xxxv XXXVI XXXVII XXXVIII XXXIX XL XLI XLII XLIII XLIV XLV XLVI XLVII XLVIII ¦ 2 H-Tyr-D-Ser-Gly-MePheNH(CH2)2N(0)Me2 H-Tyr-D-Met-G1y-MePheNH(CH2)2NMe2 H-Tyr-D-Ala-GIy-MePheNH(CH2)2NHC02C2H5 H-Tyr-D-Ala-Gly-MePheNH(CH2)2NHCON H2 H-Tyr-D-Ala-Gly-MePheNH(CH2)2OCONH2 H-Tyr-D-Ala-Gly-MePheNH(CH2)2NHCONMe2 zwiazek o wzorze 17 zwiazek o wzorze 18 zwiazek o wzorze 19 zwiazek o wzorze 20 H-Tyr-D-Ala-Gly-MePhe-NHCH2CH2NMeCH2 CH2CHMe2 H-Tyr-D-Ala-Gly-MePhe-NHCH2CH2N(Ó)Me CH2CH2CHMe2 H-Tyr-D-Ala-G!y-MePhe-NHCH2CH2NHC02 CH2Ph H-Tyr-D-Ala-Gly-MePhe-NHCH2CH2CH2NH C02CH2Ph | 3 Md =+4,2 (c= l, 0,1NHC1) Md =+30,0 (c=0,93, 0,1N HC1) Md=+25,3 (c=0,91,0,1NHCI) M d=+23,5 (c=0,97, 0,1N HC1) Md =+25,7 (c=0,97, 0,1N HC1) M d=+24,8 (c=0,96, 0,1NHC1) [a]2^=-5A (c=0,58, 0,1NHC1) Md=-5,0 (c=0,58, 0,1NHC1) Md=-53,3 (c= l,25, DMF) , M d=+23,8 (c=0,93, 0,1NHC1) M^^+18,3 (c=0,51, 0,1NHC1) M^^-38,0 (c= l, DMF) 4 3B 4A 5B 3B 4A 5B 3A 4B 7B 3A 4A 7A 3A 3B 7A 3A 3B 7A 3A 7B 3A 3B 3B 4A 5B 3B 4A 5B 3B 4A 5B 3A 3B 4A 3D 4A 7B 3A 4A 7B 0,22 0,30 0,17 0,31 0,27 0,16 0,35 0,72 0,34 0,12 0,62 0,50 0,13 0,54 0,49 0,15 0,57 0,33 0,85 0,46 0,17 0,67 0,47 0,55 0,41 0,48 0,56 0,46 0,52 0,57 0,36 0,40 0,60 0,54 0,76 0,76 0,33 0,32 0,73 0,45 5 3 ¦ 4 4 4 " 4 4 4 3 4 3 4 3 4 4 a =hydroliza z przykladu XI b=amonoliza z przykladu X Wyjsciowe aminy o wzorze HNR8RX stosowane w spo¬ sobach przedstawionych w powyzszych przykladach, o ile nie sa dostepne w handlu, moga byc wytwarzane znanymi sposobami lub w przypadku niektórych amin sposobami przedstawionymi w przykladach XLIX— —LIV.Przyklad XLIX. Wytwarzanie N-izoamylo-N',N'- -dwumetyloetylenodwuaminy 1) Me2CH2CH2CONHCH2CH2NH2.Chlorek izowaleroilu (5 g, 38 mmole) w dwuchloro- metanie wkraplano do mieszanego roztworu N,N-dwu- metyloetylenodwuaminy (3,38 g, 38 mmola) i NMM (7,75 g 76,7 mmoli) w CH2C12 w 0°C. Calosc mieszano w temperaturze pokojowej w ciagu 4 godzin, po czym od¬ parowywano rozpuszczalnik. Pozostalosc rozpuszczono 55 60 65 w 5M NaOH (50 ml) i ekstrahowano octanem etylu (2 x x 100 ml). Octan etylu przemyto nasyconym wodnym roz¬ tworem chlorku sodu, wysuszono (Na2S04) i odparowa¬ no. Pozostalosc rozpuszczono w eterze etylowym i do- clano 5M HC1 w octanie etylu (10 ml). Otrzymany staly produkt odsaczono, przemyto eterem etylowym (5 x xl0 ml) i suszono pod silnie zmniejszonym cisnieniem.Wydajnosc=5,43 g Rf 3A 0,40. 2) Me2CHCH2CH2NHCH2CH2NH2.Roztwór powyzej otrzymanego amidu (5 g) w suchym THF (50 ml) wkroplono do mieszanego roztworu LiAlFU (2 g) w suchym THF (20 ml) w temperaturze pokojowej.Mieszanine reakcyjna ogrzewano pod chlodnica zwrotna w ciagu 4 godzin do momentu gdy t.l.c. wykazala nieobec¬ nosc substancji wyjsciowej. Dodano nasycony wodny114 15 roztwór siarczanu sodu w celu ochlodzenia nadmiaru UAIH4. Otrzymana zawiesine przefiltrowano i przesacz zakwaszono 4 M HC1 (1Ó ml). Roztwór odparowano do ... uzyskania bialego, stalego produktu, który rozcierano z eterem etylowym; odfiltrowano i wysuszono. Wydajnosc = -5,51 g.Przyklad L. Wytwarzanie N-fenetylo-N',N'-dwu- metyloetylenodwuaminy. 1) PI1CH2CONHCH2CH2NH2 .HC1.Zwiazek wytwarzano w podobny sposób jak opisano w przykladzie XLIX (1), sprzegajac chlorek fenacetylu (1,0 g, 6,47 mmoli) z N,N-dwumetyloetylenodwuamina (0,42 g, 6,47 mmoli) w obecnosci NMM. Wydajnosc = = 1,38 g. Rf 3A=0,30. 2) PhCH2CH2NHCH2CH2NH2 .HC1.Zwiazek wytwarzano przez redukcje wyzej otrzyma¬ nego amidu (10 g) za pomoca LiAlH^jak opisano w przy¬ kladzie A (2). Nieoczyszczony produkt (12 g) Oczyszczono na kolumnie chromatograficznej wypelnionej zelem krze¬ mionkowym, stosujac krzemionke rozpuszczalników 3A.Wydajnosc =4,5 g, Rf 3B=0,31.Przyklad LI. Wytwarzanie N- (2-aminoetylo)- -N/N'-dwumetylomocznika. 1) PhCH2OCONHCH2CH2NHCONMe2.Roztwór chlorku dwumetylokarbamoilu (1,39 g) w ete¬ rze etylowym (15 ml) wkroplono do mieszanego roztworu NMM (1,57 g) i 2-benzyloksykarbonyloaminoetyloaminy (3,02 g) w eterze etylowym (110 ml). Calosc mieszano 4 godz. i pozostawiono na 2 dni. Po odparowaniu eteru pozostaly staly produkt, rozdzielono pomiedzy 10 % wod¬ ny kwas cytrynowy i octan etylu. Ekstrakty w octanie etylu przemywano—10% wodnym kwasem cytrynowym, nasyconym roztworem kwasnego-weglanu sodu i nasy¬ conym roztworem chlorku sodu, wysuszono (Na2S04) i odparowano do uzyskania stalego produktu. Próbka krystalizowana z mieszaniny octan etylu/eter naftowy - (temperatura wrzenia 60—80°) Wykazywala temperature topnienia 81—82°. 2) H2NCH2CH2NHCONMe2.Zwiazek N-benzyloksykarbonylowy otrzymany powy¬ zej (1,06 g) hydrogenolizowano nad 10% Pd/C (100 mg) w etanolu (30 ml) zawierajacym 2N wodny HC1 (2,1 ml) w ciagu 1 1/2 godz. Po odsaczeniu i odparowaniu prze¬ saczu otrzymywano zadany zwiazek w postaci chlorowo¬ dorku, który stosowano bez oczyszczania.Przyklad LII. Wytwarzanie N-izoamylo-N-me- tyloetylenodwuaminy. 1) BOC-Gly-N(Me)CH2CH2CHMe2.BOC-Gly-OH (17,5 g, 0,1 mola) rozpuszczono w su¬ chym CH2C12 (100 ml), po czym dodano NMM (10,1 g, 0,1 mola) i IBCF (13,7 g, 0,1 mola) w —15°C. Po 2 min. dodano chlorowodorek N-metyloizoamyloaminy (13,7 g, 0,1 mola) i NMM (10,1 g). Calosc mieszano w —15 °C w ciagu 11/2 godzin i w temperaturze pokojowej przez noc. Rozpuszczalnik odparowano i olej rozpuszczono '55 w octanie etylu, ekstrahowano nasyconym kwasnym we¬ glanem sodu (2'xl00 ml), 10% wodnym kwasem cytry¬ nowym (2x100 ml), przemyto woda do odczynu obo¬ jetnego, wysuszono (Na2SO olej. Wydajnosc=27 g 2) H2NCH2CH2N(Me)CH2CH2CHMe2.BOC-Gly-N(Me)CH2CH2CHMe2 (12 g) rozpuszczo¬ no w 90% TFA, czyli wodnym kwasie trójfluorooctowym (H2O.CF3CÓOH 1:9, 35 m) Po 2 min rozpuszczalnik odparowano otrzymujac olej. Olej rozpuszczono w 50 m 981 16 swiezo wysuszonego THF i dodano do dwuboranu w THF (IM, 150 ml) w atmosferze azotu w —20°C. Tem¬ perature doprowadzono do temperatury pokojowej i mie¬ szanine reakcyjna mieszano,przez noc. Ostroznie dodano 5 metanol (100 ml) do zniszczenia nadmiaru dwuboranu i rozpuszczalnik odparowano uzyskujac olej. Olej nastepnie traktowano 6M HC1 (50 ml). Mieszanine ogrzewano pod chlodnica zwrotna 3 godz. i odparowano do uzyskania oleju. Olej nastepnie traktowano 2M NaOH 1 godz., za- 10 kwaszono i odparowano. Tak otrzymany olej oczyszczono na kolumnie chromatograficznej wypelnionej zelem krze¬ mionkowym (2,5 cmx80 cm) stosujac mieszanine roz¬ puszczalników 3A, otrzymujac zadana dwuamine. Wy¬ dajnosc=4,4 g, Rf 3A = 0,20. 15 Przyklad YjII. Wytwarzanie dwumetylo(2-amino- -4-metylopentyJo)aminy. 1) BÓC-Leu-NMe2.BOC-Leu-OH (4,62 g, 20 mM) rozpuszczono w CH2C12 i roztwór ochlodzono do —20°. NMM (2,25 ml, 20 mM) 20 po czym dodano tlenek chlorodwufenylofosforanu (6,0 g, 20 mM), a nastepnie po 15 min. dwumetyloamine (5,6 g, 125 mM). Po 3 godz. w 20° roztwór odparowano i po¬ zostalosc rozdzielono pomiedzy octan etylu i wode (50 ml kazde). Faze organiczna przemyto 10% wodnym kwasem 25 cytrynowym, wodnym kwasnym weglanem i nasycona solanka, wysuszono (Na2S04) i odparowano otrzymujac zadany amid (5,15 g). 2) Me2NCH2CH(NH2)CH2CHMe2.BOC-Leu-NMe2 (1,3 g, 5 mM) rozpuszczono w wod- 30 nym kwasie trójfluorooctowym (H20:CF3COOH 9:1, 20 ml) i roztwór mieszano 1 godz. Nastepnie rozpuszczal¬ nik odparowano i pozostalosc rozpuszczono w suchym THF. Mieszany roztwór ochlodzono do —20° w atmos¬ ferze azotu i dodano roztwór dwuboranu w THF (IM, 35 30 ml). Po 5 godz. w temperaturze pokojowej dodano metanol (10 ml) i roztwór mieszano 12 godz. przed odpa¬ rowaniem. Pozostalosc rozpuszczono w wodnym HC1 (2M, 15 ml) i mieszano dalsze 12 godz. przed odparowa¬ niem. Pozostalosc oczyszczono chromatograficznie na 40 zelu krzemionkowym (mieszanina 7C 7B), Odpo¬ wiednie frakcje laczono i odparowano uzyskujac zadana dwuamfne jako olej (800 mp), który krystalizowal przy staniu.W wyzej wspomnianym tescie Kosterlitza i in. samce 45 i samice swinek morskich (szczep Duncon Hartley) za¬ bijano uderzeniem w glowe, po czym usuwano czesc je¬ lita kretego i nastawiano izolowana kapiel narzadu o obje¬ tosci 50 ml. Reakcja „skurczu" wytwarza sie pod dziala¬ niem stymulacji- niska czestotliwoscia z impulsami prosto- 50 liniowymi 0,5 msek. Badany zwiazek rozpuszcza sie w wodzie destylowanej, w celu wytworzenia roztworu za¬ pasowego o stezeniu 1 mg/ml. Przeprowadza sie seryjne rozcienczanie stosujac roztwór Krebsa w celu wytworze¬ nia stezen 10 //g, 1 fig i 0,1 //g/ml. Zwiazek bada sie do¬ dajac 0,1—0,3 ml roztworów do kapieli z narzadem. Wy¬ kresla sie nastepnie krzywa reakcji w zaleznosci od dawki i porównuje sie z krzywa dla Met encefaliny. W tescie szarpniecia ogona u szczura stosowano goraca woda (u- trzymywana w 55 ° ±1 °C) jako bodziec szkodliwy. 60 W tablicy 2 przedstawiono dane otrzymane dla zwiazków wytwarzanych sposobem wedlug wynalazku przy bada¬ niu w testach z jelitem kretym swinki morskiej (GPI, aktywnosc porównywana z Met encefalina), Hendersona i in. (HRF) oi;az w tescie^z cisnieniem ogona szczura 65 {R.T.F.).114 981 17 Tablica 2 18 Przyklad nr 1 2 3 4 22 6 19 Morfina G.P.I. sila dzialania (X Met en- cefalina) 2,6 7,2 4,1 8,5 6,5 13,0 3,2 —1,0 H & F EDso mg/Kg Lv. 0,01 0,28 0,000 .03 0,003 0,08 ng/Kg 0,028 0,24 0,07 R.T.F.ED5o mg/Kg i.v. 2,0 1,8 1,4 0,32 0,37 2,2 Kompozycje farmaceutyczne moga byc sporzadzane np. w formie do podawania pozajelitowego, takie jak sterylne wodne lub olejowe roztwory lub zawiesiny do wstrzykiwan. Postaci jednostkowe do podawania dozyl¬ nego, domiesniowego lub podskórnego zawiera 0,1— —50 mg/ml zwiazku wytwarzanego sposobem wedlug wynalazku (lub równowazna ilosc farmaceutycznie do¬ puszczalnej soli). Poziomy dawek, na ogól, dla ulzenia bólowi, wynosza 0,1—100 mg w zaleznosci od sposobu wstrzykiwan.Zastrzezenia patentowe Sposób wytwarzania nowego peptydu o wzorze ogól¬ nym 1, w którym Ri oznacza atom wodoru, rodnik mety¬ lowy, "allilowy, dwumetyloaljilowy, propargilowy, cyklo- propylometylowy, cyklobutylometylowy lub fenetylowy, B oznacza grupe -NH-CR3H-CO-, o konfiguracji D, w której R3 oznacza rodnik alkilowy o 1—6 atomach wegla lub grupe CqH2qYCrH2r_j_i, w której q oznacza liczbe 1—2, r oznacza liczbe 0—1, a Y oznacza atom tlenu, siarki, .20 30 35 grupe SO lub S02, D oznacza grupe -NR5-CR*H-CO-, o konfiguracji L, w której R5 oznacza atom wodoru lub rod¬ nik metylowy, R6 oznacza grupe aryloalkilowa o 1—3 ato¬ mach wegla w grupie alkilowej, R8 oznacza atom wodoru, rodnik alkilowy o 1—5 atomach wegla, rodnik arylowy lub aryloalkilowy o 1—2 atomach wegla w grupie alki¬ lowej, Rx oznacza grupe (CH2)S-X, w której s oznacza liczbe 2—4, a X oznacza grur5e NHR*, N +RuR^Rn^ NR9CORn, NR^COORn, NR^CONFh, NR^CONRioRn, N(0)nRnRJ2, COOR", CONRoRio lub OCONR^Rio gdzie R9 oznacza atom wodoru, rodnik alkilowy o 1—3 atomach wegla, grupe arylowa lub arylo-CH2, R10 oznacza atom wodoru lub grupe alkilowa o 1—3 atomach wegla, R11 oznacza grupe alkilowa o 1—3 atomach wegla, ary¬ lowa lub arylo-CH2-, R12 oznacza rodnik alkilowy o 1—3 atomah wegla, R13 oznacza rodnik alkilowy o 1—3 ato¬ mach wegla, a n oznacza liczbe 0 lub 1, albo grupa o wzo¬ rze 2 oznacza grupe o wzorze 3, w której m oznacza licz¬ be 1—3, a Q oznacza grupe SO, S02, CO, CHOH, N+ MeR" lub N(0)Rn, oraz grupa arylowa oznacza rodnik fenylowy, ewentualnie podstawiony atomem chloru, grupa mety¬ lowa, hydroksylowa, lub metoksylowa oraz ich soli addy¬ cyjnych z kwasami, znamienny tym, ze zwiazek o wzo¬ rze ogólnym Y-Mi-OH, w którym Y oznacza odpowied¬ nia grupe N-zabezpieczajaca, a Mi oznacza odpowiednio zabezpieczona reszte aminokwasu lub peptydu konden- suje sie ze zwiazkiem o wzorze ogólnym 4, w którym Rx i R8 maja wyzej podane znaczenie, a M2 oznacza odpowied¬ nio zabezpieczona reszte aminokwasu lub peptydu, przy czym Mi i M2 lacznie oznaczaja grupe -Tyr-B-Gly-D lub jej zabezpieczona pochodna, w których to grupach B i D maja wyzej podane znaczenie, a nastepnie usuwa sie gru¬ py zabezpieczajace, po czym w przypadku gdy w otrzy¬ manym produkcie Rx oznacza grupe (CH2)s-N(0)nRnR12, w której n oznacza liczbe 0, otrzymany produkt ewentual¬ nie poddaje sie utlenianiu nadtlenkiem wodoru.K ' Tyr — B — Giv — D — N — Rx ' ' • 'A.WZCfR 1 — N—Rx WZ.0R 2 ^Ur^Ch^ WZ0R 3 H — M2 — N — Rx A.WZ0R U114 981 BOC - Phe - N S WZÓR 5 H - Phe - N S.HCl WZÓR 6 BOC- Gly- Phe -'N S WZÓR 7 Phe - N S. HCl WZÓR 8 BOC-Tyr-(Bul)-D-Ala-Gly-Phe-N S WZÓR 9 Tyr-D-Ala-Gly-Phe-N S WZÓR 10 Tyr-D-Ala-Gly-Phe -N S—»0 WZÓR 11 H -Tyr-D-Ala - Gly-Phe-N S~»0 WZÓR 12 H-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-N N WZÓR 13 \ Me114 981 H -Tyr-D-Ala-Gly-MePhe -N' WZÓR U ^CH2CH2CHMe2 CH2CH2NMe2 H-Tyr-D- Ala-Gly-MePhe - N WZÓR 15 . CH2CH2CHMe2 ch2ch2n(o)mg2 H-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-N N ^-^ ^Ph WZÓR 16 ^ CH2CH2Ph H -Tyr-D-Ala-Gly-MePheN ^(CH2)2NMe2 WZÓR 17 . CH ChLPh H-Tyr-D-Ala-Gly-MePheN x(ch)2n(ó)mg2 WZÓR 18 ,CH2CH(CH3)2 H-Tyr-D-Ala-Gly-MePheNHC----H CH2NMe2 WZÓR 19 ,CH2CHMe2 H -Tyr-D-Ala-Gly-MePheNHC H CHN(0)Mgo 2 2 WZÓR 20114 981 Tyr D-Ala Gly Phe BOC BOC- H ¦ Bu1 v BuT k_ BOC- BOC- OH Cl0H2®- OH NH2CH2CH2NHCOCH3 NHCH2CH2NHCOOCH3 NHCH2CH2NHCOCH3 •NHCH2CH2NHCOCH3 ' NHCH2CH2NHCOCH3 SCHEMAT 1 Tyr D-A!a BOC BOC- crH-+ Bu1 ki Bu1 Y- Gly BOC4-NH(CH2)3NMe2 BOC+OH crH2+-FNH(CH2)3NMe HCl BOC- OH Cl"H2+- MePhe BOC-h-OH i -NH(CH2)3NMe2 -NH(CH2)3NMe2.HCl TNH(CH2)3NMe2 -NH(CH2)3NMe2.HCl SCHEMAT 2 Tyr D-Aia Gly BOC BOC- H Bu* Bu* OH MePha BOC BOC H OH NH2CH2CH,NMe2 NHCH2CH2NMe2 NHCH2CH2NMe22.HCl NHCH2CH2NMe2 NHCH2CH2NMe22.HCl SCHEMAT LDD Z-d 2, z. 335/1400/82, n. 90+20 egz.Cena 100 zl PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL