Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania kwasu 2,5-dwuketoglikonowego.Kwas 2,5-dwuketoglikonowy jest uzytecznym pólpro¬ duktem w syntezie witaminy C. Z tego wzgledu wytwarza sie go przy pomocy wielu róznych rodzajów bakterii takich 5 jak Acetobacter melanogenum, Acetobacter aurantium, Gluconoacetobacter rubiginosus, Gluconoacetobacter li- auifaciens i Pseudomonas sesami. Jednakze zastosowanie tych drobnoustrojów jest niepozadane z przemyslowego punktu widzenia z powodu powstawania duzych ilosci 10 brunatnych lub zólto-brunatnych pigmentów jako produk¬ tów ubocznych hodowli przez co zmniejsza sie czystosc wytwarzanego kwasu 2,5-dwuketoglikonowego.W opisie patentowym St. Zjedn. Amer. nr 3 790 444 ujawniono sposób wytwarzania kwasu. 2,5-dwuketogliko- 15 nowego bez tworzenia sie towarzyszacych brunatnych pigmentów przez nowy szczep oznaczony jako Acetobacter fragum w hodowli zawierajacej jako pozywke glikoze oraz substancje bedaca zródlem azotu. W sposobie tym stosuje sie poczatkowe pH 5,8 i po 32 godzinach otrzymuje kwas 20 2,5-dwuketoglikonowy z wydajnoscia 87% w przeliczeniu na glikoze.Wynalazek dotyczy ekonomicznego procesu wytwarzania kwasu 2,5-dwuketoglikonowego przy zastosowaniu latwo dostepnego szczepu Acetobacter cerinus. Korzystnymi 25 z tych szczepftw sa dwa: IFO 3263 i 3266, które wytwarzaja kwas 2,5-dwuketoglikonowy z wydajnoscia ponad 95% (w przeliczeniu na glikoze).Kwas 2,5-dwuketoglikonowy jest stosowany jako pól¬ produkt przy wytwarzaniu kwasu askorbinowego. Wodny 30 roztwór kwasu 2,5-dwuketoglikonowego mozna selektywnie redukowac w celu uzyskania mieszaniny 2-ketogulonianu i 2-ketoglikonianu, które mozna przeprowadzic w kwasy askorbinowy i erytorbowy.Sposobem wedlug wynalazku kwas 2,5-dwuketoglikono¬ wy otrzymuje sie latwo przez dzialanie bakterii na glikoze, stosujac znany, latwo dostepny szczep Acetobacter cerinus.Przebadano wszystkie dostepne powszechnie szczepy Acetobacter cerinus. W badaniach tych wydajnosc otrzy¬ mywanych ketokwasów wynosila 50—95 % (w przeliczeniu na glikoze). Gdy stosuje sie Acetobacter cerinus korzystnie IFO 3263 lub 3266, wytwarzanymketokwasem jest wylacznie pozadany kwas 2,5-dwuketoglikonowy a proces przebiega z wydajnoscia ponad 95 % (w przeliczeniu na glikoze).Dostepnymi powszechnie szczepami Acetobacter cerinus sa: IFO 3262 (ATCC 12303), 3263, 3264, 3265, 3266, 3267, 3268, 3269.. Szczepy te sa znane i zarejestrowane w katalogu ATCC, wyd, 11, 1974jako ATCC 12303 oraz w rejestrze prowadzo¬ nym przez Institute for Fermentation w Osace jako Gluco- nobacter cerinus IFO 3262 — IFO 3270 (róznica w nazwie szczepu wynika z odmiennej nomenklatury stosowanej przez Instytut w Osace).Wspomniane szczepy Acetobacter cerinus hoduje sie w srodowisku, w którym glówne zródlo wegla stanowi glikoza. Drobnoustroje te nie wymagaja kosztownych zródel azotu takich jak pepton lub ekstrakt miesny.Zwykle hodowle prowadzi sie na pozywce zawierajacej 2,5—20 % glikozy oraz tanie zródlo azotu takie jak mocznik i nieorganiczne zródla azotu takie jak sole amonowe, 118 433118 433 zwlaszcza siarczan amonu, azotan amonu lub fosforan amo¬ nu, a jako wskaznik wzrostu do pozywki dodaje sie kwas nikotynowy. Pozywka zawiera takze sole mineralne, oraz zródlo fosforu.Stezenie glikozy w srodowisku zmienia sie w granicach 2,5 — 20 % korzystnie 10—12 % w celu najbardziej ekono¬ micznego otrzymania kwasu 2,5-dwuketoglikonowego.Temperatura fermentacji wynosi 20—35 °C. korzystnie 25—30°C a zwlaszcza okolo 28 °C. Poczatkowe pH srodo¬ wiska hodowli wynosi 3,5—7,5, korzystnie 5—6. Podczas przebiegu fermentacji wartosc pH utrzymuje sie na pozio- •mie okolo, 5,5 przez dodawanie roztworu wodorotlenku sodu.' Do regulowania wartosci pH mozna tez stosowac weglan wapnia. Dodaje sie go, do hodowli po sterylizacji para pod zwiekszonym cisnieniem w ilosci okolo 30 g na 110 g glikozy.Po inokulacji, srodowisko fermentacyjne miesza sie przy pomocy mieszadla mechanicznego o szybkosci 1700 obro¬ tów/min i napowietrza z szybkoscia 0,5—1 objetosci po¬ wietrza (objetosc brzeczki) minute..Stosujac Acetobacfer cerinus IfO 3263 lub 3266 fermen¬ tacje prowadzi sie az do uzyskania wydajnosci kwasu 2,5-dwuketoglikonowego co najmniej 90 % (w przeliczeniu na glikoze) (36—40 godzin).Za pomoca chromatografii bibulowej stwierdzono, ze konwersja glikozy do lcwasu 2,5-dwuketoglikonowego przebiega w nastepujacy sposób: glikoza^*" kwas 2-ketoglikonowy -£ kwas 2,5-dwuketogIi- konowy glikoza - kwas 5-ketoglikonowjr -+ kwas 2,5 -dwuketo- glikonowy.Zastosowano bibule Whatman nr 1 i nr 4 i uklad roz¬ puszczalników keton metyloetylowy:aceton:kwas mrów¬ kowy:woda (80:6:2:12). Plamki kwasu identyfikowano przez spryskiwanie 0,2 % roztworem etanolowym o-fenyle- nodwuaminy zawierajacym 1 % kwasu azotowego i ogrzewa¬ nie do temperatury okolo 70 °C (kwas 5-ketoglikonowy- niebieski; kwas 2-ketoglikonowy — zólty; kwas 2,5-dwu- ketoglikonowy — zielony).W celach identyfikacyjnych mozna stosowac równiez ciekla chromatografie wysokocisnieniowa.Kwas 2,5-dwuketoglikonowy mozna oddzielic i odzyskac z koncowej brzeczki fermentacyjnej wjakikolwiekkonwencjo¬ nalny, znany sposób. Odsaczona brzeczke fermentacyjna mozna potraktowac borowodorkiem a otrzymana miesza¬ nine kwasów 2-ketoglikonowego i 2-ketogulonowego poddac hydrolizie, uzyskujac,kwasy askorbinowy i erytorbowy.Przyklad I. Przygotowano nastepujace wodne sro¬ dowisko inoculum.; Skladnik g/litr Glikoza, 25 Roztwór namoczonej kukurydzy 5 KH2PO4 0,5 K2HP04 0,5 MgS04 —7H20 0,2 CaCOs ' '" • 6,3 pH 6,2 Wytrzasana kolbe zawierajaca 1 litr srodowiska poddaje sie sterylizacji pare pod zwiekszonym cisnieniem w ciagu 30 minut w temperaturze 121°C. Wartosc pH oziebionego srodowiska wynosi 5,0. Do kolby dodaje sie komórki Aceto- 5 bacter cerinus IFO 3263 pochodzace ze skosu' agarowego jako pozywki (5 ml z 20 ml sterylnej wodnej zawiesiny) i nastepnie kolbe wytrzasa sie na wytrzasarce obrotowej w temperaturze 28 °C w ciagu 24 godzin.Przyklad II. Czesc hodowli kultury dostateczna 10 do wytworzenia 5%. objetosc/objetosc inoculum dodaje sie do 4-litrowego fermentatora z mieszadlem, zawierajacego 2-litry nastepujacej pozywki produkcyjnej: Skladnik g/litr Glikoza 110 15 Roztwór namoczonej kukurydzy 0,5 (NH4)2HP04 0,58 KH2P04 1,5 MgS04-7H20 0,5 mocznik 0,5 20 CuS04-5H20 1 mg _ kwasnikotynowy 300 r pH 6,0 Fermentacje przeprowadza sie w temperaturze okolo 28 °C, przy mieszaniu z szybkoscia 1700 obrotów/jninute 25 i napowietrzaniu z szybkoscia 0,75 objetosc/objetosc brzeczki/minute. Po okresie fermentacji trwajacym okolo 20 godzin, dodaje sie sterylnej glikozy (55 g/litr). Wartosc pH utrzymuje sie na poziomie 5,5 przez dodanie roztworu wodorotlenku sodu. Fermentacje prowadzi sie az do uzys- 30 kania wydajnosci kwasu 2,5-dwuketoglikonowego powyzej 95% (w przeliczeniu na glikoze). Otrzymany produkt wydziela sie, poddajac surowa brzeczke fermentacyjna chromatografii.Postepujac jak opisano wyzej, lecz stosujac Acetobacter 35 cerinus IFO 3266, otrzymuje sie kwas 2,5-dwuketogliko¬ nowy z wydajnoscia powyzej 95 %. (w przeliczeniu na gliko¬ ze). -40 Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania kwasu 2,5-dwuketoglikonowego w hodowli Acetobacter prowadzonej w warunkach aerobo- 45 wych, znamienny tym, ze prowadzi sie hodowle Aceto¬ bacter cerinus, w temperaturze 20—35 °C i poczatkowym pH 3,5—7,5 na pozywce zawierajacej 2,5—20% glikozy i zródlo azotu, zwlaszcza mocznik lub sole amonowe, sole mineralne i zródlo fosforu, w obecnosci kwasu nikotyno- 50 wego, a nastepnie wyosabnia sie zadany kwas w znany sposób. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze hodowle prowadzi sie w temperaturze 25—30 °C, przy poczatkowym pH5—6. 55 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako Acetobacter cerinus stosuje sie szczep IFO 3263. 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako Acetobacter cerinus stosuje sie szczep IFO 3266.LDD Z-d 2, z. 1075/1400/82, n. 95+20 egz.Cena 100 zl PL PL PL PL PL PL PL PL PL PLThe present invention relates to a method for producing 2,5-diketoglyconic acid. 2,5-Diketoglyconic acid is a useful intermediate in the synthesis of vitamin C. For this reason, it is produced by a variety of different types of bacteria, such as Acetobacter melanogenum, Acetobacter aurantium, Gluconoacetobacter rubiginosus, Gluconoacetobacter liauifaciens, and Pseudomonas sesami. However, the use of these microorganisms is undesirable from an industrial standpoint because of the formation of large amounts of brown or yellow-brown pigments as by-products of the culture, which reduces the purity of the produced 2,5-diketoglyconic acid. U.S. Patent No. 3,790,444 discloses a method for producing the acid. 2,5-Diketoglyconic acid without the formation of accompanying brown pigments by a new strain designated Acetobacter fragum in a culture containing glucose and a nitrogen source as a nutrient. This method uses an initial pH of 5.8 and after 32 hours, 2,5-Diketoglyconic acid is obtained with a yield of 87% calculated as glucose. The invention relates to an economical process for the production of 2,5-Diketoglyconic acid using the readily available Acetobacter cerinus strain. The preferred strains are IFO 3263 and 3266, which produce 2,5-diketoglyconic acid with a yield of over 95% (calculated as glucose). 2,5-diketoglyconic acid is used as an intermediate in the production of ascorbic acid. An aqueous solution of 2,5-diketoglyconic acid can be selectively reduced to obtain a mixture of 2-ketogulonate and 2-ketoglyconate, which can be converted to ascorbic and erythorbic acids. In the method of the invention, 2,5-diketoglyconic acid is readily obtained by bacterial action on glucose, using the known, readily available strain of Acetobacter cerinus. All commonly available strains of Acetobacter cerinus were tested. In these studies, the yield of obtained ketoacids was 50-95% (calculated as glucose). When Acetobacter cerinus, preferably IFO 3263 or 3266, is used, the only ketoacid produced is the desired 2,5-diketoglyconic acid and the process is carried out with a yield of over 95% (calculated as glucose). The commonly available Acetobacter cerinus strains are: IFO 3262 (ATCC 12303), 3263, 3264, 3265, 3266, 3267, 3268, 3269. These strains are known and registered in the ATCC catalogue, 11th edition, 1974 as ATCC 12303 and in the register kept by the Institute for Fermentation in Osaka as Gluconobacter cerinus IFO 3262 - IFO 3270 (the difference in the strain name is due to the different (nomenclature used by the Osaka Institute). The above-mentioned Acetobacter cerinus strains are cultivated in an environment in which glucose is the main carbon source. These microorganisms do not require expensive nitrogen sources such as peptone or meat extract. Usually, cultivation is carried out in a medium containing 2.5-20% glucose and a cheap nitrogen source such as urea and inorganic nitrogen sources such as ammonium salts, especially ammonium sulfate, ammonium nitrate or ammonium phosphate, and nicotinic acid is added to the medium as a growth indicator. The medium also contains mineral salts and a source of phosphorus. The glucose concentration in the medium is varied within the range of 2.5-20%, preferably 10-12%, in order to obtain 2,5-diketoglyconic acid in the most economical way. The fermentation temperature is 20-35°C, preferably 25-30°C, and especially about 28°C. The initial pH of the culture medium is 3.5-7.5, preferably 5-6. During the fermentation process, the pH value is maintained at about 5.5 by adding sodium hydroxide solution. Calcium carbonate can also be used to regulate the pH value. It is added to the culture after steam sterilization under increased pressure in the amount of about 30 g per 110 g of glucose. After inoculation, the fermentation medium is mixed with a mechanical stirrer at a speed of 1700 rpm and aerated at a speed of 0.5-1 volume of air (volume of broth) per minute. Using Acetobacfer cerinus IfO 3263 or 3266, the fermentation is carried out until the yield of 2,5-diketoglyconic acid is at least 90% (calculated as glucose) (36-40 hours). Paper chromatography has shown that the conversion of glucose to 2,5-diketoglyconic acid proceeds as follows: glucose ^*" acid 2-Ketoglyconic acid - 2,5-Diketoglyconic acid glucose - 5-Ketoglyconic acid - + 2,5-Diketoglyconic acid. Whatman No. 1 and No. 4 paper were used and the solvent system was methyl ethyl ketone:acetone:formic acid:water (80:6:2:12). The acid spots were identified by spraying with a 0.2% ethanolic solution of o-phenylenediamine containing 1% nitric acid and heating to approximately 70°C (5-Ketoglyconic acid - blue; 2-Ketoglyconic acid - yellow; 2,5-Diketoglyconic acid - green). High-pressure liquid chromatography can also be used for identification purposes. 2,5-Diketoglyconic acid can be separated and recovered from the final fermentation broth by any conventional method known in the art. The filtered fermentation broth can be treated with borohydride and the resulting mixture of 2-ketoglyconic and 2-ketogulonic acids hydrolyzed to yield ascorbic and erythorbic acids. Example I. The following aqueous inoculum medium was prepared: Ingredient g/liter Glucose, 25 Corn Soak Solution 5 KH2PO4 0.5 K2HPO4 0.5 MgSO4 —7H2O 0.2 CaCO3 ' '" • 6.3 pH 6.2 A shake flask containing 1 liter of medium was subjected to steam sterilization under increased pressure for 30 minutes at 121°C. The pH value of the cooled medium is 5.0. Acetobacter cerinus IFO 3263 cells derived from an agar slant are added to the flask as a medium (5 ml of 20 ml of sterile aqueous suspension) and then the flask is shaken on a rotary shaker at 28°C for 24 hours. Example II. A portion of the culture is sufficient to produce 5%. volume/volume of inoculum is added to a 4-liter stirred fermenter containing 2 liters of the following production medium: Ingredient g/liter Glucose 110 15 Soaked corn solution 0.5 (NH4)2HP04 0.58 KH2P04 1.5 MgSO4-7H2O 0.5 urea 0.5 20 CuSO4-5H2O 1 mg _ nicotinic acid 300 r pH 6.0 Fermentation is carried out at a temperature of approximately 28 °C, with stirring at 1700 rpm and aeration at a rate of 0.75 volume/volume of broth/minute. After a fermentation period of approximately 20 hours, sterile glucose (55 g/liter) is added. The pH is maintained at 5.5 by adding sodium hydroxide solution. Fermentation is continued until the yield of 2,5-diketoglyconic acid exceeds 95% (calculated as glucose). The resulting product is isolated by chromatography of the crude fermentation broth. Proceeding as described above, but using Acetobacter cerinus IFO 3266, 2,5-diketoglyconic acid is obtained in a yield exceeding 95% (calculated as glucose). Patent Claims 1. A method for producing 2,5-diketoglyconic acid in an Acetobacter culture carried out under aerobic conditions, characterized in that Acetobacter cerinus is cultivated at a temperature of 20-35°C and an initial pH of 3.5-7.5 on a medium containing 2.5-20% glucose and a nitrogen source, especially urea or ammonium salts, mineral salts and a phosphorus source, in the presence of nicotinic acid, and then the desired acid is isolated in a known manner. 2. A method according to claim 1, characterized in that the cultivation is carried out at a temperature of 25-30°C and an initial pH of 5-6. 3. A method according to claim 1, characterized in that the cultivation is carried out at a temperature of 25-30°C and an initial pH of 5-6. 4. The method according to claim 1, characterized in that the Acetobacter cerinus strain used is IFO 3263. 5. The method according to claim 1, characterized in that the Acetobacter cerinus strain used is IFO 3266. LDD Z-d 2, z. 1075/1400/82, n. 95+20 copies. Price PLN 100. PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL