Opis patentowy opublikowano: 31.08.1984 123315 Int. CI .13 A61K 39/00 A61K 37/02 C07G 17/00 Twórca wynalazku Uprawniony z patentu: Cilba-Geigy AG., Bazylea {Szwajcaria) Sposób wytwarzania nowych pochodnych antygenowych Przedmiotem, wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowych pochodnych antygenów o ogólnymi wzorze 1, w 'którym A oznacza reszte antygenu, Z oznacza czlon mostkowy, MP oznacza reszte pep- tydoi muramylowego Luta jego digomeru a n ozna¬ cza liczbe calkowita wieksza niz zero, przy czym antyigen jest zwiazany kowaleintnie z co najmniej jednyim peptydem muramylowyim ewentualnie po- pnzez czlon mostkowy, taki jak dwuwartosciowe reszty zwiazków alifatycznych, zwlaszcza reszty zawierajace co najmniej 'dwie gnupy aminowe, re¬ szty zawienajace co najimniej jedna grupe amino¬ wa i jedna ginupe karboksylowa lub tiokarfooksy- lowa, albo reszty zawierajace co najmniej dwie grupy karboksylowe lub liokarboksylowe, takich zwiazków jak alifatyczne dwuanidnyT" kwasy aini- notiokanboksylowe, obojetne, zasadowe lub kwas¬ ne aminokwasy alifatyczne, dwiupeptydy liub oli- .gopeptydy, zas peptyd muramylowy nia wzór o- gólny 2 lub 2a, w których to wzorach X oznacza grupe karfoonyiowa, hydroksykarfoonylowa lub sul- fonyiowa, Rx oznacza atom wodoru, grupe alkilo¬ wa, ewentualnie podstawiona gnupe benzylowa hub acylowa, grupe trójalkilosililowa, R2 oznacza ewentualnie podstawiona grupe alkilowa iiuib kar- bocyikliicizna grupe arylowa, R4 i R6 niezaleznie od siebie oznaczaja atom wodoru, ginupe alkilowa, ewentualnie podstawiona grupe benzylowa lufo acy¬ lowa, ginupe trójalkilosililowa, R3 oznacza atom wodoru iLub grupe alkilowa, R7 oznacza aitoim wo- 10 15 20 30 doru lub nizsza gnupe alkilowa, R8 oznacza atom wodoru, nizsza grupe al'kilowa, wolna, zestryfi- kowana lub zeteryfikowana nizsza girupe hydro- ksyalkilowa, wolna, zestryfiikowana lub zeteryfi¬ kowana nizsza grupe merkaptoalkilowa, wolna lub zacylowana nizsza grupe aminoalkilowa, grupe cylMoallkiiowa o 5 lub 6 atamaidh wegla, nizsza gnupe cykloalkiloalikilowa, której reszta cykloal- kilowa zawiera 5 lub 6 atomów wegla, ewentual¬ nie podstawiona grupe airylowa lulb aryloalkiiowa, zawierajaca azot gmupe heterocykliczna lub niz¬ sza gnupe heterocyklicznoalikilowa, R7 i R8 razem oznaczaja takze gnupe alkiienowa o 3 lob 4 ato¬ mach wegla, R9 oznacza atom wodoru lulb nizsza giurpe alkilowa, a Ri©, Rn i R12, niezaleznie od siebie oznaczaja ewentualnie zestryfikowana Lub zaimidowana grupe karboksylowa, albo Rn ozna¬ cza takze atom wodoru, a R13 oznacza nizsza gru¬ pe alkilowa lub w przypadku gdy Ri, R4 i Pe oznaczaja nizsze gnupy trójalkilosililowe, zwlasz¬ cza trój-metylosililowe, R13 oznacza równiez atom wodoru.Pod okresleniem „antygen" irozuimie sie substan¬ cje powodujace specyficzne uodpornienie zywego organizmu na dzialanie zarazków chorobotwór¬ czych wywolujacych infekcje lub niepozadane re¬ akcje takie jak odrzucenie transplantowanych ob¬ cych tkanekK a (takze substancje skladowe szcze¬ pionek.Takimi substancjami skladowymi szczepionek 123 3151Z3 315 Sa np. oslabione zywe lub usmiercone zmodyfiko¬ wane badz odbudowane zarazki chorób zakaznych, wytworzone przez te zarazki toksoidy lub natu¬ ralne badz wytworzone syntetycznie czesci sklado¬ we zarazków i toksoidów. 5 Korzystnymi antygenami sa skladowe substan¬ cje szczepionek przeciwko pasozytom, bakteriom, winusom, komórkom nowotworowym w oslabionej lub usmierconej postaci liub ich czesci skladowe, skladniki szczepionek przeciwko strukturom en- ) 10 dogennyim, immunologicznym strukturom rozpo¬ znawczym lub ^ szczepionek nadajajcycih sie do specyficznego odczulania przy alergiach Uiih tikfarinitki ^szczejgfronek przectiwkio malarii, cho- l^ze^Ef^USOwi/zap^niiu opon, goraczce reuma- os tycznej spowodowanej zakazeniem paciorkowca- ijii, grypie, chorobie racic i pyska lub skladniki szczepionek dla wywolania odpornosci wobec roz¬ mnazajacych siauilgLadów lub do ponojwnego wy¬ wolania tolerancji wobec endogennych skladników 20 tkanek czastek krazacych lub skladników szcze¬ pionek uzywanych do leczenia grypy rzekomej 1—3 chorób ukladu oddechowego wywolanych od¬ dechowym wiirusem Syncital, wirusami nosowymi lub ademoidowymi, komórkami olbrzymimi rózycz¬ ki, odry, swinki, krztiusca, Heine-Medina, oprysz- czki zwyklej 1 i 2, ospy wietrznej i pólpascca, chorób wywolanych wirusami skretowymi, zapale¬ nia wajtiroby, zwlaszcza A, B chorób wywolanych pneumokokami próchnicy i jaglicy grypa, bakte¬ riami Pseudomonas i Proteus, biegunek wywola¬ nych zarazkami duiru rzekomego i innymi ba¬ kteriami jelitowymi, rzezaczka, syfilisem, swidrow- cem (spiaczki i choroby Ohagasa), leiszmaniozy, filariozy, przywirzyc, ankylostomiaizy i innych cho- rób czerwiowych albo alergicznej astmy wywo¬ lanej uczuleniem na pylki 'traw, pylki Lub lekii, alergicznego niezytu i nadwrazliwosci na srodki lecznicze. Jako szczególnie korzystne antygeny (wy¬ mienia sie merozoity malarii, wlasciwe typowi zdlaffenkowców polisacharydy A, Bi C, M-paKtfeiny padorkowców, hemoaglutynian wirusa grypy, ko¬ mórki nowotworowe liub czesci skladowe blon ko¬ mórek nowotworowych, czesciowe sekwencje ludz¬ kiej gonadoitropiny kosimówkowej, ekstrakty pyl¬ ków traw, specyficzne dla antygenów komórki T- -limfoblastów i ich receptory dla antygenów lob specyficzne dla antygeniu imaminogloibuliny, chla- rnidy, irifcetsje, pierwotniaki lub wielokomórkowe pasozyty, czesci skladowe plemników, mediatory procesów zapalnych lanb homologiczne badz hetero- logiczne komórki nowotworowe reagujace krzy¬ zowo z^komórkami nowotworowymi wlasnego po¬ chodzenia, fragmenty komórek nowotworowych wlacznie z jglikoproteinami kodowanymi wirusem Ohkorna, lub alergeny.Innymi slowy, jako skladniki szczepionek bra¬ ne sa pod uwage itakie, które w ramach klasycz¬ nej immunologii mozna stosowac do specytficznego uodpornienia przeciwko chorobom infekcyjnym.Z dnugiej strony wymienia sie szczepionki no¬ wego rodzaju, skierowane nie przeciwko zarazkom chorób zakaznych lecz albo przeciwko wlasciwym organizmowi skladnikom, (tj.), zwyklym lufo zmo¬ dyfikowanym wlasnym antygenom, albo przeciw 25 30 35 40 50 55 65 uczulajacym antygenom srodowiskowym, (tj.), aler¬ genom.Odnosnie szczepionek skierowanych przeciwko wlasciwym organizmowi skladnikom dazy sie, przez uodpornienie przeciw zwyklym lub zwyrod¬ nialym wlasnym antygenom, do wyeliminowania dzialania wlasciwych organizmowi czasteczek (np. hormonów — od innych mediatorów i od hiumo- ralnych oraz stalokomórkowych (receptorów), wzglednie do zniesienia rozsiewania luib prze¬ trwania zwyrodnialego, szczególnie nowotworo¬ wego szeregu komórek.Korzystnymi antygenami stanowiacymi czesci skladowe takich szczepionek, sa np. czesciowe sek¬ wencje ludzkiej gonadotropiny kosimówkowej, lub czesci skladowe plemników dla uodpornienia przed mediatorami plodnosci i przez to prowadzace do immunologicznego wylaczenia funkcji repirodiuk- cyjnej; mediatory procesów zapalnych, zwlaszcza w postaci oczyszczonej, oddzielone od ich lim¬ focytów limfokiny, szczególnie MIF (micropihage migration inhibitory factor) dla imniunologicznego tlumienia chorób zapalnych; immunologicznie wla¬ sciwe (receptory antygenowe limfocytów i prze¬ ciwcial (frakcjonowane wlasciwe antygenom lim¬ focyty, ekstrahowane lub oddzielone od tych lim¬ focytów receptory antygenowe, frakcjonowane wla¬ sciwe dla antygenu przeciwciala, wzglednie czesci przeciwcial) uodporniajace przeciw typowi dszie- dziicznosci) uodpornienie przeciw charakterystycz¬ nym dla autogenów strukturom receptora anty¬ genu w celu wylaczenia specyficznych reakcji od¬ pornosciowych dla wyeliminowania chorobotwór¬ czych procesów immunologicznych takich jak sa- mouodpornienie (np. na antygeny maziowe i im- munologlobuline przy pierwotnym chronicznym zapaleniu stawów, na skladniki melinowe parzy chorobach zwyrodnieniowych centralnego ukladu nerwowego, na receptory TSH przy samouodipor- nieniu w przypadku zapalenia gruczolu tarczowa- tego, na ireceptory acetylocholiny miesni (popirzecz- riie prazkowanych przy ciezkiej miastenii, na sklad¬ niki narzadu wysepkowego trzustki pirzy mlo¬ dzienczej cukrzycy itd. (lub uczulenia) np. na pylki traw, pyl lub leki przy alergicznej astmie, alergicznym niezycie nosa, wzglednie nadwrazli- wosdi na srodki lecznicze (albo dla unikniecia nor¬ malnej jako takiej, albo niepozadanej reakcji od¬ pornosciowej) np. wywolanie tolerancji immuno¬ logicznej w celu inhibicji odrzucenia przeszczepio¬ nego obcego organu lub tkanki); wlasnego pocho¬ dzenia, badz reagujace z nimi krzyzowo homolo¬ giczne lub heterologiczne komórki nowotworowe, czesci komórek nowotworowych lub skladniki ich blony komórkowej wlacznie z glikoproteLnami ko¬ dowanymi wirusem Onkorma, jak np. GP 70, do specyficznie nowotworowego uod(pornienia "w ra¬ mach profilaktyki i leczenia chorób nowotworo¬ wych.Odnosnie szczepionek skierowanych przeciwko 'uczuleniowym antygenom srodowiskowym próbo¬ wano przez uodipornienie przeciw alergenom za¬ miast patogenicznie odpowiedniej stosowanej od¬ powiedzi przeciwcial IgE pobudzic wytwarzanie w . przewazajacej lub w wystarczajacej ilosci przeciw-123 315 6 cial IgG i IgA i tym sposobem wychwytac za po¬ moca specyficznych przeciwcial alergeny znajduja- ce sie w krazeniu i wewnetrznych wydzielinach zanim wejda one w reakcje z przeciwcialami IgE zwiazanymi z komórkami tucznymi powodujac e- wientuadnie uwolnienie alergicznych mediatorów.Przy tym specyficznym antygenowym odczule¬ niu antygenowa czesc skladowa szczepionki sta¬ nowia same alergeny tj. np. uczuleniowe pylki traw, ipyly lub leki, lub antygenowe szkladniki szczepionek. * Antygejny, zwlaszcza gdy sa one zwiazkami ni- skoczasteczkowymi, moga równiez z powodzeniem byc kowalencyjnie zwiazane z wielkoczasteczko¬ wymi nosnikiem. Jako nosniki wymienia sie zwla¬ szcza polimery (kwasu mlekowego i jego pocho¬ dne, które na koncu lancucha maja wolna grupe karboksydowa, jalk tez ich estry z kwasami gliko- lowymi, poliamidy kwasu mlekowego lub polie- stroamidy kwasu mlekowego, jak np. opisane w brytyjsikim paitemtowym opisie paitentiowyim nr 932 38<2, nastepnie kwasy alginowe, kwasy poligaiaktu- roniowe, kwasy pektynowe, kariboksymetylocefluloza lub agaroza. Nastepnie, jako nosniki wchodza w rachiuibe zasaidiowe, obojetne lub kwasne poliamino- kwasy, nie bedace same limmun^ogennymi, jak kwas paliasparaginiowy, kwas poligluitaminiowy, polilriizy- na lob pollorndtyma. Jako nosniki mozna stosowac równiez dowolne inne antygeny objete wyzej po¬ danym okresleniem, liuib przykladami, o ile reakcje immunologiczne na nie sa do przyjecia alltao nawet pozadane. Tak wiec, np. HOG moze byc kowalen- tnie izwiiazany na anatoksyniie tezcowej jako na nosniku.Rózne czesci nowych zwiajzków polaczione sa wzajemnie kowalencyjnie, tan. antygen jest zwia¬ zany co najmniej jedna swoja grupa funkcyjna przez zwykle w chemii peptydów polaczenie z re¬ szta peptydu muramylowego, bezposrednio lub przez czlon mostkowy (Spacer).Jako czlony mostkowe sluza dwuwartosciowe re¬ szty zwiazków alifatycznych zwlaszcza takie, które zawieraja co najmniej dwie grupy aminowe, co najmniej jedna gnupe aminowa i jedna grupe karboksylowa lub tiokanboksylowa albo co naj¬ mniej dwie grupy karboksylowe lub tiokarboksy- lowe, takich zwiajzków jak alifatyczne dwuaminy, kwasy aminotiokariboksylowe, obojetne, zasadowe lub kwasne aminokwasy alifatyczne, dwupeptydy lub oligopeptydy.Jako czlony mostkowe wymienia sie 'w pierw¬ szym rzedzie sze a, ^Kiwuaminoalkany, takie jak etylenodwu- aimina, propylenodwuarnina, caterornetyllenodwu- amina, kwasy alkilodwukanboksylowe, takie jak kwas bursztynowy lub glutarowy, kwasy a, (3- Lub Y-amkioailkanokarboIksylowe, przede wszystkim niz¬ sze kwasy a-aminoalkanokamboksylowe, zwlaszcza naturalne nizsze kwasy a-aniinoalkanokaiiboksylo- we, takie jak glicyna, p-alanina, L-aianina, kwas a-aminoizomaslowy, walina lub leucyna.Jako kowalencyjne czlony spinajace wymienia sie zwlaszcza grupy estrów kwasów karboksylo- wych, amidów kwasów karboksylowych, estrów kwasów tiokarboksylowych lub amidów kwasów tiokarboksylowych.Wymienione nowe zwiazki wytworzone sposo¬ bem wedlug wynalazku moga posiadac wiecej 5 czlonów kowalencyjnie spinajacych, zaleznie od radzaju czlonu mostkowego. Zatem powyzszy wzór 1 moze np. otrzymac postac szczególowa jak we wzorze 3, w którym A oznacza reszte antygenu, T oznacza reszte nosnika, MP oznacza reszte pe- io ptydu muramylowego, Z' i Z" oznaczaja dwuwar¬ tosciowe czlony mostkowe, a X', X", X"' i X*v oznaczaja kowalencyjne czlony spinajace, zas m i n oznaczaja licziby calkowite wieksze od zera.Nizej podano korzystne znaczenia kilku okreslen, 15 stosowanych w opisie.Grupa alkilowa oznacza prostolancuchowy lub rozgaleziony, w dowolnym polozeniu zwiazany alkil zawierajacwy do 18 atomów wegla, w pierw¬ szym rzedzie jednak nizszy alkil. 20 Jako podstawniki ewentualnie podstawionych grup alkilowych wchodza w gre w pierwszym rzedzie wolne lub funkcyjne przeksztalcone grupy hydroksylowe lub merkaptanowe, takie jak zetery- fikowane lub zesitryfikowaine grupy hydroksylowe 25 lub merkapatanowe, ,np. nizsze grupy alkoksylo- we lub nizsze grupy alkuomerkaptanowe, albo atoimy chlorowca, badz wolne lub fukcjonalnie zmienione grupy karboksylowe, takie jiak nizsze grupy alkoksykarboksylowe ilub karibanioiJlowe. 30 Przy tym podstawiania reszta alkilowa taka jak nizsza reszta alkilowa moze zawierac jeden, dwa lub wiecej jednakowych lub róznych podstawni¬ ków, zwlaszcza Wolne grupy hydroksylowe lub atomy chlorowca. 35 iCanbocykMczaie reszty arylowe to glównie re¬ szty arylowe monocykliczne, a takze dwucykliicz- ne, w pierwszym rzedzie fenylowa, lecz takze na¬ fty!ojwa. Moga one ewentualnie byc mono-, dwu- lub wielopodstawiome np. przez nilzsza grupe alki- 40 Iowa, wolna, zeteryfikowana lub zestryfikowana grupe hydroksylowa, np. nizsza grupe adkoksylo- wa lub nizsza grupe alkilenodwuhydrofasylowa, badz atomami chlorowca ii/Ilub grupa trójffluoro- metylowa. . 45 Reszta heterocykliczna zawierajaca azot stanowi w szczególnosci rodnik 5- lub 6-czlonowy, zawie¬ rajacy jeden lub dwa atomy azotu w pierscieniu zwiazku heterocyklicznego. Moze byc ona niena¬ sycona, lecz takze nasycona, np. zawierac nie- 50 skondensowana grupe fenylowa. Jako takie wy¬ mienia sie np. pierscienie pirolowe, indanowe, pi- rydylowe lub iimidazoiowe.Zestryfikowana lub tworzaca amid grupe kar¬ boksylowa stanowi w pierwszym rzedzie sama gru- 55 pa kanboksyjowa, badz zestryfikowana nizszym alkanoiem grupa karboksylowa lub takze karba- moilowa, niiejpodstawiona przy atomie azotu, badz jedno- lub dwupodstawiona grupa alkilowa, zwla¬ szcza nizsza grupa alkilowa, grupa arylowaj, w 60 pierwszym rzedzie grupa fenylowa lub aryloaikillo- wa, taka jak benzylowa. Grupa karibamoilowa moze jednak zawierac takze reszte aikilenowa, np. cztero- lub pieciometylenowa. Grupa fcaribamoilo- wa Rs maze przy atomie azotu byc podstawiona 65 takze grupa karbamoiilometylowa.123315 r 8 Gsnupa acyloiwa stanowi zwykle reszte acylowa kwasu organicznego, zwlaszcza organicznego kwa¬ su kanbolksyllowego .Talk wiec, gnupa acylowa jest zwyMe grupa alkanodlowa, przede wszystkim o 2—18 atomach wegla, w pierwszym rzedzie wsza¬ kze nizsza grupa alkanoiloWa lub takze anoiiowa, taka jak grupa 1-naftoilowa, 2-naftoilowa, a zwla¬ szcza bemzoilowa lufo grupa foenzoilowa lufo nafto- ilolwa podstawiona atoimem chlorowca, nizsza gru¬ pa alkilowa, nizsza grupa lalkoiksylowa, grupa trój- fluoiroimetylowa, grupa hydroksylowa lufo nizsza grupa alkanoilohydrofcsylowa, badz takze reszta acylowa organicznego sulcEokwasu, np. kwasu alka- nosufomowego, zwlaszcza niiziszego kwasu aikano- suifonowego, lub kwasu arylosulfonowego, zwla¬ szcza ewentualnie podstaiwiona nizsza grupa alki¬ lowa lufo aitoimeim chlorowca reszta kwasu feny- losultfonowego, takiego jak kwas benzenosuiifono- wy ilufo p-toluenosulfonowy, a takze grupy kairfoa- moilowe, np. niepodstawiona grupa karfoamoilo¬ wa^ nizsza grupa alkUokaorfoaimoolioiwa lub aryio- kanfoamoilowa, zwlaszcza metylo- lub fenylokarfoa- moilowa.Zesttryfikowana lub zeteryfikoiwana grupa hy¬ droksylowa to zwykle nizsza grupa alkoklsylowa lub nizsza grupa acyloksylowa, zwlaszcza nizsza grupa alkanoilolksyiowa.Zeistryfikowana lub zeterefikowana grupa mer- kaptanowa to zwykle nizsza grupa alkiloimenka- ptanowia lub nizsza ginupa acyloiwa, zwlaszcza niz¬ sza grupa alkanoiioimerkaptanowa.Zacylofwiana grupa aminowa to zwykle nizsza grupa aflkanoilominowa lufo karbamottoaminowa.W opisie i zastrzezeniach patentowych, grupy i zwiazki okreslone jako „nizsze" zawieraja prze¬ waznie do 7, a zwlaszcza do 4 atomów wegla.Powyzsze jak i ponizsze okreslenia ogólne moga miec nastepujace znaczenie.Niizsza gnupa alkilowa stanowi np. gfriupe n-pro- pylowa, n- foutylowa, izofoutyllowa, drugianzedowa foutylowa, dalej n-pentylowa, nnheksylowa, izohe- ksylowa lub n-heptylowa, a w pierwszym urzedzie metylowa lub etylowa. W grupie arylowej, cylklo- alkfilowej lub nizszej gnupe heiterocyklicznoalkilo- wej nizsza gnupe alkilowa stanowi zwykle grupa metylowa lufo etylowa, przy czym reszta arylowa, cykloalkilowa lub nizsza heterocyklicznealkilowa maja wyzej podane znaczenie.Nizsza gnupe alkoksylowa stanowi np .n-propa- mo-, n-butano-, izofoutano-, dmugonzedowa butano- lulb trzeciorzedowa grupa b^ano-hydiroksylowa, a zwlaszcza meitoksylowa lub etoksyflowa.Nizsza grupe alkilomerkaptanylowa stanowi np. grupa n^propylo-, n-ibuitylo-, izolbutylo-, dnugo- rzedowa butylo-, lub trzeciorzedowa butylo-mer- kapfcancwa, a zwlaszcza metylomerkaptanowa lub etyloimeirkaptanowia.Nizsza grupe alkilenodwunydroksylowa stanowi zwykle grupa metylenodwuhydrofcsyloWa^ etyleno- lub propylenodwuhydroksylowa.Chlorowiec to fluor lufo broim, zwykle jednak ohlor. Nizsza grupe alkanoilowa stanowi zwykle grupa propionylowa lub butyrylowa, w pierwszym rzedzie jednak acetylowa.Nowe zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wy¬ nalazku moga wystepowac w postaci mieszaniny izomerów lub czystych izomerów.Wiadomo, ze peptydy imuramylowe sa dobrymi adjuwantaimi, które w stosowanych odpowiednich 5 mieszaninach z antygenami umozliwiaja wzrost dzialania uodporniajacego. Jednakze wykazano, ze wywoluja one tylko krótkotrwale dzialanie, gdyz sa wzglednie szybko wydalane z organizmu lu¬ dzkiego lub zwierzecego. Przede wszystkim sa one w stanie wywolac in vivo jedynie w okreslonydji warunkach, nieprzydatnych do celów klinicznych, mianowicie w mieszaninie z antygenami jako emulsja w oleju mineralnym, odpornosc nadana komórkom na rozpuszczalne antygeny. Nowe zwia¬ zki wytworzone sposobem wedlug wynalazku po¬ woduja wiec zdecydowany wzrost reakcji odjpor- nosciowej na antygen, zwlaszcza moga wykazac równiez nadana komórkom odpornosc w klinicznie dopuszczalnych wanunkach podawania, jak to wyraznie wskazano w nizej opisanych metodach badawczych./I. Potegowanie nadanej komórkom odtponnoscd na bydlece albuminy surowicy (RSA) i na owcze erytrocyty (SRBC) w przypadku swinek morskich.Swinki morskie Pinbrighta uoidpannia sie w dniu zerowym 1 mg BSA lub 1 mg SRBC — „Ghosta" (SRBCG) w kompletnym adjiuwanoie Freunda dro¬ ga injekcji do obu tylnych lapek po 0,1 mi mie¬ szaniny antygen — adjuwant Po 3 tygodniach oce¬ nia sie ilosciowo reakcje sikory przez sródskóme wstrzykniecie 100 jjug BSA lub 100 i^g SRBCG rozpuszczonych w 0,il ml zbuifoirowanego roztworu soli fizjologicznej oceniajac odczyn na podstawie wiiellkosoi powienzchni rumieniiowej i pnzyirostai gru¬ bosci skóry po 24 godzinach.Zaobserwowany po 24 godzinach (odczyn opóz¬ nionego rodzaju) specyficznie antygenowy przy¬ rost objetosci odczynu sluzy jako miara odporno¬ sci nadanej komórkom. BSA i SRBCG sa zbyt sla¬ bymi imimunogenami, aby same lufo w wodtno- olejowej emulsji z niekompletnym adjuwanteim Freuda (10 czesci roztworu BSA wzglednie zawie¬ siny SRBCG w 0,9% NaGl wmieszane z 8,5 czescia¬ mi Bayolu F i 1,5 czesciami Arlacelu A) mogly wywolac odczyn opóznionego typu, lecz musza w celu skutecznego uodpornienia byc podane z kom¬ pletnymi adjuwantami, z dodatkiem mykoibakterii (5 mg niezywych i zliofiiizowanych pratków ma¬ slowych kwasoodpoirnych na 10 ml Bayott F (Arlaceu A).W miejsce mykoibakterii podaje sie nowe zwiazki zawierajace jako antygen BSA (1 mg BSA, 60 [ig MDP na zwierze) lub zawienajace. jako antygen SRBCG (1 mg SRBCG, 25 \ig na zwierze) albo w postaci mieszaniny antygen — olej, alfoo w postaci zawiesiny w kariboksymetylocelulozie (CMC). Nowe zwiazki wywoluja, pod nieobecnosc mykobakte/rii w opisanej metodzie doswiadczalnej, opózniony typ odczynu.Znaczne spotegowanie odczynu opóznionego typu na BSA i na SRBCG moze byc takze osiagniete w ten sposób, ze nowego zwiazku nie wkompono¬ wuje sie w niekompletny adjuwant Ereumda, leciz podaje zawieszony w CMC.Szczególnie skuteczne okazalo sie w tym przy- 15 20 25 30 35 40 45 50 55 80123 315 9 10 padku podawanie domiesniowe. W tych okolicz¬ nosciach równa ilosc wodnego pefctydu muramy- lowego, zastosowana jako mieszanina z CMC, wy¬ kazala ^znacznie mniejsza skutecznosc, niz noiwe zwiazki wytworzone sposobem wedlug wynalazku.Dowodzi to, ze zwiazki te w klinicznie dopu¬ szczalnych warunkach podawania, tzn. przy (poda¬ wania z korzystnymi dla ustroju srodkami towa- reyszacyimi, umozliwiaja wywolanie nadanej ko¬ mórkom odpornosci, nawet na rozpuszczalne anty¬ geny bialkowe. 2. Potegowanie sródkomórkowej odpornosci in vivo: Wzmaganie nadwrazliwosci opóznionego ro- dziajru na BSA i na SRBCG u myszy.Samce myszy MAG uodpornia sie w dniu zero¬ wym stolpiniowanymi dawkami antygenu nie sprze¬ zonego z peptydeim muramylowyim (agaroza — BSA lub SRBCG) liub antygenu sprzezonego z pe¬ ptydem murarnylowym (agaroza — BSA lub SRBCG). Srodki BSA — agaroza podaje sie pod¬ skórnie iw dawkach 0,1 do 100 fig (co odpowiada dawkom substancji czynnej dla nowych zwiazków z peptydam muramylowym 0,00(29 — 6 \ag na zwie¬ rze) o objetosci 0,2 ml zbuforowanego roztworu fizjologicznego soli kuchennej. Srodki SRBCG po¬ daje sie w dawkach 0,0.1 — 3 mg (co od(powiada dawce nowych zwiazków z peptydem imuramylo- wyim wytwoiiizicinyich sposobem wedlug wynaliazku wynoszacej 0,25—75 fig na zwierze) o objetosci 0,5 ml w zbufoirowanyim roztworze soli fizjologicznej dootrzewnowo lub 0,05 ml sródskórnie, wzglednie podzielnie w 3 lapki.Po 4 do 20 dni okresla sie ilosciowo odczyn typu opóznionego wywolany przez wstrzykniecie 100 \kg BSA, wzglednie 108 SRBC w 20 yg zbuforowainego roztworu soli fizjologicznej w lewa tylna lapke, na podstawie obrzeku lapek po 24 i 48 godzanach wskazujacego na wielkosc odczynu. Zaobserwowa¬ ny przyrost specyficznie antygenowy wielkosci la¬ pki sluzy jako miara odpornosci nadanej komór¬ kom.Od 14 dnia po uodpornieniu zwiazkami BSA — agaroza ¦..*- MDP wystepuje juz przy bardzo nis¬ kich dawkach (0,1 \ig; odpowiednia 0,006 \ag sub¬ stancji czynnej) wyrazny odczyn typu opóznionego.W przeciwienstwie do tego, wolna agaroza — BSA nie moze wywolac odczynów typu opózmiego. Tak samo zwiazki SRBCG — MDP, przede wszystkim podane sródskórnie, zdolne sa wywolac odczyn opóznionego rodzaju, znacznie wyrazniejszy od mo¬ zliwego do 'uzyskania przez uczulenie SRBCG nie zwiazanego z peptydem munamylowyim.Dowodzi to, ze nowe zwiazki wytwarzane sposo¬ bem wedlug wynalazku umozliwiaja znaczne wzmozenie odpornosci komórkowej. 3. Potegowanie odpornosci plynów ustrojowych in vivo: Wzmaganie wytwarzania .przeciwcial wo¬ bec BSA u myszy.Myszy NMRI uodpornia sie w dniu zerowym wstrzykujac doodtrzewnowo 0,1 do 100 yag BSA zwiazanego z peptydem muriamylowym (0,0014 do 6,0 pg substancji czynnej). Po 10, 17 i 28 dniach pobiera sie próbki surowicy i bada technika bier¬ nej heimaglutynacji zawarte w niej przeciwciala anty-BSA; Przy stosowanych dawkach wolny BSA jest dla przyjmujacych go zwierzat subimimunolo- giczny, tzn. nie moze spowodowac wcale lub, tylko w calkiem ograniczonym zakresie wydarzania przeciwcial. Zwiazanie BSA z peptydem muramy- lowym umozliwia 2—3 krotny wzrost miana, prze¬ ciwcial w surowicy (miano sumy log2 róznicy mia¬ na -miedzy trzema dniami krwawienia).' Godne uwagi jest ponadto to, ze nowe zwiazki wytwa¬ rzane sposobem wedlug wynalazku, które mozna sprzegac z agaroiza jako nosnikiem, sa jeszcze sil¬ niejszymi immunologenami po podaniu dotrzew- nowo lub podskórnie.W oparciu o wymienione doswiadczenia wyka¬ zano, ze srodki z nowymi zwiazkami otrzymanymi sposobem wedlug wynalazku umozliwiaja takze znaczny wzrost odpornosci plynów ustrojowych., Otrzymane nowe pochodne antygenowe sa szcze¬ pionkami nowego irodzaju lub ulepszonymi znany¬ mi szczepionkami i sluza nowym sposobem szcze¬ pienia lub ujprosziozeniu stosowanych metod szcze¬ pienia (w tym np. liczbie szczepien koniecznych dla utrzymania ochrony przez dluzszy okres cza¬ su).Wynalazek dotyczy zwlaszcza sposobu wytwa¬ rzania nowych pochodnych antygenowych wywo¬ dzacych sie z peptydu muraimylowego o wzorach 2 lub ^a, w których Ri, Ra, R4, Re i R7 oznaczaja atomy wodoru, X oznacza grupe karbonylowa, a R2 ewentualnie oznacza nizsza grupe alkilowa pod¬ stawiona grupa hydroksylowa lub nizsza grupe alkoksylowa, badz grupe fenylowa ewentualnie podstawiona grupa hydroksylowa, nizsza grupa alkoksylowa, nizsza grupa alkilowa Hub atomem chlorowca, a R8, 99, Rio, Rn, R12 i R13 maja wyzej podane znaczenie.Wynalazek dotyczy glównie sposobu wytwarza¬ nia nowych pochodnych antygenowych, wywodza¬ cych sie z peptydu niuramyilowego, o wzorach 2 lub 2a, w których Ri, R4, Re i R7 oznaczaja atomy wodoru, X oznacza grupe karbonylowa, R* oznacza nizsza grupe alkilowa ewentualnie podstawiona grupa hydroksylowa lub nizsza grupa aflikoksylowa, albo grupe fenyjowa ewentualnie podstawiona ^gnu^ pa hydroksylowa, nizsza grupa alkoksylowa, nizsza grupa alkilowa lub atomem chlorowca, a R3 ozna¬ cza grupe 'metylowa, zas R8, R9, Rio, Ru R12 i R13 ma/ja wyzej podane znaczenie.Wynalazek dotyczy w pierwszym rzedzie sposobu wytwarzania nowych pochodynch antygenowych, wywodzacych sie z peptydu muramylowego o wzo¬ rze 2 lub 2a, w którym Ri, R4 i Re i Ria oznaczaja atom wodoru, X oznacza grupe karbonylowa, R2 oznacza nizsza grupe alkilowa ewentualnie podsta- \ wiona grupa hydroksylowa lub metciksylowa, badz grupe fenylowa ewentualnie podstawiona gffiupa hydroksylowa^ metoksylowa, metylowa, etylowa lub atomem chlorowca, R3 oznacza atom wodoru lub grupe metylowa, R7 i Rs oznaczaja atom wo¬ doru, Rj oznacza nizsza grupe alikiloiwa, nizsza gnu- pe alkilomerkapto-nizsza alkilowa, nizsza grupe hydrdksyajkilowa, benzylowa, p-hydroksybenzylo- wa luib fenylowa, a Rio, Ru i R12 oznaczaja grupe karboksylowa, nizsza grupe alkoiksykaribonylowa % lub karfbamoiiowa, zas Ru równiez oznacza atom wodoru. 10 i? 20 25 30 35 40 45 50 55 60123 315 11 12 Wynalazek dotyczy przede wszystkimi sposobu wytwarzania nowych pochodnych antygenowych, wyiwodzacych sie z peptyidu imuramylowego o wzo¬ rze 2 lub 2a, w którym Ri, R4, IRe, R7 i R13 Ozna- czaija atom wodoru, X oznacza grupe karbonylo- wa, R2 oznacza nizsza grupe alkilowa ewentualnie podstawiona grupa hydroksylowa lub nietoksylo- wa, grupe fenylowa ewentualnie podstawiona gru¬ pa hydroksylowa, metoksylowa, metylowa, etylo¬ wa lub atoimem chlorowca, R3 i R9 oznaczaja atom wodoru lub grupe metylowa, R8 oznacza grupe me- tylopropylówa, .metyloimerkapitometylowa, hydro- ksyimetyHowa, ihydirokisyetylowa, feinylowa, benzylo¬ wa lub p-hydroksybenizyloiwa, a Rio, Rn i R12 ozna¬ czaja grupe karboksylowa, nizsza grupe alkoksy- karbonylowa lub grupe ikarbamoilowa Irub Rn oznacza takze atom wodoru.Wynalazek dotyczy takze sposobu wytwarzania nowych pochodnych antygenowych, wywodzacych sie z peptydu muraimylowego o wzoirize 2 lulb 2a, w którym Ri, R4 i R6 oznaczaja aitomy wodoiru, X oznacza grupe karbonylowa, R7 i Rs lacznie Oznaczaja grupe propyflenowa lub butyienowa, a R2, Ra, Rg, Rio, Rn i R^ 'maga wyzej podane zna- ozende.Czlon mostkowy w wytwarzanych zwiazkach stanowia zwlaszcza nizsze ji, 'Q-dwuaminoalkany, nizsze alkilowe kwasy dwfuikarboksylowe i natu¬ ralne nizsze a-amoniikwasy aillkanokarboksylowe.Wynalazek dotyczy zwlaszcza sposobu wytwarza¬ nia nowych pochodnych antygenowych opisanych w przykladach.Sposobem wedlug wynalazku nowe pochodne antygenowe o wzorze 1 wyttwarza sie kondensujae antygen, ewentualnie polaczony z czlonami mositka, z peptydem miuramylowym o ogólnym wzorze 2 lub 2a, w iktórych to wzorach wszystkie podstaiw- ndiki maja wyzej podane znaczenie, ewentualinie po¬ laczonym z czloniami mositka, przy czym jeden z kondensowanych ireagentów zawiera co najmniej jedna wolna grupe aminowa, hydroksylowa i/lub merkaptanowa, zas drugi co najmniej jedna reszte kwiasu karboksyiowego i ewentualnie otrzymany zwiazek kondensuje sie z czlonem mostka zwia¬ zanym z nosnikiem, przy czym jeden z kondenso¬ wanych reagentów zawiera co najmniej jedna wolna gtrupe aminowa, hydroksylowa i/liub merka¬ ptanowa, zas drugi co najmniej jedna reszte kwa¬ su kairboksylowego.Kondensacje prowadzi sie przy tym np. w taki sposób, ze zwiazek w postaci zaktywowanego kwasu karboksylowego kondensuje sie ze zwiaz¬ kiem zawierajacym wolna grupe aminowa, hydro¬ ksylowa lulb merkaptanowa .Zwiazkiem zawiera¬ jacym zalktywowana grupe karboksylowa moze przykladowo byc bezwodnik, wzglednie, azydek kwasowy, amid kwasowy, taki jak imidazolid, izo- ksaizolid lub zaktywoany ester.'Jako zaktywowane estry wymienia sie zwla¬ szcza: ester cyjano-metylowy, karboksymetylowy, p^nitrotfienylotioester, meitoiksyetyloltioester, acetylo- aminoetylotioester, p-nitrotfenylo- ester, 2, 4, 5- -trójichlorofenyloester, ester N-hydroksybursztyno- imidowy, N^hydroksyftalimidowy, 8-hydrofksychi- nolinowy, N-hydroksypiperydynowy. Aktywne estry mozna równie otrzymac ewentualnie z karbodwu- imidu dodajac do niego N-hydroksybuirsztynoimid lub niepodstawiony badz .podsitawiony np. chlo¬ rowcem, grupa metylowa lub metoksylciwa 1-hy- 5 droksybenzotriaizol lub 3-hydroksy-4-keto-3,4-dwu- hydrobenzo [d]-tl, 2, 3-trójazyne.Stosowane w tej kondensacji odszczepiailne gru¬ py musza byc nietoksyczne lub przynajmniej latwo wydalane, aby uniknac ponownego zatrcymaffiia 10 toksycznych elementów w wyniku adsorpcji tych prtzewanie wysokoczasteczkowych zwiazków.Dlatego korzystnie jako aktywne stosuje sie ta¬ kie estry z N-hydroksytoursztynoiniideim lub jego C-pOdstawionymi produktami takimi jak N-hydro- 15 ksymetylo- lub — dwumetylobursztylnoimid, lub poddane reakcji z karbodwuimidem, takim jak sam karibodwuiimid lub l-etylo-3-/3-dwumetyloamino- projpylo/-kajrbodwumid.Powyzsze reakcje przeprowadza sie w znany 20 sposób w obecnosci lub bez srodków rozcienczaja¬ cych, kondensujacych i/lub kaitalitycznych, o ile konieczne, w obnizonej lub podwyzszonej tempera¬ turze. Zwykle korzystnie prowadzi sie reakcje w srodowisku wodnym, tak aby nie naruszyc anty- 25 genu, i w zakresie pH 6—0, zwlaszcza 7—8.Celowe jest stosowanie takich zwiazków wyj¬ sciowych od przeprowadzenia kondensacji sposo¬ bem wedlug wynalazku, które prowadza do otrzy¬ mania produktu koncowego, zawierajacego wyzej 30 opisane korzystne grupy. Stosowane substraty sa znane lub nawet jesli sa nowe, daja sie otrzymac znanymi metodami.Otrzymane sposobem wedlug wynalazku pocho¬ dne antygenowe mozna stosowac w postaci prepa^ 35 matów farmaceutycznych, które zawieraja nowe pochodne antygenowe. Chodzi o takie preparaty farmaceutyczne do podawania dojelitowo1, jak tez doustnie lub doodbytniczo, a takze pozajelitowo zwierzeciu stalocieplnemu, które zawieraja farma- 40 kologicznie czynna substancje sama lub z daja¬ cym sie stosowac farmaceutycznie nosnikiem.Preparaty farmaceutyczne zawierajace jako sub¬ stancje czynna nowe pochodne antygenowe o wzo¬ rze 1 zawieraja je w ilosci od Okolo 10% do oko- 45 lo 951%, zwykle od okolo 20% do okolo 90%. Pre¬ paraty te stosuje sie w postaci dawek jednostkdt- wych takich jak drazetki, tabletki^ kapsulki, czop¬ ki lulb ampulki.Korzystnie nowe pochodne (antygenowe wytwo- 50 rzone sposobem wedlug wymalazteu podaje sie w postaci roztworów lub zawiesin zawierajacych zwykle do 10% wagowych karboiksymetyloceiLulozy.Jezeli nowe pochodne antygenowe wytworzone sposobem wedlug wynalazku stosuje sie jako 55 szczepionki, to stosuje sie je wedlug namych spo¬ sobów 'szczepien i znanego dawlkowania w jedno¬ stkach wagowych lub miedzynarodowych, np. po¬ daje sie pochodne antygenowe zawierajace limfio- blasty w ilosci 10*—1010 organizmów komórkowych 60 w injeikcji w odstepach 2—8 tygodni 1—6 razy.Zawartosc peptydu • ^muramylowego na mg bialka powinna zwykle wynosic 5—200 inikrograinów.Do uodpornienia korzystnie stosuje sie rozpusz¬ czalne preparaty zawierajace odpowiednia ilosl 05 pochodnej antygenowej w roztworze Falza (BSS)123 315 1S 14 skladajacym sie z 0,14 g chlorku wapnia 8,0 g soda kuchennej, 0,2 g siedmiowodmego siarczanu magnezowego, 0,2 g szesciowodnego iahlofrku ma¬ gnezowego, 0,6 g dwuiwodorosifosforanu potasowe¬ go i 0,24 g dwuwodnego kwasnego foscforairau dwu- sodowego w litrze wody. W razie tendencji do dzialania kumulujacego i(np. przy podaniu doimiej- scowo, srodskóinnie lub wewnatrzczasteczkowo) mno¬ zna do ta/k rozpuszczonej pochodnej antygenowej dodac jeszcze kariboksymetyloceliiloze (zwykle do stezenia koncowego 5%).Nierozpuszczalne wysokoczasteczkowe nowe po¬ chodne antygenowe wytworzone sposobem wedlug wynalazku podaje sie zwykle jako zawiesiny w BSS i kairboksymeitylocelulozie jako stabilizatorze) (stezenie koncowe wyzMe 5%).P.rzy tym, w celu otrzymania trwalej zawiesiny ochlodzona lodem mieszanine korzystnie zateza sie dziatoanieim ultradzwieków.Nowe pochodne antygenowe z komórkami sto¬ suje sie w pierwszym rzedzie w szczególnie korzy¬ stnym dlia danego (rodzaju komórek srodowisku hodowli tkanek (np. dla limfocytów EAGLE high amino /aicid medium — porównaj Clicfc i in. Celi.Immunod. vol. 3 p. 264—276 (1972)).Nowe substancje wyjsciowe stosowane do wy¬ twarzania peptydów muramylowych o wzorach 2 i 2a, w których Z oznacza gttiupe katfbonylowa, Ri oznacza atom wodoru, grupe alkilowa, ewentual¬ nie podstawiona grupe benzylowa lub acylowa, R2 oznacza ewntualnie podstawiona girupe alkilowa lub kanbocykliczna grupe arylowa, R4 i R6, nieza¬ leznie od siebie, oznaczaja atom wodoru, grupe al¬ kilowa, ewentualnie podstawiona grupe benzylowa lub acydowa, R3 oznacza atom wodoru lub girupe alkilowa, co najmniej jeden z podstawników R7, R9 i Rl3 oznacza nizsza grupe alkilowa, zwlaszcza metylowa, a pozostale oznaczaja atomy wodoru, R8 oznacza atom wodoru, nizsza grupe alkilowa, wolna, zestryfikowana iiub zeteryfifcowama nizsza grupe hydroksyialkiiowa, wolna, zestryfikowana lub zeteryfikowana nizsza grupe merkaptoalkdlowa, wolna lub ziacylowiana nizsza grupe aminoalktiloiwa, grupe cyjklo,allkilowa \o 5 lub 6 atomach wegla, niz¬ sza girupe cyfcloalMlo-alkilowa, której reszta cy- kloalfcilowa zawiera 5 lub 6 atomów wegla, ewen¬ tualnie podstawiona grupe arylowa lub airyloallki- loVa, ziawierajaca azot grupe heterocykllo- ilulb he- terocyklo-niBko-alkilowa, R7 i R8 lacznie oznacza takze grupe alkiilenowa o 4 lub 3 atomach wegla, a podstawniki Rio, Rxi i Ri2 niezaleznie od siebie oznaczaja ewentualnie zestryfikowana lub prze¬ ksztalcona w amid grupe karboksylowa, zas Rn oznacza równiez altom wodoru, mozna otrzymac w znany sposób, jesli podda sie 'kondensacji zwia¬ zek o wzorze 4, w którym X, R2, R3 i Rw maja wyzej podane znaczenie, a R°i, R°4 i R°s zastepuja¬ ce podstawniki Rj, R4 wzglednie R6 luib latwo od- szczepialne grupy zabezpieczajace, alba jego po¬ chodna ze zwiazkiem o wzorze 5, w którymi R°», R°io» R°n i R°i2 maja znaczenie podiane dla Ra, Rio, Rn i R12 2 tym, ze wystepujace w nich grupy karboksylowe i, gdy pozadane, wolne grupy hy¬ droksylowe, sa zabezpieczone latwo odszczepial- 10 15 25 30 35 40 45 50 55 nymi grupami zabezpieczajacyimi i ewentualnie odszczepiia sie grupy zabezpieczajace.Kondensacje przeprowadza sie przy tym m(p. w taki sposób, ze zwiazek o wzorze 4 w postaci zak- tywowanego kwasu karboksylowego poddaje sie reakcji z aiminozwiazkieni o wzorze 5, badz kwas 0 wzorze 4 poddaje sie reakcji ze zwiazkiem o wzorze 5, którego grupy aminowe maja postac zaktywowana. Zaktywowana grupa karlboksylowa moze byc przykladowo /bezwodnik kwasowy, ko¬ rzystnie mieszany bezwodnik, jak równiez azydek kwasowy, amid kwasowy, a takze imidazolid, izo- ksazolid lub zaktywowany ester.Jako zaktywowane estry wymienia sie: ester cyjainometylowy, ester karboksymetylowy, p-nitro- fenylotioester, ester p-nitrotfenylowy, ester 2,4,5- -trójchlorofenylowy, ester piecioclhloroifenyttowy, ester N-hydroksybursztynoimidowy, ester N-hydr- oksyftalimidowy, ester 8-hydroksychinoliny, ester 1 -hyldrofcsy-1,2-dwuwodorowi-kairboetoOasychinolLiny, ester Nhydroksypiperydyny lub ester enoHowy, o- trzymany z sulififonianu ^N-etylo-5-fenylotizotasazoli- ny-3. Zaktywowane estry mozna równiez ewen¬ tualnie otrzymac z karbodlwuiniidu przez doda¬ nie N-hydroksyimidu kwasu bursztynowego lub niepodstawionego, albo mp. podstawionego atomem chlorowca, girupa metylowa lub metoksylowa, 1- -hydroksybenzotrójazolju lub 3-hydroksy-3-fceto-2,4- -dwuwodorobenzo(d)-1,2,3-trójazytny.Grupe aimiinowa aktywuje sie przykladowo w reakcji z lamidofosforynem.Wsiród metod prowadzenia reakcji z aktywowa¬ nymi estrami nalezy iwymienSc zwlaszcza reakcje z sulfonianem N-etylo-!5-fenyloizofcsazolilny-3, (rea¬ gent K. Woodwarda) lub 2-etoksy-l,2-dwuwodorov -1-karfoofetoksychinoiina lub karbodwuimidem.Latwo odszczepialne grupy zabezpieczajace sa grupami znanymi w chemii ptefptydów wzglednie cukrów. Dla grup karboiksylowych nalezy wymie¬ nic zwlaszcza trzeciorzedowa grupe butylowa, gru¬ pe benzylowa lub zenzyhydrylowa, a dla grup hydroksylowych szczególnie reszty acylowe, np. nizsze reszty alkainoilowe, takie jak acetylowa, re¬ szte airoilowa, taka jiak foenzoilowa, a przede wszy¬ stkim pochodne kwasu weglowego, tafcie jak re¬ szta benzyloksykarbonylowa lufo nizsza reszta al- kdksykarbonylowa, badz alkilowe, izwlaszcza trze¬ ciorzedowa butylowa,'ewentualnie benzylowa, pod¬ stawiona grupa nitrowa, nizsza girupa aUkoksylo- wa lub atomem chlorowca, alb czteaxwodoropiira- nyliowa, badz ewentualnie podstawiona grupa al- kilidemowa wiazaca atomy tlenu w polozeniu 4 i 6.Tafcie grupy alkiliidenowe to zwykle nizsze allkli* Udany, w pierwszym rzedzie grupy etylidenowe, izolpropylidenowe lub propylidenowe, alfoo rów¬ niez ewentualnie podstawione, zwykle w polozeniu para, girupy benzylidenowe.Owe grupy zabezpieczajace moga byc w znany siposób odszczepiane. Mozna je wiiec usunac wodo- rolitycznie, np. wodorem w obecnosci metallu szla¬ chetnego jako kataHizatoma, tafcieglo jak fcataMzatpi* paUiadowy lub platynowy, albo przez kwasna hy- droMze.S5 Sitosowane substraty sa znane lub dadza sie otrzymac w znany sposób.Inmy nowy sposób postepowania w celu otrzy¬ mania tych nowych subfcitnaitow polega ma tym, ze zwiazek o wzoinze 6, w któryrai R°i R2, R3, R°4, R°6, R7 i R°8 maja wyzej podane znaczenie, poddaje sde kolndensiacji ze zwiazkiem o wzorze 7, w któiryim R°io, R°n i R°i2 maja wyzej podlane znaczenie z tyim, ze wystepujace w podstawnikach R°8, R°ió, R°n i R*i2 grupy karboksylowe i, gdy to pozadane* wod¬ nie grupy hydroksylowe, zabezpiecza sie latwo od- aziczepiiaflinyimi grupami zabezpieczajacymi i ewen¬ tualnie z otrzymanego zwia,zku odszezepia sie gru¬ py odhironine.Kondensacje przeprowadza sie przy tym np. w taki sposób, ze zwiazek o wzorze 6 w positaci zak- tywowanego kwasu karibolksyiowego poddaje sde reakcji z aiminozwiazkiein o wzorze 7, allbo kwas o wzorze 6 poddaje sie reakcji ze zwliaizkiiem o wzorze 7, .którego grupy aminowe wystepuja w formie zaktywpwanej. Zakitywowiana gnupa karbo¬ ksylowa moze byc pirzykladojwo bezwodnik kwaso^ wy, korzystnie mieszany bezwodnik, amid kwaso¬ wy lub zaktywowany ester. Jako takie wchodza zwlaszcza w gre wymienione wyzej bezwodniki kwasowe, amidy lub estry. Grupe lamdinowa lakty- wuje siie przykladowo amidofosforynem.- Równiez latwo odszczepialne grupy zabezpiecza¬ jace od,poiwiadaja juz wymienionym wyzej. Moga One byc w znany sposób odszczepioine ,inp. wodo- roiitycznie, przykladowo iwodorem w obecnosci ka¬ talizatorów z metali szlachetnych, takich jiak pal¬ lad lub platyna, albo przez hydrolize kwasowa.Substraty mozna otrzymac w znany sposób. Tak np. odpowiedni niepodstawiony w polozeniu 3 cu¬ kier mozna .poddac reakcji z kwasem chlorowco- -Ra-acetamiido-RVoctowy[m, lub zwiazek o wzo¬ rze - 3 mozna poddac reakcji z kwasem amino-R7- -octowyrci, w których to kwasach grupa karboksy- loiwa jest zabezpieczona i usuwa sie grupy zabez¬ pieczajace.Dalszy sposób postepowania w celu wprowadze- itiia do. reszty cukrowej lancucha bocznego zajmu¬ jacego polozenie 3 polega na tym, ze zwiazek o wjzorze 8, w którym X, R2, R°i, R°4, R°6 i R13 maja wyzej podane znaczenie, a ewentualnie wystepu¬ jace w nim grupy hydroksylowe sa zabezpieczone latwo odszczepialLnymi grupami ochronnymi, pod¬ daje sie reakcji ze zwiazkiem o wzorze 9, w któ¬ rym Z oznacza reaktywna zestryfikowana grufee hydroksylowa, a R3, R7, R9, R°a, R°io, R°n i R°i2 miaja wyzej podane znaczenie, i ewentualnie od¬ szezepia sie wystepujace grupy zabezpieczajace..Reaktywna zestryfikowana grupa karboksylowa jest zwykle gnupa hydroksylowa zestryfikowana silnym kwasem nieorganicznym lub organicznym, w pierwszym rzedzie zestryfUkowana kwasem chlo- rolwcowodorowym, takim jak chlorowodór, bromo- wpdór diub jodowodór.Latwo oidszczepdialine grupy zabezpieczajace od¬ powiadaja juz podanym wyzej. Moga byc one od- szczepiiane w znany sposób, np. wodoroditycznie, przykladowo wodorem w obecnosci katadiizatOfra z meitailii szlachetnego, takiego jak pallad lub pla¬ tyna, adibo przez hydrolize kwasowa. 3l# 16 Nolwe zwiazki wyjsciowe stosowane do wytwa¬ rzania peptydów muramylowych o wzorach 2 i 2a, w których X oznacza grupe karboksylowa, R1? R4 i R6 oznaczaja nizsza grupe trójalikillosiililowa, 5 w pierwszym rzedzie trójimetylosililowa, R2 ozna¬ cza ewentualnie podstawiona grupe alkilowa liub karbocykliczna grupe arylowa, R3 oznacza atotrn wodoru lub grupe alkilowa, R7 i R13 oznaczaja atom wodoru liub nizsza grupe alkilowa, R8 ozna- 10 cza atom wodoru, nizsza grupe alkilowa, wolina, zestryfikowana lub zeteryfikowana nizsza grupe hyidroksyalkilowa, wolna, zestryfikowana lub zete¬ ryfikowana nizsza grupe imerkaptoalkilowa, wodna lub zacylowana nizsza grupe amkioalkilowa, gru- 15 pe cyfklOaikilowa o 5 lub 6 atomach wegla, niizsza grupe cykloadkidoalkilowa, której reszta cykloali- kifljowa zawiera 5 lub 6 atomów wegla, ewentual¬ nie podstawiona grupe airyflowa lub aryloalkilLowta, zajwicirajaca azot grupa heterocykliczna liub grupe 20 heterocykliczno -nizsza-alkilowa, R7 i R8 razem tak¬ ze oznaczaja grupe alkilenowa o 3 lub 4 atomach wegla, R9 oznacza atom wodoru lub nizsza grupe alkilowa, a podstawniki Rio, Rn i R12 niezaleznie od siebie oznaczaja ewentualnie zestryifiiikowana 25 lub zamidowiana grupe karboksylowa, zas Rn o- zinacza takze atom wodoru, mozna otrzymac, gldy zwiazek o wzorze 10, w którym wszystkie pod¬ stawniki maja wyzej podane znaczenie, poddaje sie reakcji z reaktywnym estrem nizszego zwiazku 30 trójialkilosililowego. / Jako reaktywne estry nizszych zwiazków trój- allkilosililowych wymienia sie zwykle: nizsze ha¬ logenki trójadkilosililowe, zwlaszcza chlorki liub bromki, nizszy bis-siKiloacetamid lub sulfamid. 35 Reakcje prowadzi sie korzystnie w rozpuszczal¬ niku, nie zawierajacym zadnych reaktywnych grup hydroksylowych lub eimiinowych, takim jak dwumetylofbrmamiJd, dioksan, czteirowodorofuran, dwumetoksyetan lub chloroform.Nastepujace przyklady ilustruja sposób wedlug, wynalazku, nie ograniczaja one jednak w zadnym razie jego zakresu. Temperature podano w stolp- niach Celsjusza.,. 4g Przyklad I. D(o roztworu 1 g albuminy suro¬ wicy bytdlecej w 100 ml roztwoiru o stezeniu 0,1 M wodoroweglanu sodowego i 0,5 M chlorku sodo¬ wego, mieszajac, dodaje sie 500 mg 2-acetamido-3- -0 - {i[L-1-/D-1-karbamoilo-3-Eukcyniimidooksykarbo^ 50 nydo-propylo/-karibamoiio-etylo]-karbiamoiloimetylo}- -2-dezoksy-DHglikozy. Roztwór miesza sie w ciagu 4 godztLn w temperaturze pokojowej, po czyim ste¬ rylnie przesacza przez mikropoirowaity filtr MF, 0,45 jjim). Sprezona albumdine surowicy bydlecej 55 oddziela sie za pomoca dializy przy uzyciu filtra Amikon UM-10 od niskoczasteczkowych produk¬ tów reakcji wzglednie soli i liofilizuje.Oznaczenie ilosciowe peptydu muriaimylowegO ziwiazanego z adbunlina surowicy bydlecej przepro- 60 wadza sie droga reakcji Morgana Eisona wedlug modyfikacji J. M. Ghuysena i wspólpr. [„Methods iin Enzymology,, 8, (1966) 629]. Rrzecietnie zinadeziio- no 60 ^tg peptydu muramylowego w 1 mg zwiaz-1 ku z albumina surowicy bydlecej. w Ester sukcynimidowy, stosowany jakjo awiazek123 315 17 13 wyjsciowy mozna wytworzyc np. w nastepujacy sposób: 1 mmol 2^acetamido-3-0-{i[L-l-/ID-lnkarbamoilo- -3-karbaksy-p(ropyilo/-karibaJiwiIL^ -metylo}-2-dezoksy-D-g!ikozy, 1 mmol dwucyklo- heksylokaribodwuimidu i 1,1 mmola ,N-hydroksy- sukcyniimiidu rozpuszcza sie w 3 mil /absolutnego dwumetyloformaimidu i miesza w ciagu 20 go- dzLn w zamkndetyim naczyniu odbierajac wode.Wytracony dwucykloneksjlomocziiiik oddziela sde, rozpuszczalnik odparowuje sie w wysokiej prózni, a pozositalosc zadaje eterem, odsacza i suszy. Tak oitnzymany ester sukcyriimidowy ,mozna po wysu¬ szeniu przechowywac np. w ampulkach pod azo¬ tem.P »r z y k l a d II. Kondensacja otrzymanej w przy¬ kladzie I pochodnej antygenowej na aktywowanej agarozie. Stosuje sie przy tym dostepna w han- dliu pochodna agairozowa BIO-RAD, zel o nazwie Affi Gel-10. Zawiera on na szkielecie agairozowym eterowe lancuchy boczne („spacer anms") N-alkiio- isuikcynaimidów, które sa zestryfikowane N-hy- dipksysukcynimideim. 120 mg pochodnej ailbuminy surowicy bydlecej otrzymanej wedlug przykladu I rozpuszcza sie w 12;5 ml 0,1 M buforu fosforanowego o pH 7,3 w temperaturze 4°C. Nastepnie 500 mg zeliu A±fi-Gel 10 dysperguje sie w tym roztworze przez wstrza¬ sanie i dalej wstrzasa w ciagu 4 godzdn iw tem¬ peraturze 4°C. Pozostale jeszcze reaktywne gru¬ py estrowe ulegaja reakcji w ciagu 30-minutowe¬ go traktowania roztworem o stezeniu IM chloro¬ wodorku etanoloaminy i 0,1 M buforu fosforano¬ wego lumnie i przemywa 200 ml /roztworu 0,1 M buforu fosforanowego i 1 M chlorku sodowego (pH 7,3) a potema 20 ml fizjologicznego roztworu chlorku sodowego.Oznaczenie zwiazków peptydu muramylowego z aOjbumina surowicy bydlecej przeprowadza sie na drodze analizy M/osciowej reprezentatywnych ami¬ nokwasów albuminy surowicy bydlecej w calkowi¬ tych hydrolizatach okreslonych ilosci zelu. Prze- aiejtnde znaleziono 9—10 mg pochodnej miuramylo- peptydowej albuminy surowicy bydlecej na 1 ml specznianego zelu Affi-Gel 10.Przyklad III. Blony erytrocytów owcy otrzy* muje sie ze swiezej krwi owcy metoda J. M. Dod- ge'a i wspólpr. [Arch. Biochem. Biophys. 100, (1963) atr. 114^180]. Do zawiesiny 500 mg blon erytrocytów owcy w 50 ml roztworu o stezeniu 0,1 M woidoweglanu sodowego 0,1 M chlorku so¬ dowego mieszajac, dodiaje sie 400 mg 2-acetaimddo- -3-0- {{L-l-/D-l-kaaibamoriio-3-sukcymmido^ karbonyiopropylo/-kar|bamoi^ -metylo}-2-dezoksy-D-glikozy i miesza w ciagu 4 godzin. Nastepnie zwiazek spanzezony z blonami erytrocytów sedymentuje sie przez 1 godzine ul- trafifltracje przy 90 000 g, w temperaturze 4°C.Osad przemywa sie trzy razy, za kazdym razem ponownie dyspergujac i poddajac ultradMitnacji, roz¬ tworem chlorku sodowego z dodatkiem buforu fo¬ sforanowego i jeden raz woda destylowana. Prze¬ myta substancje dysperguje sie w 100 ml destylo¬ wanej wody i liofilizuje.Ilosciowe oznaczenie dwupeptydu muramyloiwie* go zwiazanego z erytrocytami owcy przeprowadza sie diroga reakcji Morgana-Eisona znajdujac 25 pg dwupeptydu muramylowego na 1 mg blon erytmo- 5 cytów.Przyklad IV. 100 mg polisacharydu z grupy C Nedisserda meningitidis i 110 mg (0,2 mimola) chlorowodorku 2-acetamido-3-0-{L-l-/D-l-karba- modlo-3-N-amiirioetyiokarb^^ io moilo-etylo]-ikairbamoilo-metyio}-2-dezoksy-D-gli- kozy rozpuszcza sie w 10 mi wody destylowanej i odczyn roztworu doprowadza sie do wartosci pH 5 rozcienczonym kwasem solnym.Nastepnie do tego roztworu, mieszajac, dodaje 15 sie 19,2 mg chlorowodorku l-etylo-3-/3-dwumety- loarniniC)piropylo/-kar)bcdwuQmjidu. Mieszanine mie¬ sza sde w ciagu 1 godziny w temperaturze poko¬ jowej, otrzymuje wartosc pH 5 dodajac rozcien¬ czony roztwór lugu sodowego, po czym dodaje sie. 20 5 ml 2 M buforowego roztworu octanu sodowego o pH 5 i dalej miesza w ciagu 30 minut. Nastep¬ nie odczyn roztworu doprowadza sie do wartosci pH 7 lugiem sodowym. Roztwór sterylnie saczy sie i w temperaturze 4°C poddaje dializie przy 25 uzyciu wody a nastepnie liofilizuje.Oznaczenie ilosciowe dwupeptydu desimetyiomu- amarylowegio przeprowadza sie tak jak opisano w przykladzie 1 droga reakcji Morgana-Eisona znaj¬ dujac 80 \ig dwupeptydu desmetylomuiramylowego 30 na 1 mg polisacharydu.Chlorowodorek 2Hacetamdno-3-0-{[jL-l-/D-l-kar- bamoiilo-3-N-amirioetyio-ka^ baimoiiloetylo]-metylo} -2-dazoiksy-D-g(liilkozy mozna wytworzyc np. w nastepujacy sposób. . 35 1 mmol 2^aceitamino-3-0-{i|L-ln/D-l-karibaimoiJk- -3-karbokBy-propyioi/-karba^ -imetyio}-2-dezoksy-D-gldkozy i 2 mancie cMoro- wodorku NHetylo-N'-^3^wumetyioanTinopropyllQ/- -kartoodwuliimidu rozpuszcza sie w 10 -ml wody 40 i doprowadza do wartosci pH 5,0 kwasem solnym, po czyim dodaje sie roztwór 5 rnmoM dwuchlom- wodorku etylenodwuamdny w 10 iml wody. Otazy- maina miesizanine miesza sie w ciagu 6 godzin w temperaturze pokojowej, utrzymujac pH 5. Mie- 45 szianline wprowadza sie do kolumny (2,6X45 mm) zawierajacej slabo kwasny ikatlohtiit — Amiberltiit GG 50 II i eliuuje przy liniowym gradiencie 300 ml 0,05 M roztworu octanu pirydyny o pH 6 do 300 ml 0,5 M roztworu octanu pirydyny o pH 50 3,7. Otrzymane tekcje zawierajace octan 2-ace- tamino-3-0- {,[L-1 -/D-l-karibamoilo-3-N-amdlnoety- lo-karbamoilo-priopylo/-kar!bamoiio^etyl'o]karibaimo- ilo-metyio}-2-dezoksy-D-gllikozy bada sie i otore- sTLa za pomoca ninhydryny wzglejcMe elektrofore- 55 zy wysokonapieciowej a nastepnie liofilizuje. Prze¬ ksztalcenie w postac chlorowodorku odbywa sie w nastepujacy sposób: Lioifilizat rozpuszczal sie w 6 ml 0,2 N HO i poddaje cnromatografii w ko¬ lumnie (2,5X90 om) zawierajacej Bio-Gel P 2 sto- w sujac wode jako eluent.Frakcje zawierajace chlorowodorek 2-acetaimi- no-3^0-{|[L-l-/D-l-karbamiodlo-3-N-aminoetylo-kar- , bamoalo-projpyloZ-karbamoilo-etylo]-karibamoilo- nmetyilo}-2^dezoksy-D-glikozy liofilizuje sie. Pire- 65 parat jest jednolity co wykazuje elektroifloreza wy-123 315 19 20 sokonapieciowa. Oznaczajac skladniki iw calkowi¬ tych hydrolizatach stwierdzono stosunek imoileiku- lianny kwas muraiminowy — L alaninai — kwas giutetmdnowy — etylenodwuairnina jaik l:il:(l:l.W podobny sposóib stosujac odpowiednie dwu- peptydy imjuraimyaoiwe, otrzymuje sie odpowiedniie ^'-aimilioetyioamfidofwe zwiazM w postaci chioro- wfedorkow, mianowicie jak: 2-jacettamino-3M)-{D-l-i[L-^^ -aminoetylo-karbamoilopropyilo/-k -kartoamoilo^yio}-2-dezoksy-D-^^ 2^enEoiloamino-3-0- {D-l -|[L-1-yD-ll -karbaimoiioi- -3-NnammoetyiOHkar(bam0iilo-propy^ /etyflojkarbamoiila-etylo} -2-deizoksy-D-gllikoiza • •na, 2^iberizoiloaffndino-3-0- {iJL-l-^-l-karbaimoilo-3-N- -aarainoetyio-kaor?^^ l'o] -karibamoiio-metylo}^2-dezi^^ HO, 2-aaraeta«iiino-3-0-{i[L-i-/D-d-N-karibamoiilOHmety- lo^karbamoilo-3-N-aminoetyto nkarbamoilo-etyloJ-karibaimoM^ -2-dezoksy- -F-gUrikoiza-HCl, 24enzoiloiafrnii«-3-0-{i[L.-l-/D-l-karibaimoiilo-3-N- -amilnoetylo-ikaribamoilo-propy^^ pyio]-karbainoiilo-mety •Ha 2-propionyloamino-3-0-{flp-l-karibamoiloi-3-N-aimi- noetyio-karbamoilo^propyloZ-karibamoilO-etylo] - -kaaiaamoilo-metylo}-2-dezoiksy-D-g[liikoza«HCi, 2-acetyloamiino-3-0-{i|Ij-l-/D-l-ikaiibam -aminoetylo-karbaimoiio-propylo/-kiarbaiinoilo-pro- pylo]4oairfoafmoilo-imetyloi}-2-diezoksy-D-glikoza- •HCI, A-acetyloami -atóiwetylo-karbamoiilo-pro^ droksyetylo]-karbamoiiio-me^ kozai-HCl, 2-paxpianyloamtiin©-3-0-{i^ 3/nkainboksy- -<3tfLub lZ-N-anidnoetylo-karbamoi^ btan^oilo-eitylo]-karbainailo-nieitylo}-2-dezofcsy-D- -gUjipza-HCl, 2^beozK»iLaamino-3-0- {{L-1-/D-l -N-karbamoiio-imeity- lo^katfbanioiflo^^-anTinoe^ lo/4caa1baimoiiio-eityaoj-^ klsy-Piglllitaoza-HGl, ^toenizodloaimino-3-0-{L-l-TID-lHkariboksy-3-iN-ami- noetyfto-kaxbaoiioilo-prDpyilo/-(kaTibamo{ilo-efoyfooJ-kajr- baimo#Qmetylo}-2-dezoksy-D-g^^ 2^aeetamiiK-3-0-{|[L-l-/D-a-karbamoilo^3^-aini^ edyio^korbamoillp-propylo/ -ptrop^oj-karibamoilo-ime^ • •HO, 2-aeertmintoo-3^)-{D-l-p^-l-^ namiinoetydoHkaaibaim^ lo/-kainbairnoilo-etylo'}^^ -2-dezoksy- -D-glifooza^HCi, 2-acetamino-3-0- {i[iL-l-ytD-l-kaiinboJksy-3-iN-aim(iinoi- etylo-karbaimoilo-propylo/-karibamoilo-2'-inie(ty(to^ ipropylo]^karbaimoilo-metylo}-2-dezoksy-D-gIiiko- za-HCl, 2-aceftaimino-3-0-{[L-1-/D-1 -ikaj^baimc^o-3-N-aaiiino^ enylo-karbamoilo-propyloZ-kar^ medyilettiol-kambaaiioilo-iiietyilo} -2-dezoksy-D-giiikoza- -HOl, 2-aceteimano-3-0-{i[L-l-^^ etylo<-karibaiii^ilo-propylo/-kar^ tylo-karbamoilio-metylo} -2^deizoksy-D-gliikoza-H!Cl lub 2-beinzoiloamiino-3-0-{^ 5 nairnino&tylo-karibamoilo-propylo/-^^^ -metylo-propylo]-karbamonlo-metylo } -2Hdezoksy- -D-gliJkoza-HGl.Zwiazki te, jak wyzej opisano, kondeosuja sie z polisacharydem grupy C Nedsseinia meningiitii- 10 dis.Przyklad V. Merozoiity pasozyta zimnicy POiasmodium kmowiesi, beizposirediniio po ottnzyima- nau — calkowita wydajnosc z kirwi zakalzonej mal¬ py Macacus Rhesus [metoda otrzymywania maro- 15 zoitów — patrz G. H. MEchel et al. (1975), Immu- nology, 29, 397] — dysperguje sie w [roztworze 100 mg (0,17 mmola) 2-acetaunino-3-0-{^ -karbanioilo-3-&ukcyniirnido^ loi/-karnbam'0(ilo-etylo]-ikaa*aanoiio-metylIo}-e-cle2- 20 oksy-D-glikozy w 15 mil fizjologicznego rozitworiu buforowego o pH 7,2.Zawiesine iinkufouje sie w ciagiu godzdiny w tem¬ peraturze 37°C. Zwiazek sprzezony z (meonazoitamd sadymentuje sie przez wirowanie. Osad przemy- 25 wa sie, ponownie dyspergujac w fizjologiieznyim roztworze buforowym i odwirowujac. Przemyta substancje dysperguje sie wedlug metody G. H.Mlitchela (patrz referecja powyzej) w 10°/e am/tolo1- gicznej surowicy malpy Macacus Rhesus i liofili- 30 zuoe.Oznaczenie ilosciowe dwupeptydu muiraimylowe- go sprzezonego z merozoiitaimi przeprowadza sie droga ireakcji Morgana-Elsona znajdujac 40—80 \ug dwupeptydu rnuraimyiowego na 1 mg merozoi- 35 tów.Przyklad VI. W roztworze 200 mg (0,34 mmo¬ la) 2-acetamino-3-0- {ILi-l-ZD-l-karbamoilo-S-suk- cynimldooksy-kan±oirrylo-p^^ lio]-kaiiibaimailo-nietyiio}-2-deziciiksy-D-giLikofzy w 40 20 mi fizjologicznego roztworu chlorku sodowego z dodatkiem buforu fosforanowego, pH 7,2, dysper¬ guje sie 109T-ibLmifiolb!laist6w myszy GBA/J. /T-lliLm- folbflasty oitrzymuje sie w ,^m)iesizanej kuilrturze liim- focytowej,, przeciwko komórkom stymulujacym 45 myszy, C57BL/6; patrz L. C, Andersen et al., (1977), The Journal of Expe™nenital Mediciine, 146, 1124/. Zawiesine inkubuje sie w ciagiu 90 mi¬ nut w temperaturze pokojowej. Nastepnie Ewda- zek sprzezony z limfoiblastami sedymentuje sie 50 przez odwirowanie i przemywa ponownie dysper¬ gujac w fizjologicznym rozitworze ohionku sodowe¬ go z dodatkiem buforu fosforanowego li odwiro¬ wujac.Oznaczenie ilosciowe dtwupeptydu muraimylowe- 55 go sprzezonego z T-limfoibiasitaimi przeprowadza sie droga reakcji Morgana-Elsona (paitrz pmzyldad I) znajdujac 60—70 |ig dwupeptydu muraanylowego na 10^-liiinfoblastów.Przyklad VII. W podobny sposób jak w po¬ co przednich przykladach otrzymuje sie albumine su¬ rowicy bydlecej sprzezona z: 2-acetamido-3-0-{D-lJIj-l-{DJl-(karbamottilD-3Hkar- boksy-pix)pylo/-karbamoilo-etylo] -karbaimoilOHeity- lo}-2-dezoksy-D-gildkoza, 65 2-Jbenzoiloamino-3-0- {D-l-JL-a -/D-1-karbamoiiO'-3-123 315 21 22 jkarboksyipropyW-karbanioilo-etylo]-karbaimodlo- -eltylo}-2^dez PL PL PL PL