Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych przeszczepów narzadów z narzadów i z czesci narzadów ryb, ptaków i ssaków.Oferta materialu protezowego w rekonstrukcyj¬ nej chirurgii dla chorobowo zmienionych lub w swej funkcji naruszonych narzadów lub czesci narzadów obejmuje kilka mozliwosci (F. Largiader, „Organ Transplantation", 2 wydanie, wydawca Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1970). Zastepowa¬ nie pierwotnych narzadów lub czesci narzadów moze mianowicie nastepowac: — przez material wlasciwy cialu, np. autologicz- ne zyly [G. E. Mavor i wspólpracownicy, J. Cardio- vasc. Surg. 16 (1975), 130]; — przez implantaty z tworzyw sztucznych [M. E.De. Bakey i wspólpracownicy, „Fifteen Year's Experience with Dacron Vascular Prostheses", bro¬ szura, Baylor Coli. Med. 1971 (Amer. Coli. Surg.Exhibit, 1971)] lub, — przez odpowiednio preparowane przeszczepy z róznych gatunków zwierzat (P. Walter i H. Schmitz, „Der heterologe Gefassersatz", Editio Cantor, Aulendorf 1976).Te ostatnie pochodza w istocie z narzadów zwierzecych lub z czesci takich,narzadów (np. cie¬ leca tetnica szyjna lub sercowa zastawka swini), które po pobraniu uwalnia sie od potencjalnie antygenoczynnych protein droga enzymatycznej hydrolizy (np. za pomoca ficyny). Po tym trakto¬ waniu pozostajaca miedzykomórkowa osnowa skla- 20 33 Z da sie w istocie z wlókien kolagenowych typu I.Aby temu, po proteolitycznej hydrolizie otrzyma¬ nemu szkieletowi kolagenowemu nadac niezbedna dla protez zawartosc i trwalosc przeprowadza sie tak zwane „garbowanie". Dla tego garbowania — lub inaczej mówiac usieciowania poprzecznego (cross linking) takich wlókien kolagenowych sa do dyspozycji aldehydy, takie jak skrobia dwu- aldehydowa, dwualdehyd glutarowy, paraformal- dehyd oraz glioksal, poliakroleina, aldehyd octowy i aldehyd krotonowy. Wspólna cecha tych substan¬ cji do sieciowania poprzecznego tkwi w tym, ze reaguja one z grupami e-aminowymi reszt lizyny z peptydowego lancucha kolagenu, tworzac zasady Schiffa.W przypadku tak wstepnie przygotowanych na¬ rzadów, takich jak protezy naczyn (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 093 439 lub szwajcarski opis patentowy nr 595 105) okazalo sie jednak, ze wskutek enzymatycznego rozkladu za po¬ moca ficyny calkowicie zanikaja pierwotnie obecne wlasciwosci biofizyczne, takie jak elastycznosc w kierunku osiowym i promieniowym oraz bardzo gladki wyglad wewnetrznej powierzchni naczyn.W nastepstwie tego nie mozna bylo dotychczas spelnic wymagan stawianych idealnej protezie na¬ czyn krwionosnych z materialu biologicznego. To samo dotyczy tez zastepowania innych narzadów lub czesci narzadów. Jesli natomiast zaniecha sie rozkladu za pomoca ficyny, to nie mozna wyklu- 127 208* czyc niebezpieczenstwa dzialania antygenowego, tak jak to ma miejsce np. w przypadku sposobu preparowania naturalnej tkanki do wszczepiania wedlug ogloszeniowego opisu Republiki Federalnej Niemiec nr 2 519 107.Dalsza modyfikacja szkieletu kolagenowego po¬ lega na tym, ze alifatyczne kwasy karboksylowe na drodze acylowainia kowalentnie wiaza sie z bocznymi lancuchami aminokwasów, tworzac silnie ujemnie naladowane pochodne (jak wiadomo, nadmiar ladunku dodatniego sprzyja tworzeniu skrzepów). Sposób ten jednak nie prowadzi do poprzecznego usieeiowania w szkielecie kolageno¬ wym (P..N. Sawyer i wspólpracownicy, „Vascular Grafts", Appleton Century Crofts, Nowy Jork 1977, strona 282 i nastepna).Pomimo opisanych staran doswiadczenie klinicz¬ ne uczy, ze te juz proponowane przeszczepy na ogól, a przynajmniej dla dluzszych okresów, nie moga byc uznane za zupelnie zadowalajace (H. Haimovici, „Vascular Surgery, Principles and Technoaues", McGraw-Hill, Nowy Jork 1976, stro¬ na 304).Nieoczekiwanie stwierdzono, ze dzieki nowemu miedzy- i/lub wewnatrzkomórkowemu sieciowaniu poprzecznemu makroczasteczek miedzykomórkowej osnowy narzadów lub czesci narzadów, przed lub tez nawet bez proteolitycznego rozkladu za pomoca ficyny, pozostaja w dalekiej mierze utrzymane, pierwotnie obecne, wlasciwosci biofizyczne, takie jak w przypadku protez naczyn krwionosnych, ela¬ stycznosc w kierunku osiowym i promieniowym oraz gladki wyglad wewnetrznej powierzchni na¬ czyn.To poprzeczne usieciowanie rózni sie od znanych sposobów tym, ze zachodzi ono nie przez utworze¬ nie zasad Schiffa, lecz dzieki chemicznie znacznie stabilniejszym wiazaniom amidów kwasowych mie¬ dzy grupami aminowymi wzglednie dzieki wiaza¬ niom estrowym miedzy alkoholowymi grupami hydroksylowymi lancuchów peptydowych osnowy miedzykomórkowej a grupami karboksylowyimi kwasu dwu-, trój- lub wielokarboksylowego, który stosuje sie jako srodek do sieciowania poprzecz¬ nego.Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze narzady lub czesci narzadów ryb, ptaków lub ssa¬ ków, korzystnie ssaków wyzszych, traktuje sie alifatycznym, cykloalifatycznym, aromatycznym lub heterocyklicznym kwasem dwu-, trój- lub wielokarboksylowym w obecnosci odczynnika sprzegajacego, albo kwasowym, chlorkiem, azyd¬ kiem lub bezwodnikiem omówionego kwasu karbo¬ ksylowego- przy czym traktowanie to przeprowadza sie w srodowisku bezwodnego rozpuszczalnika organicznego, mieszaniny dwóch lub wiecej takich rozpuszczalników, albo w przypadku stosowania rozpuszczalnego w wodzie odczynnika sprzegaja¬ cego przeprowadza sie takze w srodowisku wody.Chociaz nie jest to konieczne, jednakze dalsze traktowanie otrzymanej, poprzecznie usieciowanej wiazaniami amidowymi osnowy miedzykomórko¬ wej, wedlug omówionych nizej wytycznych daje pewne korzysci. Najpierw mozna te osnowe w pierwszym dodatkowym etapie postepowania 208 4 traktowac dwualdehydem. To traktowanie dwu- aldehydem sluzy glównie zwiazaniu grup amino¬ wych ewentualnie nie uchwyconych podczas siecio¬ wania poprzecznego. Dzieki temu podwyzsza sie » nadmiar ladunku ujemnego, który zgodnie z do¬ swiadczeniem zmniejsza niebezpieczenstwo za- krzepicy, np. przeszczepów naczyniowych.Zamiast wspomnianego traktowania dwualdehy¬ dem mozna osnowe w innym (alternatywnym) do- tt datkowym etapie postepowania droga hydrolitycz- nego rozkladu za pomoca ficyny, . papainy lub innej proteazy o takiej samej lub podobnej specy¬ fice substratu uwolnic od materialu potencjalnie antygenoczynnego. Dzieki tej dodatkowej hydroli- 15 zie lub proteolizie otrzymuje sie przeszczepy na¬ rzadów, w przypadku którym mozliwosc dzialania antygenowego, tj. wywolania immunologicznej reakcji obronnej z odrzuceniem przeszczepu lub wszczepu, jest wykluczona nawet w dlugotermino- 20 wym okresie.Jesli wspomniana proteolize przeprowadza sie za pomoca ficyny, papainy lub im podobnych, to w miedzykomórkowej osnowie uwalnia sie poje¬ dyncze grupy aminowe. W celu zwiazania tych 15 grup aminowych i grup aminowych nie przereago- wanych podczas uprzednio zaszlego sieciowania, po¬ przecznego zaleca sie osnowe w drugim dodatko¬ wym etapie postepowania albo traktowac dwu¬ aldehydem — tak jak omówiono wyzej-, albo 30 ponownie poddac sieciowaniu poprzecznemu z utworzeniem wiazan amidowych za pomoca wspomnianych kwasów dwu-, trój- i wielokarbo- ksylowych., Sposób wedlug wynalazku szczególowo omówio- 35 no nizej. Jako. material wyjsciowy stosuje sie zwlaszcza tetnice, zyly, zastawki sercowe oraz osierdzia itp. z ptaków i wyzszych ssaków o od¬ powiedniej wielkosci. Jako dawcy wchodza w ra¬ chube zarówno sam czlowiek (autologiczne prze- 4a szczepy) jak i cieleta, woly, konie, owce, swinie, gesi, indyki, bazanty i inne zwierzeta (przeszczepy heterologiczne). Korzystnymi sa w tym celu na¬ rzady i czesci narzadów zwierzat z powodu ogólnej moznosci dysponowania nimi, a zwlaszcza mlodych 43 zwierzat z powodu swietnej elastycznosci takich narzadów.Rozumie sie samo przez sie, ze narzady i czesci narzadów natychmiast po ich pobraniu uwalnia sie od otaczajacej tkanki i ze w przypadku tetnic 50 lub zyl naczynia oboczne odlacza sie przez pod¬ wiazanie. Nastepnie bezposrednio poddaje sie je postepowaniu sposobem wedlug wynalazku albo az do zastosowania tego sposobu przechowuje sie je w wodzie* w fizjologicznym roztworze chlorku so- 55 dowego lub w innym fizjologicznym roztworze wodnym., np. w roztworze srodka o nazwie Tween 80R (polioksyetylenowa pochodna oleinianów sor- bitanu), albo w niewodnej cieczy, np. w sulfotlen- ku dwumetylowym, ewentualnie wobec dodatku 80 niewielkiej ilosci azydku sodowego, w temperaturze od 0°C do -15°C.Zawsze wystepujacy etap w sposobie wedlug wy¬ nalazku sklada sie z sieciowania poprzecznego skladników miedzykomórkowej osnowy; polega on •5 na polaczeniu dwóch, trzech lub wiecej grUp- 5 . aminowych (przewaznie grup £-aminowych rodnika lizynowego), wzglednie alkoholowych grup hydroksy¬ lowych w lancuchach peptydowych przez alifatyczne, cykloalifatyczne, aromatyczne lub heterocykliczne . kwasy dwu-, trój- lub wielokarboksylowe wiaza¬ niami amidów kwasowych lub wiazaniami estro¬ wymi.Sposród omówionych kwasów karboksylowych nadaja sie przede wszystkim takie, które nie wy¬ kazuja ani grup keto (grupy aldehydowe i keto¬ nowe) ani grup aminowych. W rachube wchodza zwlaszcza takie kwasy dwu-, trój- i wielokarbo- ksylowe, które oprócz grup karboksylowych i ewentualnie grup hydroksylowych nie zawieraja zadnych innych grup funkcyjnych.Korzystnymi jako alifatyczne kwasy dwukarbo- ksylowe i trójkarboksylowe sa takie kwasy o co najwyzej li2 atomach wegla, tj. zwlaszcza kwas szczawiowy, malonowy, bursztynowy, jablkowy, glutarowy, adypinowy, pimelinowy, korkowy, se- bacynowy i dekanodwukarboksylowy, nadto kwas winowy i sluzowy, a jako kwasy trójkarboksylowe sa kwas propanotrójkarboksyIowy-1,2,3 i kwas cy¬ trynowy.Sposród cykloalifatycznych kwasów dwu-, trój- i wielokarboksylowych nadaja sie m. in. kwasy cyklopentanodwukarboksylowe i kwasy cyklohek- sanodwukarboksylowe, np. kwas cykloheksano- dwukarboksylowy-1,4.Jako aromatyczne kwasy dwukarboksylowe na¬ lezy tu wspomniec zwlaszcza kwas -ftalowy, izo- ftalowy i tereftalowy, a jako aromatyczne kwasy trójkarboksylowe- kwas trójmezynowy i kwas trójmelinowy.Sposród heterocyklicznych kwasów dwu-, trój- i wielokairboksylowych wchodza w rachube m. im. kwas furanodwukarboksylowy-2,5, kwas tetrahy- drofuranodwukarboksylowy-2,5, utlenione skrobie i karboksymetyloceluloza.Odstep istniejacy miedzy dwiema dla sieciowa¬ nia dostepnymi grupami e-aminowymi i celowa dla przeprowadzenia sposobu rozpuszczalnosc w roz¬ puszczalnikach pozwalaja w przypadku wspomnia¬ nych korzystnych grup ukazac godna polecenia waska dolna i górna granice. Szczególnie korzy¬ stnymi sa wiec z jednej strony alifatyczne kwasy dwukarboksylowe o 3—12 atomach wegla, tzn. od kwasu malonowego do kwasu dekanodwukarboksy- lowego. Z drugiej zas strony szczególnie odpowied¬ nimi okazaly sie jednak tez wyzej czasteczkowe kwasy wielokarboksylowe, takie jak np. utleniona skrobia.Sieciowanie poprzeczne mozna osiagnac za po¬ moca wszystkich w chemii rozpowszechnionych metod tworzenia wiazania amidowego miedzy grupa aminowa a grupa karboksylowa; porównaj w tym celu np. H. D. Law, „The Organie Chemi- stry of Peptides" (John Wiley and Sons Ltd., Lon¬ dyn — Nowy Jork 1970). Mozna zwlaszcza — abstrahujac od kompletnosci — poddawac reakcji chlorki, azydki lub bezwodniki kwasowe omawia¬ nych kwasów karboksylowych z wolnymi grupami ani:nowymi miedzykomórkowej osnowy. Równiez moiua wolne kwasy dwu-, trój-, lub wielokarbo¬ ksyk/v/e za pomoca odpowiedniego odczynnika 10 15 20 127 208 -¦¦¦¦ .e sprzegajacego, takiego jak karbodwuimidy, np. dwucykloheksylokarbodwuimid, zwiazac z wolnymi grupami aminowymi osnowy miedzykomórkowej.Reakcje te z reguly prowodzi sie w bezwodnym rozpuszczainiku organicznym, takim jak czterowo- dorofuram, dioksan, pirydyna, dwumetyloformamid, dwumetyloacetamid, sulfotlenek dwumetylowy i szesciomety.\otrójamid kwasu fosforowego, albo w mieszaninie dwóch lub wiecej takich rozpusz¬ czalników. Jesli stosuje sie rozpuszczalny w wo¬ dzie odczynnik sprzegajacy, taki jak chlorowodorek N-etylo-N'-{3-dwumetyloaminopropylo)-karbodwu- imidu, to jako rozpuszczalnik nadaje sie takze woda.Tak stabilizowane narzady i czesci narzadów mozna wówczas w (nieobowiazkowym) drugim etapie sposobu za pomoca dwualdehydu poddawac garbowaniu lub sieciowaniu poprzecznemu, w któ¬ rym mozliwie jeszcze wolne grupy aminowe kola¬ genowego lancucha peptydowego przereagowuja, tworzac zasady Schiffa. Traktowanie to jest o tyle korzystne, o ile protezy, zwlaszcza otrzymane za pomoca dwualdehydu glutarowego, sa juz prak¬ tycznie wyjalowione.Jako dwualdehyd nadaje sie zasadniczo kazdy dwualdehyd, korzystnymi sa formaldehyd, skrobie dwualdehydowe i przede wszystkim aldehyd glu¬ tarowy. Reakcje za poimoca dwualdehydu prze¬ prowadza sie korzystnie w roztworze wodnym, przykladowo metoda wedlug szwajcarskiego opisu patentowego nr 595105 lub opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 093 439.Alternatywnie mozna stabilizowane poprzecznym usieciowainiem narzady i czesci narzadów podda¬ wac proteolitycznemu dzialaniu odpowiedniego enzymu, nie umniejszajac istotnie ich pierwotnie wystepujacych wlasciwosci biofizycznych i bioche¬ micznych. To zachowanie sie sprowadza sie do te¬ go, ze lancuchy peptydowe kolagenu utrwalaja sie przez sieciowanie poprzeczne, nim stabilizujace skladniki miedzykomórkowej osnowy, takie jak el astyna, proteoglikany oraz strukturowe glikopro- teiny, zostana czesciowo usuniete wskutek hydro¬ lizy.Korzystny drugi etap sposobu sklada sie wiec z inkubowania materialu narzadu w wodnym roz¬ tworze ficyny, papainy lub innej proteazy o takiej samej lub podobnej specyfice substratu. Ta hydro¬ liza lub proteoliza' nastepuje 'korzystnie za po¬ moca ficyny, zwlaszcza w zakresie pH = 4,0—5,5; mozna ja przeprowadzac m, in. wedlug przy¬ kladu 3 podanego w szwajcarskim opisie patento¬ wym nr 595 105.Po hydrolizie korzystnie nastepujace, ponowne sieciowanie poprzeczne mozna przeprowadzac za pomoca dwualdehydu lub wyzej omówionego kwa¬ su dwu-, trój- i wielokarboksylowego; do tego celu nadaja sie wyzej przedstawione metody.Otrzymane przeszczepy narzadów nastepnie prze¬ mywa sie starannie woda, wyjalawia i az do ich zastosowania przechowuje w szczelnie zamknie¬ tych przez zgrzewanie torebkach z tworzywa sztucznego. Wyjalawianie tych produktów naste¬ puje wylacznie na drodze chemicznej za pomoca 1,2-tlenku propenu (patrz w czesci doswiadczalnej 30 35 40 45 50 55 60iifiós s pod okresleniem roztwór fc-I), propiolaktonu (lak- tonu kwasu |3-hydroksypropionowego) lub tlenku etylenu.Reasumujac sposobem wedlug wynalazku otrzy¬ muje sie protezy, które szczególnie dobrze nadaja 5 sie jako zastepstwo zdefektowanych narzadów lub ich czesci, poniewaz — ich miedzyczasteczkowe lub wewnetrzczastecz- kowe wiazania poprzeczne (wiazania amidów kwa¬ sowych, wzglednie wiazania estrowe) wyrózniaja 13 sie szczególna trwaloscia chemiczna, — z rpowodu wspomnianego rodzaju sieciowania poprzecznego, przed lub tez nawet bez proteolitycz¬ nego rozkladu, ich biofizyczne wlasciwosci (ela¬ stycznosc, niepodatnosc) oraz ich wlasciwosci bio- 15 cherriiczne (zmniejszona trombogenizacja) sa nie¬ mal rówrie odpowiednimi wlasciwosciom natural¬ nego (niezmienionego) materialu; ¦— nie wywoluja zadnych reakcji odrzucania przeszczepu, tj. nie moga dzialac antygenowoi. 20 Zalety Wspomnianych wlasciwosci dla chirurgicz¬ nego' stosowania i Wyniku leczenia sa widoczne i zostaly potwierdzone w dzialaniu w próbach na zwierzetach.W próbach stosowano psy-mieszance o ciezarze 25 ciala 2 Wedlug przykladu IX., Impiantacja tych protez na¬ stepowala: (a) do obu tetnic udowych kazdego z psów, bezposrednio na obwodzie wiezadla pa¬ chwinowego wedlug metody P. Walter'a i wspól- 30 pracowników [tlelv. chir. Acta 46 (1979), 81 strona i nastepne], (b) do obu tetnic szyjnych, (c) do aorty brzusznej, kanalOwo do odejsc tetnic nerkowych [P. Walter i H. Schmitz, Der heterologe Gefasser- satz, strona 30, Editio Caintor, Aulendorf 1976], oraz ** (d) do podnerkowej zyly dolnej glównej wedlug metody S. Horsch'a i wspólpracowników [Langen- becks Arch. Chir. 344 (1978), strona 225 i nastepne].Dla porównania przeprowadzono równolegle próby z protezami z teflonu(R) (policzterofluoro- *o etylenu) i z protezami z Dacronu,(R), oraz z zylami pepkowymi, które garbowano tylko za pomoca dwualdehydu glutarowego. Po uplywie 6 tygodni mierzono czesc niedroznosci implantatu.Nalezy tu podkreslic, ze zwlaszcza miejsce 45 implantacji (a) (patrz wyzej) w stawie biodrowym psa jest poddawane wysokim obciazeniom mecha¬ nicznym (zginanie), które czasowo wzrastaja do obciazen dlugotrwalych. Mówiac innymi slowami, ten uklad próby odpowiada ekstremalnie niekorzy¬ stnym warunkom fizjologicznym. Tym bardziej ciekawe byly zatem wyniki, Implantaty z teflo- nu(R) i z zyl pepkowych daly w rezultacie czesc niedroznosci 100%, implantaty z Dacronu(R) daly czesc niedroznosci równa 77%, natomiast implantaty wedlug przykladu IX wykazaly czesc niedroznosci 50%. Wartosci podane przy próbach porównaw¬ czych sa pod wzgledem statystycznym wiele zna¬ czace.W srednioterminowych próbach, tzn,, obejmuja¬ cych odstep czasu równy 6 miesiecy w fizjolo¬ gicznie korzystniejszych warunkach, mianowicie w tetnicy szyjnej, obniza sie czesc niedroznosci implantatu wedlug przykladu IX do wartosci 20%; ta oznaczona wartosc jest znaczaca pod wzgledem 65 50 55 69 statystycznym., W przypadku prób W podhefko- wym obszarze w okresie sredriioterminowym (6 miesiecy) nie zaobserwowano zadnej za- krzepnicy.Porównawcze próby na ludziach sa obecnie pro¬ wadzone w jednej z klinik uniwersyteckich.Przyklad I. Cielece tetnice szyjne uwalnia sie od otaczajacej tkanki lacznej i odlacza sie naczynia oboczne. Po tej mechanicznej preparaeji tetnice przemywa sie zdejonizowana woda, suszy za pomoca bibuly, naciaga na pret. szklany rip. o srednicy 3 mm i w celu odwodnienia wstawia do cylindra miarowego, napelnionego czter*Owo- dorofuranem. W okresie 1 do 2 godzin zawartosc cylindra miarowego miesza sie przez porU&Etiftie cylindra ruchem kolowym. Po uplywie 5 godzin ciecz te wymienia sie na nowy czterowodorofuranj Po uplywie dalszych 2—3 godzin usuwa aie Pr^ty szklane.W nastepnym dniu tetnice te umieszcza sie w 2% (wagowo-objetosciowo) roztworze chlorku kwasu adypinowego w czteroWodorofuranie i W nim (po- zostawia w ciagu 24 godzin, ftoetwór ten rMekiedy kolujac porusza sie albo wprowadza w cyrkulacje za pomoca pompki. Dalej tetnice wklada sie do czystego czterowodorofuranu, nastepnie do Ukladu czterowodorofuran-woda (1:1 objetosc: objetosc) i wreszcie do buforowanego fosforanem roztworu chlorku sodowego i pozostawia w nim W ciagu 30—60 minut. Tetnice te sa juz gotowe do wyjala¬ wiania lub do hydrolizy za pomoca ficyny, ffct- painy itp. a) Wyjalawianie za pomoca 1,2-tlemku propenu.Tetnice umieszcza sie na okres 16—24 godzin, ewentualnie na dluzej, w 1% (wagowo-objetoscio- wo) roztworze 1,2-tlenku propenu w ukladzie eta- nol-woda (1:1, objetosc: objetosc). Nastepnie w Wa¬ runkach sterylnych umieszcza sie je w wyjalo¬ wionym roztworze PBS i razem z nim zamyka przez zgrzewanie w wyjalowionym pojemniku z tworzywa sztucznego.Roztwór PIlS. W 40 litrach wody rozpuszcza sie 320 g chlorku sodowego, 8 g chlorku potasowego, 51,2 g dwuwodzianu wodoroortofosforanu dwuso- dowego, 5,2 g dwuwodzianu chlorku wapniowego i 4,0 g szesciowodzianu chlorku magnezowego., Jezeli nalezy tetnice przechowywac w miesza¬ ninie etanol-wodav, to wystarczy umieszczenie ich w wyzej wspomnianym alkoholowo-wodnym roz¬ tworze tlenku propenu i razem z ta ciecza zam¬ kniecie w zgrzewanej torebce z tworzywa sztucz¬ nego. b) Wyjalawianie za pomoca propiolaktonu tonu kwasu p-hydroksypropionowego). Nastepujace sole rozpuszcza sie w okolo 900 ml zdejoniaoWttnej wody: 0y236 g chlorku sodowego, potasowego, 0,363 g dwuwodzianu chlorku wapnio¬ wego, 0,190 g szesciowodfciairm chlorku magmezdwego i 0,172 g dwtiwodorooflrtofosfosrariu .poosiowego. Za pomoca niewielkiej ilosci O^iW wodnego iugu so¬ dowego podwyzsza sie wartó^ pil roztworu do 7,4. Nastepnie rozpuszcza sie 11,782 g wodoro¬ weglanu sodowego w roztworze i objetosc dodat¬ kiem wody uzupelnia sie do l&OO ml. Bezposrednio przed wyjalawianiem tetnic dodaje sre do 1 litra127: ~ 9 tego roztworu 8,86 ml (10,08 g) propiolaktonu, umieszcza sie te tetnice w mieszaninie i razem z nia zamyka sie w zgrzewanej torebce z tworzy¬ wa sztucznego. c) Wyjalawianie za pomoca tlenku etylenu. Tet- 5 nice ulozone w roztworze PBS lub w fizjologicz¬ nym roztworze chlorku sodowego zamyka sie lacz¬ nie z ta ciecza w zgrzewanej torebce z tworzywa sztucznego. Wyjalawia sie w ten sposób, ze te zamknieta torebke z tworzywa sztucznego znana 10 metoda w aparacie sterylizacyjnym gazuje .sie tlenkiem etylenu w ciagu 4 godzin w temperaturze 25—30°C.Przyklad II. Cztery mechanicznie spreparo¬ wane tetnice cielece pojedynczo naciaga sie na 1§ prety szklane o grubosci 4 mm i ustawia w cy¬ lindrze miarowym napelnionym do 500 ml piry¬ dyna. Po uplywie 1 godziny tetnice sa tak sztywne, ze mozna wyjac prety szklane. Ciecz zlewa sie i wymienia na nowa pirydyne. Po uplywie 1 go- 2Ó dziny ponownie odnawia sie pirydyne. Po uplywie dalszej godziny tetnice umieszcza sie w miesza¬ ninie, która wytworzono w podany nizej sposób: do mieszaniny 98 ml pirydyny i 2 ml dwumetylo- fotfmamidu mieszajac wtryskuje sie 2 ml (2,5 g) 25 chlorku kwasu adypinowego; tworzy sie przy tym subtelny osad chlorku adypilopirydynio wegOw Gdy on sie osadzi, to przykrywa sie go plytka sitowa z porcelany. Nastepnie tetnice ustawia sie na tej plytce sitowej, tak aby one calkowicie zakryly 30 sie ciecza, lecz nie zetknely sie z osadem. Po uply¬ wie 18 godzin tetnice wyjmuje sie z cieczy i za¬ nurza na okres 30 minut do roztworu K-I (patrz przyklad IX). Nastepnie przemywa sie je cztero¬ krotnie 0,05N wyjalowionym wodnym roztworem 3o kwasu octowego i dwukrotnie przemywa wyjalo¬ wionym buforowym roztworem fosforanowym o pH = 8. Ostatecznie umieszcza sie w wyjalowio¬ nym roztworze PBS i razem z ta ciecza zamyka sie w zgrzewanej torebce z tworzywa sztucznego. i0 Przyklad III. 10 tetnic cielecych preparuje sie mechanicznie i na okres 3 godzin ustawia pionowo w cylindrze miarowym, napelnionym do objetosci 500 ml czterowodorofuranem. Nastepnie stawia sie je pojedynczo w rurkach szklanych o szerokosci 45 okolo 2 cm i wytrzasa je z porcjami po 40 ml 006% (wagowo-objetosciowo) roztworu kwasu ady¬ pinowego w ukladzie czterowodorofuran-woda (4:1, objetosc: objetosc). Po uplywie 1 godziny <*o-daje sie porcje po 40 ml 2% (wagowo-objetosciowo) roz- 53 tworu dwucykloheksylokarbodwuimidu w cztarowo- -dorofuranie i droga potrzasania oraz kolistego po¬ ruszania miesza sie z juz obecnym roztworem. Po aplywie 3 godzin tetnice uklada sie w roztworze K-I (patrz przyklad IX). W'nastepnym dniu prze- 55 mywa sie je' porcjami po 40 ml wyjalowionego ukladu etanol-woda <1:1, objetosc: objetosc), wy¬ jalowionego buforowego roztworu fosforanowego [1/15 molowego] o pH = 8 i umieszcza je w wyja¬ lowionym roztworze PBS. Ostatecznie razem z roz- M tworem PBS zamyka sie je w zgrzewanej torebce z tworzywa sztucznego.Przyklad IV. 10 cielecych tetnic po preparacji mechanicznej ustawia sie w cylindrze miarowym napelnionym do objetosci 500 ml dwumetylo-forma- 65 10 midem. Po uplywie 3 godzin ustawia sie^ je poje¬ dynczo w probówkach o srednicy wewnetrznej okolo w cm i zalewa je porcjami po 40 ml 0,06% (wagowo-objetosciowo) roztworu kwasu adypino¬ wego w ukladzie dwumetyloformamid-woda (4:1).Po uplywie 1 godziny dodaje sie porcje po 40 ml 2% (objetosciowo-objetosciowo) roztworu dwucyklo- heksylokarbodwuimidu w dwumetyloformamidzie i razem z juz obecnym roztworem kwasu adypino¬ wego miesza sie droga wtrzasania i kolistego po¬ ruszania. Po uplywie 3 dalszych godzin ciecz zlewa sie z kazdej probówki i zastepuje porcja 80 ml roztworu K-I. W nastepnym dniu tetnice przemywa sie porcjami po 40 ml wyjalowionego ukladu eta¬ nol-woda (1:1, objetosc: objetosc) i wyjalowionego buforowego roztworu fosforanowego (li/15 - molo¬ wego] o pH = 8. Ostatecznie umieszcza sie tetnice w wyjalowionym roztworze PBS i razem z nim zamyka w ogrzewanej torebce z tworzywa sztucz¬ nego.Przyklady. 4 tetnice cielece w zwykly spo¬ sób uwalnia sie od tkanki lacznej i podwiazuje naczynia oboczne., Nastepnie umieszcza sie je na okres 2 godzin w 60 ml 0,2% (wagowo-objetoscio¬ wo) wodnego roztworu kwasu adypinowego. Dalej wprowadza sie je do 60 ml wodnego roztworu, za¬ wierajacego kwas adypinowy w stezeniu 0,2 g/litr i chlorowodorek N-etylo-N'-(3-dwumetyloamino- propylo)-karboimidu w stezeniu 25 g/litr. Po uply¬ wie 20 godzin tetnice uklada sie w roztworze K-I, a pózniej po 24 godzinach w wyjalowionym roz¬ tworze PBS. Razem z tym roztworem zamyka sie tetnice w wyjalowionej zgrzewanej torebce z two¬ rzywa sztucznego.Przyklad VI. Mechanicznie spreparowane tetnice umieszcza sie na okres 2 godzin w 60 ml roztworu 0,1% {wagowo-objetosciowo) roztworu kwasu korkowego w wodzie, po czym w 60 ml wodnego roztworu, zawierajacego w 1 litrze 0,24 g kwasu korkowego i 25 g chlorowodorku N-etylo- -N'-{3-dwumetyloatmiinopropylo)-karbodwuimidu. Po uplywie 20 godzin tetnice uklada sie w roztworze K-I, po uplywie dalszych 24 godzin zas w wyja¬ lowionym roztworze PBS i razem z tym roztwio- rem zamyka sie je w wyjalowionej zgrzewanej torebce z tworzywa sztucznego. . ^ Przykld VII. Wedlug sposobu postepowania, omówionego w przykladzie I, cielece tetnice szyjne traktuje sie chlorkiem kwasu adypinowego w czterowodorofuraoiie. Otrzymane tetnice nie sa nastepnie wyjalawiane, lecz hydrolizowane za po¬ moca ficyny w nastepujacy sposób: 1 litr wody ogrzewa sie do temperatury 37°C.Mieszajac dodaje sie 10 g ficyny; ficyna w tych okolicznosciach tylko czesciowo rozpuszcza sie. Na¬ stepnie mieszajac dodaje sie 1 g cysteiny i roz¬ puszcza. Za pomoca IN wodnego roztworu cytry¬ nianu trójsodowego podwyzsza sie wartosc pH roz¬ tworu do 6,0. Jesli ciecz jest metna, to saczy sie ja przez sukno bawelniane i ta droga uwalnia od zmetnienia. Jej temperatura obniza sie przy tym do temperatury okolo 25—30°C. Tetnice te ustawia sie w cylindrze miarowym i zalewa kla¬ rownym- roztworem ficyny. Cylinder miarowy usta¬ wia sde w lazni wodnej o temperaturze 37—38°Cn w celu ogrzania jego zawartosci do temperatury okolo 37°C. Pózniej po uplywie 3 godzin w tem¬ peraturze 37°C reakcja konczy sie. Wówczas roz¬ twór ficyny zlewa sie i odrzuca. Tetnice w ciagu 15 minut przemywa sie biezaca zdejonizowana woda o temperaturze okolo 20°C. Nastepnie zlewa sie wode. Tetnice stale jeszcze znajduja sie w cy¬ lindrze miarowym. Zalewa sie je 1 litrem wodnego roztworu, zawierajacego lii,9 g chlorynu sodowego (NaC102). Po uplywie 18 godzin w temperaturze pokojowej zlewa sie ciecz, a tetnice przemywa sie w ciagu okolo 15 minut biezaca zdejonizowana woda o temperaturze okolo 20°C. Teraz sa one juz gotowe do wyjalawiania lub do obróbki na¬ stepczej za pomoca odpowiedniego aldehydu.Przyklad VIII. Wedlug opisanego w przy¬ kladzie I sposobu postepowania traktuje sie cie¬ lece tetnice szyjne chlorkiem kwasu adypinowego w czterowodorofuranie. Otrzymane tetnice nie sa nastepnie wyjalawiane, lecz hydrolizowane za po¬ moca ficyny w sposób omówiony nizej.Wprowadza sie 1 litr buforowego roztworu kwas cytrynowy — fosforan o wartosci pH = 4,5, wy¬ tworzonego wedlug T. C. Mc Ilvaine [J. Biol. Chem. 49, 183 (1921)]. Mieszajac dodaje i rozpuszcza sie 10 g ficyny. Nastepnie mieszajac dodaje i roz¬ puszcza sie 1 g cysteiny. Tetnice te ustawia sie w cylindrze miarowym i zalewa wyzej omówionym roztworem ficyny. Dalsza obróbka nastepuje me¬ toda wedlug przykladu VII.Przyklad IX. Cielece tetnice szyjne, analo¬ gicznie jak w przykladzie VII, poprzecznie sie¬ ciuje sie najpierw za. pomoca chlorku kwasu ady¬ pinowego w czterowodorofuranie, po czym poddaje hydrolizie za pomoca ficyny.Nastepnie naciaga sie je ponownie na prety szklane i wstawia do 4% wodnego roztworu dwu- aldehydu glutarowego. Po uplywie 24 godzin prety usuwa sie, a tetnice w ciagu co- najmniej 90 minut przemywa sie w biezacej wodzie. Ostateczni;; tetnice umieszcza sie w roztworze K-I i zamyka w zgrzewanej torebce z tworzywa sztucznego.Roztwór K-I. 720 ml wody i 720 ml etanolu miesza sie razem. Do tego roztworu dodaje 16,9 ml (14,1 g) 1,2-tlenku propanu. Roztwór ten sporzadza sie zawsze na swiezo i bezposrednio po sporzadze¬ niu wykorzystuje doi wyjalawiania.Przyklad X. 7 osierdzi cielecych uwalnia sie od tluszczu, mozliwie gladko przycinajac i umiesz¬ cza w plaskiej misce w 5#0 ml czterowodoroifura¬ nu. Ciecz te po uplywie 1—<2 dni wymienia sie na nowy czterowodorofuran. Po uplywie lacznie 4 dni osierdzia umieszcza sie w 5O0 ml 2% (wagowo- objelosciowto) roztworu chlorku kwasu adypinowe¬ go w czterowodorofuranie i pozostawia w nim w ciagu 1 dnia. Nastepnie ciecz zlewa sie. Osierdzia umieszcza sie trzykrotnie na okres po 0,5 godziny w ukladzie etanol-woda (1:1, objetosc: objetosc), po czym w ciagu 0,5 godziny przemywa biezaca woda. Nastepnie umieszcza sie osierdzia w buforo¬ wanym przez fosforan roztworze chlorku sodowego o wartosci pH=4,5. Sa one juz gotowe do hydro¬ lizy za pomoca ficyny, papainy lub innego odpo¬ wiedniego enzymu, 10 15 20 25 127208 12 Usieciowane za pomoca chlorku kwasu adypi¬ nowego osierdzia zanurza sie w roztworze ficyny, takim jaki przedstawiono w przykladzie VII lub VIII. Temperatura wynosi 37°C. Po uplywie 3 go¬ dzin roztwór ficyny zlewa sie, a osierdzia w ciagu 15 minut przemywa sie biezaca zdejonizowana woda. Nastepnie umieszcze sie je w roztworze wodnym, zawierajacym 11,9 g chlorynu sodowego.Pózniej po uplywie 18 godzin roztwór zlewa sie.Osierdzia przemywa sie w ciagu 15 minut biezaca zdejonizowana woda. Sa one juz gotowe do obróbki nastepczej za pomoca odpowiedniego aldehydu lub do wyjalawiania.Osierdzia, usieciowane za pomoca chlorku kwasu adypinowego i hydrolizowane za pomoca ficyny, umieszcza sie na okres 24 godzin w 1% (wagowo- objetesciowo) wodnym roztworze dwualdehydu glutarowego, przez dwugodzinne przemywanie w biezacej wodzie uwalnia sie od nadmiaru alde¬ hydu i wyjalawia albo za pomoca roztworu K-I albo za pomoca tlenku etylenu. a) Wyjalawianie za pomoca roztworu K-I. Wyzej omówione, ostatecznie dwualdehydem glutarowym traktowane i przemyte osierdzia umieszcza sie w roztworze K-I i razem z nim zamyka w zgrze¬ wanej torebce z tworzywa sztucznego. b) Wyjalawianie za pomoca tlenku etylenu. Wyzej omówione, ostatecznie traktowane dwualdehydem glutarowym i przemyte osierdzia razem z 0,9% roztworem chlorku sodowego zamyka sie w zgrze¬ wanej torebce z tworzywa sztucznego. Zamknieta torebke w aparacie sterylizacyjnym w ciagu 4 go¬ dzin w tempraturze 25—30°C gazuje sie tlenkiem etylenu.Przyklad XI. Analogicznie jak w przykla¬ dzie I cielece tetnice szyjne mechanicznie prepa¬ ruje sie i przemywa woda. Umieszcza sie je wów¬ czas w 200 ml czterowodorofuranu i te ciecz po uplywie 1,2 i 4 dni wymienia sie na nowy cztero¬ wodorofuran. Po uplywie lacznie 7 dni tetnice umieszcza sie w 3,2% (wagowo-objetosciowo) roz¬ tworze dwuchlorku kwasu dekanodwukarboksylo- wego w czterowodorofuranie i pozostawia je w roztworze w ciagu 48 godzin. Nastepnie umiesz¬ cza sie je na okres 16 godzin w czterowodorofura¬ nie, na okres 8 godzin w ukladzie czterowodoro- furan-roztwór buforowy (1:1, objetosc: objetosc) o wartosci pH = 4,5 i wreszcie na okres 1 dnia umieszcza sie w wodnym roztworze buforowym o wartosci pH = 4,5. Tetnice sa juz gotowe do wyjalawiania lub do hydrolizy za pomoca ficyny.Przyklad XII. Analogicznie jak w przykla¬ dzie VII lub VIII cielece tetnice szyjne najpierw sieciuje sie poprzecznie za pomoca chlorku kwasu adypinowego w wterowodorofuranie, a nastepnie poddaje hydrolizie za pomoca ficyny. Po przemyciu roztworem chlorynu sodowego, analogicznie jak w przykladzie VII, tetnice umieszcza sie w 0,5% wodnym roztworze dwualdehydu glutarowego. Po uplywie 48 godzin ciecz zlewa sie, po czym tet¬ nice przemywa sie w ciagu 0,5 godziny biezaca woda. Ostatecznie umieszcza sie je w 0,9% roz¬ tworze chlorku sodowego, razem z ta ciecza na¬ pelnia nimi torebke z tworzywa sztucznego i zgrze¬ wajac zamyka te torebke. Zamknieta torsbke 40 45 50 55 60 6313 127208 14. . z tworzywa sztucznego wyjalawia sde analogicznie . jak w przykladzie I c) droga gazowania tlenkiem etylenu.P-rzyklad XIII. 550 g skrobi kukurydzianej wprowadza sie do 3 litrów wody i miesza w ciagu 15 minut., Nastepnie w ciagu 1 godziny wkrapla sie roztwór 705 g metanadjodanu sodowego w 9 litrach wody. Zawiesine nadal miesza sie w ciagu 18 godzin, po czym saczy sie ja przez bibule. Pozostalosc na saczku rozprowadza sie w 1,5 litra wody i ponownie odsacza. Ten proces rozprowadzania i odsaczania powtarza sie pieck krotnie. Pozostalosc na saczku, jeszcze wilgotna wprowadza sie nastepnie do 3 litrów acetonu, energicznie miesza w ciagu 0,5 godziny, po czym saczy. Pozostalosc na saczku suszy sie w ciagu 42 godzin w temperaturze 40°C pod próznia. Na¬ stepnie pozostalosc te miele sie w mlynie kulowym do postaci subtelnego pudru. 13 g tego mialkiego pudru rozprowadza sie w 1 litrze zdejonizowanej wody. Dodajac nasycony roztwór wodoroweglanu sodowego doprowadza sie odczyn do wartosci pH = 8,80.Nastepnie tetnice, takie jak wedlug przykladu VII lub VIII usieciowane poprzecznie za pomoca chlor¬ ku kwasu adypinowego i hydrolizowane za pomoca ficyny, umieszcza sie w wyzej otrzymanej zawie¬ sinie skrobi aldehydowej. Ciecz te za pomoca wibratora utrzymuje sie w stalym ruchu. Po uply¬ wie 24 godzin ciecz zlewa sie. Tetnice te przemywa sie w ciagu 30 minut w biezacej wodzie. Nastepnie umieszcza sie je w roztworze PBS, razem z ta ciecza zamyka sie je w zgrzewanej torebce z two¬ rzywa sztucznego i wyjalawia przez gazowanie tlenkiem etylenu.Przyklad XIV. 550 g skrobi kukurydzianej dodaje sie do 3 litrów wody i miesza w ciagu 15 minut. Nastepnie w ciagu 1 godziny wkrapla sie roztwór 705 g metanodjodanu, w 9 litrach wody.Zawiesine te nadal miesza sie w ciagu 18 godzin, po czym saczy sie ja przez bibule. Pozostalosc na saczku rozprowadza sie w 1,5 litra wody i odsacza.Proces rozprowadzania i odsaczania powtarza sie pieciokrotnie.Nastepnie z pozostalosci sporzadza sie zawiesine w 3 litrach wody. Energicznie mieszajac wkrapla sie w ciagu 0,5 godziny roztwór 695 g nadmanga¬ nianu potasowego w 12 litrach wody. Zawiesine te nadal miesza sie w ciagu 18 godzin, po czym te mieszanine pozostawia sie w ciagu 2 godzin. W tym czasie osadza sie wieksza czesc utworzonego braun¬ sztynu. Zawiesine, tworzaca górna warstwe mie¬ szaniny, ostroznie doprowadza sie za pomoca le- waru hydraulicznego do innego naczynia, zas faze blotna odrzuca sie.Zawiesine te saczy sie przez bibule. Pozostalosc na saczku rozprowadza sie jako zawiesine w 1,2 li¬ tra wody i odsacza. Proces rozprowadzania i od¬ saczania powtarza sie trzykrotnie. Nastepnie po¬ zostalosc na saczku rozprowadza sie w 9 litrach 0,5N kwasu solnego o temperaturze 0°C i miesza w ciagu 1 godziny. Zawiesine te nastepnie saczy sie przez bibule. Proces rozprowadzania i odsacza¬ nia powtarza sie trzykrotnie. Pozostalosc na saczku rozprowadza sie nastepnie jako zawiesine w 3 lit- 10 15 25 20 35 45 50 55 60 65 rach acetonu, miesza w ciagu 0,5 godziny i odsacza.W ciagu 42 godzin w temperaturze 40°C suszy sie pod próznia te pozostalosc z saczka i miele ja w mlynie kulkowym do postaci subtelnego pudru.Z 2 g tego pudru, skladajacego sie ze skrobi o duzej ilosci grup karboksylowych, sporzadza sie zawiesine w 1 litrze wody. Mechanicznie spre¬ parowane tetnice umieszcza sie na okres 2 godzin w 150 ml tej zawiesiny. Za pomoca wibratora lekko porusza sie te ciecz., Nastepnie tetnice te wprowadza sie do 200 ml zawiesiny, zawierajacej w 1 litrze 0,26 g wyzej wspomnianego pudru oraz 25 g chlorowodorku N-etylo-N'-'(3-dwuimetylaami- nopropylo)-karbodwuimidu. Zawiesine te nadal poddaje sie lagodnemu wibrowaniu. Po uplywie 24 godzin ciecz zlewa sie. Tetnice przemywa sie w ciagu 0,5 godziny pod biezaca woda. Nastepnie umieszcza sie je w 150 ml buforowego roztworu kwasu cytrynowy — fosforan o wartosci pH = 4,5 i poddaje je obróbce za pomoca ficyny, analogicz¬ nej jak w 'przykladzie VIII.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowych przeszczepów na¬ rzadów z narzadów i z czesci narzadów ryb, pta¬ ków i ssaków, znamienny tym, ze narzady i czesci narzadów traktuje sie alifatycznym, cykloalifatycz- nym, aromatycznym lub heterocyklicznym kwa¬ sem dwu-, trój- lub wielokarboksylowym w obec¬ nosci odczynnika sprzegajacego, albo kwasowym chlorkiem, azydkiem lub bezwodnikiem omówio¬ nego kwasu karboksylowego, przy czym traktowa¬ nie to przeprowadza sie w srodowisku bezwod¬ nego rozpuszczalnika organicznego, mieszaniny dwóch lub wiecej takich rozpuszczalników, albo w przypadku stosowania rozpuszczalnego w wodzie odczynnika sprzegajacego przeprowadza sie takze w srodowisku wody. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie kwasy dwu- trój- lub wielokarboksyIo¬ we, nie zawierajace grup aldehydowych, ketono¬ wych, ani grup aminowych, zwlaszcza zas takie kwasy, które zawieraja tylko grupy karboksylowe i ewentualnie grupy hydroksylowe. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako alifatyczne kwasy karboksylowe stosuje sie kwasy o 3—12 atomach wegla, jako cykloalifa- tyczne kwasy karboksylowe stosuje sie kwasy cyklopentanodwukarboksylowe i cykloheksano- dwukarboksylowe, jako aromatyczne kwasy karbo¬ ksylowe stosuje sie kwas ftalowy, izoftalowy, tere- ftalowy, trójmezynowy i trójmelitowy, a jako heterocykliczne kwasy stosuje sie kwasy furano- i tetrahydrofurano^dwukarboksylowe-2,5, utleniona skrobie i karboksymetyloceluloze. 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze narzady po obróbce kwasem karboksylowym trak¬ tuje sie dodatkowo formaldehydem lub dwualde- hydem. 5. Sposób wedlug zastrz., 4, znamienny tym, ze jako dwualdehyd stosuje sie skrobie dwualdehy- dowa lub dwualdehyd glutarowy, korzystnie dwu¬ aldehyd glutarowy.mm 16 16 6. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze 8. Sposób wedlug zastrz; 6, znamienny tym, ze narzady po obróbce kwasem karboksylowym do- narzady po hydrolizie doidatkowo traktuje sierali- datkowo poddaje sie enzymatycznej hydrolizie za fatycznym cyiki0alifatycznym, aromatycznym lub pomoca ficyny, papainy lub innej proteazy o takiej ,,-,,. , , , samej lub podobnej. specyfice substratu. 5 heterocyklicznym kwasem dwu-, trój- lub wielo- 7. Sposób wedlug zastrz. 6, znamienny tym, ze karboksylowym w obecnosci odczynnika sprzegaja- narzady po hydrolizie dodatkowo traktuje sie dwu- cego albo kwasowym chlorkiem, azydkiem lub aldehydem. bezwodnikiem omówionego kwasu karboksylowego.LZGraf. Z-d Nr 2 — 397/86 85 egz. A4 Cena IM zl PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL