Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania drozdzy paszowych i/lub alkoholu etylowego z od¬ padów pochodzenia roslinnego.Rosliny, a dokladniej: 25—40% substancji suchej, roslinnych substancji odpadowych, skladaja sie z celulozy. Ponadto zawieraja one lignine w ilosci 20—40% i w mniejszej ilosci polimery pentozowe, heksozowe, jak równiez inne substancje nieorganicz¬ ne i organiczne.Znane sa dwie drogi wykorzystywania roslinnych substancji odpadowych przez poddanie ich fermen¬ tacji. Jedna z nich jest bezposrednia fermentacja celulozy z pomca mikroorganizmów rozkladajacych celuloze. Druga mozliwosc polega na rozkladaniu celulozy kwasami lub enzymami do glukozy i na sfermentowaniu uzyskanej glukozy.Istnieje niewiele mikroorganizmów, które sa zdol¬ ne do bezposredniej fermentacji celulozy, a i te or¬ ganizmy moga dokonywac rozkladu celulozy tylko w bardzo powolnym tempie. Mikroorganizmami roz¬ kladajacymi celuloze sa na przyklad bakteria z ga¬ tunku Cellulomonas i Cellovibrio, a z drozdzy na¬ lezy tu zaliczyc przykladowo Myrrothecium ver rucaria, Trichadrema viride itd.Ch. E. Dunlap (A. Chem. Soc. Symp. 1978) ekspe¬ rymentowal na szczepach Cellulomonas i Alcalige- nes w celu uzyskania mikroorganizmów rozkladaja¬ cych celuloze. F. Kargi i M. L. Schuler (Biotechn. and Bioeng. Vol. XXII 1567—1600, 1980) przeprowa- 10 15 20 30 dzal eksperymenty na pewnej mutacji Pseudomo- nas fluorescens.Próby wytwarzania bialka pochodzenia mikro- organicznego (single celi protein SCP) za pomoca bakterii i plesniaków traca stopniowo na znacze¬ niu, poniewaz stosowanie tych mikroorganizmów jako bialka paszowego jest.kwestionowane w aspek¬ cie medyczno-weterynaryjnym.Mozliwosci wykorzystania celulozy przez podda¬ nie jej fermentacji staja sie znacznie szersze, jezeli najpierw dokona sie hydrolizy celulozy na glukoze, poniewaz glukoza asymilowana jest przez niemal wszystkie mikroorganizmy.Sholler i Thorns opracowali jako pierwsi na prze¬ lomie XIX i XX w. sposób calkowitej hydrolizy celulozy. W sposobie tym zastosowano kwasy mi¬ neralne o srednim stezeniu i temperatury ponad 100°C. Sposób byl w zwiazku z fym bardzo energo¬ chlonny, a do jego przeprowadzenia uzywano urza¬ dzen odpornych na dzialanie kwasów i cisnienia.Sposób tan zostal wprawdzie pózniej unowoczesnio¬ ny (stezenie Wasów i cisnienie mogly ulec zmniej¬ szeniu), jednak nie buduje sie wiecej fabryk, które mialyby pracowac w oparciu o ten sposób.Od 1950 podejmowano próby przeprowadzenia hy¬ drolizy za pomoca enzymu celulozy, wytwarzanego przez grzyby (B. Hagerdal, m.in. Biotechn. and Bioeng. VoL XXII 1515—1526 i 1527—1542). Do hy¬ drolizy celulozy stosowano powszechnie system en¬ zymatyczny Trochoderma viride (D. Sternberg, 129 919129 919 3 Bdotechn. and Bioeng. Symp. nr 6, 35^53, 1976).Enzymatyczna nydroliza jest procesem drogim.Oplaca sie w zasadzie dopiero wówczas, gdy roz¬ twór glukozy uzyskany droga hydrolizy zostanie poddany obróbce celem uzyskania produktu dróz- » szego.Punktem wyjscia przy opracowywaniu sposobu wedlug wynalazku bylo to, ze do wytworzenia bial¬ ka pochodzenia mikroorganlcznego mozna stosowac mikroorganizmy, które nadaja sie do wykorzystania io jako karma dla zwierzat i moga wykorzystac poza lignina szeroki wachlarz skladników roslinnych.Nalezace do gatunków Candida i Torulopsis, utilis Spezies uzywane sa od dziesiatków lat jako drozdze paszowe. Te znane gatunki drozdzy nie moga roz- 15 kladac ani celulozy, ani ligniny. Równiez w litera¬ turze nie opisano dotychczas zadnego gatunku droz¬ dzy, które bylyby w stanie rozkladac celuloze.Nieoczekiwanie odkryto teraz, ze wyodrebniony w 1978 roku, metoda genetyczna i metoda selekcji 20 szczepów, szczep Candida utilis posiada zdolnosc rozkladu celulozy uwodnionej oraz czesciowo zde¬ gradowanej. Dla uwodnienia i degradacji celulozy wypracowany zostal prosty sposób obróbki wstep¬ nej, za pomoca którego z materialu zawierajacego 25 celuloze mozna przygotowac odpowiedni dla wymie¬ nionego szczepu drozdzy roztwór pozywki.Wedlug wynalazku zawierajace celuloze odpady poddaje sie wstepnej obróbce za pomoca rozcienczo¬ nego kwasu mineralnego o stezeniu 0,5—^10% i/lub 30 rozcienczonego lugu o stezeniu 0,5—10% w tempe- rautrze 80—100°C, w ciagu 0,5—5 godz., a nastepnie fermentacji w warunkach tlenowych lub beztleno¬ wych pod wplywem szczepu Candida utilis var. cel- lulolytica, który zlozony zostal w Wegierskiej Ko- 35 lekcji Szczepów (OKI) dnia 23.09.1980 za numerem CU 28 00199.Korzystnie stosuje sie 0,5—4,0%-owy kwas siar¬ kowy i/lub 0,5—4,0%-owy lug. Obróbke wstepna przeprowadza sie korzystnie w temperaturze 90— 40 —98°C, w ciagu 0,5—3 godzin. Fermentacje przepro¬ wadza sie korzystnie w temperaturze 35—37°C, w sposób nieciagly lub ciagly. W przypadku fer¬ mentacji nieciaglej, czas Jej trwania w zaleznosci od materialu wyjsciowego wynosi 16—72 godziny, 45 korzystnie 16—50 godzin.Do wytworzenia drozdzy paszowych zawartosc wolnego tlenu w brzeczce fermentacyjnej wynosi 1,0-^0,4 mg CVI, korzystnie 1,5—2,5 mg Oj/l. Dla wy¬ tworzenia alkoholu etylowego fermentacje przepro- & wadza sie w warunkach beztlenowych. Do równo¬ leglej produkcji drozdzy paszowych i alkoholu ety¬ lowego napowietrza sie brzeczke fermentacyjna tak, aby zawartosc wolnego tlenu wynosila w niej 0—1 mg0^1. 55 Szczep Cu 28 zostal wyodrebniony ze szczepu po¬ lowego. Okolo 1 g zgnilego drewna zhomogenizo- wano z 9 ml sterylnego fizjologicznego roztworu soli kuchennej. Z roztworu sporzadzono decymalny szereg rozcienczenia, którym zaszczepiono agar Sa¬ bourauda zawierajacy karboksymetyloceluloze.Agar Sabourauda zawierajacy karboksymetylocelu¬ loze odpowiada pod wzgledem skladu pozywce Oxoid CMa41 z ta jednak róznica, ze zawiera on karboksymetyloceluloze zamiast deksstrozy). Plytki 65 60 inkubowano przez 72 godziny w temperaturach 25, 30 wzglednie 37°C. Metoda morfologii komórki wy¬ brano wyrosle na plytkach kultury drozdzy i przesz¬ czepiono je na powyzke zawierajaca glukoze i kar¬ boksymetyloceluloze o nastepujacym skladzie: ekstrakt wolowiny (difko) 5,0 g glukoza 7,5 g karboksymetyloceluloza 7,5 g pepton poch. bakteryjnego (difko) 4,0 g ekstrakt drozdzy (Oxoid L 21) 1,0 g dwuwodorofosforan potasu 0,2 g wodorofosforan dwupotasowy 0,15 g dwuwodorofosforan sodowy 2,0 g wodorofosforan dwusodowy 1,5 g siarczan magnezu 0,3 g siarczan cynku 0,1 g siarczan amonu 3,0 g chlorek zelaza(III) 0,1 mg siarczanmiedzi 0,6 mg chlorek manganu 0,15 mg jodekpotasu 0,05 mg kwas ortoborowy 0,1 mg agar 15 g woda do 1 litra Droga zwykle stosowanych procesów oczyszcza¬ jacych wyhodowano kultury pochodzace od jednej komórki i utrzymywano je na pozywce zawieraja¬ cej glukoze i karboksymetyloceluloze. Sposród tych wyodrebnionych kultur wyszukano te, która najle¬ piej rozkladala karboksymetyloceluloze.Synchroniczna kulfura tego szczepu zostala w 1978 podddana obróbce mutagennej (majacej na celu wy¬ tworzenie odpowiednich mutacji), a mianowicie uzy¬ to N-metylo-N-nitrozo-N'-nitroguanidyne o takim stezeniu, przy którym liczba zywych zarodków spa¬ da co najmniej o trzy rzedy wielkosci. Komórki, które przezyly, wysegregowano na pozywce w sta¬ nie plynnym, zawierajacej karboksymetyloceluloze i przeszczepiono na pozywke Sabourauda, zawieraja¬ ca karboksymetyloceluloze. Aktywnosc celulozy (tj. jej zdolnosc do rozkladu celulozy) uzyskanych ko¬ lonii mutantów okreslono za pomoca kwasu dwu- nitrosalicylowego, a szczep o najwiekszej aktywno¬ sci celulazy (Candida utilis var. cellulolytica) zostal wybrany i zlozony pod numerem 00199 w Narodo¬ wej Zbiornicy Mikroorganicznej Krajowego Insty¬ tutu Zdrowia (Orszagos Kózegsgti-gyii Intezet Mi- kroorganizmusik Nemzeti Gyiijtemsnye).Komórki wymienionego szczepu maja ksztalt eli¬ psoidalny, mniejsza srednica lezy miedzy 2,5 a 4,5 |xm wieksza srednica wynosi od 4,5 do 7,5 |xm. Szczep tworzy biale, wypukle kolonie o blyszczacej po¬ wierzchni i gladkich brzegach.W celu uwodnienia i czesciowej degradacji na ce¬ luloze dziala sie rozcienczonym kwasem mineral¬ nym i/lub rozcienczonym lugiem przy temperaturze miedzy 80 a 10O°C w zaleznosci od rodzaju odpa¬ dów roslinnych w ciagu 0,5—5 godzin. Kwas i lug maja stezenie 0,5—10% wagowych.Optymalne stezenie jak równiez temperature oraz czas trwania obróbki wstepnej okresla sie w zalez¬ nosci od skladu chemicznego i struktury roslinnych odpadów dla kazdego przypadku oddzielnie.W zaleznosci od rodzaju odpadów roslinnych moz¬ na co najmniej 25 do 60% przetworzyc przez kon-5 129 919 6 wersje biologiczna na drozdze paszowe badz na al¬ kohol etylowy 1. Ponizej przeprowadzono porówna¬ nie miedzy szczepem Tdrulopsis tradycyjnie stoso¬ wanym do wytwarzania drozdzy paszowych a sto¬ sowanym zgodnie z wynalazkiem szczepem Candi- da utilis var. cellulolytica. W tabeli podana zostala ilosc suchych drozdzy w kg, jaka mozna uzyskac ze 100 kg suchego surowca oraz ilosc alkoholu etylo¬ wego w hl° (wykorzystanie wyrazone w litrach absolutnego alkoholu), jaka mozna uzyskac ze 100 kg suchego surowca. 10 siarczan amonu 3,0 g ekstrakt wolowiny (difko) 5,0 g pepfon pochodzenia bakteryjnego (difko) 4,0 g ekstrakt drozdzy (Oxoid L 21) 1,0 g chlorek zelazowy — siedmiowodzian 0,1 mg siarczan miedzi — pieciowodzian 6,6 mg chlorek manganu — trójwodzian 0,15 mg jodek potasu 0,05 mg kwas ortoborowy 0,1 mg zostaja rozpuszczone w 1 litrze destylowanej wody.Roztwór sterylizuje sie przez godzine w tempera- Material wyjsciowy oraz produkt drozdze paszowe ze slomy alkohol etylowy ze slomy drozdze paszowe z makulatury alkohol etylowy z makulatury drodze paszowe z kenafu alkohol etylowy z kenafu drodze paszowe i alkohol etylowy z kenafu drozdze paszowe z mieszanki przygotowanej z odpadów trzciny cukrowej i bagasu w stosunku 75:25 alkohol etylowy z mieszanki przygotowanej z odpadów trzciny cukrowej i bagasu | w stosunku 75:25 Wykorzystanie Candida utilis var. cellulolytica 9,6—11,2 12,0—13,0 13,2—14,0 13,6—14,0 16,0—18,0 20,0—22,0 9,0—10,0' 8,0—10,0 18,0—19,0 22,0—23,6 Torulopsis utilis 6,4^- 7,8 8,2— 9,4 8,6— 9,2 9,6— 9,2 9,2—10,0 11,4^12,2 4,0— 5,0 3,5— 4,5 9,8—10,6 12,2—13*6 Kenaf jest roslina wlóknista, bagas jest! to pozosta¬ losc po wytloczeniu trzciny cukrowej.Wynalazek zostal wyjasniony blizej w oparciu o przyklady.Przyklad I. 1000 jednostek wagowych kenafu miele sie w mlynie mlotkowym na czasteczki o wiel¬ kosci 1—2 mm. Do tego materialu dodaje sie 9000 jednostek wagowych 3,2% kwasu siarkowego, a mie¬ szanine poddaje sie obróbce cieplnej w kwasoodpor- nym pojemniku w temperaturze 96°C w ciagu 120 minut. Nastepnie dodaje sie i rozpuszcza 7,2 jedno¬ stek wagowych superfosfatu i 4,0 jednostki wagowe technicznego siarczanu amonu. Roztwór zostaje od¬ wirowany, a jego wartosc pH zostaje ustawiona na 6,5 za pomoca technicznego lugu sodowego. Uzyska¬ ny w ten sposób roztwór pozywki zostaje ochlodzo¬ ny do temperatury 37°C i zaszczepiony w stosunku 1:100 kultura wstepna Candida cellulolytica zawie¬ rajaca 108 komórek na jeden milimetr.Kultura wstepna zostaje sporzadzona w nastepu¬ jacy sposób: glukoza karboksymetyloceluloza (rozpuszczalna w wodzie) ^ dwuwodorofosforan potasu wodorofosforan dwupotasowy dwuwodorofosforan sodu — jednowodzian wodorofosforan dwusodowy siarczan magnezu — siedmiowodzian siarczan cynku 7,5 g 7,5 g 0,2 g 0,15 g 2,0 g 1,5 g 0,3 g 0,1 g 35 40 45 50 55 60 turze 105°C w kolbach zamknietych zatyczkami z waty. Roztw6r pozywki zostaje przy temperatu¬ rze 37°C zaszczepiony 10 ml majacej 24 godziny za¬ wiesiny Candida utilis var. cellulolytica, a nastep¬ nie poddaje sie go inkubacji. Zawiesine zawieraja¬ ca 108 komórek na milimetr zostaje zaszczepiona pozywka kultury glównej.Fermentacja odbywa sie przy zapowietrzaniu nadwyzka tlenowa 1—2 mg CVI. W przypadku fer¬ mentacji o przebiegu nieciaglym fermentacja trwa 36^0 godzin.Na koncu fermentacji (po uzyskaniu maksymal¬ nej ilosci komórek) mozna drozdze odfiltrowac na prózniowym filtrze bebnowym lub prasie filtracyj¬ nej lub tez wysuszyc metoda suszenia rozprysko- wego. Ze 100 kg kenafu mozna w opisany sposób uzyskac 16—18 kg suszonych drozdzy.Przyklad II. Postepowanie jest takie, jak w przykladzie I z ta róznica, ze fermentacja prze¬ biega w warunkach beztlenowych, bez napowietrza¬ nia. Fermentacja trwa 46—50 godzin. Ilosc alkoho¬ lu, jaka mozna oddestylowac z brzeczki fermenta¬ cyjnej wynosi — w przeliczeniu na alkohol absolut¬ ny — 20,0—22,0 1.Przyklad III. Postepowanie jest takie jak w przykladzie I, jednak zamiast kenafu jako suro¬ wiec stosuje sie slome. Przez 38 minut trwa obrób¬ ka wstepna 3,7% kwasem siarkowym w temperatu¬ rze 98°C. Po przefiltrowaniu pozostalosc poddaje sie dzialaniu 2,8% lugu sodowego w temperaturze 98°C przez 42 minuty. Zarówno kwas jak i lug zastoso-129 919 8 wano w ilosci 4500 jednostek wagowych. Fermen¬ tacja trwa 4j6 godzin przy wartosci pH 6,3.Ze 100 kg suchej slomy uzyskuje sie 9,6^11,2 kg suchy drozdzy paszowych. przyklad IV. Postepuje sie w sposób opisany w przykladzie III z ta róznica, ze fermentacje prze¬ prowadza sie w warunkach beztlenowych. Pb 52- -godzinnej fermentacji brzeczke fermentacyjna kul¬ tury poddaje sie destylacji. W przeliczeniu na alko¬ hol absolutiny uzyskuje sie ze 100 kg slomy 112—13 litrów alkoholu.Przyklad V. Postepuje sie tak jak to opisano w przykladzie I, z tym, ze zamiast kenafu jako ma¬ terial wyjsciowy zastosowano tu makulature. Pod¬ daje sie ja przez 60 minut obróbce wstepnej za po¬ moca 3,6% lugu sodowego w temperaturze 98i°C. Fer¬ mentacja trwa 54 godziny. Ze 100 kg makulatury pozwala to uzyskac 13,2—14,0 kg suchych drozdzy paszowych.Przyklad VI. Praca przebiega tak, jak to opi¬ sano w przykladzie V z ta róznica, ze dokonuje sie fermentacji bez napowietrzania, w warunkach bez¬ tlenowych. Po 60 godzinach fermentacji mozna ze 100 kg makulatury otrzymac alkohol w ilosci 13,6^ —14,0 1 (abs.).Przyklad VII. Postepowanie jest takie, jak to opisano w przykladzie I z t4a róznica, ze jako ma¬ terial wyjsciowy stosuje sie mieszanke z 75 czesci odpadów zniwnych trzciny cukrowej i 25 czesci ba- gasu (wytloków trzciny cukrowej). Obróbka wstep¬ na odbywa sie przez dzialanie 2,8% kwasem siarko¬ wym w temperaturze 96°C przez 150 minut. Fer¬ mentacja trwa 40—44 godziny. Ze 100 kg wymie¬ nionej mieszanki mozna wyprodukowac 18—19 kg suchych drozdzy paszowych.Przyklad VIII. Praca przebiega fak jak w przykladzie VII z ta róznica, ze przeprowadza sie fermentacje w warunkach beztlenowych, bez napo¬ wietrzania. Fermentacja trwa 50—56 godzin. Ze 100 kg materialu wyjsciowego mozna wyproduko¬ wac 22,0—2^6 1 absolutnego alokholu.Przyklad IX. Postepowanie jest takie, jak przedstawiono w przykladzie I, z tym, ze kulture napowietrza sie nadwyzka tlenowa 0,2 mg (VI.W takim przypadku ze 100 kg kenafu otrzymuje sie 10 15 25 30 35 40 45 9—10 kg suchych drozdzy paszowych i 8—10 1 ab¬ solutnego alkoholu etylowego.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania drozdzy paszowych i/lub alkoholu etylowego z odpadów pochodzenia roslin¬ nego rolniczego i/lub przemyslowego, znamienny tym, ze zawierajace celuloze odpady poddaje sie obróbce wstepnej za pomoca rozcienczonego kwasu mineralnego, o stezeniu 0,5—10% i/lub rozcienczo¬ nego lugu o stezeniu 0,5—10%, w temperaturze 80— —100°C, w ciagu 0,5—5 godzin, a nastepnie fermen¬ tacji w warunkach tlenowych lub beztlenowych za pomoca szczepu Candida utilis var. cellulolytica CU 28 001'99 (OKI),), w temperaturze 33—39°C. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie 0,5—4% kwas siarkowy i/lub 0,5—4,0% lug. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze obróbke wstepna prowadzi sie w temperaturze 90— —98°C. 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze obróbke wstepna prowadzi sie w ciagu 0,5—3i go¬ dzin. 5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze fermentacje prowadzi sie w temperaturze 3)5—37°C. 6. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze fermentacje prowadzi sie w sposób ciagly. 7. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze fermentacje prowadzi sie w sposób okresowy w cia-. gu 16r-72 godzin, korzystnie 16—50 godzin, w za¬ leznosci od materialu wyjsciowego. 8. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze przy wytwarzaniu drozdzy paszowych brzeczke fer¬ mentacyjna napowietrza sie tak, aby zawartosc wol¬ nego tlenu wynosila 1,0—0,4 mg (VI, korzystnie 1,5—2,5 mg CVI. 9. Siposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze przy wytwarzaniu alkoholu etylowego fermentacje przeprowadza sie w warunkach beztlenowych. 10. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze przy równoleglej produkcji drozdzy paszowych i al¬ koholu etylowego napowietrza sie brzeczke fermen¬ tacyjna tak, aby zawartosc wolnego tlenu wynosila 0—1 mg Oi/l.ZGK 1761/1131/5 — 80 egz.Cena 100 zl PL