Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania roztworu zawierajacego glukoze i fruktoze /izomeroze/ przez reakcje izomeryzacji zachodzaca w roztworze zawierajacym glukoze na kata¬ lizatorze o aktywnosci glukozo!zomerazy na nosniku SiOp.Znaczenie enzymatycznego przeksztalcania glukozy w mieszanine glukozy i fruktozy w ostat¬ nim czasie wzrasta. Mieszanina ta stosowana jest przewaznie w postaci syropu, zwanego izome- roza, i zastepuje przede wszystkim w przemysle srodków spozywczych i napojów brakujacy w swiecie coraz bardziej i coraz drozszy cukier krystaliczny /cukier trzcinowy, cukier bura¬ czany, sacharoza/ z trzciny cukrowej albo z buraków cukrowych. Jako zródlo glukozy potrzeb¬ nej do wytwarzania mieszaniny glukozy i fruktozy sluza naturalne zasoby ekrobii, np. skrobia kukurydziana albo ziemniaczana, które przez kwasna i/albo enzymatyczna hydrolize przeksztalca sie w glukoze.W celu enzymatycznego przeksztalcenia glukozy we fruktoze wodny roztwór glukozy, ewentu¬ alnie z dodatkiem substancji sprzyjajacych izomeryzacji /np. jony kobaltu* magnezu/ poddaje sie dzialaniu glukozoizomerazy az do osiagniecia zadanego stopnia izomeryzacji, oddziela sie potem ewentualnie dodatki od roztworu i zateza ewentualnie roztwór do konsystencji syropu.Dotychczas prowadzono proces enzymetycznego przeksztalcenia glukozy we fruktoze porcjami i stosowano albo glukozoizomeraze wyizolowana albo pozostawiona w naturalnym wiazaniu komór¬ kowym mikroorganizmu produkujacego glukozoizomeraze. Poniewaz tego rodzaju stosowana glukozo- izomeraza nie daje sie odzyskac wogóle albo tylko przy duzym nakladzie i nie mozna jej po¬ nownie stosowac, stosuje sie ostatnio coraz czesciej glukozoizomeraze przeprowadzona przez utrwalanie w wiazaniu komórkowym w etan nierozpuszczalny w wodzie i wzmocniona mechanicznie przez zastosowanie dodatków. Ponadto wyizolowana glukozoizomeraza moze byc zwiazana adsorp- cyjnie albo kowalencyjnie z nosnikami nieorganicznymi albo organicznymi. Tego rodzaju utrwa¬ lona i wzmocniona albo zwiazana na nosniku glukozoizomeraze mozna ponownie stosowac wielokrot¬ nie i mozna tym samym przejsc do procesów ciaglych, np. przez napelnienie reaktora glukozo¬ izomeraza zwiazana z nosnikiem i przepuszczanie roztworu glukozy /substratu/ przez reaktor.2 141 192 Potrzebna do takich procesów ciaglych zwiazana z nosnikiem glukozoizomeraza, zwana dalej katalizatorem albo katalizatorem na nosniku o aktywnosci glukozoizomerazy, znana jest ze stanu techniki. Jako przyklad mozna tutaj wymienic opis patentowy RFN nr 2 726 188, w którym opisano w szczególnosci wytworzony katalizator z aktywnoscia glukozoizomerazy na nosniku SiOp* Wedlug wynalazku sposób wytwarzania roztworu zawierajacego glukoze i fruktoze opiera sie na procesach dajacych sie przeprowadzic w sposób ciagly, w których roztwór glukozy /aubstrat/ przeplywa przez reaktor zawierajacy katalizator na nosniku z aktywnoscia glukozoizomerazy* Wynalazek opiera sie oprócz tego na nastepujacym rozpoznaniu: Zdolnosc konkurencyjna izomerazy w porównaniu z naturalna sacharoza oprócz ceny okresla glównie ilosc zawartej w niej fruktozy, poniewaz jest ona miarodajna dla mocy slodzacej. W przeciwienstwie do naturalnej sacharozy, dwucukru zlozonego z glukozy i fruktozy, w której glukoza i fruktoza wystepuja w stosunku molowym 1:1, zawartosc glukozy i fruktozy w izomerozie i tym samym jej moc slodzaca waha sie i w pierwszym rzedzie zalezna jest od czasu dzialania glukozoizomerazy na roztwór glukozy i od temperatury, w której nastepuje oddzialywanie. Osiagalna maksymalnie w tempera¬ turze 60°C równowaga, ustalajaca sie po wystarczajaco dlugim ozasie oddzialywania, lezy przy stopniu izomeryzacji wynoszacym okolo 51%, to znaczy ze 100 zastosowanych czasteozek glukozy 51 czasteczek ulega izomeryzacji do fruktozy* Rynek zaakceptowal obecnie izomeraze o zawar¬ tosci fruktozy wynoszacej 42% w suchej substancji* Poniewaz zawartosci glukozy w technicznych produktach wsadowych wynosza z reguly 90-95%, potrzebny jest w praktyce stopien izomeryzacji 44-47%, aby uzyskac te zawartosc fruktozy* W celu uzyskania tego rodzaju stopni izomeryzacji mozna stosowac katalizatory na nosniku 0 aktywnosci glukozoizomerazy tylko z calkiem okreslona predkoscia objetosciowa, zalezna od Ich kazdorazowej aktywnosci* Nowoozesne, wysokoakfywne katalizatory, jakie mozna wytwarzac np* sposobem wedlug opisu patentowego ROT nr 2 726 188, moga byc stosowane z poczatkowa pred¬ koscia objetosciowa wynoszaca okolo 10-20 v/vh /tj* 10-20 objetosci roztworu glukozy na 1 objetosc katalizatora w ciagu 1 godziny/* Ze wzrostem czasu eksploatacji maleje jednak ak¬ tywnosc znanych katalizatorów w zaleznosci od temperatury reakoji z wieksza albo mniejsza szybkoscia* Znany katalizator wedlug opisu patentowego ROT nr 2 726 188 po okolo 670 godzinach eksploatacji w temperaturze reakcji 60°C ma jeszcze 50% swej aktywnosci poczatkowej* W celu otrzymania tego samego stopnia izomeryzacjijak na poczatku mozna taki katalizator stosowac tylko jeszcze z polowa poczatkowej predkosci objetosciowej* 20% aktywnosci resztkowej, która nalezy uwazac za dolna granice oplacalnosci, osiaga sie po 1700 godzinach eksploatacji* Nieoczekiwanie stwierdzono, ze czas eksploatacji katalizatora o aktywnosci glukozoizomerazy na nosniku SiOp moze byc wiecej niz podwojony, jesli roztwór zawierajacy glukoze przed reak¬ cja na katalizatorze na nosniku doprowadza sie do zetkniecia z czastkami SiOp albo z krzemia¬ nem glinu* Stosunek wagowy katalizator: czastki SiOp zmienia sie na ogól miedzy 3:1 i 1:3, korzystnie 1:1* Przy tym sposobie postepowania podwaja sie równiez produktywnosc kataliza¬ tora* Produktywnosc jest zdefiniowana jako ilosc substratu, obliczona jako substancja sucha *Tkg Jt która moze byc przerobiona przy danym stopniu izomeryzacji za pomoca 1 kg kataliza¬ tora az do aktywnosci resztkowej wynoszacej 20% aktywnosci poczatkowej katalizatora* W urzadzeniu do ciaglego przeksztalcania glukozy we fruktoze, obok reaktora dla kataliza¬ tora na nosniku o aktywnosci glukoizomerazy wystepuja elementy takie jak: zasobniki, odbie¬ ralniki, przewody, pompy, przyrzady pomiarowe, urzadzenia wyrównujace temperature itp** Dla realizacji sposobu wedlug wynalazku do tego znanego urzadzenia podlaczona jest na poczat¬ ku kolumna wstepna, która sluzy do przyjecia czastek S102 albo glinokrzemianu* Objetosc ko¬ lumny wstepnej jest przy tym tak utrzymywana w stosunku do objetosci reaktora, ze przy uwzgle¬ dnieniu ciezaru nasypowego katalizatora i materialu kolumny wstepnej moga byc zapewnione wyzej wymienione stosunki wagowe*141 192 3 Wykonanie sposobu wedlug wynalazku w szczególnosci przy ciaglej metodzie, polega na tym, ze w wodnym roztworze glukozy, korzystnie o zawartosci okolo 40-50% wagowych suchej substan¬ cji, ustala sie wartosc pH odpowiednia dla zwiazanej na nosniku glukozoizomerazy, roztwór ogrzewa sie do odpowiedniej temperatury izomeryzacji i roztwór pompuje sie najpierw przez ko¬ lumne wstepna wypelniona czastkami Si02 albo krzemianem glinu i nastepnie przez reaktor wy¬ pelniony katalizatorem na nosniku SiOp o aktywnosci glukozoizomerazy* W odplywajacym roztwo¬ rze glukozy i fruktozy oznacza sie w regularnych odstepach zawartosc fruktozy, np. za pomoca analizy polarymetrycznej albo cieczowej chromatografii cisnieniowej /HPLC/.Predkosc objetosciowa, przy której eksploatuje sie katalizator, ustala sie przy tym tak, ze odplywajacy roztwór wykazuje zawartosc okolo 42% wagowych fruktozy, w odniesieniu do su¬ chej substancji* Dla materialu kolumny wstepnej szczególnie korzystna jest wielkosc ziarna okolo 0,5-5,0 mm, a dla katalizatora na nosniku wielkosci ziarna okolo 0,08-0,5 mm*- Jesli przy wytwarzaniu katalizatora na nosniku z aktywnoscia glukozoizomerazy stosuje sie glukozo- izomeraze Streptomyces albus, szczególnie korzystne jest ustalenie wartosci pH roztworu okolo 7,0-8,5 i ogrzewanie roztworu glukozy do temperatury okolo 55-65°C.Oprócz tego okazalo sie, ze w przypadku glukozoizomerazy Streptomyces albus dodanie jonów Co/II/ i Mg/II/ do roztworu glukozy w ilosci okolo 0,1-2 ppm Co/II/ i okolo 10-200 ppm Mg/II/, korzystnie w postaci ich soli jak np* chlorki albo siarczany, sprzyja izomeryzacji* Wreszcie korzystne jest jeszcze dodanie do roztworu glukozy stabilizujaca ilosc przeciwutleniacza, korzystnie S02 w ilosci okolo 100-600 ppm w postaci siarczynu albo wodórosiarczynu metalu alkalicznego* Zanim otrzymany roztwór glukozy i fruktozy zostanie zatezony do konsystencji syropu albo roztwór zostanie doprowadzony do jego ostatecznego zastosowania, godne zalecenia jest jeszcze usuniecie niepozadanych, np* pogarszajacych smak skladników jonowych za pomoca wymieniaczy kationów i anionów z roztworu glukozy i fruktozy.Przyklad I* Do reaktora wprowadza sie 5 g katalizatora na nosniku o aktywnosci glukozoizomerazy, wytworzonego wedlug opisu patentowego RFN nr 2 726 188 i z nizej opisanymi wlasciwosciami* Do reaktora podlaczona jest kolumna, która zawiera 5 g dostepnego w handlu w postaci kulek, wodoodpornego* porowatego krzemianu glinu /np* typ KGT-WS firmy Kali-Chemie AG, sklad okolo 31% wagowych Si02 i 3% wagowych AlgOy* Przez ten uklad kolumna wstepna - reaktor pompuje sie roztwór glukozy ogrzany do temperatury 60°C* Ustalenie predkosoi objetosciowej /w odniesieniu do branej pod uwage objetosci reaktora dla katalizatora/ przeprowadza sie tak, ze stopien izomeryzacji przez caly czas eksploatacji wynosi niezmiennie 46,5*. Stopien izome¬ ryzacji wyplywajacego roztworu substratu mierzy sie polarymetrycznie* W szczególnosci katalizator, wypelnienie kolumn wstepnych i proces ich scharakteryzowane przez naatepujace parametryi 1* Katalizator: nosnik - Si02s aktywnosc - 9000 U/g; wielkosc ziarna - 0,1-0,2 mm; ciezar nasypowy /w stanie suchym/ - 0,45 kg/l* 2* Wypelnienie kolumn wstepnych! material wypelniajacy - KCT-WS /Kali-Chemie AG/; wiel¬ kosc ziarna - 1-2 na; oiezar nasypowy /w stanie suchym/ - 0,70 kg/l* 3* Process substrat - 45% wagowyoh glukozy w roztworze wodnym; czynniki wspóldzialajaoe - 120 ppm Mg/II/, 1 ppm Co/II/, 200 ppm SOg /w postaoi Na2S0yi wartosc pU - 7,5; gestosc substratu - 1*2 kg/l; temperatura wejsolowa substratu - 60°C; stopien Izomeryzacji - 46,5%; poczatkowa predkosc objetosciowa - 13.0 h . 4* Oznaczenie aktywnosoi roztworu glukozoizomerazy* Aktywnosc roztworu glukozoizomerazy zastosowanego do sporzadzania katalizatora oznaoza sie wedlug metody Takasaki /por* Y* Taka- sakls Agr.Biol.Chem.Vol* 30, nr 12, 1247-1253. 1966 oraz Z* Disohe i E.Borenfreund: J.-Biol* Chem* 192, 583» 1951/* Jednostka aktywnosci /U/ jest zdefiniowana jako ilosc enzymu, która w nizej podanych warunkach inkubacji tworzy 1 mg fruktozy.4 141 192 Warunki inkubacji: ozaa reakcji - 1h, temperatura - 65°Cf substrat - 0,1 m glukozy x H20 /Merck 83^/ w 0,05 m buforu fosforanowego, pH 8,0 z 0,0004 m MgSO^.Przyklad daje nastepujace wyniki: Okres póltrwania - 1300 h, czas eksploatacji do aktyw¬ nosci resztkowej 20% - 3800 h, srednia aktywnosc w czasie eksploatacji w ciagu 3800 h - 44% /w odniesieniu do aktywnosci poczatkowej 100%/, produktywnosc po 3800 h - 26.000 kg suchej substancji z 46,3% fruktozy/kg katalizatora* Prz/klad II. W reaktorze umieszcza sie 5 g katalizatora na nosniku wedlug przy¬ kladu I* Do reaktora podlaczona jest kolumna, zawierajaca 10 g dostepnego w handlu w poataci Lulek, wodoodpornego, porowatego SiOp /np. typ AP 125 firmy Kali-Chemie AG, zawartosc SiOp powyzej 99% wagowych/* Dalszy sposób postepowania odpowiada przykladowi I* Wypelnienie kolumny wstepnej charakteryzuje sie nastepujacymi parametrami: material wypelniajacy - AP 125 /Kali- Chemie AG/, wielkosc ziarna - 1-2 mm, ciezar nasypowy /w stanie suchym/ - 0,45 kg/l* Wyniki doswiadozenia sa identyczne jak opisane w przykladzie I* Przyklad III* W celu porównania powtarza sie przyklad I z tym samym katalizato¬ rem, jednak bez kolumny wstepnej, ale poza tym w takich samych warunkach reakcji* Przyklad III daje nastepujace wyniki: okres póltrwania - 670 h, czas eksploatacji do reaktywnosci 20% - 1700 h, srednia aktywnosc w czasie eksploatacji w ciagu 1700 h - 47,2% /w odniesieniu do aktywnosci poczatkowej 100%/, produktywnosc po 1700 h - 12500 kg suchej substancji z 46,5% fruktozy/kg katalizatora* W celu uwidocznienia wyników uzyskanych w sposobach wedlug przykladów I, II i III przed¬ stawiono spadek aktywnosci w zaleznosci od czasu eksploatacji na fig* 1• Na wykresach krzywe x——--x dotycza przykladów I i II, krzywe o—-—o dotycza przykladu III. Na wykresie /fig* 1/ wyrazna jest stabilizacja aktywnosci katalizatora w ciagu dlugiego okresu eksploa¬ tacji, uzyskana przez zastosowanie wedlug wynalazku kolumny wstepnej wypelnionej perelkami krzemianu glinu albo Si02 /przyklady I, II/.Na fig* 2 przedstawiony jest stanowiacy o oplacalnosci sposobu, przebieg produktywnosci katalizatora w zaleznosci od czasu eksploatacji* Oznaczenie /kg T§7 dotyczy produktywnosci wyrazonej w kg suchej substancji na kg katalizatora* W przykladach I i II, przeprowadzonych w warunkach sposobu wedlug wynalazku, zwieksza sie ekonomicznie uzyteczna, specyficzna wydaj¬ nosc katalizatora o czynnik 2*08, to znaczy do wytworzenia okreslonej ilosci izomerozy po¬ trzebna jest juz tylko mniej niz polowa ilosci katalizatora* Poniewaz koszt potrzebnego wedlug wynalazku materialu kolumn wstepnych stanowi tylko ulamek kosztów katalizatora, eko¬ nomiczna zaleta sposobu wedlug wynalazku jest znaczna* Zastrzezenia patentowe 1* Sposób wytwarzania roztworu zawierajacego glukoze i fruktoze przez reakcje izomeryza¬ cji w roztworze zawierajacym glukoze na katalizatorze o aktywnosci glukozo!zomerazy na nos¬ niku Si02, znamienny tym, ze roztwór zawierajacy glukoze przed reakcja na katali¬ zatorze na nosniku kontaktuje sie z czastkami Si02 albo krzemianu glinu* 2* Sposób wedlug zastrz* 1, znamienny tym, ze stosuje sie katalizator o aktyw¬ nosci glukoizomerazy na nosniku Si02 oraz czastki Si02 albo krzemianu glinu w stosunku wago¬ wym 3:1 do 1:3, korzystnie 1:1*141 192 Beispiele 1und 2 Beispiel 3 Aktivitdt [% 100 50 H 1000 2000 3000 o:o 30000 Produkt i vitdt [kg TS/kg Katalysator] 25000 20 000 15000 10000 5000 Beispiele 1 und 2 Beispiel 3 FIG.2 Betriebs:** h! 1000 2000 3000 PL PL