Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych pochodnych cyklicznych peptydów A-21978C, majacych wlasciwosci antybiotyczne.Cykliczne peptydy A-21978C sa pokrewnymi antybiotykami, opisanymi w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 208 403. Jak podano w tym opisie, kompleks antybiotyczny A-21978 zawiera Jako glówny skladnik czynnik C, który sam jest z kolei kompleksem pokrewnych - czynników. Czynnik C kompleksu A-21978, zwany kompleksem A-21978C, zawiera poszczególne czyn¬ niki CQ, C1, C2, C-z, C^ i Cr. Glównymi czynnikami sa C|, C2 i C,, natomiast Cq, C^ i Cc sa czynnikami pomniejszymi. Budowe czynników A-21978C przedstawia ogólny wzór 2, w którym 3MS oznacza ugrupowanie kwasu L-treo-3-mety loglutarninowego, a R oznacza specyficzne ugrupowanie kwasu tluszczowego.N R w czynnikach C-j, C2t C,, CQ, C^ i Cc oznacza odpowiednio grupe 8-metylokaprynoilo- wa, 10-metyloundekanoilowa, 10-metylolauroilowa, C.Q-alkanoilowa, C12-alkanoilowa i C12-alka- noilowa, przy czym te trzy ostatnie grupy nie zostaly jeszcze zidentyfikowane. Skróty Ala, Asn, Asp, Gly, Kyn, Om, Ser, Thr i Trp sa znane i oznaczaja odpowiednio ugrupowania alaniny, asparaginy, kwasu asparaginowego, glicyny, kynureniny, ornityny, seryny, treoniny i tryptofanu.Ze wzgledu na mozliwosc i stala grozbe powstawania szczepów chorobotwórczych drobno¬ ustrojów opornych na poszczególne antybiotyki ciagle istnieje potrzeba poszukiwania nowych antybiotyków. W szczególnoici, chorobotwórcze szczepy Gram-dodatnie Staphylococcus i Steepto- coccus sa czesto oporne na zwykle stosowane antybiotyki, takie jak penicylina i erytromycyna, o czym np. pisze W.O. Foye w "Principles of Medicinal Chemistry", str. 684-686 (1976).Obecnie stwierdzono, ze nowe pochodne cyklicznych peptydów A-21978C o wzorze 1 oraz ich farmakologicznie dopuszczalne sole sa skutecznymi srodkami antybiotycznymi.2 142 112 . Sposobem wedlug wynalazku wytwarza sie nowe pochodne cyklicznych peptydów A-21978C o ogólnym wzorze 1, w którym R, R i R sa Jednakowe lub rózne i oznaczaja atom wodoru, ewentualnie podstawiona grupe C2-C^-alkanoilowa, grupe Cc-C ^-alkenoilowa lub grupe za¬ bezpieczajaca grupe aminowa, taka jak grupa Hl-rz.-butoksykarbonylowa lub benzyloksykar- bonylowa, a R , R i R oznaczaja atomy wodoru, przy czym (1) co najmniej jeden z podstaw- 1 2 ników R, R lub R ma znaczenie inne niz atom wodoru lub grupa zabezpieczajaca grupe ami- 12 nowa (2) co najmniej jeden z podstawników R i R oznacza atom wodoru lub grupe zabezpie¬ czajaca grupe aminowa, (3) grupy R, R i R razem zawieraja co najmniej cztery atomy wegla i (4) gdy R i R oznaczaja atom wodoru lub grupe zabezpieczajaca grupe aminowa, wówczas R ma znaczenie inne niz grupa 8-metylokaprynoilowa, 10-metyloundekanoilowa, 10-metylolauro- llowa, grupa C.0-alkanoilowa, czynnika CQ peptydu A-21978C lub grupy C^-alkanoilowe czyn¬ ników C. i Cc peptydu A-21978C, oraz farmakologicznie dopuszczalne sole tych zwiazków.Zwiazki te sa uzytecznymi pólsyntetycznymi srodkami przeciwbakteryjnymi lub pólproduktami do wytwarzania takich srodków* Okreslenie "ewentualnie podstawiona grupa C2-C^-alkanoilowa" i "grupa Cc-Cjg-alke- noilowa" dotycza grup acylowych pochodzacych z kwasów karboksylowych o odpowiednio 2-19 i 5-19 atomach wegla• Gdy R oznacza grupe alkanoilowa, to stanowiacy jej czesc rodnik alki¬ lowy Jest jednowartosciowym, nasyconym, prostym lub rozgalezionym rodnikiem weglowodoro¬ wym, ewentualnie podstawionym jedna grupa hydroksylowa, karboksylowa lub C^-C^-alkoksy- lowa albo 1-3 atomami chlorowca, to znaczy chloru, bromu i fluoru. Gdy R oznacza grupe alkenoilowa, to rodnik alkenyIowy Jest jednowartosciowym, nienasyconym, prostym lub roz¬ galezionym rodnikiem weglowodorowym zawierajacym nie wiecej niz trzy wiazania podwójne.Fragment lub fragmenty z podwójnym wiazaniem nienasyconego lancucha weglowodorowego moga miec konfiguracje cis lub trans.Do korzystnych podgrup zwiazków o wzorze 1 naleza: (a) zwiazki, w których R oznacza grupe alkanoilowa o wzorze CHt/CH2/ -£0-, w którym n oznacza liczbe calkowita 3-17, (b) zwiazki, w których R oznacza grupe alkanoilowa o wzorze CH-r/CH2/n-C0-, w którym n oznacza liczbe calkowita 5-14, (c) zwiazki, w których R oznacza grupe alkanoilowa o wzorze CH3/CH2/nCT/CH,//CH2/m-CO-, w którym nim niezaleznie oznaczaja liczbe calkowita 0-14, z tym, ze suma nim nie moze byc mniejsza niz 1 ani wieksza niz 15, oraz z tym, ze gdy n oznacza 0, wówczas m nie moze oznaczac 8 oraz, gdy n oznacza 1, wówczas n nie moze oznaczac 6 lub 8, (d) zwiazki, w którym R oznacza grupe cis- lub trans- alkenoilowa o wzorze CH,/CH2/nCH» CH/CH2/m-C0-t w którym nim niezaleznie oznaczaja liczbe calkowita 0-14, z tym, ze suma min mie moze byc mniejsza niz 1 ani nie wieksza niz 15, (e) zwiazki, w których R oznacza grupe cis- lub trans- alkenoilowa o wzorze CH2«CH/CH2/n- C0-, w którym n oznacza liczbe calkowita 4-15, (f) zwiazki, w których R oznacza grupy o wzorach: CH3/CH2/e-C0-, CH-j/CH^-CO-, CH,/CH2/7- -C0-, CH5/CH2/8-C0-, CH3/CH2/9-C0-f CH^/CH 2/l0-C0~» CH2*CH-/CH2/Q-C0-, CH^/C^/^-CO-, CH3/CH2/12-C0-f CH3-/CH2/3-CH»CH-/CH2/7-C0-, CH3/CH2/13-C0-, CH3CH2CH/CH3/-/CH2/6-CO-.Zwiazki o wzorze 1 sa zdolne do tworzenia soli i sposób wytwarzania soli równiez objety Jest zakresem wynalazku. Takie sole sa przydatne np. do wyodrebnienia i oczyszcza¬ nia zwiazków. Szczególnie uzyteczne sa farmakologicznie dopuszczalne sole z metalami alkalicznymi, sole z metalami ziem alkalicznych, sole z aminami i sole addycyjne z kwasami.Zwiazki o wzorze 1 maja wolne cztery grupy karboksylowe mogace tworzyc sól. Tak wiec zakresem wynalazku objety Jest sposób wytwarzania czesciowych, mieszanych i calko¬ witych soli tych grup karboksylowych. Podczas wytwarzania tych soli nalezy unikac pH wyzszego niz 10 ze wzgledu na nietrwalosc zwiazków w tym zakresie.Do reprezentatywnych i odpowiednich soli zwiazków o wzorze 1 z metalami alkalicznymi i metalami ziem alkalicznych naleza sól sodowa, potasowa, litowa, cezowa, rubidowa, barowa, wapniowa i magnezowa. Odpowiednimi solami amoniowymi zwiazków o wzorze 1 sa sól amoniowa oraz142 112 3 pierwazorzedowe, drugorzedowe i trzeciorzedowe sole Cj-C^-alkiloamonlowe i hydroksy-C2-c4~ -alkiloamoniowe. Przykladowymi solami amoniowymi sa sole wytwarzane w reakcji zwiazku o wzorze 1 z wodorotlenkiem amonowym, metyloamina, II-rz,-butyloamina, izopropyloamina, dwuetyloamina9 dwu- lzopropyloamina 9 cykloheksyloamina, etanoloamina, trójetyloamina lub 3-amino-1-propanolem.Zwiazki o wzorze 1 maja takze wolne grupy aminowe i moga tworzyc sole addycyjne z kwa¬ sami. Sposób wytwarzania tych soli objety jest zakresem wynalazku* Do reprezentatywnych i odpowiednich soli addycyjnych naleza sole kwasów organicznych i nieorganicznych, takich jak np. kwas solny, siarkowy, fosforowy, octowy, bursztynowy, cytrynowy, mlekowy, maleino¬ wy, fumarowy, palmitynowy, cholowy, embonowy, sluzowy, D-glutaminowy, d-kamforowy, glutarowy, glikolowy, ftalowy, winowy, laurynowy, stearynowy, salicylowy, metanosulfonowy, benzenósulfonowy, sorbowy, pikrynowy, benzoesowy lub cynamonowy.Zgodny z wynalazkiem sposób wytwarzania nowych pochodnych cyklicznych peptydów A-21978C o ogólnym wzorze 1 oraz ich farmakologicznie dopuszczalnych soli polega na tym, ze rdzen cyklicznego peptydu o ogólnym wzorze 3, w którym R' i R° sa jednakowe lub rózne i oznaczaja atom wodoru lub grupe zabezpieczajaca grupe aminowa, majaca wyzej podane znaczenie, wzglednie jego pochodna zabezpieczona takimi grupami jak grupa Ill-rz.-bu- toksykarbonylowa lub benzyloksykarbonylowa, ewentualnie w postaci farmakologicznie do¬ puszczalnej soli, poddaje sie reakcji ze srodkiem acylujacya o wzorze R -COOH, w którym R oznacza ewentualnie podstawiona grupe C1-C1Q-alkilowa lub C^-C^-alkenyIowa, wzgled¬ nie z jego aktywnym estrem, bezwodnikiem lub halogenkiem kwasowym, po czym ewentualnie usuwa sie grupe lub grupy zabezpieczajace ewentualnie obecne w produkcie i powstaly zwiazek ewentualnie przeprowadza sie w sól. 1 2 Zwiazki o wzorze 1, w którym R, R lub R oznaczaja grupe alkanoilowa, alkenoilo- wa lub grupe zabezpieczajaca grupe aminowa, wytwarza sie droga acylowania czynnika A-21978C, zabezpieczonego czynnika A-21978C, zwiazku o wzorze 3 lub odpowiedniego zwiaz¬ ku o wzorze 3 zawierajacego grupe dC -aminowa tryptofanu zablokowana zadanym alkanoilowym lub alkenoilowym lancuchem bocznym. Stosuje sie tu typowe metody tworzenia wiazania amidowego. Acylowanie prowadzi sie na ogól poddajac wybrany zwiazek reakcji z aktywna pochodna kwasu alkanokarboksylowego odpowiadajacego zadanej grupie acylowej (R, R lub R ). Okreslenie "aktywna pochodna" oznacza pochodna nadajaca grupie karboksylowej srodka acylujacego reaktywnosc wystarczajaca do sprzegniecia z pierwszorzedowa grupa aminowa i utworzenia wiazania amidowego, w wyniku czego acylowy lancuch boczny zostaje przylaczony do rdzenia. Odpowiednie aktywne pochodne, sposoby ich otrzymywania oraz zastosowanie jako srodków acylujacych aminy pierws-orzedowe sa dobrze znane. Korzys¬ tnymi aktywnymi pochodnymi sa halogenki kwasowe, np. chlorki kwasowe, bezwodniki kwaso¬ we, np. bezwodniki kwasu alkoksymrówkowego, lub estry aktywnew np. ester 2,4,5-trój- chlorofenylowy. Inna metoda aktywowania grupy karboksylowej jest reakcja kwasu karbo- ksylowego z karbonylodwuimidem, np. N,N'-dwucykloheksylokarbodwuimidem lub N,N'-dwu- izopropylokarbodwuimidem, w celu otrzymania aktywnego zwiazku przejsciowego, który ze wzgledu na nietrwalosc nie jest wyodrebniany. Reakcje z pierwszorzedowa amina pro¬ wadzi sie w takim przypadku in situ.Zwiazki o wzorze 1 wytwarza sie droga selektywnego acylowania przy zastosowaniu grup zabezpieczajacych grupy aminowe. Np., gdy zwiazkiem wyjsciowym jest zwiazek o wzorze 3, w którym R' i R oznaczaja atomy wodoru, acylowaniu ulegaja zarówno©£ -ami¬ nowa grupa tryptofanu jak i /l -aminowa grupa ornityny i powstaja pochodne NT , N0 -dwiiacylowe. W celu otrzymania pochodnych jednoacylowanych przy grupie ©C -aminowej tryptofanu korzystne jest acylowanie zwiazku o wzorze 3, w którym grupa ornityny (pozycja R°) jest zablokowana grupa zabezpieczajaca. Takie zwiazki wyjsciowe korzystnie otrzymuje sie blokujac przed acylowaniem czynnik A-21978C w tej pozycji.Aromatyczna grupa aminowakynureniny jest najmniej reaktywna ze wszystkich trzech wolnych grup aminowych w rdzeniu A-21978C. Przy acylowaniu kunereniny odpowiednio blokuje sie grupy aminowe tryptofanu i ornityny, natomiast przy acylowaniu w pozycji R° i Rx zwykle nie blokuje sie aminowej grupy kynureniny.4 142 112 Schematy 1, 2 i 3 ilustruja ogólny sposób wytwarzania zwiazków o wzorze 1, w którym 1 2 ieden z podstawników R, R lub R oznacza grupe alkanoilowa, alkenoilowa lub grupe za¬ bezpieczajaca grupe aminowa. Na tych schematach x oznacza reszte czasteczki A-21978C, Nm oznacza srupe =C -aminowa tryotofanu, Nn oznacza grupe tT -aminowa ornityny; Nv oznacza T w * *-m p aromatyczna grupe aminowa kynureniny, R, R , R oznaczaja podstawniki zdefiniowane po¬ wyzej, Rm oznacza grupe acylowa naturalnego czynnika, a B, B oznaczaja grupy zabez¬ pieczajace grupy aminowe. Korzystnie wytwarza sie NT -n-kaprynoilowa pochodna zwiazku o wzorze 1, w reakcji kwasu n-kaprynowego lub jego estru, bezwodnika lub halogenku z NQ -Ill-rzed.-butoksykarbonylopochodna rdzenia o wzorze 3 w którym R =H a R°«t-BOC.Na schemacie 1 pochodne NT -jednoacylowe A-21978C przedstawia ogólny wzór 3', a pochodne NT » NQ -dwuacylowe A-21978C przedstawia ogólny wzór 4'. Pochodne NT , Nn -dwuacylowe, w których grupa N„ -acylowa jest taka jak w naturalnym czynniku A-21978C, przedstawia ogólny wzór 8, Na schemacie 2 pochodne NT , N„ -dwuacylowe A-21978C przedstawia ogólny wzór 10.Pochodne te sa otrzymywane ze zwiazków o wzorze 9. Pochodne NL_f NR -dwuacylowe, w któ¬ rych grupa Nm -acylowa jest taka jak w naturalnym czynniku A-21978C, przedstawia ogól¬ ny wzór 12. Zwiazki te otrzymuje sie po usunieciu grupy zabezpieczajacej ze zwiazku o ogólnym wzorze 11. Zwiazki o wzorach ogólnych 5, 6 i 7 sa takze przedstawione na schemacie 1.Na schemacie 3 pochodne NQ -jednoacylowe A-21978C przedstawia ogólny wzór 18, pochodne NR -jednoacylowe A-21978C przedstawia ogólny wzór 15, a pochodne N0rn» N£vn" dwuacylowe A-21978C przedstawia ogólny wzór 20. Zwiazki o wzorze 20 wytwarza sie ze zwiazków o wzorze 19, otrzymanych ze zwiazku o wzorze 6, poprzez zwiazki o wzorach 13, 16 i 17. Zwiazki o wzorze 15 wytwarza sie ze zwiazku o wzorze 6 poprzez zwiazek o wzo¬ rze 1^. Zwiazki o ogólnym wzorze 6 sa takze pokazane na schematach 1 i 2. 1 2 Zwiazki o wzorze 1, w którym jeden z podstawników R, R i R oznacza grupe alka¬ noilowa lub alkenoilowa, korzystnie wytwarza sie stosujac ester aktywny. Szczególnie korzystnym zwiazkiem wyjsciowym jest zwiazek o wzorze 3, w którym R'»H i R°»t-BOC, to znaczy rdzen N0rn-t-B0C A-219?8C (rdzen tBOC). Skrót t-BOC oznacza grupe Ill-rz.-bu- toksykarbonylowa. Korzystnym srodkiem acylujacym jest ester 2,4,5-trójchlorofenylowy zadanego kwasu alkanokarboksylowego lub alkenokarboksylowego. Zgodnie z tym wariantem sposobu, nadmiar estru aktywnego poddaje sie reakcji z rdzeniem t-BOC w temperaturze pokojowej, w obojetnym rozpuszczalniku organicznym, takim jak dwumetylo formamid, tetra- hydrofuran, eter etylowy lub chlorek metylenu, Czas reakcji nie jest istotny, ale ko¬ rzystnie jest prowadzic reakcje w ciagu okolo 6-20 godzin. Po zakonczeniu reakcji usuwa sie rozpuszczalnik i oczyszcza pozostalosc. Szczególnie korzystna metoda oczyszczania jest cieczowa chromatografia cisnieniowa (HPLC) z odwróconymi fazami, z zastosowaniem LP-1/C^o jako fazy stacjonarnej i mieszaniny wody, metanolu, acetonitrylu, pirydyny i kwasu octowego jako ukladu rozpuszczalników. Grupe t-BOC usuwa sie w reakcji z kwasem trójfluorooctowym, anizolem i trójetylosilanem lub korzystnie z kwasem trójfluoroocto- wym i 1,2-etanodwutiolem, prowadzonej w temperaturze pokojowej w ciagu okolo 3-5 minut.Po usunieciu rozpuszczalnika pozostalosc oczyszcza sie stosujac HPLC z odwróconymi fazami.Acylowanie mozna takze prowadzic stosujac zmodyfikowana metode Schotten-Baumanna, zgodnie z która niezabezpieczony rdzen poddaje sie reakcji z chlorkiem kwasowym zada¬ nego kwasu alkanokarboksylowego lub alkenokarboksylowego w mieszaninie pirydyny i wody.Nadmiar chlorku kwasowego w obojetnym rozpuszczalniku organicznym, takim jak aceton, dodaje sie powoli do roztworu rdzenia w mieszaninie pirydyny i wody (90:10). Nieprze- reagowany chlorek kwasowy wyodrebnia sie z produktu reakcji droga ekstrakcji niemie- szajacym sie rozpuszczalnikiem organicznym, np. eterem etylowym. Produkt oczyszcza sie tak jak powyzej opisano, metoda HPLC z odwróconymi fazami.Sole zwiazków o wzorze 1 wytwarza sie w znany sposób.142 112 5 Sole metali alkalicznych i metali ziem alkalicznych zwiazków o wzorze 1 wytwarza sie zgodnie z metodami zwykle stosowanymi dla otrzymywania soli kationowych* Np. wolny kwas o wzorze 1 rozpuszcza sie w odpowiednia rozpuszczalniku, takia jak cieply metanol lub etanol, i nastepnie dodaje sie roztwór stechiometrycznej ilosci zadanej zasady nieorganicznej w wodnym roztworze metanolu. Powstala sól mozna wyodrebniac rutynowymi metodami, takimi jak saczenie lub odparowanie rozpuszczalnika. Dobra metoda wytwarzania soli jest zastosowanie zywic jonowymiennych.W podobny sposób mozna wytwarzac sole z organicznymi aminami. Np. gazowa lub ciekla amine mozna dodawac do roztworu zwiazku o wzorze 1 w odpowiednim rozpuszczalniku, takim jak etanol, a nastepnie odparowywac rozpuszczalnik i nadmiar aminy.Sole addycyjne zwiazków o wzorze 1 z kwasami wytwarza sie w typowej reakcji z odpo¬ wiednimi kwasami organicznymi lub nieorganicznymi.Cykliczne peptydy o wzorze 3, stosowane jako zwiazki wyjsciowe w sposobie wedlug wy¬ nalazku wytwarza sie na drodze biochemicznej. Sposobem podanym w opisie Stanów Zjednoczo¬ nych Ameryki nr 4 208 4039 wytwarza sie kompleks antybiotyczny, który nastepnie dezacylu¬ je sie.Jest rzecza wyjatkowo trudna stwierdzenie czy istnieje enzym, który moze byc uzyty do dezacylowania antybiotyku peptydowego. Znalezienie takiego enzymu jest jeszcze trud¬ niejsze, gdy antybiotyk zawiera w swojej strukturze cykliczny peptyd. Poniewaz enzymy wy¬ kazuja wysoki stopien specyficznosci, róznice w ugrupowaniu peptydowym i w lancuchu bocz¬ nym substratu wplywaja na rezultat dezacylowania. Ponadto wiele drobnoustrojów wytwarza duza ilosc peptydaz, które atakuja rózne miejsca ugrupowania peptydowego. Prowadzi to czesto do mieszaniny produktów.Enzym stosowany do dezacylowania w grupie ©c -aminowej tryptofanu ugrupowania kwasu tluszczowego, stanowiacego lancuch boczny, moze byc produkowany przez drobnoustrój z rodziny Actinoplacaceae, korzystnie przez drobnoustrój Actinoplanes utahensis NRR1 12052 lub jego wariant.Dla przeprowadzenia dezacylowania do hodowli drobnoustroju dodaje sie dowolny antybiotyk wybrany z grupy obejmujacej kompleks A-21978C, A-21978C czynnik CQ, C^t C2, C,, C^ lub Cc, zabezpieczony kompleks A-21978C oraz zabezpieczone czynniki CQ, C.f C2, C,, C, lub Cc kompleksu A-21978C, Okreslenia "zabezpieczone czynniki A-21978C" i "aabezpieczony kompleks A-21978C" dotycza indywidualnych czynników A-21978C lub mieszanin czynników (kompleksu), w mtórych grupa aminowa omityny i/lub kynureniny jest zabezpieczona. Ko¬ rzystnie, grupa zabezpieczajaca znajduje sie przy grupie ó~ -aminowej ornityny w indy¬ widualnym czynniku lub mieszaninie czynników. Hodowle inkubuje sie z substratem az do praktycznie calkowitej dezacylacji. Otrzymany odpowiedni cykliczny peptyd A-21978C wydziela sie z brzeczki fermentacyjnej stosujac znane metody.W procesie powyzszej enzymatycznej dezacylacji otrzymuje sie cykliczne peptydy o wzorze 3, w którym R' i R niezaleznie oznaczaja atom wodoru lub grupe zabezpiecza¬ jaca grupe aminowa, oraz sole tych peptydów.Po odszczepieniu grupy acylowej z kompleksu A-21978C lub indywidualnych czynni¬ ków Cq, Cj, C2, C,, C^ i Cc otrzymuje sie zwiazek o wzorze 3, w którym R' i R° oznacza¬ ja atomy wodoru. Odacylowana czasteczka jest cyklicznym peptydem wspólnym dla kazdego z czynników w antybiotyku A-21978C. Dla uproszczenia zwiazek ten okresla sie jako rdzen C-21978C. Jest to zwiazek o wzorze 4, w którym 3MG oznacza ugrupowanie kwasu L-treo-3-metyloglutarninowego.Zwiazki o wzorze 3, w którym podstawniki R' lub R° sa inne niz atom wodoru, wy¬ twarza sie droga dezacylacji odpowiednich zabezpieczonych czynników CQ, C^, C2, C,, C^ i Cc antybiotyku A-21978C. Dla uproszczeniaj powyzsze zwiazki okresla sie jako za¬ bezpieczony rdzen A-21978C. Takie zabezpieczone zwiazki sa uzytecznymi pólproduktami do otrzymywania róznych peptydów o wzorze 1, to jest tych zwiazków, w których co najmniej 12 jeden z podstawników R i R oznacza grupe zabezpieczajaca grupe aminowa.6 142 112 Dla fachowców jest oczywiste, ze rdzen A-21978C oraz zabezpieczony rdzen A-21978C mozna otrzymywac zarówno w postaci wolnych amin jak i soli addycyjnych z kwasami. Cho¬ ciaz mozna stosowac dowolne odpowiednie sole addycyjne, to korzystne sa sole farmakolo¬ gicznie dopuszczalne, czyli takie, które sa uzyteczne w chemioterapii ludzi i zwierzat cieplokrwistych.Sposób wytwarzania rdzenia A-21978C o wzorze 3 przy uzyciu róznych drobnoustrojów Jest obszernie opisany w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 482 487.Korzystny enzym deacylujacy-A. utahensis NRRL 12052- jest dostepny w Agricultural Research Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, U.S. Department of Agricul- ture, 1815 North University St., Peoria, Illinois 61604, U.5.A., gdzie jest zarejestrowany pod numerem NRRL 12052. W przykladzie I niniejszego opisu zilustrowano wytwarzanie rdzenia A-21978C w procesie fermentacji z zastosowaniem jako substratu kompleksu A-21978C oraz Actinoplanes utahensis NRRL 12052 jako drobnoustroju. Do wytwarzania rdzenia A-21978C o wzorze 3 mozna tez stosowac inne drobnoustroje Actinoplanaceae dostepne w Northern Regio- nal Research Laboratory, takie jak Actinoplanes utahensis (NRRL 12052), Actinoplanes missouriensis (NRRL 12053), Actinoplanes sp. (NRRL 8122), Actinoplanes sp. (NRRL 12065) i Streptosporangium roseum var. hollandensis (NRRL 12064).Przydatnosc danego szczepu drobnoustroju z rodziny Actinoplanaceae do dezacylac.ii oznacza sie w nastepujacy sposób. Odpowiednia pozywke wzrostowa zaszczepia sie drobnoustro¬ jem i inkubuje w temperaturze okolo 28°C w ciagu 2 lub 3 dni na trzesawce obrotowej. Na¬ stepnie dodaje sie do hodowli odpowiedni antybiotyk jako substrat i utrzymuje wartosc pH pozywki fermentacyjnej na poziomie okolo 6,5. Podczas fermentacji oznacza sie aktywnosc stosujac do tego celu drobnoustrój Micrococcus luteus. Zanik aktywnosci antybiotycznej wskazuje, ze drobnoustrój wytwarza pozadany enzym dezacylacyjny. Nalezy to jednak weryfi¬ kowac za pomoca jednej z nastepujacych metod: (1) analiza za pomoca HPLC na obecnosc nie¬ naruszonego rdzenia, lub (2) powtórna acylacja odpowiednim lancuchem bocznym, np. lauro- ilowym, n-kaprynoilowym lub n-dodekanoilowym, w celu przywrócenia aktywnosci.Stosowane jako zwiazki wyjsciowe w reakcji acylowania kwasy alkanokarboksylowe i alkenokarboksylowe oraz ich pochodne, w szczególnosci chlorki kwasowe i estry 2,4,5-trój- chloro fenylowe, sa znanymi zwiazkami lub mozna je otrzymywac znanymi sposobami ze znanych zwiazków. Estry 2,4,5-trójchlorofenylowe otrzymuje sie w reakcji chlorku kwasowego kwasu alkano- lub alkenokarboksylowego z 2,4,5-"trójchloro fenolem w obecnosci pirydyny, lub w reakcji wolnego kwasu alkano- lub alkenokarboksylowego z 2,4,5-trójchlorofenolem w obec¬ nosci jako srodka sprzegajacego N,N'-dwucykloheksylokarbodwuimidu. Ester 2,4,5-trójchlo- rofenylowy mozna nastepnie oczyszczac za pomoca chromatografii kolumnowej na zelu krzemionkowym.Cykliczne peptydy A-21978C wytwarzane sposobem wedlug wynalazku mozna podawac jako srodki przeciwbakteryjne doustnie lub pozajelitowo. Zwiazek A-21978C podaje sie razem z farmakologicznie dopuszczalnym nosnikiem lub rozcienczalnikiem. Wielkosc dawki A-21978C zalezy od wielu czynników, takich jak rodzaj i nasilenie zwalczanej infekcji. Odpowied¬ nie wielkosci dawek lub dawki jednostkowe mozna okreslic na Dodstawie wartosci MIC i EDC~ oraz toksycznosci, z uwzglednieniem innych czynników takich jak dane farmakokinetyczne, charakterystyka pacjenta i zakazajacego drobnoustroju.Aktywnosc prze ciwbakteryjna zwiazków o wzorze 1 mozna oznaczac in vitro. Wynik ba¬ dan aktywnosci przeciwbakteryjnej reprezentatywnych zwiazków o wzorze 1, otrzymane po przeprowadzeniu standardowych testów dyfuzyjnych przy uzyciu krazków i plytek agarowych, zestawiono w tablicy 1. W tablicy 1 aktywnosc podano jako srednice w mm strefy, w której testowany zwiazek hamowal wzrost drobnoustroju.Badane zwiazki dyspergowano w wodzie w stezeniu 1 mg/ml, w zawiesinie zanurzano krazek o srednicy 7 mm, umieszczano go na powierzchni agaru i prowadzono inkubacje w cia¬ gu 24-48 godzin w temperaturze 25-37°C. Drobnoustrój B.subtilis hodowano na minimalnie odzywczym agarze. Kreska, podobnie jak w tablicach 2a i 3 oznacza, ze próby z danym zwiazkiem i danym drobnoustrojem nie przeprowadzono. Skrót Obz oznacea grupe benzylo- ksykarbony Iowa.142 112 Wyniki badan aktywnosci przeciwbakteryjnej reprezentatywnych zwiazków o wzorze 1, otrzymane po przeprowadzeniu standardowych testów rozcienczeniowyeh na agarze, zestawiono w tablicach 2 i 2a. W tablicach tych aktywnosc antybiotyczna przedstawiono jak minimalne stezenie inhibitujace (MIC), to znaczy najnizsze stezenie zwiazku, przy którym zachodzi hamowanie wzrostu drobnoustroju. Wartosci dla zwiazków nr 1-11 podano w tablicy 2, a war¬ tosci dla zwiazków nr 12-21 podano w tablicy 2a.Cykliczne peptydy A-21978C o wzorze 1 wykazuja in vivo aktywnosc przeciw drobno¬ ustrojom w doswiadczalnych infekcjach bakteryjnych. Dwie dawki badanego zwiazku podawano podskórnie lub doustnie zarazonym doswiadczalnie myszom i aktywnosc oznaczano jako war¬ tosc EDc.q» czyli wielkosc skutecznej dawki w mg/kg, chroniacej 50* testowanych zwierzat /patrz Warren Wiek i wsp., J. Bacteriol., 81, 233-235 (1961)7 •Wartosci ED5Q dla repre¬ zentatywnych zwiazków A-21978C o wzorze 1 przedstawiono w tablicy 3.Wyniki badan toksycznosci niektórych cyklicznych peptydów o wzorze 1, otrzymane po przeprowadzeniu testów na myszach, którym podawano dozylnie badane zwiazki, przedstawiono w tablicy 4.Numery zwiazków w tablicach 1-4 odpowiadaja numerom zwiazków w tablicach a, 8 i 10.T a b 1 i c a 1 Zwiazek R R1 R2 Wielkosc strefy hamowania (mm) Staphylo- Bacillus Microco- B.subti- coceus substilis ccus lu- lis aureus ATCC teus ATCC ATCC 6633 ATCC 6633 6738P 9341 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 CH3/CH2/5CO- CH3/CH2/6CO- CH3/CH277CO- CH3/CH2/8C0- CH3/CH2/9C0- CH3/CH2/1QCO- CH3/CH2/11C0- CH3/CH2/12C0- CH3/CH2/13CO- CH3/CH2/14C0- CH2«CH-/CH2/8C0- CH3/CH2/3CH=CH/CH; ..... ,/tCO CH3CH2CH=CHCH2CH=CH- CH2CH=CH/CH2/yCO- CH3CH2CH/CH3/- /CH2/6C0- xi ac i a: ioi i ! i: 1 ! H H H H H H H H - H H H H H H H H H H H H H H H H CH3C0- 17 23 20 24 19 25 21 22 20 19 21 22 15 21 15 18 "~16 20 19 , \ 20 17 21 19 17 17 19 13 18 21 13 18 22 21 19 19 21 19 17 20 20 20 20 16 20 "~27 29 21 32 29 28 24 23 25 30 14 258 142 112 c.d, tablicy 1 15 j CH,aUCH/CH,/ \ /CH2/6CO 16 { ch^/ch^cc- H HOCO/CRp/^ I CO- ay.cl^/6 J co- 17 J CH3/CH2/gCO 18 20 | CH3/CH2/11C0 19 j ch3ch2ch/ch3/ ! /ch2/6co ! Obzx CH5/d^/g | H ! C^/CH^H } 12 CO -l +-- I x! H ! t-BOC J 14 t II i x Obz - grupa benzyloksykarbonylowa x t-BOC - III-rzed, grupa butoksykarbonylowa CH3/CH2/10 ! 15 I CO-142 112 ri i i i • J i i • i • i i i i i IU I! 1 O 1 •""• 1 2 1 -H !«8 1 O 1 art i ^ i i i ! i i i i i i i : i i i i i i i i i i i i i i i i i i % 1 O 1 -p k a i + i -n 1 -£ 1 -P i 3 s i ,o Dro i ... lin r- l - i !T ; .L-J ol 1 1 1 o GO MW- 1 t- -d vo —— o ia •o ^ K —— O CM 5- 1 ¦» 1 1 ) | 1 1 1 1 1 1 1 1 f- r pi 1 ¦ « [ia i •* ]o ^•j i ia 1 1 1 L CM 1 i ^ ' 1 •* 1° i [^ 1 i i - Ila 1 * IO h-J lin 1 ICM 1 1 * 1 !°l HA 1 •» 1 *o i 1 1 1 1 1 1 1 1 IT 1 ! 1 ICM 1 i i H- 1 1 1 1 1 1 a| 1 _+_ 1 1 1 T- 1 • 1 31 1 10 1 03 3 1 ? CU 1 0) i1! cd i <0 to i co P 1 P o i o O 1 O O 1 O O 1 O O 1 O H 1 H 1 £ 1 X! ia 1 -i o { *- 1 1 1 1 1 1 V 1 1 1 1 • 1 ia i » i Ol_ ia i CM I T- 1 •» 1 O ^ 1 •» ia • o —j la 0* 1 * i o [ I ia i » § O 1 r- 1 1 CM 1 1 1 i i ^ i i i —)-- i i 00 I 1 1 "T" j 1 1 1 1 1 1 l ca 1 P l a !i 1 cO 1 l ca 1 P 1 ° ! O 1 o 1 O 1 O 1 H 1 ^ 7 ^: • i °s i i i i i CM 1 1 1 1 1 1 CM 1 1 1 1 1 1 » 1 1 r- 1 —4— i i ia i * i °l i i i l i i i •i. 1 X- 1 —l- 1 IA l • i °i i i T- 1 1 1 1 (M 1 —1~ 1 1 1 1 1 1 GO 1 1 1 1 1 | 00 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 CO 1 P i a •1 1 CO 1 i ca l P 1 O 1 O 1 O 1 O 1 O 1 H 1 , i .G,a i .C a i &n i p. co i d 1 r- i cd SIS 1 1 1 ia i i w.i i ++ ^, CM j| 1 1 1 1 H ^ 1 1 CM 1 -* 1 1 1 1 1 1 1 1 1 • 1 • 1 1 1 1 1 ™L—--L i 7 ir\ i cm i ia • l • O J O IA i i * 1 1 O 1 1 •» » O T- 1 —-J 1 j LA | LA 0 I 0 l IA 1 1 •» 1 1 Ol t- 1 f- 1 CM ] cm i --4- H 4 1 CO I —j—-j CO 1 VO 1 1 v- 1 i ca i i a i 1 T) 1 1 H | !g i 1 Q 1 1 73 1 1 -H 1 1 Pi 1 i i» i 1 O 1 1 O | 1 O 1 i o i 1 O 1 1 H 1 __!£ i O 1 P-W 1 P.T- 1 q 1 cdrn | njr i ^|WW|t0Wl 1 1 1 ™~ ca 0} 73 B Q TJ P. a» ca 3 o o o o o r-l » .C i » *" i ° _4— CNt | T- 4 CM «» CM •—J IA •» O T- — IA •» O IA O T- CM 4 — CO P.CN 1 cd K i W 1 i t- 1 CM * 1 IA —2- I IA 1 CM 1 •* ! ° [ 1 LA 1 CM 1 * 1 O \--nr 1 CM 1 *- 1 * ! ° i i i i 1 S 1— 1 IA 1 A 1 ° T- CJ | IA 1 | 1 | CM 1 1 m | i * i i*i i i i ; !~"sH—liir-i ! ^! !*L ! 1 O } ^ } O j V— j- ¦j— l—"" {— ca G* (U O P< ca ^ o o o o o -p p. s§ I 1 CO 1^ 1 O 1 s i d i a i ca i 2 I O I O 1 O 1 O 1 O 1 -p 1 Pi O o IA o -SL.IA CM ¦ » O IA CM •» O IA CM •k O IA O r- <•«..CM — CO --• co 1 •-• 1 1 bX 1 u u i £<2 ! 1 1 CM 1 i 1*1 1 CM 1 O 1 i cm i i 1 1 •» 1 1 1 LAGO J 1 * 1 CM CM i 1 IA 1 t-*- l i o i o*A , }——-4———^ m i i ! ° ! ^. ! 1 * 1 CM 1 1 O 1 ^ 1 i i° •' 1 1*1 1 4 | IA I 1 CM I-O 1 f""t"'1 1 1 LA | 1 l*| 1 CM 1 O 1 1 VO 1 (\j 1 1 ^~ 1 | 1 v£ 1 OJ l !"t'"i 1 CM 1 CO 1 —I—-i VD l-r 1 —f—j co i co i CM 1 CM 1 r Ir 1 « !S ! ^ i o i Q i 0% i P-l ft i Pip 1 ca i ca i PIP i O 1 O | O 1 O 1 O 1 O 1 O | O 1 O 1 O 1 -PIP 1 Pi 1 P. 1 a i a i U 1 U 1 fi ! S ! • _J142 112 <8 d-P-P PiS N co CCi Cti^Of-l C OHO d O 0) lip O O * Cfl 00 cdi P.P.TJO N N*2 - o o 9 cd cd .o cd142 112 11 Tablica 3 Zwiazek i nr 1 | CH^/CHg^CO- 2 I CH3/CH2/6CO- j 3 j CH^O^/yCO- I- 4 i CH^/cWg/gCO- 5 | CH^CHg/gCO- 6 { CH3/CH2/10CO- TT 2 i Wartosci EE^ (mg/kgx2) } staphylococcus Streptococcus .pyogenes • • aureus podskórnie {doustnie 1,49~ 5,1a j - J podskórnie H H I 2,65 I 3,75, 1,4 H H H H i i "HT" I 7 I CH3/CH2/11CO- I H | I -I— I 0,5 0,28 0,37 _ I H 1 0,54 0,1.4, 0,243 j 92, 117 ----- 0,03 0,13 0,05 | 138 '- ——. ----- 0,046 45 CH3/CH2/12C0- 1,17, 3,08 0,98, 0,20, <0,54 9 i CH^/a^/^CO- 10 j GH3/CH^/14C0- I H 8,3 -H 1,1 KO,5, 0,18 ;200 2D0 0,18 11 i CH2-CH-/CH2/8C0- 12 j ai3/CH2/3ak CH/CHg/yCO- H H i i i -r- i i -•- 0,93 0,068 0,134 138 ~75 163, 2D0 14 | ch3ch2ch/ch3//c^/6co- CH3C0- 1t3 15 I ch3ch2ch/cw3//ch^/6(X)- ! I I I I 17 I CH3/CH2/9CO- i H0C0- /Cl^/gCO- 6,27 1.4 J L CH-i/ CHo/q" 35 2, 85 aoo 200 a Dwa doswiadczenia b Trzy doswiadczenia Tablica 4 Zwiazek | nr i •~r-::± 1 ! 1 L_ » ! 1 3 i 1 ^ ! 1 5 ! 1 b 1 R CH2/CH2/5C0— CH3/O^/gC0- CH3/CH2/7C0- CH3/CH2/QC0- CH3/CH2/9C0- CH3/CH2/1QC0- I i t i } i i i i i i i i i i i i i i R1 "3 H H H H H H i ii ii ii i 1 1 :::5:::::::::j H H H H ! 1 H ! 1 H ! 1 LD^ (mg/kg) „::::::::5:::-.:::: 600 | ¦y 600 j 600 300 ; 600 144, 265a12 142 112 c.d. tablicy 4 j—1 < 1 7 ! 8 i | 9 1 | 10"" 11 12 i t^ "l5 i' i«" "1 £ 2 1 1 CH3/CH2/11C0- | gh3/ct^/12co- [ CHj/CHg/^CO- | OT3/C^714C0- | CHg* CH-/CH^/qCO- ! CH^/CHg/jCtfc CH/Ct^/7CO- | I CHjCHgOl/CH^/CHg/gCO- I cH3ai2ai/cH3//cH2/6co- I CH^/CHg/gCO- ] I 17 [ CHj/CHg/gOO- j p:::2~™::::j I H l H i H H ! H H | H ! H ! H | H~" L-——.----———-' H I H L_..____, | 62.5 | H \ 56 | H | ! H " | ¦ H I r i : CHjGO- T ^ 600 f| HOOO/CHg/gCO- CHj/0H^/gCX- CBj/CK^CO- ] *».j I »^«»»»M ^»« PTT3I 112,5 I < 150' | p~—2™"" " | 50 i?500 I 450 ^ 600 J ^ 600 1 600 1 U"94 Wynalazek ilustruja ponizsze przyklady, przy czym przyklady I-V dotycza wytwarzania siibstratów.Przyklad I. Wytwarzanie rdzenia A-21978C.A* Fermentacja Actinoplanes utahensis* Przygotowano hodowle macierzysta Actinoplanes utahenais NRRL 12052 i przechowywano ja na skosach agarowych* Do przygotowania skosów stosowano jedna z ponizszych pozywek* Rzrwka A« Rzywka ta siala nastepujacy sklad: wstepnie gotowana maka owsiana 60,0 g drozdze 2,5 g KgHH^ 1,0 g mineralna pozywka Czapka** 5,0 g agar 25,0 g woda dejonizowana do 1 litra Wartosc pH, wynoszaca przed autoklawowaniem okolo 5,9, doprowadzono do 7,2 za pomoca NsOH* B autoklawowaniu pH wynosilo okolo 6,7* ul Mineralna pozywka Czapka miala nastepujacy skladt FfcSO^HgO 2 g (roztwór w 2 ml stezonego kwasu solnego) KO. 100g «gS04*7^0 100 g woda dejonizowana do 1 litra Fazywka B# Etozywka ta miala fcastepujacy sklad: dekstryna ziemniaczana 5,0 g ekstrakt drozdzowy 0,5 g enzymatyczny hydrolizat kazeiny*' 3,0 g ekstraktbydlecy 0,5 g glukoza 12,5 g skrobia kukurydziana 5,0 g peptonmiesny 5,0 g142 112 13 melasa 2,5 g HeS04.7%0 0,25 g CaOOj 1,0 g mineralna pazywka Ciapka 2,0 "1 agar 20,0 g woda demonizowana do 1 litra x/ N-Z Amine A, Humko Sheffield Chemical, Lyndhurst, NJ.Skos zaszczepiona Actinoplanes utahensis NRRL 12052 i inkubowano w temperaturze 30°C w ciagu 8-10 dni. Okolo polowe hodowli na skosie stosowano do zaszczepiania 50 al pozywki wegetatywnej o nastepujacym skladzie: wstepnie gotowana maka owsiana 2D90 g sacharoza 20,0 g drozdze 2,5 g suszona pozostalosc z fermentacji ziarnax/ 5,0 g KgHFO^ 1,0 g mineralna pozywka Czapka 5,0 ml woda demonizowana do 1 litra x/ National Distillers Products Oo«, 99 Park Ave*, New York, NT Wartosc pH doprowadzono do 7,4 za pomoca HaOH. Eto autoklawowaniu wartosc pH wyno¬ sila okolo6,8* ^ Zaszczepiona pozywke wegetatywna inkubowano w szerokoszyjnej kolbie Erlenmeyera o pojemnosci 250 ni, w temperaturze 3D°C, w ciagu okolo 72 godzin, na trzesawce obrotowej o srednicy luku okolo 50 mm i 250 obrotach/minute.Inkubowana pozywke wegetatywna mozna stosowac bezposrednio do zaszczepiania pozywki wegetatywnej drugiego stadium* Alternatywnie i korzystnie, hodowle te mozna przechowywac do póz¬ niejszego stosowania w oparach cieklego azotu* Z tego zapasu mozna sporzadzac hodowle w malych fiolkach w sposób nastepujacy. W kazdej fiolce umieszcza sie 2 ml lnkubowanej pozywki wegeta¬ tywnej i 2 ml roztworu laktozy w glicerynie [n.A. Dailey i CE* Higgens, "Prese-~vation and Storage of Microorganisms in the Gas Riase of Liauid Nitrogen" Cryobiol. 10, 364-367 /lcJ73/Ji Otrzymana zawiesine przechowuje sie w oparach cieklego azotu* 1 ml przechowywanej zawiesiny stosowano do zaszczepiania 50 ml pozywki wegetatywnej pierwszego stadium o skladzie podanym powyzej. Zaszczepiona pozywke wegetatywna pierwszego sta¬ dium inkubowano w sposób opisany powyzej* W celu przygotowania duzej objetosci inokulum, 10 ml lnkubowanej pozywki wegetatyw¬ nej pierwszego stadium stosowano do zaszczepiania 400 ml pozywki wegetatywnej drugiego stadium o takim samym skladzie jak pierwsza. Rzywke drugiego stadium inkubowano w szerokoszyjnej kolbie Erlenmeyera o pojemnosci 2 litrów w ciagu okolo 48 godzin, w temperaturze 30°C, na trzesawce obrotowej o srednicy luku okolo 50 mm i 250 obrotach/minute.Inkubowana pozywke wegetatywna drugiego stadium (80 ml), przygotowana jak powyzej, stosowano do zaszczepiania 10 litrów jednej z ponizszych jalowych pozywek. iozywka I, Ebzywka ta miala nastepujacy sklad, przy czym ilosc skladników podano w g/litr. maczka arachidowa 10,0 rozpuszczalny pepton miesny 5*0 sacharoza 2o,0 KI^PO^ 0,5 I^HPO^ 1,2 MgS0^.7H20 0,25 woda wodociagowa do 1 litra Wartosc pH pozywki wynosila do 6,9 po wyjalowieniu w autoklawie w temperaturze 121 C, w ciagu 45 minut, pod cisnieniem okolo 110-123 kFa.14 142 112 Bpzywka II. Pozywka ta miala nastepujacy sklad, przy czym ilosci skladników podano w g/litr* sacharoza 30,0 pepton 5 f0 K2HP04 1 f0 KO. 0,5 MgS04.7ty) 0,5 FeSO^H^ 0,002 dejonizowana woda do 1 litra Wartosc pH doprowadzono do 7,0 kwasem solnym* R autoklawowaniu pH wynosilo okolo 7,0.R)zywka III. Ibzywka ta miala nastepujacy sklad, przy czym ilosci skladników podano w g/litr. glukoza 20,0 mkd 3,0 Na^O^ 2,0 ZnCl2 0,019 Mga2.6jy) 0,304 Fed5»6H^0 0,062 MnCl2.4fy) 0,035 CuCl2.2H^0 0,005 CaCO^ 6,0 Kl^P04** 0,67 woda wodociagowa do 1 litra Koncowa wartosc pH wynosila okolo 6,6. x/ Wyjalowiono oddzielnie i dodano w warunkach jalowych.Zaszczepiona pozywke produkcyjna fermentowano w 14-litrowym fermentatorze w tempe¬ raturze okolo 30°C, w ciagu okolo 66 godzin. Fbzywke fermentacyjna mieszano za pomoca typowych mieszadel (okolo 600 obrótów/minute) i napowietrzano jalowym powietrzem, utrzymujac ilosc roz¬ puszczonego tlenu na poziomie powyzej 3096 nasycenia powietrza pod cisnieniem atmosferycznym.B. Dezacylowanie A-21978C.Fermentacje A. Utahensis prowadzono jak w punkcie A, stosujac pozywke skosowa A i pozywke produkcyjna I, oraz inkubujac w ciagu okolo 67 godzin. Do srodowiska fermentacji dodano 100 g surowego kompleksu A-21978C, otrzymanego sposobem podanym w opisie patentowym Sta¬ nów Zjednoczonych Ameryki nr 4 208 4}3« Rroces dezacylowania kompleksu A-21978C kontrolowano przeprowadzajac próby wobec Micrococcus luteus. Fermentacje prowadzono do calkowitego zakonczenia dezacylacji, na co wska¬ zuje zanik aktywnosci wobec M. luteus po uplywie okolo 24 godzin.C. Wyodrebnianie rdzenia A-21978C. Cala brzeczke fermentacyjna (20 litrów) otrzy¬ mana w punkcie B, przesaczono stosujac pomocniczym material filtracyjny (Hyflo Super-Cel, John Manville Corp.). Grzybnie odrzucono, a przesacz przepuszczono przez kolumne zawierajaca 1,5 litra zywicy HP-20 (Diaion High Fbrous Palymer, HF-Series, Mitsubishi Chemical Jhdustries Li- mitedp Tokio, Japonia). Wyciek z kolumny odrzucono, a kolumne przemyto 10 litrami dejonizowa- nej wody w celu usuniecia resztek przesaczonej brzeczki i odrzucono wode. Kolumne eluowano kolejno 10 litrami mieszanin wody i acetonitrylu (95:5, 9 :1 i 4:1), zbierajac frakcje po 1 litrze.Przebieg elucji kontrolowano za pomoca chromatografii bibulowej, rozwijajac mie¬ szanina n-butanolu, pirydyny, kwasu octowego i wody (15:10:3:12) i wykrywano zwiazki metoda fluorescencyjna UV. W tym ukladzie czynniki A-21978C wykazuja Rp okolo 0,56, a rdzen A-21978C okolo 0,32. Produkt mozna równiez wykrywac stosujac analityczna HPLC na zelu krzemionkowym/0.q i eluujac mieszanina wody i metanolu (3:1) zawierajaca 0,196 octanu amonowegOi Rdzen wykrywano w promieniowaniu UV przy 254 nm.142 112 15 Frakcje zawierajace rdzen polaczono9 zatezono pod zmniejszonym cisnieniem w celu usuniecia acetonitrylu i liofilizowanof otrzymujac 40,6 g póloczyszczonego rdzenia A-21978C.D. Oczyszczanie rdzenia A-21978C. 15 g póloczyszczonego rdzenia A-21978C, otrzy¬ manego w punkcie C, rozpuszczono w 75 ml mieszaniny wody, metanolu i acetonitrylu (82:10:8), zawierajacej 0,2# kwasu octowego i 0,896 pirydyny. Roztwór podawano za pomoca pompy na kolumnie o wymiarach 4,7 x 192 cm, zawierajaca 3,33 litra zelu krzemionkowego (CU8) Ouantum LP-1, Ouantum Industries, 341 Kaplan rrive, Fairfield, NJ 07006)• Do elucji stosowana powyzej podana miesza¬ nine rozpuszczalników i zbierano frakcje po 350 ml. Przebieg elucji kontrolowano za pomoca mo¬ nitora UV przy 280 nm. Eblaczone frakcje zawierajace rdzen zatezono pod zmniejszonym cisnieniem w celu usuniecia rozpuszczalników i nastepnie liofilizowano, otrzymujac 5,2 g oczyszczonego rdzenia A-21978C.E. Charakterystyka rdzenia A-21978C. a) Fbstaci biala bezpostaciowa substancja stala, fluoryzujaca w krótkofalowym promieniowaniu UV# b) Wzór empiryczny: C62H83N17°25 c) Masa czasteczkowa: 1465 d) Rozpuszczalnosc: substancja rozpuszczalna w wodzie e) W widmie absorpcyjnym w podczerwieni (KBr) wystepuja maksima absorpcji przy 3300 (szerokie pasmo), 3042 (slabe), 2909 (slabe), 1655 (silne), 1530 (silne), 1451 (slabe), 1399 (srednie), 1222 (srednie), 1165 (slabe), 1063 (slabe) i 758 (srednie do slabego) cm"1 f) W widmie absorpcyjnym w nadfiolecie (metanol) wystepuja maksima przy 223 nm (£ s41482) i 260 ran ( £ =8687). g) ELektrometryczne miareczkowanie w 6896 wodnym roztworze dwumetyloformamidu wykazuje obecnosc czterech dajacych sie miareczkowac grup o wartosciach pK okolo 5,2, 6,7, 8,5 i 11t1 (po¬ czatkowe pH 6,12).Pr zy k l a d II. Alternatywny sposób wytwarzania rdzenia A-21978C. Rdzen A-21967C wytwarzano tak jak w przykladzie I, wprowadzajac tylko pewne zmiany w punkcie Bi Hodowle A. utahensis inkubowano poczatkowo w ciagu okolo 48 godzin, jako substrat stosowano póloczysz- czony kompleks A-21978C (50 g) i po dodaniu substratu inkubowano w ciagu okolo 16 godzin. R?ze- sacz z brzeczki przepuszczono przez kolumne zawierajaca 3,1 litra zywicy HP-20. Kolumne przemy¬ wano 10 objetosciami wody i nastepnie eluowano mieszanina wody i acetonitrylu (95:5), kontro¬ lujac jej przebieg jak w przykladzie I. R) zebraniu 24 litrów zmieniono rozpuszczalnik na mie¬ szanine wody i acetonitrylu (9:1), eluujac nia rdzen, fblaczone frakcje zawierajace rdzen za¬ tezono pod zmniejszonym cisnieniem dla usuniecia acetonitrylu i liofilizowano, otrzymujac 24,3 g póloczyszczonego rdzenia A-21978Ci 24,3 g póloczyszczonego rdzenia A-21978C rozpuszczonego w wodzie (400 ml) podano za pomoca pompy na kolumne stalowa o wymiarach 4,7 x 192 cm, zawierajaca 3,33 litra zelu krze¬ mionkowego (Quatum LF-1/c.o) w mieszaninie wody, metanolu i acetonitrylu (8:1:1), zawierajacej 0,296 kwasu octowego i 0,8% pirydyny. Kolumne eluowano tym samym rozpuszczalnikiem pod cisnie¬ niem okolo 13 720 kPa, zbierajac frakcje po 350 ml. Przebieg elucji kontrolowano przy 280 nnu Polaczone frakcje zawierajace rdzen zatezono pod zmniejszonym cisnieniem w celu usuniecia roz¬ puszczalników i liofilizowano, otrzymujac 14 g rdzenia A-21978C o wysokiej czystosci.Przyklad III. Wytwarzanie czynników C2 i C^ NQrn-t-B0C-A-21978C. 10 g mie-r szaniny czynników O, i C~ A-21978C, otrzymanej w sposób przedstawiony w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 208 4Q3, rozpuszczono w 50 ml wody. Wartosc pH roztworu wy¬ noszaca 4,05 doprowadzono do 9,5 za pomoca 3,6 ml 5 n wodorotlenku sodowego. Nastepnie dodano 3,0 ml dwuweglanu dwu-III-rz.-butylu i calosc mieszano w ciagu 2 godzin w temperaturze pokojowej.Wartosc pH utrzymywano na poziomie 9,5 dodajac w tym czasie 6,5 ml 5 n roztworu wodorotlenku sodowego. Przebieg reakcji sprawdzano okresowo za pomoca chromatografii cienkowarstwowej na zelu krzemionkowym, stosujac do rozwijania mieszaniny acetonitrylu i wody (7:3 i 8:2) i wykrywajac produkt w UV.16 142 112 R uplywie okolo 10 minut roztwór gwaltownie zmetnial i wzroslo zuzycie zasady.Fb uplywie 30 minut stopien wzrastania zmetnienia i zuzycia zasady malal, co oznacza, ze reakcja zostala zakonczona* Mieszanie jednak kontynuowano w ciagu dodatkowych 90 minut* R zakonczeniu reakcji, trwajacej razem 2 godziny, mieszanine natychmiast liofilizowano i otrzymano 12.7 g mieszaniny czynników C^ i C, N0rn-t-B0C-A-21978C* Stosujac podobne postepowanie, poddano reakcji dwie porcje po 10 g i jedna 30 g« W kazdym przypadku czas reakcji wynosil tylko 40 minut* Z porcji po 10 g otrzymano 11,9 i 12,1g, a z porcji 30 g otrzymano 35f4 g produktu.Przyklad IV. Wytwarzanie rdzenia N0rn-t-B0G-A-2197BC A. Fermentacja A. utahensis. Fermentacje A. utahensls prowadzono w sposób opisany w punkcie A przykladu I, stosujac pozywke skosowa A i pozywke produkcyjna I, oraz inkubujac pozywke produkcyjna w ciagu okolo 66 godzin.B. Dezacylowanie kompleksu NQ^n-t-B0C. Do srodowiska fermentacji dodano 1185 g surowego kompleksu A-21978C-N-n~t-B0C zawierajacego okolo 176 g kompleksu A-21978C. ftxces dezacylowania prowadzono jak w punkcie B przykladu I. Dezacylowanie zachodzilo calkowicie po uplywie okolo 24 godzin, co stwierdzono za pomoca HFLC.C. Wyodrebnianie rdzenia N0rn-t-B0C-A-21978C* 100 litrów brzeczki fermentacyjnej, otrzymanej tak jak opisano w punkcie B, rzpesaczono przez pomocniczy material filtracyjny (ityflo Super-cel). ft*zesacz przepuszczono przez kolumne, zawierajaca 7,5 litrów zywicy HP-20 (Dlaion), po czym kolumne przemyto 38 litrami wody. KLucje kontrolowano za pomoca HPLC na zelu krzemionkowym/0.Qf stosujac wykrywanie w UV przy 254 nm. W wodzie stwierdzono obecno só pewnej ilosci rdzenia. Nastepnie rdzen eluowano kolejno 40 litrami mieszaniny wody i acetonltrylu (95:5), 40 litrami mieszaniny wody i acetonltrylu (9:1) oraz 100 litrami mieszaniny wody i ace- tonitrylu (85:15)* ftlaczone frakcje zawierajace rdzen zatezono pod zmniejszonym cisnieniem w celu usuniecia rozpuszczalnika i liofilizowano. Otrzymano 298,5 g póloczyszczonego rdzenia N0rn~t"B0C~A"21978C# ' D. Oczyszczanie rdzenia N0rn-t-B0OA-21978C. 30 g póloczyszczonego rdzenia Nc^-t- -B0OA-21978C, otrzymanego w punkcie C, rozpuszczono w 75 ml mieszaniny wody i acetonltrylu (9:1) zawierajacej 0,2% kwasu octowego i 0,8% pirydyny. Roztwór naniesiono na kolumne stalowa o wymiarach 4,7 x 192 cm, zawierajaca 3,33 litra zelu krzemionkowego (Ouantum UM/C-o), zrów¬ nowazona takim samym ukladem rozpuszczalników. Kolumne eluowano pod cisnieniem mieszanina wody, acetonltrylu i metanolu (80:15:5) zawierajaca 0,2% kwasu octowego i 0,8% pirydyny. Zbierano frakcje po 350 ml i wykrywano produkt w UV przy 280 nm. Bblaczone frakcje zawierajace produkt zatezono pod zmniejszonym cisnieniem w celu usuniecia rozpuszczalnika i liofilizowano. Otrzy* mano 18,4 g oczyszczonego rdzenia Nq^ -t-B0OA-21978C o nastepujacej charakterystyce. a) Rstac: biala, bezpostaciowa substancja stala, fluoryzujacy w krótkofalowym promieniowaniu UV. b) Wzór empiryczny: ^7^^7027 c) Masa czasteczkowa: 1565 d) Rozpuszczalnosc: substancja rozpuszczalna w wodzie e) W widmie absorpcyjnym w podczerwieni (KBr) wystepuja maksima absorpcji przy 3345 (szerokie pasmo), 3065 (slabe), 2975 (slabe), 2936 (slabe), <^ 1710 (przegiecie), 1660 (silne), 1530 (silne), 1452 (slabe), 1395 (srednie), 1368 (slabe). 1341 (slabe), 1250 (srednie), 1228 (sred¬ nie), 1166 (srednie do slabego), i 1063 (slabe) cm" . f) W widmie absorpcyjnym w nadfiolecie (90% etanolu) wystepuja maksima przy 220 nm ( £, »42 000 ) i 260 nm ( £ =10 600), g) Czas retencji podczas cieczowej chromatografii cisnieniowej wynosi 6 minut. Kolumna o wy¬ miarach 4,6 x 300 nm, zel krzemionkowy/Oiq, elucja mieszanina wody, acetonltrylu i metanolu (80:15:5) zawierajaca 0,2% octanu amonu, szybko só przeplywu 2 ml/minute, wykrywanie w W.142 112 17 Przyklad V, Alternatywny sposób oczyszczania rdzenia Nq^ -t-B0C-A-21978C. 10,8 g póloczyszczonego rdzenia Nc^-t-BOC-A-21978C, otrzymanego w sposób podany w punkcie C przykladu IV, rozpuszczono w wodzie i naniesiono na kolumne zawierajaca 80 ml Amberlitu IRA-68 (Rohm and Hass, Fhiladelphia, PA, postac octanowa). Kolumne przemyto woda 1 z szybkoscia. 5 ml/minute eluowano kolejno 1060 ml 0,05 kwasu octowego. 840 ml 0,1 n kwasu octowego i 3120 ml 0,2 n kwasu octowego. Zbierano frakcje po 120 ml, a przebieg elucji kontrolowano za pomoca HPLC na zelu krzemionkowym/Gjg, stosujac mieszanine wody, acetonltrylu i metanolu (80l15:5), zawierajaca 0,2# octanu amonowego i wykrywajac produkt w UV przy 254 nm. fblaczone frakcje zawierajace produkt, po doprowadzeniu pH do 5,8 pirydyna, zatezono pod zmniejszonym cisnieniem do objetosci okolo 200 ml. Do pozostalosci dodano wody i otrzymany roztwór zatezono w celu usuniecia pirydyny. R zliofilizowanlu otrzymano 3,46 g oczyszczonego rdzenia NQ^n-t-B0C-A-21978C.Przyklad VI-XXXI, Zwiazki o wzorze 1 wytwarza sie przez acylowanie zwiazków o wzorze 3 droga zmodyfikowanej frakcji Schotten-Baumanna, stosujac chlorek kwasowy jako czynnik acylujacy (metoda A), wzglednie stosujac ester aktywny, to jest ester 2,4,5-trójchlorofenyIowy, jako srodek acylujacy (metoda B). Ogólny tok postepowania stosowany dla przeprowadzenia reakcji acylowania metoda A i metoda B opisano ponizej.Metoda A - Zmodyfikowana reakcja Schotten-Baumanna. Metoda ta polega na reakcji rdzenia o wzorze 3 z chlorkiem kwasu alkano- lub alkenokarboksylowego, odpowiadajacego zadanemu acylowemu lancuchowi bocznemu.Zwiazek o wzorze 3 (1,92-2,16 g, 1,33-1,47 mmola) lub zwiazek o wzorze 2 (409 mg, 0,25 mmola) rozpuszcza sie w 200 ml mieszaniny pirydyny i wody (9:1), po czym do roztworu wkrapla sie w ciagu 1-3 godzin srodek acylujacy (nadmiar 18-20 mmoli chlorku acylu w 15 ml acetonu).Mieszanine reakcyjna miesza sie w ciagu dodatkowych 2-3 godzin w temperaturze pokojowej, a na¬ stepnie zateza usuwajac aceton. Rzostala faze wodna rozciencza sie woda do okolo 200 ml, war¬ tosc pH doprowadza lodowatym kwasem octowym do pH 3,0-3,5, przemywa 8 razy jednakowa objetoscia eteru etylowego i liofilizuje.Surowa pochodna acylowa oczyszcza sie za pomoca cieczowej chromatografii cieczowej cisnieniowej (HPLC) z odwróconymi fazami. W tym celu, próbke rozpuszcza sie w 4-6,5 ml wody lub mieszaniny do elucji i wstrzykuje na kolumne o wymiarach okolo 84-1,6 cmf wykonana ze stali nierdzewnej i wypelniona zelem LP*/c^g. Kolumne eluuje sie mieszanina wody, metanolu, acetonltry¬ lu, pirydyny i kwasu octowego z szybkoscia okolo 10-12 ml/minute i pod cisnieniem okolo 10 290 - 13 720 kPa, stosujac pompe LDC duplex (Milton-Roy). Wyciek kontroluje sie w UV przy 280 nm, stosujac detektor ISC0-UA-5. Zadane frakcje laczy sie i odparowuje do sucha pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymujac zadana pochodna alkanoilowa. Oczyszczony produkt analizuje sie za pomoca chromatografii cienkowarstwowej, stosujac plytki z odwróconymi fazami (Whatman KC^Q) i do roz¬ wijania mieszanine wody, metanolu, acetonltrylu, pirydyny i kwasu octowego (45:15:^0:2:2).Produkt wykrywa sie obserwujac plytki w swietle UV. Produkt mozna takze analizowac mierzac wspólczynniki ekstynacji przy 22o i 2G0 nm oraz za pomoca analizatora aminokwasów. Czystosc oznacza sie za pomoca HPLC z odwróconymi fazami (C-jn Microbondapak, Waters Co. ), stosujac mie¬ szanine wody, metanolu, acetonltrylu, pirydyny 1 kwasu octowego i kontrolujac eluat UV przy 280 nm.Metoda B - Zastosowanie aktywnego estru. 2f4,5-trójchlorofenylowego. Rdzen NQrn-t- -B0C-A-21978C (1,0 g, 0,64 mmola), rdzen A-21978C (0,5-1,0 g, 0,34-0,68 mmola) lub A-21978C (946 mgf 0,58 mmola) oraz 3,5 molowy nadmiar aktywnego estru trójchlorofenylowego rozpuszcza sie w 100 ml dwumetyloformamidu i miesza w temperaturze od zblizonej do pokojowej do okolo 50 C, w ciagu okolo 6-20 godzin. Nastepnie mieszanine reakcyjna zateza sie pod zmniejszonym cisnieniem.Oleista pozostalosc uciera sie z 50 ml mieszaniny eteru etylowego i toluenu (1:1) i przemywa eterem. Pochodne jednoacylowa i dwuacylowa rdzenia A-21978C, acylowa A-21978C1 i zacylowany rdzen T-B0C-21978C oczyszcza sie tak jak w metodzie A.18 142 112 Zacylowany rdzen t-B0C-A-21978C odblokowuje sie stosujac 50 mg/ml mieszaniny kwa¬ su trójfluorooctowego, anizolu i trójetylosilanu (10:1:1) i prowadzac reakcje w temperaturze od okolo -10 do Okolo 0°C w ciagu 3-5 minut. Mieszanine reakcyjna zateza pod zmniejszonym cis¬ nieniem, a oleista pozostalosc uciera sie dwukrotnie z 20 ml eteru etylowego. Surowy zacylowa¬ ny produkt oczyszcza sie stosujac HPLC z odwróconymi fazami analizujac jak w metodzie A« Warunki i parametry procesu wytwarzania pochodnych N,^ -Jedno acyIowyeh i N™^ f Ng^-dwuacylowych cyklicznych peptydów A-21978C oraz pochodnej N^ , N- -dwuacylowej podano w tablicach odpowiednio 5» 7 i 9f natomiast wlasciwosci fizykochemiezne^Cyeh pochodnych podano w tablicach odpowiednio 6, 8 i 10« W przykladach VI-XXI (tablica 5) wytwarza sie zwiazki o wzorze 1, w którym R i R oznaczaja atomy wodoru. Jako substrat stosuje sie zwiazek Nm^-acylo- -H^-t-BOC.W przykladzie XXIV (tablica 7) produkt wytwarza sie dzialajac na zabezpieczony rdzen bezwodnikiem bursztynowym i 9096 pirydyna (metoda C). W przykladzie XXIX produkt wytwarza sie stosujac bezwodnik Ill-rz.-butoksykarbonylowy w wodzie (metoda D).Wartosci R„ podane w tablicach 6, 8 i 10 otrzymano przeprowadzajac analize metoda chromatografii cienkowarstwowej z odwróconymi fazami na zelu krzemionkowym (Whatman KC-g ze wskaznikiem fluorescencyjnym), przy uzyciu jako ukladu rozwijajacego mieszaniny wody, metanolu w acetonitrylu (45:15:40) z dodatkiem 0,2# pirydyny i 0,2% kwasu octowego.Tablica 5 j ft-zyklad | i nr j 1 VI VII l~ | Metoda I synte-j zy CH^CH^CO- CH^CHg/gCO- Hosc I rdzenia j (mg) | a i Ilosc i Czas I ELuent reakcji w HPLC dlej ( godzi-} substratu sród- J 1028 1950 ka (mg) ny) 800 i 20 3421 | i 3 "zk ¦+' 55:15:20 50:15:35 Rrodukt eluent J w HPLC i 50:15:35 55:15:30 ilosc (mg) 205 355 "264"" 212 240 334 3921 VIII CH^/CHg/gCO- IX CH^/CHg/yCO- 1000 2000 350 ! 882 J 2 115:15:64 ! 115:15:64 \ nie oczysz¬ czany 50:15:35 CH3/CH2/7CO- 1000 400 j 20 nie oczysz¬ czany 50:15:35 XI CH^/C^/gCO- 2160 4595 5 22 50:15:35 45:15:40 XII CH^/CHg/cCO- 1000 288 XIII nie oczysz¬ czany ! 45:15:40 i— 1 CH5/CH2/10C0- 1000 3406 | 1 800 1 1 2 24" 45:15:40 j 45:15:to 1 1 40:15:45 370 "317 267 215 A 337,8 XIV a^/a^/^co- I b 1000 10:15:75 ¦+- 1 1:0:1° + j 50:15:35 J 35:10:55° XV CH3/CG2/12C0- | B 1000 812 22c 50:15:35 t- XVI XVII ch^o^/^co- CH^/CHg/^CO- B 1000 1000 900 1031 20 22L 60:15:35 nie oczysz* czony i- XVIII | CHj/CHg/^CO- B j 1000 744 18L 1 ——1 XIX x nie oczysz- J 2:0:3 czony 1 } cH^cH-Za^/gCO- r- •• B ! 1000 237 20 20:15:65 T45:15:*0 257 290 XX CT^/CH^CH. CH/ O^/yCO- XXI B J 1000 -i-- 1- CH,CHpCH=CHCHpCH= CH^CHlOLCH/CHg/yCO- B j 1000 400 400 48 28 nie oczysz¬ czony ! 40:15:45 35:15:50 j 35:15:50 1 1 1 —1- 1 1 1 215 283142112 19 dane z tablicy 5 a mieszanina podanych objetosci wodyt metanolu i acetonitrylu, zawierajaca 0,2% pirydyny i 0,2# kwasu octowego b temperatura reakcji 5°C c mieszanina zawierajaca 1% pirydyny i 1# kwasu octowego Tablica 6 i Zwiazek L.—__—- 1 1 p————1 [ 5 r * i _ i ! 8 ! 9 , 1 1 ! 10 ! i i ! R GH^CHg/jCO- CH^/CHg/gCO- CH^CHg/yCO- CH^/CHg/gCO- CHy^CH^CO- CH^/CHg/^CO- O^/O^/^CO- O^/O^/^CO- O^/O^/^CO- O^/O^/^CO- ! 11 i CH^CH-Zct^/gCO-l i 12 i CH^CH^CH. CH/ ! | | /cV7co- i 13 ! CH^CHgClLCHCHgCHJ j j ^CH-CHgOLCH/ | 1 /CT^/yCO- 1 ! H 1 H 1 H ! h ! H H H H H H H H H 1 j 1 1 ! 1 1 1 —t—¦ 1 1 1 —U— 1 1 1 1 I j 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 R2 H H H H H "ii H H H H H H H i 1 j Charakterystyka produktu | R„ J eluent w 1 1 analitycz- | nej HPLC 1 0,85 j 60:15:25 | 0,80 J 60:15:25 | 0,75 " 45:15:to t l_t j 0,70 S 45:15:40 0,65 i 45:15:40 0,59 1 45:15:^0 0,53 1 45:15:40 0,42 ] 50:0:49 . j 0,34 1 1:0:1° ; 1 1 0,25 ] 39:0:65 "| 1 1 0,70 | 45:15:40 | , i J 1 1 1 1 0,54 | 45:15:^0 j 1 1 i i 1 1 0,50 j 45:15:40b | 1 1 ! UY 1 tjt max 220 nm | 48 100 | 46 900 46 000 46 500 46 200 44 000 48 500 48 447 .j 50 172 | i 54 000 i i 44 000 | i ; 45 000 | i 1 1 1 50 000 1 1 1 1 1 < fj max i !C 260 nm J ! 11 400 1 , -1 10 500 j _J 11 000 j 11 000 j 10 400 j 9 500 j 9 800 I 9 170 j 1 9 751 | j 12 000 | 9 200 } 1 1 9 600 j 11 600 | a mieszanina podanych objetosci wody, metanolu i acetonitrylu, zawierajaca 0,296 pirydyny i 0,2% kwasu octowego b mieszanina zawierajaca 1% pirydyny 1 '\% kwasu octowego1tó 112 J- I ° P - SP H *« 3 S •H | O N oj co p^ HOxH O^ O p SMM HO 01 W-P^ id i •o a CM 5 00 8 s %i o ffi i i i i i i i i K—— I T* I (0 I iH I ^ Lh ¦1 • 5 I ir\ 5 m o JO i i i i i v i a !S 5 i- i cm IfN i l i l 12 I I 15 I - i m i v I •• - vO -I—¦+- a r* i i i i i -^ I CM I 81 io I KY I LTv I I I I I 18 I T I O O m i i 13 I O I I I I 18 I r- ON 15 I I CM I T-*- O ~h-+ 00 co I I I I -I -I— C* 1 -I— . o !8 I r- m In O o a? O . o 18 I X I T~r * ii O I U vo i . er* JO | K » H—+ lit PQ PQ -u. i W I W U v0 | U vO Cl! Cl 8 4-.- M H M LB- « A ii U I O lll I I I I I !i I 0 1 ¦ O O I U o I *- l K I K\ 15 15 I I Ir- ¦ i i -r-— i i i i i -t-H I I -4- i i I CM '•8 18 I *- I I I U i o i t- ff\ «\# ! aT 15 \i se i i I Ih IB IB I I I I I IM a Ib is is is e i i i £ 4-1 i I I -o •o o I •o o as o o m o c 1 N 3 0) (0 (U cd = 3 1 U142 112 21 Tablica 8 Zwiazek i nr i i i i i 14 | CH3O^CH/CH3/ j /c^/6co- 15 ! ch3o^ch/ch3/ 16 j ch3/o^/6co- j 17 j CH3/CH2/9CO- I -?— I 18 |cH3/a^/11co- CH3CO- -t HOCO/CHg/gCO CH3/CH2/6CO- CH3/CH2/9C0- CH3/CH2/11CO- -—4 Charakterystyka produktu S eluent w analltycz- j nei HPLC* 0,69 I 45:15:40 0f75 0,67 | 0,31 l- 45:15:40 45:15:40* 4 30:15:55^ J 45:15:40D 0,03 |45:15:^0B" "t IXmax la 220 nmj 260 46 000 ! 10 400 max 47 000 | 11 000 45 000 j 9 000 1 48 200 8 000 -i 49 000 ! 9 000 I 1 19 Sa^CHgCH/CHj/ ! I /CH^CO- ;— ! 20 I 4.—— |Cbz I -*-—.H H t-BOC 1 l 1 1 —•— CH3/CH2/10CO- j 0,58 | I Przy¬ klad nr i XXXI 1 1 1. mieszanina podanych objetosci wody, metanolu i acetonitrylu, zawierajaca 0,2% pirydyny iOf2^ kwasu octowego mieszanina zawierajaca 1% pirydyny i 1% kwasu octowego Tablica 9 1 1 1 1 1 1 1 -J R, R1 i C^/CHg/g -+- co- ! Metoda syntezy "Ilosc substra- tu (g) -l- 15 ! hosc srodka acylu- jacego (g) 15 r j Czas reakcji (godzi-! ny) Eluent w j Produkt HPLC dla . , t-BOC- J eluent, j ilosc " dwuacylo- j w HPLC j (mg) wej po¬ chodnej 30 150:15:35 1 50:15:35 ! 211 a patrz przyklad XXXIII b mieszanina podanych objetosci wody, metanolu i acetonitrylu, zawierajaca 0,296 pirydyny i 0,2% kwasu octowego Tablica 10 I Zwiazek I | nr | i 1 1 1 i 21 ! a | CH3/CH2/8C0- i 1 1 ! R ! CHj/CHg/gCO- ! R2 H i ! RF i 0,66 Charakterystyka produktu l 1 im 1 analitycz- i£Amax l£/lmax j nej HPLCa J 220 nm j 260 nm 1 1 1 i 61:15:23:1 ! 41 800 ,'11 500 1 1 1 I a mieszanina podanych ilosci wody, metanolu, aceonitrylu i octanu amonu, zawierajaca 0,2% pirydyny i 0,2% kwasu octowego22 142 112 Przykl ad XXXII. Wytwarzanie rdzenia N^ -/n-kaprynoilo/-A-21978C (zwiazek nr 4).Opisany ponizej tok postepowania ilustruja sposób wytwarzania zwiazków w duzej skali przy uzy¬ ciu estru aktywnego.A. Wytwarzanie n-kaprynianu 2,4,5-trójchlorofenylu. Roztwór 5,6 ml chlorku kaprynoilu (Pfaltz i Bauer) i 5,6 g 2,4, 5-trójchlorofenolu w 1 litrze eteru etylowego i 120 ml pirydyny miesza sie w ciagu 4 godzin. Mieszanine przesacza sie i odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem.Otrzymany n-kaprynian 2,4,5-trójchlorofenylu oczyszcza sie na kolumnie wypelnionej zelem krze¬ mionkowym (Woelm), stosujac do elucji toluen, kontrolujac frakcje za pomoca chromatografii cien¬ kowarstwowej i stosujac do wykrywania krótkofalowe promieniowanie UV. Fblaczone frakcje zawie¬ rajace produkt odparowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymujac 10,4 g n-kaprynianu 2f4,5-trójchlorofenylu.B. Acylowanie rdzenia N~, -t-B0C-A-21978C-n-kaprynianem 2,4,5-trójchlorofenylu. Roztwór 15,0 g rdzenia N^^t-BOC-A^^fsc i 15,0 n-kaprynianu 2f495-trójchlorofenylu w 500 ml bez¬ wodnego dwumetyloformamidu miesza sie w atmosferze azotu w temperaturze pokojowej w ciagu 25 godzin. Mieszanine miesza sie w ciagu 5 godzin w temperaturze 6o°C az do zakonczenia reakcji co stwierdza sie za pomoca chromatografii cienkowarstwowej. Mieszanine reakcyjna zateza sie pod zmniejszonym cisnieniem do objetosci okolo 200 ml i miesza z 1,2 litra mieszaniny eteru ety¬ lowego i toluenu (5:1 )? Produkt odsacza sie, przemywa eterem i suszy pod zmniejszonym cisnie¬ niem, otrzymujac 15,05 g surowego rdzenia N^ -/n-kaprynoilo/-N~,n-t-B0C-A-21978C (wzór 1, ftsn-kaprynoil, R«H, R2»t-B0C).C. Oczyszczanie rdzenia N™. -/n-kaprynoilo/-N0rn-t-B0C-A-21978C. Surowy rdzen N- -/n- kaprynoilo/-NQrn-t-B0C-A-21978C oczyszcza sie w nastepujacy sposób• Surowy preparat rozpusz¬ cza sie w okolo 50 ml mieszaniny do elucji i oczyszcza za pomoca HPLC, stosujac uklad Waters Prep/500 zawierajacy ladunki adsorbenta do odwróconych faz z G-o zelem krzemionkowym. Do elucji stosuje sie mieszanine wody, metanolu i acetonitrylu (50:15:35), zawierajaca 0,2% piry¬ dyny i 0,2% kwasu octowego. Frakcje kontroluje sie w UV przy 280 nm. Odpowiednie frakcje laczy sie i odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymujac 8,56 g oczyszczonego rdzenia H_ -/n- -kaprynoilo/-NQrn-t-B0C-A-21978C.D* Usuwanie grupy N0rn-t-B0C. GruPS "t-BOC usuwa sie mieszajac 1,47 g rdzenia Nm^ -/n- -kaprynoilo/-NQ^-t-B0C-A-21978C z 15 ml mieszaniny kwasu trójfluorooctowego 1 1,2-etanodwu- tiolu (10 :1 ) w temperaturze pokojowej w ciagu 3 minut. Mieszanine odparowuje sie pod zmniej¬ szonym cisnieniem, a pozostalosc uciera z 50 ml eteru etylowego. Fb przemyciu 20 ml eteru i wysuszeniu pod zmniejszonym cisnieniem otrzymuje sie 2,59 g surowego rdzenia N- -/n-kapry- noilo/-A-21978C (zwiazek o wzorze 1, Rsn-kaprynoil, R1SH, RcH).E. Oczyszczanie rdzenia Nr^ -/n-kaprynoilo-A-21978C» Surowy rdzen N^ -/n-kaprynoilo- -A-21978C oczyszcza sie za pomoca HPLC z odwróconymi fazami w nastepujacy sposób. Próbke 2,59 g rozpuszcza sie w 4,0 ml mieszaniny wody, metanolu acetonitrylu, pirydyny i kwasu octo¬ wego (50:15:2:2) i wstrzykuje na kolumne ze stali nierdzewnej o wymiarach okolo 84 x 2,5 cm wypelniona adsorbentem LF-1/o.q» Kolumne eluuje sie ta sama mieszanina rozpuszczalników.ELucje prowadzi sie z szybkoscia 10-12 ml/minute pod cisnieniem okolo 8230-11660 klfc, stosujac pompe LDC duplex (Milton-Roy). Wyciek kontroluje sie za pomoca detektora UV (isco Model UA-5, Instrument Specialist CO., 4700 Superior Avenue. Lincoln, NB 6850 4) przy 280 nm. Oo dwie minu¬ ty zbiera sie frakcje po 20-24 ml. Zadane ze wzgledu na aktywnosc przeciw drobnoustrojom frakcje laczy sie i odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymujac 1,05 g produktu.Oczyszczanie powtarza sie stosujac odpowiednio 4,35 g, 4,25 g, 2,14 g, 2,00 g i 1,75 g surowej wyjsciowej pochodnej, otrzymujac lacznie 5,58 g oczyszczonego rdzenia N,- -/n-kapry- noiW-A-21 978C.142 112 23 Przyklad XXXIII, Yfytwarzanie HCrp-/n-kaprynoilo/-NK-/n-kaprynoilo/-A-21978C (zwiazek nr 21 )# Rdzen N- -/n-kaprynoiloZ-N^ -/n-kaprynoilo/-A-21978C (zwiazek o wzorze 1f "1 2 \ Ky** R i R s=n-kaprynoilf RsH) Jest pomniejszym produktem reakcji wytwarzania pochodnej Nm-—- -/n-kaprynoilowej/ w przykladzie XXXII# Wyodrebnia sie go podczas oczyszczania za pomoca HPLC z odwróconymi fazami opisanego w punkcie E. Zadane frakcje laczy sie i odparowuje pod zmniej¬ szonym cisnieniem, otrzymujac 211 mg surowego produktu. Zwiazek oczyszcza sie za pomoca anali¬ tycznej HPLC/C18 Microbondapak, Waters Go.) stosujac do elucji mieszanine wody, metanolu, ace- tonitrylu, wodorotlenku amonowego i kwasu octowego (6x23:15:0*5:0*5). R oczyszczeniu (32 razy przy uzyciu za kazdym razem próbki 500 jug) otrzymuje sie 4,4 mg rdzenia N^ -/n-kaprynoilo/- -Njcyn-/n-kaprynoilo/-A-21978C, zidentyfikowanego na podstawie widma 1H NMR (360 MHz).Przyklad XXXIV. Wytwarzanie rdzenia N^ -Cbz-N0rn-lauroilo-A-21978C (zwiazek nr 2o). Sposób ten polega na zabezpieczeniu grupy o£ -aminowej tryptofanu w rdzeniu Ng^-t-BOO -A-21978C grupa Cbz, a nastepnie usuwaniu grupy t-BOC i acylowaniu grupy-^ -aminowej ornityny laurynianem trójchlorofenylu.A. Wytwarzanie rdzenia N^ -Cbz-N0rn*T-B0C-A-21978C. 1,0 g rdzenia No^-t-BOC-A^lp/fSC rozpuszcza sie w 150 ml dwumetyloformamidu i roztwór ogrzewa sie do temperatury 6o°C. Do roz¬ tworu dodaje 0,55 ml Nf0-bis-trójmetylosililoacetamidu I nastepnie 257 mg weglanu benzylowo- pieciochlorofenylowego. Mieszanine reakcyjna miesza si^ w ciagu 20 godzin, po czym zateza do objetosci okolo 20-25 ml zadaje Ja 100 ml wody i doprowadza pH do 6,0 za pomoca 1n roztworu wo¬ dorotlenku sodowego. Mieszanine przemywa sie 6 x 2qo ml eteru etylowego i liofilizuje.Surowa pochodna oczyszcza sie za pomoca HPLC z odwróconymi fazami w nastepujacy sposób.Rróbke rozpuszczona w okolo 6 ml mieszaniny wody, metanolu, acetonitrylu, pirydyny i kwasu octowego (55:15:30:2:2) poddaje sie na kolumne ze stali nierdzewnej o wymiarach okolo 84 x 1,27 cm, wypelniona nosnikiem LF-1/CLi. Zadane frakcje, oceniane za pomoca absorpcji w UV przy 280 nm i aktywnosci przeciw drobnoustrojom, laczy i zliofilizuje otrzymujac 951 mg pochodnej rdzenia ^rp^bz-N0rn-t-B0C-A-21978C.B. Usuwanie grupy t-B0C. Grupe t-BOC usuwa sie rozpuszczajac zwiazek przejsciowy w mie¬ szaninie kwasu trójfluorooctowego, anizolu i trójetylosulami (L0:1:1) w ilosci 50 mg/ml. R uplywie 3 minut w temperaturze -100°C mieszanine zateza sie a pozostaly olej uciera sie z eterem etylowym (2 x 25 ml), otrzymujac 520 mg surowego rdzenia N,^ -Cbz-A-21978C# C. Acylowanie rdzenia N^ -Cbz-A-21978C. Rdzen NTr^-Cbz-A-21978C acylu je sie w reakcji z aktywnym estrem trójchlorofenylowym. W tym celu, 520 mg R- -CBZ-A-21978C dodaje sie do roz¬ tworu 7 mg 1-hydroksybenzotriazolu i 123 mg laurynianu trójchloro fenylu w 150 ml pirydyny.Mieszanine reakcyjna miesza sie w ciagu 20 godzin w temperaturze 6o°C i nastepnie zateza, a pozostalosc uciera z eterem etylowym (3 x 25 ml) otrzymujac 350 mg rdzenia NQ -lauroilo-A- -21978C.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowych pochodnych cyklicznych peptydów A-21978C o ogólnym wzo- rze 1, w którym R, R i R sa jednakowe lub rózne i oznaczaja atom wodoru, ewentualnie pod¬ stawiona grupe C^-Ojn-alkanoilowa, grupe Cc-C^n-alkenoilowa lub grupe zabezpieczajaca grupe aminowa, taka jak grupa Ill-rz.-butoksykarbonylowa lub benzyloksykarbonylowa, a R , R i R 1 2 oznaczaja atomy wodoru, przy czym co najmniej jeden z podstawników R, R lub R ma znaczenie inne niz atom wodoru lub grupa zabezpieczajaca grupe aminowa, co najmniej jeden z podstawników 12 12 R i R oznacza atom wodoru lub grupe zabezpieczajaca grupe aminowa, R, R i R razem zawie- 1 2 raja co najmniej cztery atomy we^la, a gdy R i R oznaczaja atom wodoru lub grupe zabezpie¬ czajaca grupe aminowa, wówczas R ma znaczenie inne niz grupa 8-metylokaprynoilowa, grupa 10- metyloundekanoilowa, grupa 10-metylolauroilowa, grupa C10-alkanoilowa czynnika C. peptydu24 142 112 A-21978C lub grupy C12"alkanoilowe czynników C^ i Cc peptydu A-21978C, oraz farmakologicznie dopuszczalnych soli tych zwiazków, znamienny tym, ze rdzen cyklicznego peptydu o ogólnym wzorze 3, w którym R' i R° sa jednakowe lub rózne i oznaczaja atom wodoru lub grupe zabezpieczajaca grupe aminowa, majaca wyzej podane znaczenie, wzglednie jego pochodna zabezpie¬ czona takimi grupami jak grupa III-rz#-butoksykarbonylowa lub benzyloksykarbonylowa, ewentual¬ nie w postaci farmakologicznie dopuszczalnej soli, poddaje sie reakcji ze srodkiem acylujacym o wzorze R -COOH, w którym R oznacza ewentualnie podstawiona grupe Oj-Ojg-alkilowa lub C4-G13- -alkenylowa, wzglednie z jego aktywnym estrem, bezwodnikiem lub halogenkiem kwasowym, po czym ewentualnie usuwa sie grupe lub grupy zabezpieczajace ewentualnie obecne w produkcie, i powstaly zwiazek ewentualnie przeprowadza sie w sól, 2. Sposób wedlug zastrz, 1, znamienny tym, ze w przypadku wytwarzania U -n-kaprynoilowej pochodnej zwiazku o wzorze 1, kwas n-kaprynowy, wzglednie jego aktywny ester, bezwodnik lub halogenek kwasowy poddaje sie reakcji z NQ^n-1II-rz.butoksykarbonylo-po¬ chodna rdzenia A-21978C o wzorze 3f w którym R° oznacza grupe III-rz»-butoksykarbonylowa, a R' oznacza atom wodoru. 3r1 ho2cihYoH3 IH H02C h-N CH 0 H02C Wzór 1142 11L L-Asp D-Ala l L-Asp t L-Orn \ Gly \ Gly \ D-Ser l 3MG l L-Kyn O / L-Thr l L-Asp L-Asn t L-Trp l NH RN Wzór 2 z^4 D-Ala t L-Asp l L-Orn \ Gly -Ser L MG Lyn Gly O \ / L-Thr t L-Asp t L-Asn l L-Trp I NH; Wzór U HO H-N O NHR' N-H 0 = ,, CONH2 0< CH20 h /NH C02H H02C H-N7 ^9 ^ H~N =0 vVS* H^ -N-R° O A ^ o- H02C Wzór 3142 112 AHRN a a MRN NKH NKH2 WzórB WzórT NTH2 , NTHR * j NtHR DezocytoW}n,e - CI^Hi(g£ M^StW^ NKH2 NKHj NKHj Acylowanie zuzyciem wzót2' V wtór3' wzórV gmpy zabezpieczajacej \ Usuwanie grupy zabezpieczajacej NKH2 NKH2 NKH2 Wabr5 Wzór6 Wzór7 Schemat 1 NtHR^ Usuwanie NjHRm NKHR' jacej NKHR1 Acylowanie Wzór11 Wzór 12 NTH2 NTHR NTHR ,/NjHRn Dezacylo- / '* Acylo- ,,/ ,. Agto^ NKH2 N^j NKH2 NKHR! lKn2 Wzór5 Wz°r6 Wzór7 NtHR Usuwanie grupy _^ ' zabezpieczajacej l \ O.2 NKHR wzono Schemat 2 Wzór 9142 112 NyHB1 Usuwanie grupy (*)'-N0HR2 . . . . '\ u , zabezpieczajacej nkhr' ^- Acylowanie (*) / NTH2 NoHR2 Wzór 19 N NKHRt Wzór20 y NTH2 Usuwanie NjHB1 Selektywne nthb' grupy (*) — NQHB *',!"¦ . 1 l\ u zabezpie- N^H2 czajacej Wzór 6 Usuwanie grupy t*\/n ud usuwanie (*)-N0HB grupy Acylo- NtH1 N„H2 zabezpiecza¬ jacej i<"o»2-^ri*)x-w# zabezpiecza¬ jacej NNKH2 Wzór 16 NKH2 Wzór 17 m -(*)—N0HR2 •W Wzór 18 y NTH2 Schemat 3 NyHB1 Usuwanie NKHR jacej Wzór14 Wzór 15 NKHR PL