Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania wzorcowego roztworu hemoglobiny z czystej krwi lub masy erytrocytarnej, stosowanego jako wzorzec przy oznaczaniu stezenia hemog¬ lobiny w krwi obwodowej.W Polsce nieznane sa sposoby otrzymywania wzorcowych roztworów hemoglobiny, które odpowiadalyby parametrami roztworom znanych firm zagranicznych, takich jak: Dade-Szwaj- caria, Baker — USA czy Technicon-USA. Celem wynalazku bylo wyeliminowanie kosztownego importu i usuniecie wynikajacych z tego faktu niedogodnosci.Cel ten osiagnieto poprzez opracowanie sposobu otrzymywania wzorcowego roztworu hemoglobiny z czystej krwi lub masy erytrocytarnej po okresie jej przydatnosci do przetaczania.Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze pelna krew lub mase erytrocytarna plucze sie dwukrotnie roztworem chlorku sodu o stezeniu 0,15 molowym. Po oddzieleniu sie supernatantu dodaje sie do gestej masy erytrocytarnej okolo 1/3 objetosci jalowej wody redestylowanej i po dokladnym zmieszaniu po okolo 30 minutach zamraza sie w lazni alkoholowej wraz z zestalonym dwutlenkiem wegla o temperaturze minus 50°C. Nastepnie naczynie zhemolizatem umieszczasie w zamrazarce w temperaturze minus 25°C. Po uplywie jednej doby preparat rozmraza sie stopniowo do temperatury pokojowej, po czym hemolizat zlewa sie do naczynia i odwirowuje sie przy sile odsrodkowej 4000 g. Po ponownym zlaniu do jalowego naczynia doprowadza sie stezenie hemog¬ lobiny do zamierzonej wartosci woda destylowana i po dokladnym wymieszaniu saczy seprzezfiltr membramowy o porowatosci 0,22 mikrometra do zbiorczego naczynia i rozlewa do jalowych fiolek.Przyklad. 250 ml pojemnik krwi stanowiacy wyjsciowa objetosc substratu wiruje sie przez 15 miunut wirówka np. We-2przy 3000 obr/min. Po czym zlewa sie nadsacz a do pozostalej masy erytrocytarnej dolewa sie roztworu chlorku sodu (NaCl) o stezeniu 0,15 molowym w ilosci uzupel¬ niajacej wyjsciowa objetosc pojemnika. Ponownie wiruje sie w sposób podany wyzej. Po odwiro¬ waniu zlewa sie nadsacz a do pozostalych erytrocytów dolewa sie ponownie roztworu chlorku sodu i postepuje jak poprzednio. Po ponownym zlaniu nadsaczu objetosc pozostalych erytrocytów odczytuje sie z podzialki na pojemniku. Nastepnie dodaje sie jalowej wody redestylowanej w ilosci stanowiacej 1/3 objetosci erytrocytów. Np. jezeli otrzymano 120ml erytrocytów, to nalezy dodac2 143 415 40 ml wody.Hemolize uzyskana przez dodanie wody i dokladne wymieszanie umieszcza sie wlazni alkoholowej wraz z zestalonym dwutlenkiem wegla o temperaturze minus 50°C i zmraza sie po okolo 30 minutach.Nastepnie naczynie z uzyskanym hemolizatem umieszcza sie w zamrazarce w temperaturze minus 25°C na okres jednej doby. Po uplywie tego czasu preparat rozmraza sie w temperaturze pokojowej. Zlany do jalowego naczynia hemolizat wiruje sie przez 30 minut przy sile odsrodkowej 4000 g. Po zlaniu nadsaczu oznacza sie stezenie hemolizatu hemoglobiny metoda Drabkina (klasy¬ czna metoda oznaczania stezenia wedlug wzorca) i doprowadza sie woda destylowana stezenie hemolizatu do zamierzonej wartosci. Po dokladnym wymieszaniu roztwór saczy sie przez filtr membramowy o porowatosci 0,22 mikrometra i rozlewa do jalowych fiolek. Podstawowym para¬ metrem hemolizatu jest jego widmo.Wykres widma wzorcowego roztworu hemoglobiny wedlug wynalazku przedstawionyjest na rysunku, gdzie oznaczono: E — ekstynkcje (wartosc absorpcji) A — dlugosc fali, wykazuje maksimum absorpcji E = 0,320 jednostki absorpcji przy dlugosci fali ^ — 540 nm, minimum absorpcji E = 0,200 jednostki absorpcji przy dlugosci fali A — 504 nm. Wspólczynnik van Kam- pena (iloraz wartosci absoprcji maksymalnej do minimalnej (jest równy: 0,320 = 1,60 przy tolerancji 0,02 0,200 Analize widma i stezenia przeprowadza sie na spektrofotometrze. Jezeli wzorzec, do którego porównujemy otrzymany wedlug wynalazku wzorcowy roztwór hemoglobiny ma stezenie 16 g/dl, wartosc jego ekstynkcji E = 0,500 a ekstankcja otrzymanego roztworu w zalozeniu wynosi E = 1,000, to stezenie hemoglobiny obliczamy z proporcji: 0,500:16 = 1,000: X 16X1,000 X= =32 g/dl 0,500 zatem stezenie otrzymanego wedlug wynalazku roztworu hemoglobiny wynosi 32 g/dl, które za pomoca wody destylowanej doprowadza sie do zamierzonej wartosci. Wzorcowe roztwory wyko¬ nuje sie w trzech stezeniach: ponizej normy (8-14g/dl), w zakresie normy (14-16g/dl) i powyzej normy (16-18 g/dl). Wzorcowe roztwory rozprowadza sie w zestawach. Do zestawu dodaje sie odwazke odczynnika Drabkina do rozpuszczenia wjednym litrze. Oznaczenia stezenia sa zgodne z metoda zalecana przez Europejski Komitet Standaryzacji Metod w Hematologii. Miano stezenia oznacza sie w jednostkach dotychczasowych (g/dl) i w ukladzie SI (mmol). Wzorcowy roztwór hemoglobiny stosowanyjestjako wzorzec przy oznaczaniu stezenia hemoglobiny w krwi obwodo¬ wej w labolatoriach, ponadto do kalibracji, kontroli dokladnosci i odtwarzalnosci w kontroli wewnatrz- i miedzylabolatoryjnej.Zastrzezenie patentowe Sposób otrzymywania wzorcowego roztworu hemoglobiny, znamienny tym, zepelna krew lub mase erytrocytarna plucze sie dwukrotnie roztworem chlorku sodu o stezeniu 0,15 molowym, po oddzieleniu sie supernatantu dodaje sie do gestej masy ertyrocytarnej okolo 1/3 objetoscijalowej wody redestylowanej i po dokladnym zmieszaniu po okolo 30 minutach zamraza sie w lazni alkoholowej wraz z zestalonym dwutlenkiem wegla o temperaturze minus 50°C, nastepnie naczynie z hemolizatem umieszcza sie w zamrazarce w temperaturze minus 25°C, po uplywie jednej doby preparat rozmraza sie stopniowo do temperatury pokojowej, po czym hemolizat zlewa sie do naczynia i odwirowywuje sie przy sile odsrodkowej 4000 g, po ponownym zlaniu do jalowego naczy¬ nia, doprowadza sie stezenie hemoglobiny do zamierzonej wartosci woda destylowana i po doklad¬ nym wymieszaniu saczy sie przez filtr membranowy o porowatosci 0,22 mikrometra do zbiorczego naczynia i rozlewa do jalowych fiolek.143415 £ c Ui PLThe subject of the invention is a method of obtaining a standard hemoglobin solution from pure blood or erythrocyte mass, used as a standard in determining the concentration of hemoglobin in peripheral blood. In Poland, there are no known methods of obtaining standard hemoglobin solutions that would correspond to the parameters of solutions of well-known foreign companies, such as: Dade -Switzerland-caria, Baker - USA or Technicon-USA. The aim of the invention was to eliminate the costly import and to eliminate the resulting inconveniences. This aim was achieved by developing a method of obtaining a standard hemoglobin solution from pure blood or erythrocyte after its useful life for transfusion. The method according to the invention consists in using whole blood or erythrocyte mass. rinses twice with 0.15 molar sodium chloride solution. After separation of the supernatant, about 1/3 of the volume of the sterile redistilled water is added to the thick erythrocyte mass and, after thorough mixing, after about 30 minutes, it is frozen in an alcohol bath with solidified carbon dioxide at a temperature of minus 50 ° C. Then the vessel with hemolysate is placed in the freezer at minus 25 ° C. After one day, the preparation is gradually thawed to room temperature, then the hemolysate is poured into a vessel and centrifuged at a centrifugal force of 4,000 g. After re-decanting into the sterile vessel, the hemoglobin concentration is adjusted to the desired value with distilled water and, after thoroughly mixing the slices, is seped through a 0.22 micron membrane filter into a collecting vessel and poured into sterile vials. The 250 ml blood container, which is the starting volume of the substrate, is spun for 15 minutes in a centrifuge e.g. We-2 at 3000 rpm. The supernatant is then decanted, and the sodium chloride (NaCl) solution of 0.15 molar concentration is added to the rest of the erythrocyte mass to make up the original volume of the container. It spins again as described above. After centrifugation, the supernatant is decanted, and the remaining erythrocytes are re-poured with sodium chloride solution and the procedure is as before. After refilling the supernatant, the volume of the remaining erythrocytes can be read from the graduation on the container. 1/3 of the redistilled sterile water is then added. For example, if you have obtained 120 ml of erythrocytes, add 40 ml of water. The hemolysis obtained by adding water and thoroughly mixing it is placed in an alcohol bath with solidified carbon dioxide at a temperature of minus 50 ° C and it freezes after about 30 minutes. the obtained hemolysate is placed in a freezer at minus 25 ° C for one day. After this time, the preparation is thawed at room temperature. The hemolysate poured into a sterile vessel is centrifuged for 30 minutes at a centrifugal force of 4,000 g. After decanting the supernatant, the hemoglobin concentration is determined using the Drabkin method (classic method for determining the concentration according to the standard) and distilled water is adjusted to the desired value. After thorough mixing, the solution is filtered through a membrane filter with a porosity of 0.22 micrometers and poured into sterile vials. The basic parameter of the hemolysate is its spectrum. The spectrum of the standard hemoglobin solution according to the invention is presented in the figure where: E - extinction (absorption value) A - wavelength, shows the maximum absorption E = 0.320 absorption units at a wavelength of ^ - 540 nm , minimum absorption E = 0.200 absorption units at wavelength A - 504 nm. The van Kampen coefficient (quotient of the maximum to minimum absorption value (equal to: 0.320 = 1.60 with a tolerance of 0.02 0.200 The analysis of the spectrum and the concentration is performed on a spectrophotometer. If the standard to which we compare the standard hemoglobin solution obtained according to the invention has the concentration 16 g / dl, its extinction value is E = 0.500 and the extinction of the obtained solution is assumed to be E = 1.000, then the hemoglobin concentration is calculated from the ratio: 0.500: 16 = 1.000: X 16X1.000 X = = 32 g / dl 0.500, therefore the concentration obtained According to the invention, the hemoglobin solution is 32 g / dl, which is adjusted to the desired value with distilled water. Standard solutions are made in three concentrations: below the norm (8-14 g / dl), within the normal range (14-16 g / dl). ) and above the norm (16-18 g / dl) Standard solutions are distributed in kits A weight of Drabkin's reagent is added to the kit to be dissolved in one liter Concentration determinations are in accordance with the method recommended by the European Committee t Standardization of Methods in Hematology. The concentration titer is denoted in the current units (g / dl) and in the SI system (mmol). The standard hemoglobin solution is used as a standard in the determination of peripheral hemoglobin concentration in the peripheral blood in laboratories, and for calibration, accuracy and reproducibility control in intra- and interlabolatory control. Patent disclaimer. twice with a sodium chloride solution of 0.15 molar concentration, after separating the supernatant, about 1/3 of the volume of redistilled water is added to the dense erythrocyte mass, and after thorough mixing after about 30 minutes, it is frozen in an alcohol bath with solid carbon dioxide with a temperature of minus 50 ° C, then the vessel with hemolysate is placed in the freezer at minus 25 ° C, after one day, the preparation is gradually thawed to room temperature, then the hemolysate is poured into the vessel and centrifuged at a centrifugal force of 4000 g, then poured back to room temperature. a barren vessel, lead it After the hemoglobin concentration reaches the desired value, distilled water is thoroughly mixed and filtered through a membrane filter with a porosity of 0.22 micrometers into a collecting vessel and poured into sterile vials. 143415 £ c Ui PL