PL143999B1 - Process for preparing novel antibiotic - Google Patents

Description

******* Zgloszenie ogloszono: 83 04 11 Opis patentowy opublikowano: 88 08 31 143 999 Int CL4 A23K 1/17 Twórca wynalazku Uprawniony z patentu: Rikagaku Kenkyushof Hirosawa; Kaken Pharmaceutical Co., Ltd., Tokio /Japonia/ Srodek przyspieszajacy wzrost i zwiekszajacy efektywno&c zywienia Przedmiotem wynalazku jest srodek przyspieszajacy wzrost i zwiekszajacy efektywnosc zy¬ wienia drobiu i zwierzat domowych.Pewne antybiotyki znalazly szerokie zastosowanie jako dodatki paszowe, przyspieszajace wzrost zwierzat i drobiu i zwiekszajace nosnosc jaj* Podawanie zwierzetom tych samych anty¬ biotyków co czlowiekowi powoduje pojawianie sie opornych szczepów, co moze miec szkodliwy wplyw na leczenie ludzi. Ponadto istnieje niebezpieczenstwo akumulacji antybiotyku w ciele zwierzecia i wprowadzanie tego antybiotyku do organizmu czlowieka ze spozywanym mie gez.Poszukujac nowych antybiotyków, z próbek gleby pobranych w róznych miejscach izolowano mikroorganizmy i badano wytwarzane przez nie antybiotyki. W wyniku tych badan znaleziono nowy antybiotyk, oznaczony symbolem 76-11, nieznany dotychczas w literaturze. Antybiotyk ten jest wytwarzany przez nowo-wyizolowany mikroorganizm i jest akumulowany w jego komór¬ kach i w pozywce hodowlanej.Badania nad czynnikami przyspieszajaoyrai wzrost doprowadzily do stwierdzenia, ze podawa¬ nie antybiotyku 76-11 zwierzetom domowym i drobiowi przyspiesza produkcje kwasu propionowe- go w narzadach trawiennych i inhibituje wzrost lepkosci cieczy zwaczowej. Wiadomo, ze wspól¬ czynnik utylizacji energii w ciele zywego zwierzecia jest dla kwasu propionowego wyz3zy niz dla innych lotnych kwasów tluszczowych, takich jak octowy czy maslowy. Na podstawie rr/zej opisanych faktów wykazano, ze antybiotyk 76-11 moze byó znakomitym czynnikiem przyspisczaja¬ cym wzrost zwierzat domowych i drobiu i zwiekszajacym efektywnosc zywienia.Powyzsze odkrycia staly sie podstawa wynalazku. Wedlug wynalazku srodek przyspieszajacy wzrost i zwiekszajacy efektywnosc zywienia zwierzat domowych i drobiu, stosowany ja/.:) doda¬ tek do pasz jako substancje czynna zawiera antybiotyk oznaczony symbolem 76-11t wykazujacy nastepujace wlasciwosci fizykochemiczne i biologiczne: /1/ analiza elementarnas wolny kwas: C 62,61# H 8,27% N &A sól sodowa: C 60,57$ H 8,04$ N 05$.2 143 999 /2/ ciezar czasteczkowy 843 /z miareczkowania/ 873 /pomiar spektrometria masowa/; /3/ temperatura topnienia: wolny kwas : 108-112°C sól sodowaj 210-212°C /z rozkladem/; IM skrecalnosc wlasciwa l~cC/ + 36f6° /C » 0f382 w roztworze chloroformowy^; D 151 widmo absorpcji w nadfiolecie: w metanolu 1 metanolu z HC1 »? mai - 217 » /» 'E !* 303/ C 1 cm 1# 262 m /i /E 1 cm 182/ 301 m fx /E 1* 68/ 1 cm w zasadowym metanolu H-,-260- /i/*1*^ 87/ 308 m yu /B 1* 59/; 1 cm /6/ widmo absorpcji w podczerwieni glówne pasma absorpcji w plytce KBr: wolny kwas: 3450, 2960f 1720, 1640, 1610, 1578, 1446, 1380, 1315, 1292, 1250, 1209, 1151, 1100, 1035, 975, 940 cm"1. sól sodowa: 3390, 2960, 1718, 1640, 1609, 1578, 1450, 1380, 1340, 1316, 1250, 1197, 1152, 1106, 1092, 1060, 1040, 1002, 980, 930 cm"1; Ul rozpuszczalnosc: latwo rozpuszczalny w benzenie, chloroformie, octanie etylu i acetonie, rozpuszczalny w metanolu, etanolu i dwumetyloformamidzie, bardzo slabo rozpuszczalny w wodzie i heksanie; l&l reakcje barwne: dodatnia reakcja z nadmanganianem potasu, ujemna z kwasem na&jodowyui-benzydyna; 191 odczyn: substancja kwasowa, pKft 4,6 /w 66,7% dioksanie/; /10/ barwa: bezbarwne krysztaly; /11/ czynnosc przeoiwbakteryjna: hamowanie wzrostu Grara-dodatnich cocci, bacilli i bakterii kwasoodpornych w stezeniu 0,4 mcg/ml.Antybiotyk 76-11 wytwarza sie przez hodowle mikroorganizmu zdolnego do syntezowania antybiotyku 76-11, nalezacego do rodzaju Actinomadura i nastepnie wyodrebnianie antybiotyku z cieczy pofermentacyjnej* Na rysunku fing. 1 przedstawiono widmo absorpcji w nadfiolecie antybiotyku 76-11 /w pos¬ tacji wolnego kwasu/, a na rysunkach fig. 2 i 3 - widma absorpcji w podczerwieni tego an¬ tybiotyku /w pastylce KBr/, odpowiednio w postaci soli sodowej i wolnego kwasu.Mikroorganizmy stosowane do wytwarzania substancji czynnej srodka i paszy wedlug wyna¬ lazku naleza do rodzaju Actinomadura i sa zdolne do wytwarzania antybiotyku 76-11. Jednym z przykladów takiego mikroorganizmu jest Sp. 76-11, który nalezy do rodzaju Actinomadura i ma nizej opisane wlasciwosci mikrobiologiczne. W srodku wedlug wynalazku mozna stooowac nie tylko naturalne lub sztuczne mutanty Sp. 76-11, lecz równiez wszystkie szczepy nalezace do rodzaju Actinomadura i zdolne do wytwarzania antybiotyku 76-11. Szczep Sp 76-11 zostal zlozony i jest dostepny w Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science143 999 3 and Teohnology, Ministerstwa Miedzynarodowego Handlu i Przemyslu, Japonia, International Depositary Authority /dalej okreslany jako "PERM11/ pod numerem PERM BP-83/* Mikroorganizm Sp* 76-11 ma mastepujace wlasciwosci mikrobiologiczne* Wlasciwosci Sp* 76-11 na róznych pozywkach hodowlanych obserwowano 20 do 30 dni po inoku- lacji* Odcienie barw podane w nawiasie zgodne Ba z Desorlption Cplor Name Dictionary* /I/ Morfologia Sp. 76-11 rozwija sie na agarze z maka owsiana i na agarze z ekstraktem slodowym i z ekstraktem z drozdzy, lecz nie rozwija sie lub prawie nie rozwija sie na innych pozywkach 1 dlatego obserwowano morfologie na pozywkach agar z maka owsiana, agar z wyciagiem slodo¬ wym i wyciagiem z drozdzy i cieklej 3% pozywce z maka owsiana* Otrzymano nastepujace wyniki; /1/ Grzybnia substratowa Grzybnia w podlozu rozciaga sie i rizgalezia w pozywkach agarowych 1 cieklych* Po dlugim okresie hodowli grzybnia substratowa dzieli sie z wytworzeniem eliptycznych zarodników wielkosci 0,8-1,2 z 1,5-1,7 mikrometrów* Grzybnia powietrzna nie powstaje na róznych pozyw¬ kach hodowlanych lecz na agarze z maka owsiana po hodowli w temperaturze 33°C w ciagu ponad 20 dni czasami formuje sie cienka grzybnia powietrzna, zgieta i w ksztalcie sznura lub peku sznurów, nieco rozgaleziona, nie tworzy zarodników* /11/ Grzybnia powietrzna Nie powstaje na róznych pozywkach hodowlanych, lecz czasami powstaje na agarze z maka owsiana, przy hodowli w ciagu ponad 30 dni* Uformowana grzybnia powietrzna jest nieregular¬ nie pozginana. Obecnosci zarodników nie stwierdzono pod mikroskopem elektronowym* /II/ Sklad komórek Sp* 76-11 hodowano w pozywce zawierajacej 1# glikozy, 1$ ekstraktu z drozdzy i 0,1% maki owsianej, w temperaturze 33°C, w ciagu 7 dni, przy wstrzasaniu. Komórki zebrano i przemyto, otrzymujac próbke do analizy na sklad komórek* Analizowano kwas dwuaminopimeli¬ nowy i sklad cukrów* Stwierdzono obecnosc kwasu dwuaminopimelinowego typu mezo, galaktoze i maduroze./III/ Wzrost na róznych pozywkach hodowlanych /a/ Agar z sacharoza i azotanem /agar Czapeck#a/: Wzrost: bardzo slaby. Nieznaczny wzrost obserwuje sie po 30 dniach hodowli* Kolonia jest przejrzysta. Powierzchnia barwy jasnobrazowej /2 cg/, spód barwy jasnej kosci sloniowej /2 ca/* Grzybnia powietrzna: nie powstaje Rozpuszczalny pigment: nie powstaje /b/ Agar glikozowo-asparaginowy: Nie obserwuje sie wzrostu* /c/ Agar glicerynowo-asparaginowy: Nie obserwuje sie wzrostu, /d/ Agar z solami nieorganicznymi i skrobia: Wzrost: bardzo slaby* Nieznaczny wzrost obserwuje sie po 30 dniach* Powierzchnia ma barwe jasnozóltobrazowa /3 gc/, spód zóltobrazowa /3 ic/* Grzybnia powietrzna: nie powstaje* Rozpuszczalny pigment: nie powstaje /e/ Agar tyrozynowy Wzrost: bardzo slaby. Powierzchnia barwy jasnózóltej /3ca/, spód barwy jasnej kosci slo¬ niowej /2 ca/.Grzybnia powietrzna: nie powstaje Rozpuszczalny pigment: nie powstaje /f/ Agar odzywczy: Wzrost: bardzo slaby. Po 30 dniach powierzchnia i spód barwy jasnej kosci sloniowej /2 ca/*4 143 999 Grzybnia powietrzna: nie powstaje Rozpuszczalny pigment: nie powstaje /&/ Agar z ekstraktem z drozdzy i ekstraktem slodowym /ISP No, 2/t Wzrosts dobry* Powierzchnia ma postac bruzdowatej, twardej powloki, zarówno powierzchnia jak i spód barwy jasnobrazowej /2 ne/f czasami niebieskawej/10 ie/.Grzybnia powietrzna: po dlugim okresie hodowli powstaje bialawej barwy grzybnia powietrzna.Rozpuszczalny pigment: nie powstaje /h/ Agar z maka owsiana /ISP No. 3/l Wzrost: dobry* Powierzchnia jest gladkar o charakterze powloki, barwy indygowo-niebieskiej /10 ie/f a spód barwy bialej* w koncu indygowo-niebieskiej /10 ne/.Grzybnia powietrzna: po 30 dniach powstaje grzybnia powietrzna barwy bialej* Rozpuszczalny pigment: nie powstaje /i/ Agar z peptonem, ekstraktem z drozdzy i zelazem /ISP Ho* 6/: Nie obserwuje sie wzrostu /j/ Odtluszczone mleko /37°C/ Wzrost: powolny* Koagulacja i peptonizacja, /k/ Zelatyna z glikoza i peptonem /2Q°C/: Wzrost: bardzo powolny. Obserwuje sie uplynnienie /IV/ Wlasciwosci fizjologiczne /a/ Optymalna temperatura dla wzrostu: 27 do 37°C, najkorzystniejsza 33 do 37°C /b/ Uplynnianie zelatyny: tak /c/ Hydroliza skrobi: nie /d/ Odtluszczone mleko: koagulacja i slaba peptonizacja /e/ Powstawanie pigmentu melanino-podobnego: nie Ul Opornosc na kwas /V/ Utylizacja róznych zródel wegla: Sp. 76-11 hodowano na agarze Pridhama i Gottlieba /ISP No* 9/ produkcja Difco Co./ zawierajacym rózne cukry, lecz nie obserwowano wzrostu i dlatego uzyto wyzej opisanej pozywki, do której dodawano 0,1% ekstraktu z drozdzy. Otrzymano nastepujace wyniki: L-arabinoza +++ D-ksyloza +++ D-glikoza +++ D-fruktoza ?++ sacharoza +++ 1-inozyt ++ L-ramnoza ++++ rafinoza ++ mannit +++ kontrola ^ Ocena: ++-H- : bardzo dobry wzrost +++ : dobry wzrost ++ s wzrost + : kontrola Charakterystyka Sp* 76-11 Sp, 76-11 mozna pokrótce scharakteryzowac nastepujaco: /a/ Morfologia:143 999 5 Sp* 76-11 na ogól nie tworzy grzybni powietrznej, lecz ozasami tworzy ja po dlugim okre¬ sie hodowli* Grzybnia substratowa jest pozginana, a w ostatnia okresie hodowli dzieli sie, z wytworzeniem eliptycznych zarodników* Grzybnia jest Oram dodatnia i odporna na kwas* /b/ Wzrost na róznych pozywkacht Sp. 76*11 nie rozwija sie lub prawie nie rozwija sie na róznych pozywkach, poza agarem z ekstraktem z drozdzy i ekstraktem slodowym* Szczep rozwija sie najlepiej na agarze z maka owsiana i po 3 do 4 tygodniach hodowli tworzy w komórkach nierozpuszczalny w wodzie pigment nlebieski-indygo* /o/ Wlasciwosci fizjologiczne! Szczep rozwija sie dobrze w temperaturze 33-37°C, lekko uplynnia zelatyne* koaguluje 1 peptonizuje odtluszczone mleko i nie tworzy pigmentu melaninowego* /d/ Utylizacja cukru: Szczep utylizuje dobrze L-arabinoze , D-ksyloze, D-glikoze, D-fruktoze, sacharoze, 1-ino- zytf L-rammoze, rafinoze i mannit na agarze Pridhama i Gottlieba z dodatkiem 0,1% ekstraktu z drozdzy* Jak wyzej opisano* Sp* 76-11 okazuje sie szczepem nalezacym do Actinomycetes* rodzaju Actinomadura, na podstawie morfologii zarodników i grzybni* wzrostu na róznych pozywkach i skladu sciany komórkowej* Jednakze przez porównanie charakterystyki Sp* 76-11 z charakte¬ rystyka opisana w Nonomura* H and Y* Oharas Distrubution of Actinomycetes in Soli* XI* Some New Species of the Genus Actionomadura* Lechebalier i inni* J* Ferment* Technol. 49:904-912, 1971 .Preobrazhenakaya, T*P*j 1I*A* Sveshnikova and L*F* Perekhoya: Key for Identification of the Species of the Genus Actinomadura* The Biology of the Actinomycetes and Related Organisms 12: 30-38* 1977: stwierdzono* ze nigdzie nie opisano tam szczepów produkujacych pigment niebieski-indygo w komórkach na agarze z maka owsiana, jak to ma miejs¬ ce w przypadku Sp* 76-11* Z powyzszego wynika, ze Sp* 76-11 jest nowym szczepem nalezacym do rodzaju Actinomadura* Mikroorganizm wytwarzajacy 76-11 hoduje sie sposobem konwencjonalnym w produkcji antybio¬ tyków* Sposób hodowli nie ma szczególnego znaczenia i mozna hodowle prowadzic « pozywce plynnej lub stalej* tf celu prowadzenia hodowli na skale przemyslowa i korzystnie, zaleca sie przyjac sposób, w którym pozywke hodowlana inokuluje sie zawiesina zarodników lub ho¬ dowla mikroorganizmu wytwarzajacego antybiotyk 76-11, a hodowle prowadzi sie przy napowietrza¬ niu i mieszaniu* zródla odzywcze stosowane w hodowli antybiotyku 76-11 nie maja szczególnie decydujacego znaczenia* Stosuje sie dowolne zródla odzywcze zwykle stosowane do hodowli mikroorganizmów* Jako zródlo wegla stosuje sie skrobie* dekstryne, gliceryne, glikoze, sacharoze, galaktoze, inozyt, mannit, itp. a jako zródlo azotu make owsiana* drozdze, pepton, proszek sojowy, ekstrakt z miesa, otreby ryzowe, otreby pszenne, mocznik, namok kukurydziany, sole amonowe,' azotanyiinne organiczne i nieorganiczne zwiazki azotu* Jezeli to jest pozadane, stosuje sie dodatek innych soli nieorganicznych, jak chlorek sodu, fosforany, lub sole potasu, wapnia, cynku, manganu i zelaza. Gdy zachodzi potrzeba, do pozywki mozna dodawac oleje zwie¬ rzece, roslinne lub mineralne. Warunki hodowli takie jak temperature i czas mozna dcbierac odpowiednio dla uzyskania maksymalnej produkcji antybiotyku 76-11. Hodowle prowadzi sie w zakresie pH 4 do 9t korzystnie okolo 7f w temperaturze 25-35°C, korzystnie w temperaturze 28 do 33°C, przez okolo 5 do 20 dni, korzystnie okolo 5 do 11 dni.Jednakze nalezy rozumiec, ze takie warunki hodowli jak sklad pozywki, pH, temperatura, mieszanie mozna odpowiednio zmieniac, dla uzyskania wyników optymalnych dla danego szczepu i warunków zewnetrznych* Po zakonczeniu fermentacji brzeczke poddaje sie np. wirowa::iu, w celu oddzielenia komórek od roztworu* Wytworzony antybiotyk 76-11 wydziela sie z brzeozki dowolnym znanym sposobem, zwykle stosowanym do wydzielania metabolitu. Przykladowo, 3tosujee 143 999 sie9 jezeli to jest konieczne wielokrotnie, sposób wykorzystujacy róznice rozpuszczalnosci antybiotyku 76-11 i zanieczyszczen, róznice ich powinowactwa adsorpcji lub kombinacje tych róznic* Antybiotyk 76-11 wystepuje zarówno w plynie hodowlanym jak i w komórkach i moze byc ekstrahowany z plynu hodowlanego za pomoca octanu etylu lub butylu, chloroformu, butanolu, itp*, dzieki róznicy rozpuszczalnosci w srodowisku wodnym i organicznym* Komórki ekstrahuje sie acetonem zawierajacym wode, po czym pod zmniejszonym olsnieniem odparowuje sie organicz¬ ny rozpuszczalnik* a wodny roztwór ekstrahuje sie octanem etylu lub podobnym rozpuszczalni¬ kiem* Oba ekstrakty laczy sie i odparowuje* otrzymujac surowy ekstrakt antybiotyku 76-11* Poniewaz surowy ekstrakt zawiera duza ilosc zanieczyszczen wydziela sie go metoda chroma¬ tografii adsorpcyjnej na zelu krzemionkowym, tlenku glinu itp*, a nastepnie oczyszcza* Przykladowo, surowy ekstrakt rozpuszczony w malej ilosci benzenu wprowadza sie na kolumne z ±elem krzemionkowym, uprzednio kondycjonowana benzenem* Eluoje prowadzi sie benzenem o wzrastajacej zawartosci octanu etylu* Bluat frakcjonuje sie przy uzyciu kolektora frakcji* Frakcje wykazujace czynnosc biologiczna zbiera sie i odparowuje, otrzymujac oczyszczony proszek* W celu dalszego oczyszczenia, powtarza sie chromatografie na zelu krzemionkowym.Dalsze oczyszczanie przeprowadza sie za pomoca preparatywnej chromatografii cienkowarstwo¬ wej, jezeli to jest konieczne* Odparowanie pod zmniejszonym cisnieniem daje oczyszczony produkt, który rozpuszcza sie w malej ilosci metanolu i ochladza, co powoduje wydzielenie antybiotyku 76-11 w postaci bezbarwnych krysztalów* Krysztaly odsacza sie i suszy, otrzy¬ mujac czysty antybiotyk 76-11* Tak otrzymany antybiotyk 76-11 wykazuje podane powyzej wlasciwosci fizykochemiczne i biologiczne* Czynnosc przeciwbakteryjna antybiotyku 76-11 jest nastepujaca: I Badany mikroorganizm 1 1 Staphylococcus aureus 209 P Staphylocoocus aureus /wleloopomy/ Baclllus subtllis PC 1219 Baoillus subtllis H 17 I Baclllus subtllis M 45 /reo~/ I Mycobacterlum SP 607 I Uacobacterlum phlel Mycobakterium avium Escherlchia ooli Salmonella typhimurium Najmniejsze stezenie hamujace wzrost / Aunog/ml/ 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 100 100 Czynnosc wobeo komórek rakowych: Antybiotyk 76-11 wykazuje indukcje róznicowania wobec bialaczki Pricoda i komórek bia¬ laczki szpikowej w stezeniu 1 do 100 racg/ml# Toksycznosc wobec myszyj Doustne podawanie 50, 100 i 200 mg/kg antybiotyku 76-11 w pos¬ taci zawiesiny w karboksymetylocelulozie nie wykazalo toksycznosci u myszy* 2 porównania fizykochemicznych i biologicznych wlasciwosci antybiotyku 76-11 z wlasciwosciami znanych antybiotyków wynika, ze antybiotyk 76-11 mozna sklasyfikowac jako tak zwany antybiotyk polieterowy jonoforowy, poniewaz jest on substancja kwasna, a jego sól sodowa jest rozpuszczalna w oleju; wykazuje silna aktywnosc wobec bakterii Gram-dodatnich i bakterii odpornych na kwas, nie zawiera azotu w strukturze czasteczkowej itp. Jednakze zadna ze znanych substancji nie wykazuje takich samych wlasciwosci fizykochemicznych, zwlaszcza takich samych pasm absorpcji w nadfiolecie, a wiec antybiotyk 76-11 jest nowym antybiotykiem.143 999 7 Antybiotyk 76-11 moina podawac drobiowi jako taki lub w postaci dodatku paszowego* Przy¬ kladani materialu paszowego sa maka jeczmienna, maka pszenna, maka zytnia, maka kukurydziana, maczka sojowa, wytloki sojowe, wytloki z nasienia kapusty, otreby ryzowe* otreby odolejone, bialy proszek ziemniaczany, proszek z batatów, skrobie innego rodzaju, drozdze, maczka rybna, pozostalosci po fermentacji i podobne* Antybiotyk 76-11 mozna równiez dodawac do pewnych konwencjonalnych dodatków paszowych, takich jak rózne witaminy, mineraly, srodki konserwu¬ jace, preparaty enzymatyczne, bialka, weglowodany, aminokwasy, srodki przeciwgoraczkowe, czyn¬ niki uspakajajace, czynniki przeciwzapalne i srodki mikrobobojeze* Zawartosc substancji czynnej zmienia sie w zaleznosci od rodzaju, wieku, drobiu i zwykle miesci sie w zakresie od okolo 5 do 200 ppm, korzystnie 10-100 ppm* Antybiotyk dodaje sie do paszy lub wody pitnej, jako taki lub w postaci zawiesiny lub roztworu w rozcienczalniku lub w postaci proszku, tabletki, kapsulki, granulki lub pigulki, które mozna wytwarzac przez mieszanie antybiotyku 76-11 z fizjologicznie nieszkodliwym sta¬ lym lub cieklym rozcienczalnikiem* W przypadku dodawania do paszy, korzystnie stosuje sie uprzednio sporzadzona przedmieszke• Frzedmieszke mozna wytwarzac przez zmieszanie oczyszczo¬ nych lub surowych produktów lub komórek zawierajacych substancje czynna z dopuszczalnym fizjologicznie, stalym lub cieklym nosnikiem*Przykladami nosnika stalego sa maka pszenna, maka sojowa, otreby ryzowe, maka kukurydziana, skrobia, glikoza, drozdze, maczka rybna, talk, ziemia okrzemkowa itp*, a przykladami nosnika cieklego fizjologiczny roztwór soli, destylo¬ wana woda, fizjologicznie dopuszczalne rozpuszczalniki organiczne itp* Antybiotyk ten mozna mieszac z innymi odpowiednimi substancjami pomocniczymi lub dodat¬ kami, takimi jak czynniki emulgujace, dyspergujace, zawieszajace, zwilzajace, zatezajace lub zelatynizujace, czynniki mikrobobójcze, preparaty enzymatyczne, antybiotyki, preparaty laktobacilli* Zawartosc substancji czynnej w mieszance wstepnej mozna odpowiednio zmieniac, w zalez¬ nosci od gatunku zwierzecia domowego lub drobiu* Stezenie antybiotyku 76-11 w srodku przyspieszajacym wzrost i efektywnosc zywienia mozna zmieniac w zaleznosci od gatunku i wieku zwierzecia itp* Przykladowo, ptakom domo¬ wym, jak kury, przepiórki, indyki, perliczki, kaczki, gesi itp* podaje sie w postaci paszy zawierajacej antybiotyk 76-11 w ilosci 5-200 ppm, korzystnie 10-100 ppm, Zawartosc substancji czynnej w paszy korzystnie wynosi 5-200 ppm, a zwlaszcza 10-100 ppm w przy¬ padku trzody chlewnej, królików itp*, a 1-100 ppm, zwlaszcza 2-50 ppm w przypadku zwie¬ rzat przezuwajacych, jak bydlo, owce, kozy itp* Stosowany w srodku wedlug wynalazku antybiotyk 76-11 roa niska toksycznosc i te zalete, ze jego podawanie lacznie z innym antybiotykiem zwierzetom domowym 1 drobiowi zasadniczo nie wywoluje dzialan ubocznych* Podawanie antybiotyków polieterowych, takich jak Salinomy- cyna I ilonencyna, w zwyklej dawce, lacznie z trojacetylo-eleandomycyna lub Pleuromutilina w postaci fumaranu, w zwyklej dawce, zwierzetom domowym lub drobiowi zwykle powoduje czaso¬ wy brak laknienia, paraliz tylnych konczyn itp* i dlatego nalezy unikac podawania antybio¬ tyku polieterowego równoczesnie lub prawie równoczesnie z tymi substancjami* Natomiast nie ma takiego niebezpieczenstwa w przypadku antybiotyku 76-11, który jest znakomitym czynnikiem przyspieszajacym wzrost i zwiekszajacym efektywnosc zywienia zwierzat domowych i drobiu.Podawanie srodka wedlug wynalazku zwierzetom domowym i drobiowi przyspiesza tworzenie kwasu propionowego w narzadach trawiennych i hamuje wzrost lepkosci cieczy zwaczowej, czego wynikiem jest nie tylko zapobieganie dyzenterii wzdeciom i ketozie zwierzat, lecz równiez przyspieszanie zdrowego wzrostu zwierzat i drobiu i zwiekszenie efektywnosci zywienia.Przy uzyciu przyspieszajacym wzrost i efektywnosc zywienia, srodka wedlug wynalazku sub¬ stancja czynna czyli antybiotyk moze byc stosowany w postaci produktu oczyszczonego lub surowego, komórek zawierajacych antybiotyk 76-11, fizjologicznie dopuszczalnej soli metalu6 143 999 /jak sodowa, wapniowa itp*/, estru organicznego kwasu /jak ester kwasu propionowego, ester kwasu walerianowego itp*/, lub kompleksu z metalem /np* z cynkiem/* Wynalazek jest opisany szczególowo w ponizszych przykladach, nie ograniczajacych jego zakresu* W opisie i zastrzezeniach % i czesci, jezeli nie zaznaczono inaczej oznaczaja % wagowe i czesci wagowe* Przyklad I. Wytwarzanie antybiotyku 76-11* Wyzej opisany szczep Sp. 76-11 /FERM HP-83/ uprzednio hodowany na skosie inokulowano do pozywki zawierajacej 3% maki owsianej, 1,5% gliceryny 1 0,5£ ekstraktu miesnego /pH okolo 6,5/* Fermentacje prowadzono w tempera¬ turze 28°C w ciagu 11 dni, przy wstrzasaniu* Po 3 ml brzeczki inokulowano do swiezej pozyw¬ ki zawierajacej te same skladniki 1 prowadzono fermentacje w ciagu dalszych 7 dni* 140 ml otrzymanej brzeczki inokulowano do 18 litrów pozywki o skladzie jak wyzej, w ka¬ dzi fermentacyjnej i prowadzono fermentacje w temperaturze 28°C w ciagu 210 godzin, przy napowietrzaniu z szybkoscia 18 litrów na minute i mieszaniu z szybkoscia 330 obrotów na minute* Po fermentacji do brzeczki dodano 400 g ziemi okrzemkowej /Radiolite 700/ i brzeczke odwirowano* Sklarowana ciecz /14 litrów, pH 7,8/ dwukrotnie ekstrahowano odpowiednio 8 litrami i 5 litrami octanu etylu* Komórki ekstrahowano dwukrotnie odpowiednio 9 litrami i 6 litrami acetonu* Ekstrakty odparowano pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymujac 2 litry wodnego roztworu /pH 8/, który ekstrahowano dwiema porcjami po 1 litrze octanu etylu* Ekstrakty polaczone z ekstraktu sklarowanej cieczy i odparowano pod zmniejszonym cisnieniem* Otrzymana pozostalosc rozpuszczono w malej ilosci benzenu, a roztwór wprowadzono na kolumne z zelem krzemionkowym /3 cm z 50 cm/, uprzednio kondycjonowana benzenem* Elucje prowadzono kolejno 2 litrami benzenu, 1 litrem mieszaniny benzen-octan etylu /5:1* objetosciowo/ i 1 li¬ trem mieszaniny benzen-octan etylu /1:1, objetosciowo/* Frakcje aktywne, które zostaly wyeluowane mieszanina benzen-octan etylu 1:1, zebrano, odparowano pod zmniejszonym cisnie¬ niem i zadano metanolem, otrzymujac okolo 1 g surowego krysztalu* Po kilku krystalizacjach z metanolu otrzymano 400 mg czystego krysztalu soli sodowej antybiotyku 76-11* Przyklad II# Otrzymana substancje czynna jednorodnie zmieszano, dla uzyskania danego stezenia w mieszance paszowej dla kurczat /Oriental Yeast Co*, sklad podany w tablicy 1/» Sporzadzona mieszanke podawano bez ograniczen kurczetom.Tablica 1 Skladnik Zawartosc* /&/ kukurydza 61,20 makapszenna 5,13 olejsojowy 3,07 maczkasojowa 15,40 maczkarybna 10,30 maczka zlucerny 3*07 weglanwapnia 0,30 sól/NaCl/ 0,50 mieszanka witaminowa 1,03 k Próby prowadzono na zdrowych kurcsetach kur niosek /Shaver Starcross/ w wieku 7 dni, hodowanych w warunkach doskonalej prewencji przeciw zakazeniu kokcydioza* Kazda grupa li¬ czyla po 5 kurczat* Wzgledny przyrost wagi* Oznaczono wage kurczat na poczatku próby oraz w 1, 2, 4» 59 6, 7,i 8 dniu. Po zakonczeniu próby zmierzono przyrost wagi w kazdej grupie testowej i obli¬ czono wzgledny przyrost wagi w odniesieniu do wagi grupy kontrolnej /100/, która karmio¬ no pasza bez dodatku*143 999 9 Zapotrzebowanie pozywienia. Zapotrzebowanie pozywienia w kazdej grupie obliczano ze sred¬ niego przyrostu wagi i sumarycznej ilosci pozywienia przyjetego od poczatku do konca próby.Zapotrzebowanie pozywienia - ^°66 PrzrJEtofi° Pozywienia przyrost wagi Wyniki przedstawiono w tablicach 3 i 4* Tablica 3 Grupa Kontrola* bez dodatku antybiotyk 76-11 antybiotyk 76-11 | Sallnomycin i 50 ppm 100 ppm 50 ppm Ilosc przyjetego pozywienia /g/ 177,2 179,3 174,4 170f6 Przyrost wagi /g/ 96,4 90f4 80,4 91,8 Ylakafnik zapotrze¬ bowania pozywienia 1 »84 1t98 2,17 1,86 Tablica 4 Grupa 1 Zmiana wagi /gramów dni -2 0 2 4 5 6 7 ' i Kontrola bez zakazenia, bez dawkowania 2 63,6 ± 1,56 81,6 ± 3t12 100,8 4,42 119,0 ± 4,76 129,4 ± 5,20 137,4 ± 5,14 147,2 ± 5,40 j Antybiotyk 76-11 50 ppm "J 63,4 ± 1,98 78,0 ± 2»98 96,0 ± 4,00 113,8 ± 4,99 120,5 ± M1 131,5 + 5,33 H3,o ; + 7»29 100 ppm I 4 63,4 ± 1#78 79,6 ± 1,91 96,0 + 2,77 113,4 + 3,11 121,6 i 4,31 127,4 i 4,61 136,2 ± 5,06 Sallnomycin 50 ppm ^ 63,6 i 1,08 78,4 ± 1#21 98,8 ± 1t52 118,8 i 1,96 127,8 ± 2'65 145,8 \ + 2,96 i 145,8 + 4,0010 H3 999 i ~t ¦ r 8 Przyrost wagi Wzgledny przyrost wagi 2 160,0 + 5,74 78,4 100 " 3 153,8 ± 7,76 75,8 i 96,7 , T , 143,8 + 6,28 64,2 81,9 T——5 155,4 + 4,74 77,0 | 98,2 Przyklad III* Sporzadzono mieszanke zawierajaca: Antybiotyk 76-11 ]%% skrobia kukurydziana 99#. Obie substancje sproszkowano i jednorodnie zmieszanof otrzymujac mieszanke wstepna o \% zawartosci antybiotyku 76-11* Przyklad IV* Sporzadzono mieszanke zawierajaca: Antybiotyk 76-11 /surowy, czys¬ tosc 40%/ 2,5%» otreby pszenne 97.5$. Obie substancje sproszkowano i jednorodnie zmieszano, otrzymujac mieszanke wstepna o 1% zawartosci antybiotyku 76-11, Przyklad V. 1000 g suchych komórek zawierajacych 0,96£ antybiotyku 76-11 sprosz¬ kowano, otrzymujac gotowa do uzycia przedmieszke« Przyklad VI. Szescdziesiat kogucików /jednodniowych/ brojlerów /shaver Star Brow/ podzielono na 3 grupy, tak, by kazda grupa miala te sama wage przecietna* Pierwsza i druga grupe karmiono pasza z mieszanka wstepna otrzymana w przykladzie III, w takiej ilosci, ze stezenie antybiotyku w paszy wynosilo odpowiednio 25 i 50 ppm* Trzecia grupa otrzymala pasze bez mieszanki wstepnej. Tuczenie prowadzono w ciagu 7 tygodni* Mierzono przyrost wagi i sumaryczna ilosc skonsumowanej paszy, obliczajac wskaznik zapotrzebowania paszy w kazdej grupie. Wyniki przedstawiono w tablicy 6.H pierwszych 21 dniach brojlery otrzymywaly pasze o skladzie przedstawionym w tablicy 5 w pierwszej kolumnie, a nastepnie, do konca okresu tuczenia, pasze o skladzie przedstawionym w drugiej kolumnie. Sa to typowe pasze dla brojlerów, nie zawierajace antybiotyków.Tablica 5 Skladnik surowe bialko surowy tluszcz surowe wlókno eurowy popiól metabolizowalna energia I 23§4% 5,5% 3,0* 5,3& 3 020 cal II | 20,4£ 6,W 2,8# 5f5£ 3100 cal143999 '11 Tablica 6 brupa1 1 1 I 2 3 " Dodatek Antybiotyk 76-11 25 ppm Antybiotyk 76-11 50 ppm Kontrola /bez dodatku; I Waga /g/ poczatkowa 1 koncowa 47 /100/ *7 /100/ 47 /100/ 1861 /105,9/ 1879 /106f1/ 1757 /100/ Przyrost wagi /fi/ 1814 /106,1/ 1832 /107.1/ 3145 /100/ Skonstruowana pasza IeJ 3140 /99,8/ 3120 /99,2/ 3145 7100/ ' Wskaznik za-1 potrzebowania pozywienia 1 1,731 /94,1/ [ 1.703 I /92,6/ 1*839 /100/ Uwaga: wartosci liczbowe w nawiasach oznaczaja stosunek /./ do kontroli Wskaznik zapotrzebowania pozywienia - llonó pozywienia przyjetego przyrost wagi Jak widac z wyzej przedstawionych wyników, podawanie antybiotyku 76-11 w stezeniu 25 ppm i 50 ppm przyspieszalo wzrost odpowiednio o 6t1{ i 7»U| a efektywnosc zywienia odpowiednio o 5,9% i 7,4%.Stwierdzono, ze podawanie antybiotyku 76-11 zwierzetom roslinozernym zwieksza stosunek kwasu propionowego do kwasu octowego i maslowego powstajacych w zwaozu zwierzat przezuwaja¬ cych, takich jak bydlo, owce i kozy lub w jelicie cienkim zwierzat majacych pojedynczy zo ladek, takich jak królik czy swinia* Wiadomo, ze sposród lotnych kwasów tluszczowych kwas propionowy jest wydajniejszym zródlem energii niz kwas octowy lub kwasy maslowe. Tak wieo uwa£a sie, ze podawanie antybiotyku 76-11 przyspiesza powstawanie kwasu propionowego w w narzadzie trawiennym, a to przyspiesza wzrost zwierzat i zwieksza efektywnosc zywienia* Ponadto, podawanie antybiotyku 76-11 nie tylko zapobiega wzdeciom i ketozie, czesto wys¬ tepujacym u bydla karmionego duza iloscia stezonego pozywienia, lecz równiez leczy zwierze* ta cierpiace na takie choroby* Jako przyklad podawania zwierzetom przezuwajacym, przedsta¬ wiono ponizszy przyklad, w którym pasze z jednorodnie przemieszana z antybiotykiem 76-11 karmi sie ciele* Przyklad VII* Cztery wykastrowane cieleta rasy Holstein, o wadze okolo 330 kg /wiek 9 miesiecy/ podzielono na dwie grupy* Pierwsza grupe karmiono pasza z dodatkiem antybiotyku 76-11 w stezeniu 30 ppm, natomiast grupa druga otrzymywala pasze bez dodatku antybiotyku* Karmienie prowadzono w ciagu 16 tygodni* Z oznaczonego przyrostu wagi 1 suma¬ rycznej ilosci skonsumowanej paszy obliczono wskafnik zapotrzebowania pozywienia w kazdej z grup* Wyniki przedstawiono w tablicy 6* Oznaczono lepkosc plynu zwaczowego pobieranego kateterem poprzez nos bezposrednio przed i po próbie oraz zawartosc w nim lotnych kwasów tluszczowych i obliczono stosunek molowy kwasu propionowego do kwasu octowego* Wyniki przedstawiono w tablicy 9* Zwierzetom podawano bez ograniczen pasze bydleca "Kuraiai New King Beef for the latter halt" produkowana przez Zon-no, Japonia i suszone rosliny ryzu /3 kg/ dobe/ciele/* Zawar¬ tosc skladników w "Kumiai New King Beef for the latter halfw jest podane w tablicy 7*12 143 999 Tablica 7 Skladnik surowe bialko surowy tluszcz surowe wlókno surowy popiól surowe bialko przyswajalne suma przyswajalnych skladników odzywczych f Zawartosc: % 11tW 2f0# 9,0£ 9,0* 9,0* 72tQS Jak wynika z tablicy 89 podawanie antybiotyku 76-11 w stezeniu 30 ppm zwieksza wskaz¬ nik zapotrzebowania pozywienia o t5%* Tablica 8 I Grupa 1 2 li i ! Dodatek antybiotyk 76-11 30 ppm kontrola /bez dodatku/ Waga /\ poczatkowa 332 /99/ 335 /100/ koncowa 457 /101/ 451 /100/ przyrost l»agi /kg/ 125 /108/ 116 /100/ i I Skonsumowana ' passsa /kg/ 880 /9V 965 /100/ Wskaznik za¬ potrzebowa¬ nia pozywie¬ nia 7,04 /85/ 8,32 /100/ | Uwaga: Wartosci liczbowe w nawiasach oznaczaja stosunek /%/ do kontroli Tablica 9 Grupa 1 2 Dodatek antybiotyk 76-11 30 ppm kontrola Przed próba * Lepkosc /cP/ kwas 4,1 /1H/ 3,6 I /100/ I Kwas propio- nowy/kwas octowy 0,54 /98/ 0,55 /100/ Po próbie' l Lepkosc | /cP/ kwas 3,2 /43/ 7,5 /100/ Kwas propio- nowy/kwas octowy 0f81 /180/ 0,45 /100/ Uwaga: wartosci liczbowe w nawiasach oznaczaja stosunek % do kontroli Jak wynika z tablicy 9t podawanie antybiotyku 76—11 w stezeniu 30 ppm inhibituje wzrost lepkosci plynu zwaczowego, co jest skuteczne dla zapobiegania wzdeciom. Ponadtof antybio¬ tyk 76»-11 jest skuteczny w zapobieganiu ketozie, gdyz jego podawanie zwieksza udzial kwasu propionowego w produkowanych lotnych kwasach tluszczowych.143 999 13 Przyklad VIII* Dziesiec prosiat w wieku 2 miesiace, z jednego miotu, podzielono na dwie grupy o tej samej przecietnej wadze i stosunku plci. Pierwszej grupie podawano pozy¬ wienie zawierajace antybiotyk 76-11 w stezeniu 50 ppmf a drugiej grupie pozywienie bez do¬ datku antybiotyku* Karmienie prowadzono w ciagu 10 tygodni. Na podstawie przyrostu wagi i sumarycznej ilosci przyjetego pozywienia obliczono wskaznik zapotrzebowania pozywienia. Wyni¬ ki przedstawiono w tablicy 11* Ponadto, na zakonczenie próby zmierzono zawartosc lotnych kwaecw tluszczowych /VPA/ w odchodach. Wyniki podano w tablicy 12* Sklad paszy dla prosiat, bez dodatku antybiotyku, jest nastepujacy: Tablica 10 I Skladnik zboze /kukurydza, pszenica/ wytloki sojowe maczka rybna inne /chlorek sodu, weglan wapnia, fosforan wapnia, itd./ Zawartosc /%/ 78# 13# W i 4* Tablica 11 Grupa 1 2 Dodatek antybiotyk 76-11 50 ppm kontrola /bez dodatku/ Wa| poczatkowa 14,07 /100/ 14,08 /100/ V* /leg/ koncowa 53,18 /112/ 47,53 /100/ Przyrost wagi/kg/ 39,11 /117/ 33,45 /100/ Skonsumowana pasza /kG 96,37 /106/ 90,75 /100/ Wskaznik za¬ potrzebowania pozywienia 2,464 /91/ 2,713 /100/ Uwaga: wartosci liczbowe w nawiasach oznaczaja stosunek /%/ do kontroli jak widac z tablicy 11, podawanie antybiotyku 76-11 w stezeniu 50 ppm przyspieszalo wzrost o \1% i zwiekszalo wskaznik zapotrzebowania pozywienia o 3%.Tablica 12 Grupa 1 2 I li Dodatek antybiotyk 76-11 50-ppm Kontrola Sumaryczna ilosc VPA ramol/g/ 0,178 /96/ 0,183 /100/ Stosunek molowy kwasu tluszczowego do sumarycznej ilosci VPA propionowy 32,7 /11t6/ 27,8 /100/ octowy 39.9 /96/ 4117 /100/ maslowy /§*/ 18,3 /100/ Uwaga: wartosci liczbowe w nawiasach oznaczaja stosunek /%/ do kontroli14 143 999 Wiadomo, ze Ilosc* lotnych tarasów tluszczowych /YFA/ absorbowanego w kanale jelitowym swini nie smienia sie w zaleznosci od rodzaju kwasu tluszczowego* Tak wiec sadzi sie, ze wzrost zawartosci kwasu propionowego w odchodach, spowodowany podawaniem antybiotyku 76-11 w stezeniu 50 ppm* odzwierciedla zwiekszona produkcje kwasu propionowego w kanale jelitowym.Zastrzezenie patentowe Srodek przyspieszajacy wzrost i zwiekszajacy efektywnosc zywienia zwierzat domowych i drobiu, znamienny tym, ze jako substancje czynna zawiera antybiotyk oznaczony symbolem 76-11, otrzymany przez fermentacje produkujacego ten antybiotyk mikroorganizmu rodzaju Actinomadura a nastepnie zmieszanie go z tradycyjna karma. w metanolu i zakwaszonym metanolu w alkalicznym metanolu 220 240 260 280 300 320 340 360 .^(m/i)143 999 FIG.2 3600 2800 20001900 1700 1500 1300 1100 900 700 500 liczba falowa (cm"1) FIG.3 "3600 2800 2000 1900 1700 1500 1300 1100 900 700 500 liczbo falowa (cm'1) PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Srodek przyspieszajacy wzrost i zwiekszajacy efektywnosc zywienia zwierzat domowych i drobiu, znamienny tym, ze jako substancje czynna zawiera antybiotyk oznaczony symbolem 76-11, otrzymany przez fermentacje produkujacego ten antybiotyk mikroorganizmu rodzaju Actinomadura a nastepnie zmieszanie go z tradycyjna karma. w metanolu i zakwaszonym metanolu w alkalicznym metanolu 220 240 260 280 300 320 340 360 .^(m/i)143 999 FIG.2 3600 2800 20001900 1700 1500 1300 1100 900 700 500 liczba falowa (cm"1) FIG.3 "3600 2800 2000 1900 1700 1500 1300 1100 900 700 500 liczbo falowa (cm'1) PL