PL155929B1 - Sposób unieruchomiania enzymów - Google Patents

Abstract

Sposób unieruchomiania enzymów, zwłaszcza glukoamylazy i peroksydazy przez wprowadzenie na powierzchnię nośnika nieorganicznego reaktywnych grup aminowych w reakcji z chlorkiem boru, chlorkiem tionylu lub czterochlorkiem krzemu, a następnie poprzez reakcję z dwuaminą alifatyczną, znamienny tym, że jako nośnik nieorganiczny stosuje się szkło o kontrolowanej porowatości, korzystnie sodowo- borowe, o średnicy porów 200-800 A i powierzchni właściwej 15-100m2/g, zaktywowane pod próżnią w temperaturze 100-200°C przez okres 1-4 godzin.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób unieruchomiania enzymów, zwłaszcza glukoamylazy i peroksydazy przez wprowadzenie na powierzchnię nośnika reaktywnych grup aminowych.

Znanych jest szereg sposobów unieruchomiania enzymów, szczegółowo opisanych w literaturze (Biotechnolog and Bioenergineering vol, XVII, 1975). Można je podzielić na metody fizyczne takie jak: adsorpcje enzymów na nierozpuszczalnych w wodzie matrycach, zamykanie w sieci polimeru lub półprzepuszczalnej matrycy oraz metody chemiczne polegające na utworzeniu wiązania kowalencyjnego pomiędzy enzymem a nierozpuszczalną matrycą lub sieciowanie cząsteczki enzymu odpowiednimi związkami dwufunkcyjnymi aż do osiągnięcia związku wielkocząsteczkowego, nierozpuszczalnego w wodzie. Spośród tych metod szczególnie efektywne okazały się metody chemiczne zapewniające stabilność układów, stanowiącą ważną cechę w dynamicznych procesach przemysłu biotechnologicznego. Dla przykładu wymienić należy pokrywanie powierzchni nieorganicznego nośnika polimerami syntetycznymi lub naturalnymi albo silanizację powierzchni szkieł czy żeli krzemionkowych silanami posiadającymi w swej strukturze reaktywne grupy aminowe, jak na przykład keratyna, poliamidy. Zmodyfikowany nośnik poddaje się następnie reakcji wiązania z enzymem.

Do niedogodności opisanych sposobów wprowadzania grup aminowych na powierzchnię żelu krzemionkowego należą w pierwszym przypadku wysoka cena y — aminopropylotrójetoksysilanu lub jego odpowiedników oraz to, że odczynniki te nie są produkowane w kraju, a w drugim przypadku zmiana struktury porowatej modyfikowanego żelu w stosunku do wyjściowego.

Z opisu patentowego PRL nr 139 222, znanyjest sposób unieruchomiania enzymów, zwłaszcza jak glukoamylaza i peroksydaza polegający na roztwarzaniu surowca poliamidowego w kwasie, modyfikację tak otrzymanego sorbentu przez przyłączenie dwufunkcyjnych związków organicznych, a następnie inkubację produktu z roztworem buforowym enzymu.

Najbliższy stanem techniki jest znany z opisu patentowego nr 149 290 sposób unieruchomiania polegający na tym, że odwodniony żel krzemionkowy aktywuje się i poddaje reakcji z chlorkiem boru, chlorkiem tionylu lub czterochlorkiem krzemu. Proces prowadzi się bez dostępu powietrza i w podwyższonej temperaturze przez 0,2-2 godziny w przypadku chlorku boru i czterochlorku krzemu, a w przypadku chlorku tionylu przez 2-4 godziny w temperaturze wrzenia rozpuszczalnika. Otrzymany produkt modyfikuje się przez przyłączenie dwuamin alifatycznych o ilości atomów węgla w łańcuchu alifatycznym od 2 do 10. Reakcję prowadzi się bez dostępu wilgoci w temperaturze 60-100°C przez 2-4 godziny, a następnie przyłącza się enzymy przez związanie grupy aminowej nośnika i enzymu znanymi metodami.

Sposób unieruchomiania enzymów z zastosowaniem jako nośników żelu krzemionkowego modyfikowanego chemicznie, przez reakcję w pierwszym etapie z chlorkiem boru lub chlorkiem tionylu, czy czterochlorkiem krzemu, powoduje podstawianie reaktywnego chloru w miejsce reaktywnych grup hydroksylowych. Następnie przez reakcję w drugim etapie z dwuaminami alifatycznymi prowadzi do kowalencyjnego związania dwuaminy za pomocą jednej grupy aminowej z powierzchnią nośnika.

155 929

Niedogodnością opisanego sposobu jest niestabilność żelu krzemionkowego w środowisku silnie alkalicznym lub silnie kwaśnym, co wymaga dużej kontroli pH w czasie procesu unieruchomiania enzymów zachodzącego zwykle w obecności buforów o pH powyżej 7.

Wynalazek rozwiązuje zagadnienie unieruchomiania enzymów, zwłaszcza glukoamylazy i peroksydazy przez wprowadzenie na powierzchnię nośnika nieorganicznego reaktywnych grup aminowych w reakcji z chlorkiem tionylu lub czterochlorkiem krzemu, a następnie poprzez reakcję z dwuaminą alifatyczną w sposób umożliwiający zastosowanie bardziej alkalicznych buforów, bez konieczności ścisłej kontroli pH, a tym samym pozwalający na rozszerzenie warunków procesu.

Zamierzony efekt osiągnięto przez unieruchomienie enzymów stosując jako nośnik szkło o kontrolowanej porowatości, korzystnie sodowo — borowe, o średnicy porów 200-800 A i powierzchni właściwej 15-100 m²/g, zaktywowane pod próżnią w temperaturze 100-200°C przez okres 1-4 godzin.

Zastosowane według wynalazku nośniki charakteryzują się dużą stabilnością mechaniczną i chemiczną. Dzięki równomiernemu rozłożeniu porów umożliwiają uzyskanie jednorodnego rozkładu związanego chemicznie enzymu.

Przykład I. lg szkła porowatego o wielkości ziarna 0,1-0,5nm i średnicy porów 5(X)A aktywowano pod próżnią w temperaturze 200°C przez 4 godziny, po czym poddano reakcji z gazowym BCI3 wprowadzając reagent pod ciśnieniem do naczynia z żelem krzemionkowym przez 10 minut, a następnie ogrzewano żel w zamkniętym naczyniu w temperaturze 50°C przez 4 godziny. Po tym czasie nieprzereagowany BCI3 odgazowano pod próżnią w temperaturze 100°C i otrzymano sorbent zawierający 25 mg jonów chlorkowych w 1g szkła.

Schlorowane szkło poddano reakcji z etylenodwuaminą w roztworze benzenowym (50% roztwór dwuaminy w benzenie) w temperaturze wrzenia rozpuszczalników przez 2 godziny. Po tym czasie produkt odsączono, przemyto benzenem, a po wysuszeniu także metanolem i wodą. Tak otrzymany żel mieszano przez 25 minut z 15 ml 12,5% aldehydu glutarowego w 0,2 M NaHCOe o pH 9,0. Po tym czasie aktywowany sorbent ze szkła porowatego przemywano 70 ml 0,05 M buforu fosforowego o pH = 8 przez 15 minut. Następnie sorbent mieszano z 0,03 g preparatu glukoamylazy, otrzymanego z Aspergillus niger C i rozpuszczonego w 15 ml 0,05 M buforu fosforanowego o pH = 8. Mieszaninę tę pozostawiono w temperaturze 4°C na 60 godzin w celu połączenia enzymu z nośnikiem, a następnie roztwór odsączano, zaś nośnik przemywano 70 ml 0,05 M buforu fosforanowego o pH = 8. Otrzymany preparat immobilizowanej glukoamylazy zawierał 10,5 mg białka na gram nośnika i wykazywał aktywność enzymatyczną wobec 1% skrobi rozpuszczalnej jako substratu 12 jednostek międzynarodowych na gram nośnika. Enzym immobilizowany sposobem jak wyżej zachowywał niezmienioną aktywność w ciągu 14 dni. Jedna jednostka międzynarodowa aktywności glukoamylazy określona jest jako taka ilość enzymu, która w warunkach optymalnych uwalnia 1 miligram glukozy ze skrobi w ciągu minuty w temperaturze 45°C.

Przykładu. Nośnik ze szkła porowatego zawierający wolne grupy aminowe otrzymanyjak w przykładzie I sprzęgano z enzymem peroksydazą sposobem podanym w przykładzie I. Otrzymany preparat immobilizowanej peroksydazy zawierał 1,5 mg białka na 1 g nośnika i wykazywał aktywność enzymatyczną wobec H2O2 i gwajakolu 1000 jednostek aktywności na 1g nośnika. Za jednostkę aktywności peroksydazy uznano taką ilość enzymu, która powoduje wzrost absorbancji przy 470 nm o 0,001 na minutę w temperaturze 22°C. Immobilizowany preparat peroksydazy w temperaturze pokojowej zachowywał 100% aktywności po 14 dniach.

Przykład III. Nośnik ze szkła porowatego zawierający wolne grupy aminowe otrzymany jak w przykładzie I z tą różnicą, że zamiast chlorku boru do chlorowania szkła porowatego zastosowano czterochlorek krzemu w ilości 3 ml na lg szkła. Nośniki sprzęgano z aldehydem glutarowym, a następnie glukoamylazą lub peroksydazą sposobem według przykładu I i II. Otrzymane preparaty zawierały 2 mg białka glukoamylazy i 1,8 mg białka peroksydazy na gram nośnika i wykazywały aktywność enzymatyczną odpowiednio: gjukoamylaza 2 jednostki i peroksydaza 750 jednostek na gram nośnika. Po 14 dniach aktywności tych enzymów zmieniły się nieznacznie.

Przykład IV. Nośnik szklany zawierający wolne grupy aminowe otrzymano jak w przykładzie I z tą różnicą, że zamiast etylenodwuaminy zastosowano propylenodwuaminę (5% roztwór w bezwodnym toluenie) w ilości 5 ml na 1g chlorowanego szkła porowatego. Otrzymany nośnik

155 929 sprzęgano z aldehydem glutarowym, a następnie glukoamylazą lub peroksydazą sposobem według przykładów I i II. Otrzymane preparaty zawierały 2,5 g białka glukoamylazy i 1,25 mg białka peroksydazy na 1g nośnika. Nośniki zawierające enzymy wykazywały aktywności odpowiednio: glukoamylaza 4 jednostki, a peroksydaza 1083 jednostki na 1g nośnika. Po 14 dniach aktywność omawianych preparatów nie zmieniała się.

PrzykładV. Nośnik szklany zawierający wolne grupy aminowe otrzymano jak w przykładzie IV. Otrzymany w reakcji z propylenodwuaminą nośnik sprzęgano z aldehydem glutarowym, a następnie glukoamylazą lub peroksydazą sposobem według przykładów I i II. Otrzymane preparaty zawierały 3 mg białka glukoamylazy i 1,46 mg białka peroksydazy na lg nośnika. Nośniki zawierające enzymy wykazywały aktywności odpowiednio: glukoamylaza 6 jednostek, a peroksydaza 733 jednostki na gram nośnika. Po 14 dniach aktywność omawianych preparatów nie zmieniała się.

Zakład Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 3000 zł

Claims (1)

1. Zastrzeżenie patento we

   Sposób unieruchomiania enzymów, zwłaszcza glukoamylazy i peroksydazy przez wprowadzenie na powierzchnię nośnika nieorganicznego reaktywnych grup aminowych w reakcji z chlorkiem boru, chlorkiem tionylu lub czterochlorkiem krzemu, a następnie poprzez reakcję z dwuaminą alifatyczną, znamienny tym, że jako nośnik nieorganiczny stosuje się szkło o kontrolowanej porowatości, korzystnie sodowo- borowe, o średnicy porów 200-800 A i powierzchni właściwej 15-100 m2/g, zaktywowane pod próżnią w temperaturze 100-200°C przez okres 1-4 godzin.