PL156162B1 - Sposób oznaczania stezenia drobnoustrojów i naczynie do oznaczania stezeniadrobnoustrojów PL - Google Patents

Abstract

1. Sposób oznaczania stezenia drobnous­ trojów metoda plytkowa, znamienny tym, ze sporzadza sie homogeniczna mieszanine prób­ ki i pozywki, mieszanine te umieszcza sie w naczyniu, którego dno jest skosne, zakrzy­ wione, schodkowe lub wyposazone w prze­ grody o róznej wysokosci, mieszanine te zesta­ la sie i inkubuje, po czym liczy sie powstale kolonie. 2. Naczynie do oznaczania stezenia drob­ noustrojów metoda plytkowa, znamienne tym, ze ma dno skosne, zakrzywione, schodkowe lub wyposazone w przegrody o róznej wyso­ kosci. FIG. 1A F IG. 3 FIG. 7 PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób oznaczania stężenia drobnoustrojów i naczynie do oznaczania stężenia drobnoustrojów metodę posiewu, polegające na tym, że badaną próbkę i pożywkę rozlewa się w naczyniu, pozostawia do zestalenia się i po zestaleniu inkubuje, a następnie liczy kolonie w naczyniu.

W przemyśle mleczarskim i innych artykułów spożywczych oraz w mikrobiologii medycznej i ogólnej,określanie liczby drobnoustrojów zawartych w próbce dokonuje się zwykle metodami posiewu z rozcieńczaniem i znane są liczne metody tego typu, zwane międzynarodowymi metodami porównawczymi .

W metodach posiewu z rozcieńczaniem, pewną objętość badanej próbki, ewentualnie rozcieńczonej, zaszczepia się na płytce Petriego. Na przykład, 10 - 15 ml iwya^wionej pożywwk, mogącej zestalać się (agar) i maiącej temperaturę 45 + 1’C, wlewa się na badaną próbkę, którą mesza się niezwłocznie z pożywką i pozwala na zestalenie się w ^moces^^e pokojtwwj, na poziomej ^^ι^ίί^ΐΓζοΙ^ι^ή. Próbkę można też mieszać z pożywką przed rtzlaniem na płytce. Zestalona pożywka tworzy na płytce warstwę o jednakowej gruboścc. Po zestaleniu odwraca się płytki dolną powierzchnią do góry i umieszcza w inkubatorze. Tempεjatura podczas inkubacj(np. 10*C, 30*C, 37*C, 44*C, 55“C) oraz czas trwania inkubacji (np. 2, 3, 6 i 10 dni) zależą od stosowanej metody, a głównie od grupy badanych drobnoustrojów. Podczas inkubacj płytki są umieszczone poziomo.

Po zakończeniu inkubacj liczy się kolonie na płytce Petriego. Ponieważ ilość szczepionki w próbce i stopień rozcieńczania są znane, przeto określając lcczbę kolonii dających się liczyć można określić liczbę drobnoustrojów na jednostkę objętości lub ciężaru próbkk, zw^t^^e na 1 ml lub na 1 g.

156 162

Pożywka może zawierać bardzo różne substancje odżywcze, wymagane dla wzrostu możliwie dużej liczby typów drobnoustrojów. Składniki odżywcze pożywki można też ograniczać lub dodawać znane związki inhibitujące wzrost drobnoustrojów. Takie środki nazywa sią środkami selektywnymi i ich stosowanie ma na celt wyróżnianie pewnej grupy drobnoustrojów.

Obliczanie można dokonywać wzrokowo, za pomocą znanych urządzeń osiowych, albo za pomocą różnych, elektrycznych urządzeń lcczących (samoczynne Hczniki kolonii).

Wssoie stężenie kolonii na płytce ogranicza lcczenie. Przy lćczeniu zwykle bierze się pod uwagę tylko te płytki, na których lćczba kolonii nie przekracza ustalonej granicy. Na przykład, przy płytkach o średnicy 9 cm za górną granicę przyjmuje się 300 kolonii. Aby umoożiwić badanie próbek o bardzo dużym stężeniu drobnoustrojów, konieczne jest stosowanie metod rozcieńczania. W metodzie posiewu zwykle niezbędne jest stosowanie rozcieńczania. Przygotowywanie kolejnych rozcieńczeń pochłania 70 do 90% czasu pracy, wymaganego dla całego etapu posiewu (w zależności od konieczności rozcieńczania). W związku z tym, ioość zużywanego mateeiału jest wielokrotnością lcczby rozcieńczeń.

Znane metody posiewu z rozcieńczaneem mają przeto tę wadę, że wymagają przygotowywania dużych serii rozcieńczeń oraz hodowania welu rozcieńczeń. Niezbędna jest przy tym duża lćczba płytek, jak również znaczna przestrzeń do inkubami. Tak więc metody te są skomplikowane i czasochłonne.

Wynnaazek umożliwia uniknięcie wspomn^nych wyżej wad i pozwala na określanie stężeń drobnoustrojów w sposób prosty i niezawodny. Zgodnie z wynalazkiem, osiąga się to stosując sposób, którego cechę jest to, że pożywkę i próbkę miesza się dla wytworzenia homoogeńcznej mieszaniny o stałym stężeniu drobnoustrojów, po czym powoduje się zestalenie się mieszaniny w naczyniu, którego dno jest skośne, zakrzywione, schodkowe lub wyposażone w przegrody o różne;) wysokości, meszaninę tę inkubuje się, po czym li.czy powstałe kolonie.

Podstawową cechą sposobu według wynalazku jest to, że powoduje się zestalanie się pożywki zawierającej drobnoustroje tak, że grubość warstwy zestalonej pożywki w naczyniu waha się w określony sposób. Pożywka może być zestalana w jednym naczyniu tak, że grubość warstwy zależy od geonmtrii naczynia. Gdy grubość warstwy pożywki w jednej części naczynia różni się od grubości warstwy w innej części, to zmienia się odpowiednio lcczba kolonii.

Tę cechę sposobu według wynalazku można wykorzystywać także w ten sposób, że mieszaninę próbki i pożywki odmierza się w zwykłych płytkach Petriego w iżośctach różniących się w dokładnie określonej merze. Otrzymuje się wówczas serie płytek o różnych grubościach warstwy. Ta metoda nie daje jednak innych korzyści poza uniknięctem konieczności stosowania kolejnych rozcieńczeń.

Przy stosowaniu sposobu według wynalazku, rozwinięte kolonie różnią się po inkubacji różnymi gęstościami w stadium obliczania, przy czym gęstość jest najmniejsza w najcieńszych warstwach agaru, a największa w warstwach najgrubszych i różni się w zależności od ρεο^^τΗ pożywki na powierzchniach o pośrednich grubościach warstw. Jeżeli próbkę i pożywkę (agar) zmiesza się dokładnie przed posiewem, a ilości mieszaniny są znane i geomntΓia pożywki oraz naczynia są maaemaycΊ.nie kontΓożowant, to stężenie drobnoustrojów w próbce można łatwo obliczyć. Do tego obliczania można stosować wszystkie informacje, wykorzystywane w uznanych typowych metodach mikrobiologicznych, np. bierze się pod uwagę tylko kolonie wyróżniające się wyraźnie w strefach warstwy o różnej grubości. Gradient grubości warstwy określa gradient gęstości kolonii i to uwzględnia się przy matematycznym wliczaniu kolonii. W stadium posiewu jest rzeczą ważną, aby były umieszczone rzeczywiście na poziomej powierzchni.

Zalety sposobu według wynalazku są następujące:

1. Zbędne są kolejne rozcieńczania, ponieważ gęstość kolonii jest na tyle maa, że można je lcczyć, przynajmniej w pewnych częściach płytki, a to dzięki zmieniajjcej się grubości warstwy pożywki. W porównaniu ze znanymi metodami daje to oszczędność 70 - 90% czasu pracy, ponieważ unika się kolejnych rozcieńczeń.

2. Oszczędność pożywki jest proporcjonalna do ograniczenia kolejnych rozcieńczeń, stosowanych w znanych meodj^tch, jak również do odpowiednio zmniejtzżnej lcczby naczyń.

156 162

3. Przy użyciu naczyń będących do dyspozycji, oszczędności materiału są proporcjonalne do liczby kolejnych rozcieńczeń, koniecznych w znanych metodacn.

4. Przestrzeń potrzebna do inkubacji jest znacznie zmniejszona, gdyż zbędne są naczynia, które trzeba było stosować do kolejnych rozcieńczeń. To samo dotyczy wielkości pomieszczeń i ilości maaeriałów.

5. Nie jest konieczne lćczenie kolonii w całym naczyniu, gdyż wystarcza lćczyć kolonie w strefach i sektorach określonych przez gromereię dna naczynia. Proces lćczenia jest więc uproszczony i skrócony, gdyż unika się rozcieńczania i konsekwernii z nim związanych.

6. Sposób według wynalazku w całości, łącznie z lczeeniem kolonii, można zmechanizować i zautomatyzować, wykorzystując głównie zmodyfikowane metody znane.

Stężenia drobnoustrojów określone sposobem według wynalazku zgadzają się bardzo dobrze z wynikami, uzyskiwanymi przy użyciu znanych metod. Sposób według wynalazku może zastąpić wszystkie znane metody posiewu z rozcieńczaniem.

Jak wspomniano wyżej, przedmiotem wynalazku jest również naczynie umożliwiające określanie stężeń drobnoustrojów metodą posiewu, w której badaną próbkę i pożywkę umieszcza się w naczyniu, pozwala na zestalenie się i po zestaleniu inkubuje, a następnie oblicza kolonie w naczyniu. Cechą tego naczynia jest to, że ma ono dno skośne, zakrzywione, schodkowe lub wyposażone w przegrody o różnej wysokości.

Zgodnie z wynalazkiem, osiąga się to stosując naczynie o takim kształcie, że mieszanina próbki i pożywki wprowadzona do tego naczynia tak, iż ma powierzchnię poziomą, tworzy po zakrzepnięciu warstwę, której grubość zmienia się w sposób kontrolowany. To naczynie nowego typu może być np. okrągłe, jak znana płytka Petriego, albo prostokątne. Grubość warstwy pożywki dostosowuje się do żądanej wartości nadając dennej powierzihni okrągłego naczynia kształt kulisty lub ti^ae^niaycznir koneΓoliwany kształt asferyczny, który może być wznoszący się lub opadający. Dno naczynia okrągłego może być też wznoszące się lub opadające, jeżeli wyposaży się naczynie w współśrodkowe, ρierśiieniowr, poziome powierzchnie płaskie, z kołową powierzchnią ołaską w środku. Dno naczynia prostokątnego może w^r^o^^ć się Mniowo, wzdłuż kołowego łuku lub w inny, maaernmaycznie kontΓożiwanc sposób. Dno prostokątnego naczynia można też wyposażać w prostokątne, płaskie powierzchnie, wytwarzając dno wznoszące się. Korzystne są naczynia o kształcie prostokątnym. GeomiiΓię naczynia można też ustalać za pomocą przegród o różnej wysokości, umieszczonych na dnie naczynia. Najmniejsza grubość warstwy pożywki w naczyniu według wynalazku może być np. 1 mm, a największa 10 mm.

Wszzytkie korzyści, jakie daje sposób według wynalazku, można uzyskać stosując naczynie według wynalazku. Zbędne są kolejne rozcieńczania i w porównaniu ze znanymi metodami zmniejsza się zużycie maaeriałów, ogranicza zużycie pożywki i znacznie ogranicza potrzebną przestrzeń.

W przypadku stosowania naczynia prostokątnego, zużycie pożywki wynosi w najeepszym przypadku tylko około 50¾ zużycia przy stosowaniu płytek Petriego, a przestrzeń do hodowH, mierzona jako powierzchnia jest o ponad 20¾ mniejzza niż przy stosowaniu naczyń okrągłych. Zgodnie z tym, w sposobie według wynalazku najkorzystniej jest stosować naczynia o kształcie prostokąta. Poza tym, korzystnie jest mieszać próbkę (szczepionkę) z pożywką dokładnie przed umieszczeniem w naczyniu.

Na rysunku, fig. 1Α, 2A, 3,4A, 56 i 7 przedstawiają pionowe przekroje różnych odmian naczynia według wynalazku, z zaznaczonymi rniaami przerywanymi powieΓzchniami mieszaniny pożywki z próbką. Fig. IB, 2B i 43 przedstawiają odpowiednie naczynia w widoku z góry. Fig. 1A i fig. IB przedstawiają naczynie kołowe, z dnem la wypukłym ku górze. Pożywka jest zaznaczona cyfrą 2. Jak widać z rysunku, grubość warstwy pożywki wzrasta w stronę obwodu naczynia, zgodnie z geometrycznym kształem dna naczynia i gęstość kolonii wzrasta odpowiednio.

Fig. 2A i fig. 2B przedstawiają naczynie 11, które różni się od opisanego wyżej tym, że jego dno łla jest w dół, toteż grubość warstwy pożyci 2 i odpowiednia gęstość kolonii są największe w środku naczynia i maaeją ku brzegom.

Fig. 3 przedstawia naczynie 21, którego dno 21a ma kształt poziomych powierzchni płaskich, umiezycyoncch współśrodkowo tak, że dno tworzy stopnie. Naczynie to ma przeto kołowe strefy warstw o grubości odpowiadającej kształtowi dna.

156 162

Fig. 4A i fig. 4B przedstawiają naczynie 31, które w widoku z góry ma kształt prostokąta, a dno 31a jest nachylone. Grubość warstwy wzrasta od jednego końca naczynia do drugiego i odpowiednio wzrasta lćczba kolonii..

Fig. 5 przedstawia naczynie 41, którego dno 41a się łukowato i odpowiednio zmienia się grubość warstwy i ilość kolonii.

Fig. 6 przedstawia naczynie 51, którego dno 51a tworzy prostokątne powierzchnie płaskie, które wynoszą się schodkowo. Strefy grubości warstwy zmieniają się odpowiednio do kształtu dna.

Fig. 7 przedstawia naczynie 61, którego dno ma przegrody ćla. Mieszaninę próbki z agarem wprowadza się do przedziału 1, z którego przepływa ona do przedziału 2 i dalej tak, że powstają strefy o różnej grubości warstwy.

Wynalazek ilustrują poniższe przykłady.

Przykład I. Próbkę 1 pl mleka wprowadza się aseptycznie (pętla lub mikropipeta) do 12 ml stopionego, wyjałowionego agaru Standard Platę Count Agar (taki jak FSL-SOF 100:1981), umieszczonego w wyjałowionej probówce i ochłodzonego do temperatury 45*C. Po zaszczepieniu, mieszaninę próbki z agarem wstrząsa się należycie, np. w mieszalniku do probówek. Po wymieszaniu, mieszaninę próbki z agarem posiewa się w prostoką^ym naczyniu, którego dno się, gdyż jest utworzone z poziomych, prostokątnych powierzchni płaskich. Naczynie obejmuje 5 płas2 kich powierzchni po 4 cm , przy czym powieΓZchnie te wznoszą się schodkami o wysokości po 2 mm.

ml cieczy, to jest agaru, wypełnia opisane naczynie tak, że powstaje w naczyniu 5 sektorów o jednakowej powieΓZChni, lecz różniących się grubością warstwy agaru. W sektorze I warstwa ta ma grubość 2 mm, w sektorze II 4 mm, w sektorze III 6 mm, w sektorze IV 8 mm, i w sektorze V 10 mm. Ilości agaru (i badanej próbki) wynoszą ldpowiednίo: w sektorze I 0,80 ml (0,066 pl), w II 1,60 ml (0,133 pl), w III 2,40 ml (0,199 pl), w IV 3,20 ml (0,266 pl) i w V 4,00 ml (0,333 pl). Łączna powierzchnia zajmowana w sektorach przez agar wynosi 20 cm . Ilości agaru i próbki w sektorach podano także w tabeli 1.

Naczynie zamyka się pokrywą i umieszczone poziomo poddaje inkubacji w temperaturze 30 - l'C, w ciągu 72 - 2 godzin. Wyciki określa się oddzCelnił dla każdego sektora, dzieląc liczbę dających się policzyć kolonii w każdym sektorze (w praktyce < 40 kolonii w 1 sektorze) przez ib^śó próbki w danym sektorze. W opisywanej próbie Hość próbki w sektorze I wynosi 0,066 pl czyli 0,000066 ml, a w sektorze V Hośó ta wynosi 0,333 pl czyli 0,000333 ml. Zgodnie z tym, jeżeli liczba kolonii w sektorze I wynosi 3, to na 0,000066 ml przypada 3 kolonie, czyli w przybliżeniu 45000 kolonii na 1 ml. jeżeli zaś lćczba kolonii w sektorze V wynosi 17, to na 0,000333 ml przypada 17 kolonii., czyli około 50000 kolonii na 1 ml. Wyrnk ten daje bezpośrednio ilość drobnoustrojów na 1 ml próbki. Liczby kolonii w sektorach i ustalone na tej podstawie podano w tabeli 2.

Informacje uzyskane z wszystkich sektorów umoHiwiających lcczenie można wykorzystywać, obliczając średnie wynńki otrzmniane z każdego sektora.

Tabela 1

o Sektor (A = 4 cm )	Agar (ml)	Próbka (ml)	\ próbki
V	4,00	0,000333	33
IV	3,20	0,000266	28
III	2,40	0,000199	20
II	1,60	0,000133	13
I	0,80	0,000066	6

156 162

Tabela 2

		Mooymkacja	□ PC		Ilość drobnoustrojów w próbce
SPC x 1000						(dczba droŁinoustrojów x 10/ml)
	I	I!	III	IV	V	I	II	III	IV	V
10	1	1	2	3	3				11	9
50	3	7	10	13	17	45	53	50	49	51
100	7	13	20	27	33	106	98	100	101	99
200	13	27	40	53	67	197	203	201	199	-

Przykład II. Próbkę zaszczepia się aseptycznie w agarze w rozcieńczeniu 10* (10 pl pierwotnej próbki na 100 ml agaru), oo czym mieszaninę agaru z próbką mesza się dokładnie, posiewa na zwykłych płytkach Petriego w ilościach 2, 5, 10, 20, 40 i 60 ml tak, że pierwotna próbka jest na poszczególnych płytkach odpowiednio w ilości 0,0002 ml, 0,0005 ml, 0,001 ml,

0,002 ml, 0,004 ml i 0,006 ml. Płytki poddaje się inkubbcji, policzone kolonie na płytkach przelicza się na stężenie drobnoustrojów w pierwotnej próbce, stosując następujący wzór:

obliczona gęstość kolonii stężenie drobnoustrojów w próbce = ilość próbki pierwotnej *yniki podano w tabeli 3.

Tabela 3

SPC x 1000	Kolonie na płytkach (dość mieszaniny próbki z agarem)
2 ml	5 ml	10 ml	20 m	40 ml	60 ml
5	1	3	5	10	20	30
20	4	10	20	40	BO	120
50	10	25	50	100	200	300
100	20	50	100	200	(400)	(600)
200	(40)	(100)	200	(400)	-	-
300	(60)	(150)	300	-	-	-
500	(100)	(250)	(500)	-	-	-

Nawiasy w tabeli 3 oznaczają, że nie można było policzyć gęstości kolonii na ołytkach. Gdy stosuje się płytki Petriego o średnicy 90 mm, to dno płytki jest całkowicie pokryte agarem tylko w przypadku płytek mających 10 ml agaru lub więcej.

156 162

FIG. 4B

FIG. 7

156 162

FIG. 2A

FIG. 1A

FIG. 1B

FIG. 2B

Zakład UP RP. Nakład 100 egz.

Cena 3000 zł

Claims (10)

1. Zastrzeżenia patentowe

   i skośne !, zakrzywione, schodkowe lub wyposażone w przegrody o różnej wyso^ośc według zastrz.2, Z n a m i e n n e t y m, że ma przekrój kołowy. według zastrz.2, z n a m i e n n e t y m , że ma przekrój prostokątny. według zastrz.2, z n a m i e n n e t y m, że ma dno w^kęsłe. według zastrz.2, z n a m i e n n e t y m, że ma dno wypuuke. według zastrz.2, z n a m i e n n e t y m, że ma dno wznoszęce się linowo według zastrz.2, z n a m i e n n e t y m, że ma dno wznoszęce się jak łuk według zastrz.3, z n a m i e n n e t y m, że ma dno wznoszęce się lub opa

   1. Sposób oznaczania stężenia drobnoustrojów metodę płytkową, znamienny tym, że sporządza się htmoteeiczną mieszaninę próbki i pożywWi, mieszaninę tę umieszcza się w naczyniu, którego dno jest skośne, zakrzywione, schodkowe lub wyposażone w przegrody o różnej wysokooci, mieszaninę tę zestala się i inkubuje, po czym liczy się powwtałe kolonie.
2. 2. Naczynie do oznaczania stężenia drobnoustrojów metodę płytkowę, znamienne tym, że ma
3. 3. Naczyr
4. 4. Naczyi
5. 5. Naczyr
6. 6. Naczyr
7. 7. Naczyr

   Θ. Naczyr kołowy.
8. 9. Naczyr dajęce, przy czym ma ono koncentryczne pierCcientowo uksztaHowane poziome obszary powierzchni płaskich z kołowym płaskim obszarem w środku.
9. 10. Naczynie według zastrz.4, znamienne tym, że ma dno wznoszęce się, utworzone przez obszary prostokątnych powieΓZihni płaskich.
10. 11. Naczynie według zastrz.2, znamienne tym, dnie jedną lub większą liczbę przegród o różnej wysokoość.

    że ma osadzoną lub osadzone na