PL156487B1

PL156487B1 - Sposób prowadzenia hodowli Treponema hyodysenteriae PL PL PL

Info

Publication number: PL156487B1
Application number: PL1986259415A
Authority: PL
Priority date: 1985-05-10
Filing date: 1986-05-09
Publication date: 1992-03-31
Also published as: ES8706817A1; KR940004541B1; GR861135B; DK217486A; JPH069505B2; BR8602091A; JPH08785B2; DK217486D0; ZA863451B; EP0201796B1; KR860009121A; HU201114B; ATE74159T1; JPS6211090A; HUT44072A; ES554822A0; DE3684503D1; JPH06293662A; EP0201796A3; CA1279277C

Abstract

1. Sposób prowadzenia hodowli Treponema hyodysenteriae w odpowiednim srodowisku w celu uzyskania komórek do wytworzenia bakteryny, znamienny tym, ze poddaje sie hodowli Treponema hyodysenteriae w srodowisku odzywczym, zawierajacym frakcje wolowa bogata w cholesterol, otrzymana z plazmy lub surowicy wolowej, przy czym frakcje wolowa bogata w cholesterol wytwarza sie w procesie obejmujacym nastepujace etapy: (a) kontaktowanie cieklej plazmy lub surowicy wolowej zawierajacej cholesterol z adsorbentem krzemionkowym w celu zaadsorbowania frakcji bogatej w cholesterol, (b) oddzielenie zaadsorbowanej frakcji bogatej w cholesterol od pozostalej cieklej plazmy lub surowicy, (c) zamrozenie i rozmrozenie zaadsorbo- wanej frakcji bogatej w cholesterol, (d) wymywanie zaadsorbowanej frakcji bogatej w choleste- rol przy pH od 9,0 do 1 1 ,5, (e) zatezenie roztworu bogatego w cholesterol przez ultrafiltracje, (f) doprowadzenie pH zatezonego roztworu cholesterolu do wartosci w zakresie 11,0-11,4, (g) dializowanie zatezonego roztworu bogatego w cholesterol kolejno do weglanu sodu i wody, (h) dalsze zatezanie dializowanego roztworu bogatego w choresterol przez ultrafiltracje do osiag- niecia poziomu cholesterolu 50 do 3000 mg/dl, (i) nastawienie pH zatezonego roztworu boga- tego w cholesterol na wartosc w zakresie od 7,0-11,0, (j) ogrzewanie zatezonego roztworu bogatego w cholesterol w temperaturze 50-100°C w ciagu od 30 minut do 24 godzin i (k) odzyskanie z niego oczyszczonej frakcji bogatej w cholesterol. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób prowadzenia hodowU Treponema hyodysenneriae na odpowiednim podłożu zawierajęcym frakcję wołową bogatą w cholesterol i sposób wytwarzania bakteryny z wykorzystaneem uzyskanych komórek.

W sposobie według wynalazku można stosować zjadHwy szczep T. hyodyse.enariae. Jest to szczep zdolny do wywołania typowej infekcji dyzenterią świń. Stwierdzono, że do tego celu szczególnie nadają sią szczepy B 204 i B 234, które są zdeponowane w American Type Culture Collection i mają numery ATCC nr 31 212 /B 204/ i ATCC nr 31 287 /8 234/.

Szczep R. hyodysenteriae może wzrastać na podłożu zawierającym mieszaniną bulionu Tryptic Soy Broth /Dlfeo Laboł8jorirs/ uzupełnionego surowicą płodową cielęcą lub jagnięcą, glkloozę·, chlorolodorkrem l-cysteiny, witaminą B_l2 i ekstremem drożdżowym. W sposobie według wynalazku ulepszenie polega na wprowadzeniu do takiego podłoża hodowlanego dla T. hyodysenteriae frakcji wołowej bogatej w cholesterol. Korzystnie frakcja taka stanowi 1,0 do 2,5% obj podłoża, może być jednak stosowana w ilości 0,1 do 5,0% obj.

Frakcje wołowe bogate w cholesterol nadające sią do stosowania w sposobie według wynalazku można uzyskać z kilku źródeł. Do tego zastosowania nadaje sią preparat pod nazwą Chooesterol Concemrate Codą 82-010 firny Miles Sciennific Division of Miles Laboratories, Inc., wytworzony z surowicy wołowej sposobem według opisu patentowego Stanów Zjedn. Ameeyki nr 4 290 774 oraz Bovine Chooesterol Conccnnrate List 3200 firny Biocell Laboratories.

Sposób według wynalazku prowadzenia hodowU Treponema hyodysenteriae w odpowiednim środowisku w celu uzyskania komórek do wytworzenia bakteryny polega na tym, że poddaje się hodowU Treponema hyodysenteriae w środowisku odżywczym, zawierającym frakcję wołową bogatą w cholesterol, otΓzemaną z plazmy lub surowicy wołowej przy czym frakcję wołową bogatą w cholesterol, wytwarza się w procesie obejmującym nastąpujące etapy:

a/ kontaktowanie ciekłej plazmy lub surowicy wołowej zawierającej cholesterol z adsorbentem krzemionkowym w.celu zaadsorbowania frakcji bogatej w cholesterol, b/ oddzielenie zaadsorbowanej frakcji bogatej w cholesterol od pozostałej ciekłej plazmy lub surowicy, c/ zamrożenie i rozmrożenie zaadsorbowanej frakcji bogatej w cholesterol, d/ wymownie zaadsorbowanej frakcji bogatej w cholesterol przy pH od 9,0 do 11,5, e/ zatążenie roztworu bogatego w cholesterol przez ultrafiltaację, f/ doprowadzenie pH zatężonego roztworu cholesterolu do wartości w zakresie 11,0 - 11,4, g/ dialiłowanir zatężonego roztworu bogatego w cholesterol kolejno do węglanu sodu i wody, h/ dalsze zatążenie dializwwanego roztworu bogatego w cholesterol przez ultrafibaację, i/ nastawienie pH zatężonego roztworu bogatego w cholesterol na wartość w zakresie od 7,0 11,0, j/ ogrzewanie zatężonego roztworu bogatego w cholesterol w temperaturze 5O-100°C w ciągu od 30 minut do 24 godzin i k/ odzyskanie z niego oczyszczonej frakcji bogatej w cholesterol.

Korzystnie środowisko odżywcze zawiera 0,1 - 5,0% objątoścociwych frakcji wołowej bogatej w cholesterol.

Ponadto korzystnie środowisko odżywcze zawiera 1-2,% objątoścociwych frakcji wołowej bogatej w cholesterol wytworzonej w procesie obejmujęcym etapy:

a/ kontaktowanie ciekłej plazmy lub surowicy wołowej zawierającej cholesterol z adsorbene^m krzemionkowym w celu zaadsorbowania cholesterolu.

156 487 b/ oddzielenie zaadsorbowanej frakcji bogatej w cholesterol od pozostałej ciekłej plazmy lub surowicy, c/ zamrożenie i rozmrożenie zaadsorbowanej frakcji bogatej w cholesterol, d/ wymywanie zaadsorbowanej frakcji bogatej w cholesterol przy pH od 10,4 do 10,6, e/ zamrożenie i rozmrożenie wymyyej frakcji bogatej w cholesterol, f/ nastawienie pH frakcji bogatej w cholesterol na wartość 12,0, g/ zatężanie frakcji bogatej w cholesterol przez ultrafiltracje do objętości wynoszącej 15-20& początkowej objętości, h/ dialioowanie zatężonej frakcji bogatej w cholesterol kolejno do węglanu sodu i wody, i/ dalsze zatężenie dializwwanej frakcji bogatej w cholesterol przez ultraflibację do objętości, którą miała ona na początku etapu /h/, j/ nastawianie pH zatężonej frakcji bogatej w cholesterol na wartość 8,6, ^k/ ogrzewanie zat^onej fraltcji laogatej w cholesterol w te^^er^turze ⁸⁰°C w cię^gu 3⁰ minut do 5 godzin i

1/ odzyskanie z niego oczyszczonej frakcji wołowej bogatej w cholesterol.

Taka frakcja i sposób Jej wytwarzania są opisane i zastrzeżone w opisie patenzawym Stanów Zjedn. Ameeyki nr 4 758 517.

Surowcem do wytwarzania frakcji bogatej w cholesterol może być plazma lub surowica wołowa lub ich frakcje, zawierające cholesterol. Korzystnym surowcem jest surowica wołowa. Oeżeli surowcem Jest surowica, korzystnie dodaje się rozpuszczalną sól., taką jak cytrynian sodu, do uzyskania siły jonowej 0,25 do 1,0. Inne nadające się sole obejmują chlorek sodu, fosforan sodu, fosforan potasu, siarczan amonu i siarczan sodu. Dodatek rozpuszczalnej soli do powyższego koncentratu powoduje zwiększenie ilości zaadsorbowanego cholesterolu w następnym etapie adsorppji na krzemionce. Plazmę wołową zwykle zbiera się wykorzystując dodatek cytrynianu jako antykoagulanta i wówczas ta ioość soli wystarcza także w etapie adsoprrji i dodatkowe wprowadzanie soli jest już niepotrzebne.

^plazm^ę lub surowic^ę u^żywan^ą jako sutowiej^, utrzymuje się w temperaturze o^d 0°C do 50°C ^, korzystnie od 2°°^C do 25°^ ^pH ^jsrowada si.ę ^do zaltresu od ^5,5 do 9,⁰, korzystnie od 7,0 do 8,0.

Adsorbent krzemionkowy, stosowany w tym procesie nie musi mieć szczególnego składu. Odpowiednim maieriαlem krzemionkowym jest substelnie rozdrobniona krzemionka znana pod nazwą handlową Cabooil frmy Cabot Corporation i sproszkowana krzemionka o nazwie handlowej Aerosil 380 firny Cary Comppny. Krzemionkę dodaje się do ciekłej plazmy lub surowicy w ilości 2 do 50 g/1, korzystnie od 10 do 20 g/1.

Zawiesinę krzemionki w ciekłej plazmie lub surowicy miesza się przez około 3 do 4 godzin, po czym krzemionkę zawierającą zaadsorbowany cholesterol oddziela się od ciekłej plazmy lub surowicy, korzystnie przez wirowanie i odrzuca się fazę ciekłą. Pastę krzemionkową zamraża si^ę w tlm3ere^tutie -2°^OC i utrzymuje w tej temperaturze w cięgu co najmniej jednego tygo^dnia, a korzystnie dwóch tygodni.. Zamrożoną pastę topi się w temperaturze pokojowej /około ²⁰ - ²5°^C/ przez ^{24 d}o ⁴⁸ godzin. Ciecz wyciśni^ęt^ą ze sto^pionej ^past^y, odrzuca s^ię. ^past^ękrzemionkową przemywa się, aby usunąć niepożądane proteiny. W tym celu wytwarza się zawiesinę pasty w wodnym roztworze soli zawierającym około 0,15 M chlorku sodu. Inną nadającą się solą jest octan sodu i fosforan sodu. ioość stosowanego roztworu soli stanowi dwukrotny ciężar pasty. Pastę oddziela się od cieczy. Przemywanie z użyciem roztworu soli korzystnie powtarza się dwa razy, aby usunąć iαokludowαnl proteiny. Przygotowuje się zawiesinę przemytej wody i doprowadza się pH do wartości 9,0 do 11,5, korzystnie 10,4 do 10,6 dodając odpowiednią substancję alkalcczną, taką Jak wodorotlenek sodu. Zawiesinę miesza się przez około 2 godzin 1 utrzymuje w tym czasie pH na żądanym poziomie dodając okresowo powyższą substancję alkaliczną. W ten sposób wymywa się żądaną frakcję chollstlroZową z krzemionki. Następnie

156 487 zawiesinę pozostawia się do odstania na 12 do 24 godzin, korzystnie 12-18 godzin. Supernantant zawierający cholesterol zlewa się i poddaje dalszej obróbce. Korzystnie, w celu wytworzenia żądanej frakcji bogatej w cholesterol, przeprowadza się tylko jedno przemywanie, jednakże można powtórzyć etapy wytwarzania alkalicznej zawiesiny, przemywania, mieszania i osiadania jeszcze dwa razy i połączyć supernatanty z drugiego i trzeciego przemywania z materiaeem uzyskanym w pierwszym przemywanńu. Krzemionką należy odrzucić.

Z roztworu cholesterolu usuwa się ślady krzemionki poddając go filtaacji i wirowaniu, po czym zatęża się do 15 - 50%, korzystnie 20%, początkowe,] objętości na drodze ultrafiltracji. pH doprowadza się do wartości w zakresie od 11,0 do 11,4, ko [rzystnie 11,2, dodając substancję alkaliczną. Pomaga to w rozpuszczeniu resztek krzemionki, którą następnie usuwa się. Koncennrat cholesterolu poddaje się dalszej obróbce w celu całkowitego usunięcia soli-. Korzystnym sposobem usuwania soli jest dialiowwanie do węglanu sodu i wody. Ten etap usuw^i^i.a soli Jest ważny ze względu na następującą po nim obróbkę cieplną. Nawet nieznaczna ilość soli spowoduje niepożądaną denaturację cholesterolu po ogrzaniu.

Dialiorwaiy roztwór cholesterolu dalej zatęża się na drodze ultrafiltracji do stężenie 50 do 3000 mg/dl, korzystnie do 1000 do 2000 mg/dl, po czym doprowadza się pH stężonego roztworu cholesterolu do wartości w zakresie od 7,0 do 11,0, korzystnie do 7,6, w celu nadania mu właściwości lepszego mieszania się z innymi składnikami w dalszym jego zastosowaniu w pożyw ce fiodowHnej. Roztwór o^grzewa si^ę do temperatury w zakresie 5⁰°0 do 100°0, korzystnie do 80°0 w ciągu 30 minut do 24 godzin, korzystnie 30 do 60 minut, w celu zwiększenia stabilności choTesterolu w czasie pr^echo^^aan^. Roztwór ochładza się do tempeeatury pokojowej i w warunkach sterylnych filtuuje się w celu odzyskania oczyszczonej frakcji bogatej w cholesterol. Produkt ten nie jest czystym cholesteroeem, ale zawiera domieszkę małych ilości niezidentyfikwwanych substannji, które przechodzę w procesie jego wytwarzania.

Czysty cholesterol nie nadaje się do zastosowania w sposobie według wynalazku, ponieważ nie wpływa w sposób dostrzegalny na wzrost T. hyodysenteriae w porównaniu ze wzrostem uzyskw^^r^^^m przy zastosowaniu frakcji wołowych bogatych w cholesterol.

Kornmóki T. hyodysenteriae hoduje się na podłożu zawierającym frakcję wołową bogatą w cholesterol w znanych w technice warunkach. Uzyskane komórki zabija się znanym sposobem, stosując takie środki jak form lina, meri-olat lub j -propiolakton. Następnie komórki zbiera się i wytwarza się ich zawiesinę w odpowiednim nośniku, wytwarzając w ten sposób żądaną bakterynę. Aktywność bakteryny można jeszcze zwiększyć stosując adjuwant. Korzystnym adjuwantem nadającym się do użycia wraz z komórkami T. hyodysenteriae wyhodowanymi sposobem według wynalazku jest kombinacja polimeru kwasu ak^^wego usieciwwanego poliallilosccharydem i specjalnego układu emulgującego iiaajgi i zastizeżonegi w opisie pateno^ym Stanów Zjedn. Ameeyki nr 3 919 411. Takie adjuwanty są sprzedawane przez fimę Bayvet Division of Miles Laboratories, Inc. pod nazwą handlową HAVL0GEN.

Stwierdzono, że bakteryna z T. hyodysenneriae, wytworzona powyższym sposobem, zwiększa znacznie odporność świń na dyzennerię, przy podaniu w postaci iniekcji domięśniowych tylko w dwóch dawkach z 3-tygodniowymi przerwami.

Wynalazek opisany jest' szczegółowo w następujących przykładach.

Przykład I. Frakcję włową bogatą w ch^leeiterol wytworzono w następujący sposób. Świeżą surowicę wołową umieszczono w temperaturze 20 - 25°0 i dodano 14,7 g/1 cytrynianu sodu /siaa j(^i^t^wa surowicy' 0,5/. Wytworzony roztwór mieszano przez 30 mnut i doprowadzono pH do wartości 7,0 dodając odpowiednią Hość IN wodorotlenku sodu. Dodano subtelnie rozdrobnioną krzemionkę w ilości 10 g/1 i mieszano wytworzoną zawiesinę w ciągu 3 godzin w temperaturze pokojowee# Następnie zawiesinę odwirowano i oddzielono krzemionkę zawierającą isαdtorbowsną substancję od fazy ciekłej, którą odrzucono. Pastę krzemionkową wówczas zam^tożlio w temperaturze -²0^OC i przechowywano w tej temperatu^rz^e fii-zez 2 tyędnie, ^po ^ym topiono ją w temperaturze pokojowej przez 48 godzin. Wyccśniętą ciecz odrzucono. Następnie wytworzono zawiesinę pasty krzemionkowej w 2 objętościach 0,85% /wag./obb./ wodnego roztworu chlorku sodu /0,146 M NaCl/ i mieszano łagodnie przez 15 minut, po czym pozostawiono do

155 487 odstania na co najmniej 3 godziny. Ciecz stanowiącą supernantant zlano i odrzucono. Ten etap przemywania powtórzono dwa razy. Następnie sporządzono zawiesinę przemytej pasty w 2 objętościach dejonizowanej wody. pH doprowadzono do wartości 10,5 dodając 1 N woddrotlenek sodu. Wytworzonę zawiesinę mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, doprowadzając w tym czasie pH do wartości 10,5, po czym mieszanie przerwano i zawiesinę pozostawiono do odstania na 18 godzin. Supernatant odlano i skatowano przez przesączenie i odwirowanie. Krzemionkę odrzucono. Sklarowany roztwór zatężono do 20% początkowej objętości na drodze ultrafiltracji. pH zatężonego roztworu doprowadzono do wartości 11,2 dodatkiem 1 N wodoTotlenku sodu, po czym zatężony roztwór dialioowano do 6 objętości 0,01 M węglanu sodu przy pH 11,2, a następnie do 5 objętości dejonizowanej wody. Oznaczono poziom cholesterolu w koncentracie znaną metodą i dalej zatężano przez ultrafiltrację do poziomu cholesterolu 1000 mg/dl. pH doprowadzono do wartości 7,6 dodat^em IN kwasu solnego i ogrzewano ^^tworzon^y roztwór w temperaturze ⁸⁰°C ^przez 1 ^godzin^ę. Następmie roztw^ oc^hłodzonr do temperatury pokojowej i przesączono w sterylnych warunkach. Przesączony matował stanowił oczyszczoną frakcję wołową bogatą w cholesterol.

Zamrożony szczep maaćerzysty T. hyodysenteriae przeniesiono do szklanej ruryki zawierajęcej 13 ml bulionu Tryptic Scy Broth /Difco Laboratories, 27,5 g/1/, 10% płodowej surowicy cielęcej, 0,5% dekstrozy, 0,0i% chlorowodorku l-cysteiny i 0,25 mg/ml witaminy B^· Podane procenty są to procenty wago^/Dojętościowe. Rurkę zatopiono i inkubowano w atmosferze a^er^owej obejmującej 10% obj. wodoru, 80% obj. azotu i 10% obj. dwutlenku węgla w te^jer^turze ³⁷°C przez ^{72 g}odziny. Uzys^ną Iculturę maaierz^yst^ą paskowano do ² rurek zawierających to samo podłoże i inkubowano w temperaturze ³⁷°C przez ²4 ^godzin^y w tych ^samych warunkach. Zawartość rurek połączono. 7 ml porcję połączonej aktywnej kultury dodano do każdej z dwóch butelek o pojemności 500 ml, zawierających po 200 ml bulionu Tryptic Scy Broth, 1% ekstraktu drożdżowego, 5% surowicy jagnięcia, 0,!% dekstrozy, 0,05% chloi-owodorku l-cysteiny i 0,25 mg/ml witaminy B^· przy czym podane procenty są wagowo/oOjętościowe. Zawortoέci butelek inkubowano w wyżej opisanej atairobowej atmosferze w temperaturze 37°C aż do zmętnienia /około 24 godziny/.

Uzyskaną rozwiniętą kulturę podzielono na dwie części i każdą oddzielnie użyto do zaszczepienia dwóch doświadczalnych fermentorów o pojemności 14 litr<5w każdy, zawierających po 7 litów bulionu Tryptic Scy Broth, 1% ekstraktu drożdżowego, 3% surowicy jagnięcej, 1% dekstrozy, O.OESli chlorowodorku l-cysteiny i 0,25 mg/ml witaminy B₁₂, przy czym podane procenty są ^^ę^^ww^oobęteściowe. Do jednego z fermentorów dodano 2,5% obj. frakcji wołowej bogatej w cholesterol, wytworzonej sposobem opisanym powyżej Obydwa fermentory inkubowano w temperaturze 3⁷° C ^przez ^{44 g}odziny w anaeto^broej atmosferze. pH utrzymywano na poziomie 6,5, dodając okresowo 5 N wodorotlenek sodu.

Po inkubacj z każdego fermentom pobrano odpowiednie próbki i zawartości ferm^^rów potraktowano 0,15% obj. formaliną, aby zabić komm^!. Próbki komórek badano pod mikroskopem.

Całkowitą lćczbę komórek zmierzono w komorze lcczącej ^^trof^-Hausera, a Hczbę komórek widzialnych określono metodą kolejnych rrziiβńiziń na świeżo lanych płytkach agarowych z 5% krwi ^bydl^ęcej. ^Płytl<i ajjarowe inkubowano w temperaturze 37°C w anrirr^booej atmosferto obejmującej 50% obj. wodoru i 50% obj. dwutlenku węgla w ciągu 14 dni..

Kolonie T. hyodysentoriae występowały jako pojedyńcze strefy hemmrizy. Wynńki tych obserwacji przedstawiono poniżej w Tablicy 1.

156 487

Tablica 1

Wzrost T. hyodysenteriae ATCC 31212 na podłożu zawierającym i nia zawierającym frakcji wołowej bogatej w cholesterol.

Podłoże	Badanie mikroskopowe 1 1	Całkowita lcczba ¹komórek ¹ _ 1.	Liczba komórek¹widzialnych ¹
¹ bez frakcji 1 cholesterolowej	• Luźno zwinięte spiralnie; ' 1 komórki o cienkich ściankach, ; , zwykle nieaktywne	1.3	g x 10 /ml 1 » 1	3,7 x 10⁷/ml 1
			1.
z frakcją ¹ cholesterooową	¹ ciasno zwinięte spiralnie; i komóóki krótsze o grubszych 1 , ściankach, aktywne , 1 1	2.5	g ¹ x 10/ml , 1 t	g ¹ ^1,4 x IO /ml ⁱ

Z powyższych danych widać, że obecność frakcji bogatej w cholesterol zwiększa dwukrotnie całkowitą liczbę komórek, lćczbę komórek widzialnych około 100-krotnie i wpływa korzystnie na morfologię komórek.

Przykład II. Kultury maccerzyste T. hyodysanneriae ATCC nr 31212 wyhodowane jak opisano w przykładzie I, użyto do zaszczepienia na poziomie 3% obj . zcwactości trzech butelek o pojemnośći 500 ml, z których każda zawiera 200 ml bulionu Tryptic Soy Broth zmieszanego z 1% ekstraktu drożdżowego , 3% surowicy jagnięcej, 1% dekstrozy, 0,0% chlorowodorku l-cysteiny i 0,25 mg/ml witaminy B^· ^p°dane procenty są procentami wagowo/oojętościowymi. Jedna z butelek - kontrolna - zawierała 2,5% obj. frakcji wołowe;) bogatej w cholesterol, wytworzonej sposobem opisanym w przykładzie I. Druga butelka zawierała 2,% obj. preparatu Chooesterol Concennrate Codę 82-010 firny-Miles Laboratories, Inc. Trzecia butelka zawierała 2,5% obj. preparatu Bovine Choresterol Concennrate List 3200 firny Biocell Laboratories. Te zaszczepione butelki inkubowano w rnaerrjroej etm^sferze obejmującej 10% obj. wodoru, 80% obj. azotu i 1C% obj. dwutlenku węgla w temperaturze ³7°C przez ^{38 g}odzin. ^pH zawartości, butelek doprowadzono do wartości 7,0 w 24 i 31 godzinie, dodając 2N wodorotlenek sodu. Całkowitą lcczbę komórek z każdej butelki mierzono w komorze lćczącej PetroffHfausera. Wynnki przedstawiono poniżej w Tablicy 2.

Tablica 2

Wzrost T. hyodysenneriae ATCC nr 31212 na podłożu zawierającym różne bogate w cholesterol.

frakcje wołowe

Dodatek do podłoża	¹ Całkowita t	lcczba komórek
Korzystna frakcja choles	I j 2,5 x	10⁹/ml
/hodowla kontrolna/	1
Cholesterol Concennrate	¹ 2,7 x	Q 10/ml
Codę 82-010	t
Bovine Chooesterol Concennrate	, 3,0 χ	Q 10⁹/ml
List 3200	I

Z powyższych danych wynika, że do wyhodowania pożądanej wysokiej lćczby komórek T. hyodysenteriae można wykorzystać frakcje wołowe bogate w cholesterol, pochodzące z różnych źródeł:.

Przykład III. W celu uzyskania wysokiego stężenia komórek, powtórzono procedurę według przykładu I stosując szczep T. hyodysenneriae ATCC nr 31287 na podłożu zawierającym korzystną frakcję cholesterolową.

156 487

Przykład IV. Szczepionkę lub bakterynę wytworzono mieszając zabite komórki T. hyodysenteriae wyhodowane sposobem opisanym w przykładzie I, na podłożu zawierającym korzystną frakcję cholesterolową, z 10% obj. adjuwanta HAVL0GEN opisanego w opisie patentowym Stanów Zjedn. Ameeyki nr 3 919 411 i 1 s 10000 martiolatu. Szczepionka zawierała g

x 10 kom6rek/ml. Szczepionkę tę użyto w pięciu oddzielnych badaniach typu challenge przeprowadzonych w celu określenia skuteczności szczepionki przeciwko dyi^^nneeiii świń. Do każdego z badań szcze|3ienie/chal.^^nge wykorzystano świnie obojga płci, pochodzące z trzody, w której nie notowano dyzenneeri, zwykle z hodowli Yorkshire, Hampshire lub Cross. Pierwsze szczepienie przeprowadzono r,a świniach, które były co najmniej 3 tygodnie po odstawieniu od mt^i i miały wagę w zakresie 15,75 kg do 18 kg.

Wszysskie badania hzczepieπie/chałeengr przeprowadzono w warunkach izolacji uwżżiwiających segregację świń szczepionych i kontrolowanych. Świnie karmiono prltetoową karmą nie zawierającą antybiotyków. Przed badaniem challenge świn:iom pobrano wymaz z odbytu, którego badanie na odpowiednim podłożu izolacytspm wykazało nieobecność T. hyodysenteriae i Salmonena spp.

świni-om wprowadzono dożołądkowo szczepy T. hyodysenteriαr ATCC nr 31212 lub 31287, wyhodowane sposobem podobnym do opisanego w przykładzie I, z tym, że komórki nie były zabite. Do żołądka każdej świni przez sondę żołądkową wprowadzono 100 miłilitnwę dawkę 8 9 aktywnej kultury rozcieńczoną do zawaatości 10 - 10 m/roor^(^£^nymrw, po czym następował 48-godzinny okres głodzenia. Każdą yainrklowatą świnię obserwowano codziennie przez 28-dniowy okres po zainfekowaniu. Na początku kltniytnych objawów choroby, chorym na dyzenterię ś^^no<^m pobrano wymaz z odbytu, aby wyizolować środek wyw^ojący chorobę. Potwierdzenie, iż jest to infekcja T. isodysenteΓiae uzyskano prowadząc hodowlę pochodną mtt^ri.ał^u z wacika na ^płytkah a^gam^yc^h z Itrwi-ą i s^sektynlmycynę, in^bację w ⁴2°C iJrzez 4 do 6 dni. i mk^ros/lsowr badanie zhrmolizowanyh płytek agarowych na obecność krętków. Przeprowadzono sekcję każdej świni, która padła podczas pięciu badań. Zanotowano zmiany makroskopowe i pobrano z odbytu wymaz śluzówki okrężnicy, który użyto do hldowli przeprowadzonej jak wyzae·

Odpowiedź klnnizzną poszczególnych świń na challenge mierzono stosując następujące Indeksy Kliniczne.

INDEKSY KLINICZNE

r 1	Stan ogólny	...........Ί - ¹ Skład kału i . _l _____________	Konsystencja kału ,
1	0 - normalny	¹ 0 - normalny	1	0 - normalna
1 i	1 - biegunka	, 1 - śluz		1 - miękki
1	2 - dyzenteria	¹ 2 - krew i śluz		1,5 - luźny
1	3 - wychudzenie	3 - krew		2 - cieknący
1 1	4 - zdychająca 5 - śmierć	1 1	1	3 - wodnisty
L		1	- -i -

Do obliczenia wartości indeksu kl^cz^ego stosowano różne metody analizy, które określono poniżej :

a/ Dzienny Indeks Kliniczny /DCI/ - dzienny indeks klinćczny dla każdej zainrekowanrj świni obliczom wykorzystując trzy wyżej opisane paramery.

DCI = Stan ogólny + Skład kału + Konsystencja kału b/ Dzienny Indeks Kliniczny Grupowy /DGCI/ - dzienny indeks klinćczny grupowy dla grupy szczepionej i kontrolnej obliczono według następującego wzoru:

DGCI - -^.25b_Zί3ła_l25Y5.S!ίłci_śWiń _w_2£uEŹ:^^_ χ ιοο Ilość świń w grupie

156 487 c/ Indywidualny Skumulowany Indeks Kliniczny /ICCI/ - skumulowany indeks kliniczny dla każdej świni przez cały okres 28 dni po zainfekowaniu obliczono następująco:

£ DCI /przez 28 dni po zainfekowaniu/

ICCI = ----------------------------------------------------------- x 100

Całkowita liczba przeprowadzonych obserwacji /84/ d/ Grupowy Skumulowany Indeks Klinćczny /GCCI/ - grupowy skumulowany indeks klinćczny dla grupy szczepionej i kontrolowanej otrzymano jako średnią wartość z indeksów ICCI w obrębie każdej grupy świń.

Gcci & ICCI /dla wszystkich świń w grupie/

Liczba świń w grupie

Badanie nr 1. 10 świń podzielono na dwie równe grupy, które umieszczono w dwóch pomieszczeniach. Pięciu ś^^not^m w grupie szczepionej podano domięśniowo wyżej opisaną szczepionkę w dwóch 5 ml dawkach z przerwami trzy tygodniowymi. 5 nieszczepionych kontrolowanych świń trzmmam w oddziennym poi^me^s^^c^^e^niu. W 2 tygodnie po drugim zastrzyku szczepionki wszystkie świnie zai^nfeoi^włano złośiiwmm szczepem T. hyodysenteriae ATCC nr 31212.

Badanie nr 2. 23 świnie, które miały być szczepione, rozmieszczono w 5 pomieszczeniach, a 6 świń kon t^^wanych w 2 pomieszczeniach. W grupie szczepionej świnie otrzymały domięśniowo dwie 5 ml dawki wyżej opisanej bakteryny z przerwę trzyyygodniową. Zainfekowanie przeprowadzono tak samo jak w badaniu nr 1.

Badanie nr 3. 10 świń podzielono na dwie równe grupy i umieszczono w dwóch pomieszczeπiach. Pięciu świnot^m w grupie szczepionej podano domięśniowo dwie 5 ml dawki wyżej opisanej bakteryny z tΓzywyoodπlową przerwę. Pięciu świń, stanowięcych grupę kontrolnę nie zaszczepiono. W dwa tygodnie po drugim szczepieniu wszystkie świnie za^eskoMa^ złoślwwym T. hwodysθntθriae ATCC nr 31287.

Badanie nr 4. 36 świń do szczepienie rozmieszczono w 9 pomieszczeniach, a 10 świń grupy kontrolnej nieszczepionej w 2 pomiaszczθniach. Szczepione świnie otrzymały dwie 5 ml dawki wyżej opisanej bakteryny z przerwę 3-i^j^ę^odni^^wą. Zainfekowanie przeprowadzono tak samo jak w badaniu nr 3.

Badanie nr 5. 36 świń do szczepienia rozmieszczono w 9 pomieszczeniach, a 10 świń grupy kontrolnej ^oszczepionej w 2 pomieszczeπiaih. Szczepione świnie otrzymały dwie 5 ml dawki wyżej opisanej bakteryny z 3 tygodniowę przerwą. Zainfekowanie przeprowadzono tak samo jak w badaniu nr 1.

W pięciu badaniach wykorzystano 105 świń w grupie szczepionej i 36 świń w grupie kontrolnej. IWynki pięciu badań zestawiono w Tablicy 3 i 4.

156 487

Tablica 3

Odpowiedź kliniczna świń zainfekowanych dożołądkowo szczepem T.hyodysenteriae ATCC 31212 Grupa szczepiona

r.....

* Dyzenneria klinczzna

¹ Wychudzenie

1

śmierć

L. „

iLiczbę

Liczba

Procenfl

średnic/ Średni

' Liczba'Procent

' Liczba ιprocfnt1 Brak

indeks *

iświń

* p^y- i

i

dzień

i czas

i przy-

i

1 przy- >

* łak-

Kii- · ¹

B

'padków

i

poczęti trwa-

, padków,

i padków i

i nienia

niczny i

ku cho

- nia

|

i /dni/

¹

roby

/dni/

1___

___J

J

-* _ _ _

i

1

*Bcdcnίe 1

* 5

i 1 *

20

i

10

1 5

¹ 0

1 1

0

B 0

8,8 '

(Badanie 2

**23

' ^c .

34,7

i

12,6

, 3.5

_i 1

i 4,3

ⁱ o

i

0

1 1

23,3 i

•Badanie 5

i 36 I

i 2 ¹ 1

5.5

i i

15,5

1 3,5 i

1 0 i

1 0

1 i

0

1 0 i

2.3 '

¹ Ogólnie

* 64

_r - - - , 11 1

17,2

1

12,9

1 3,6

¹ 1

' 1,6

' 0

1

0

1 1

’ 10,4 '

-J__ -

-J -

L _

i

. L_...........

1....... 1

Grupa

kont rolna

'Badanie 1

* 5

* 5 *

100

*

10,8

¹ 12^,9

* 0

ⁱ 0

’ 3

1 I

60

’ 9 I

' 159.0 J

Badanie 2

, 6

, ⁴ .

66.7

7,0

, 8,4

, 0

i 0

i 1

i

16,7

4

i 82,3 ,

iBadanie 5

i 10

i 6 i

60

i

10,3

i 6,6

i 1

i 10

i 1

*

10

i 2

* 45,9 ·

r - -

4 - - w

Ł - -

- t.

_l _ _ _ .

J - - - -ł

i Ogólnie

i 21

i 15 1

71,4

i

9,6

* 10,3

· 1

I 4.8

' 5

*

23,8

* 15

1 83,2 ¹

__--J

—U

J_______

-1_______

-J_______

I_____

i

1 i

W badaniach challenge, w których przeprowadzono dożołądkową infekcję szczepem ATCC 31212, dyzenterię zanotowano u 17,2% szczepionych świń /11 z 64/ i u 71,4% świń w grupie kontrolnej /15 z 21/. Odpowiada to zmnnejszeniu przypadków dyzeeteeri w 75,5% wśród świń szczepionych. Skumulowany indeks klinćczny /GCCI/ obliczony dla całego 28-dniowego okresu obserwacci po zainfekowaniu i^nossł 10,4 dla świń szczepionych i 83,2 dla świń nie szczepionych. Odpowiada to zmniejszeniu lćczby objawów kinnczznych choroby w 87,5% /beegunka, dyzenneria, wychudzenie, śm^rć,/ mierzonych indeksem klńnćzznym. Wśród świń szczepionych nie zanotowano przypadków śmiertelnych, podczas gdy 5 z 21 świń kontrooowanych padło po zainfekowaniu /23,8%f. U świń szczepionych opóźniony był początek choroby i czas jej trwania skrócony. Znacznie zmnnejszył się też okres braku łaknienia.

Tablica 4

Odpowiedź kinnćczna świń zainfeSowctych dożołądkowo szczepem T.hyodysenteriae ATCC 31287 Grupa szczepiona i Dyze^e ner * ^Wychudzeni^{e 1} śm^rć ¹ Liczba i świń i

I

Liczba przypadków

Pro- ,średni* średni cent dzień · czas począt-ι trwa¹ ku cho-j nia _ _ _*roby_ /dni/ _ 4*5,6

Liczba przypadków

Procent

Liczba przypadków

Procent

Badanie 3 ¹ 5 i

Badanie 4 . 36

12,5

11,5

3,0

34,7 * 13,6 i 2.5 i

Brak łaknienia /dⁿi/

Grupowy*

Indeks

Kliniczny

21,2

18,2

Ogólnie 41 *14,5 * 35,4 * 13,3 ₁ 2,6 * 0 _________________Λ-------1______X______________

18,6

Grupa kontrolna

Badanie 3 i 5

Badanie 4 | 10_ -------Ogólnie ₍ 15 i 60

7,5 * 75

10,5 , 70

6,3 ¹ 15,3

6,6 6,4 i 1 ¹ 13,3 ' 2

-x-------x_

13,3 J------i

93,2

63z6_

73,5 i ²⁰ i 10

156 487

W badaniach challenge ze szczepu ATCC 31287 dyzenterię zanotowano u 35,4% świń szczepionych /14 z 41 + jedna Świnia/ i u 70,C% świń kontrolnych /10 z 15, +, jedna Świnia/. Odpowiada to zmniejszeniu przypadków dyzenteeri w 49,4% wśród świń szczepionych. Grupowy skumulowany indeks kliniczny dla świń szczepionych wynosśł 18,6, podczas gdy dla grupy kontrolnej nieszczepionej - 73,5. Odpowiada to zmnńejszeniu Ićczby objawów klńićczn^i^h choroby w 74,7% u świń szczepionych. Wśród świń szczepionych nie zanotowano przypadku śmiertelnego, podczas gdy 2 z 15 świń kontrolwwanych padło po zainfekowaniu /13,3%/.

U świń szczepionych początek choroby był znacznie opóźniony i czas jej trwania skrócony.

We wszystkich przypadkachpotwwerdzenie, że przyczyną dyzennerii były T.hyodysenneriae, uzyskano prowadząc hodowlę materiału uzyskanego z wymazu z odbytu na płytkach agarowych z krwią i spektynomycyną. Równnoześnie hodowla na pożywce izolacyjnej dla Salmonneia spp. dała wynik negatywny.

Zawartość jelita grubego padłych świń była krwista i wodnnsta, a same jelita grube były zaognione i pozbawione kosmków. Wymazy odbytnicze pobrane ze ścian jelit w czasie sekcji wykazywały dodatni wynik na obecność T.hyodysenteriae i ujemny na Salmonella spp. Wymazy pobrane u świń szczepionych 28 dnia po zainfekowaniu wykazywały wynik ujemny we wszystkich ^zy^a^ach ho^dowania na [pJiytkach a^ga^^w^yc^h z krwi^ą i s^oel<tynomyc^yn^ą w tempera turze ⁴²°C.

W tablicy 5 zestawiono odpowiedzi kUn^zne dla wszystkich 141 świń, zarówno szczepionych jak i kontrolnych, uzyskane w 5 badaniach challenge. U 25,5 za 105 szczepionych świń rozwinęła się dyzenteria /24,3%/, podczas gdy w grupie kontrolnej wśród świń nirszizeoionych 25,5 z 36 miało dyzenterię /70,8%/. Odpowiada to zmntejszrniu występowania choroby wśród świń szczepionych w 65,7%. 7 z 36 świń kontrolnych padło po zainfekowaniu /19.4%/, podczas gdy wśród świń szczepionych nie zanotowano żadnego przypadku śmiertelnego. Grupowy Skumulowany Indeks Kliniczny dla wszystkich 105 świń szczepionych wynoosł 13,6, dla grupy kontrolnej tiescizroionrj GCCI było równe 79,2 /dla 36 świń/. Odpowiada to zmnnejszeniu kl^^znych objawów wśród świń szczepionych w 82,8% /beegunka, ^zenne^o, wychudzenie, śmierć/.

Bioręc pod uwagę wyniki z 5 badań szczepienie/challenge, można wycięgnęć wniosek, że bakteryna z T.hyocJysenteriae, zastosowana w celu zapobiegania dyze^^ świń, wykazuje określony stopień skuteczności.

Tabli.ce 5

Badania scczepienie/chαlrengr 1, 2, 3, 4, 5

Odpowiedź klżniczna świń cainreltowanyih dożołądkowo szczepami Treponema hyodysentariae ATCC nr 31212 i 31287.

Dyzenneria	©ΐπίοζηθ			Wychudzeniel śmierć	- ” - - “1 i	Grupowy
iLiczba Liczba	1 ---- ,Procent	ł , * .średni,	średni	I 1 i • Liczba^ro-, LiczbajPro-	,Brak ⁱ	Indeks
iświń przy-	1	‘dzień '	czas	i przy- cent przy- cent	łaknie- i	Klin iuzny
, ¹ padków	1	‘ począt-¹	trwa-	i padków^{1 1}padków¹	' nia i
f	1	<ku choJ	nia	1 i I	i
1	1	i roby i	/dni/	¹ li i L---- _r---.---	i 1

Grupa	‘ 105	i 25,5	i 24,3	H3,l i	2,8	1 1 1	• 1,0 •	0	' 0	• 1	, 13.6
szcze-		i	i	i t		i	ł i		f	i t	i
piona		I i	i i	i i I 1		i	I ł s i		1 i	1 t	i
Grupa		i	i	i B		I	i i		i	i	1 \|
kontrol-	¹ 36	i 25,5	i 70,8	i 8,2 i	9.1	' 3 1	• 8,3 ·	7	• 19,4	• 21	, 79,2

na

L

Zakład Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 3000 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób prowadzenia hodowli Treponema hyodysenteriae w odpowiednim środowisku w celu uzyskania komórek do wytwarzania bakteryny, znamienny tym, że poddaje się hodowU Treponema hyodysenteriae w środowisku odżywczym, zawierającym frakcję wj^owę bogatą w cholesterol, otzyymanę z plazmy lub surowicy wołowej, przy czym frakcję ułowę bogatą w cholesterol, wytwarza się w procesie obejmującym następujące etapy:

a/ kontaktowanie ciekłej plazmy lub surowicy wołowej zawierającej cholesterol z adsorbentem krzemionkowym w celu zaadsorbowania frakcji bogatej w cholesterol, b/ oddzielenie zaadsorbowanej frakcji bogatej w cholesterol od pozostałej ciekłej plazmy lub surowicy, c/ zswi^i^^r^i.0 i rozmrożenie zaadsorbowanej frakcji bogatej w cholesterol, d/ wymywanie zaadsorbowanej frakcji bogatej w cholesterol przy pH od 9,0 do 11,5, e/ zatężenie roztworu bogatego w cholesterol przez ultrafiltrację, f/ doprowadzenie pH zatężonago roztworu cholesterolu do wartości w zakresie 11,0 - 11,4, g/ dialioowanie zatężonego roztworu bogatego w cholesterol kolejno do węglanu sodu i wody, h/ dalsze iatężrnie dializowanego roztworu bogatego w cholesterol przez ultraflibację do osiągnięcia poziomu cholesterolu 50 do 3000 mg/ dl, i/ nastawienie pH zatężonego roztworu bogatego w cholesterol na wartość w zakresie od 7,0 11.0, j/ ogrzewanie zatężonego roztworu bogate^go w cholesterol w temperaturze 50-100°C ^{w c}ią^guod 30 minut do 24 godzin i k/ odzyskanie z niego oczyszczonej frakcji bogatej w cholesterol.
2. Sposób według zastrz.l, znamienny tym, że środowisko odżywcze zawiera 0,1 - 0,i% objętościowych frakcji wołowej bogatej w cholesterol.
3. Sposób według zastrz.l, znamienny tym, że środowisko odżywcze zawiera 1-2,% objęt:oścoowych frakcji wołowej bogatej w cholesterol wytworzonej'w procesie obejmującym etapy:

a/ kontaktowanie ciekłej plazmy lub surowicy wołowej iawierającej cholesterol z adsorbentem krzemionkowym w celu iaadsitbooania cholesterolu, b/ oddzielenie zradsitbioanej frakcji bogatej w cholesterol od pozostałej ciekłej plazmy lub surowicy, c/ z8yi^i^^r^i.8 i rozmrożenie zaadsotbooanβj frakcji bogatej w cholesterol, d/ wymywanie zaadsirbooanej frakcji bogatej w cholesterol przy pH od 10,4 do 10,6, e/ zamrożenie i rozmrożenie wymytej frakcji bogatej w cholesterol, f/ nastawienie pH frakcji bogatej w cholesterol na wartość 12,0, g/ zatężenie frakcji bogatej w cholesterol przez ultrafilrrację do objętości wynoszącej 15-2£% początkowej objętości.

h/ diaIłowanie zatężonej frakcji bogatej w cholesterol kolejno do węglanu sodu i wody, i/ dalsze zatężanie dia^Liow^anej frakcji bogatej w cholesterol przez ultrafi^^cją do objętości, którą mała ona na początku etapu /h/, j/ nastawienie pH zatężonej frakcji bogatej w cholesterol na wartość 8,5,

156 487 k/ ogrzewanie zatężonej frakcji bogatej w cholesterol w temperaturze 80°C w ciągu od 30 minut do·24 godzin i

1/ odzyskanie z niego oczyszczone;) frakcji wołowej bogatej w cholesterol.

* * *

Wynalazek dotyczy sposobu prowadzenia hodowli Treponema hyodysenteriae.

Dyzenteria świń jest ostrą śluzokrwotoczną biegunkę, atakującą głównie świnie po odstawieniu od matki. Do leczenia stosuje się zwykle chemooiotyki i antybiotyki. Nie ma jednak żadnego środka profilaktyzznego, który nie byłby lekiem i pozwwoił opanować tę chorobę.

Za główny etiologcczny czynnik wywołujący dyzenterię u świń uznano bazteanowy krętek Treponema hyot^y^seeni^rrLae.

W pubbikacci R.M.Lemcke i in. Biological Abstracts, Band 69, str. 8574, ref nr 80 868, Philadelphia, PA, USA, zatytułowanej : “Sterol requi.n^ment for the growth of Treponema hyodyseitθrile“, □.Gen. Microbiol. - 116/2/:539-544 opisano sposób prowadzenia hodowU Treponema hyodysenneriae przy zastosowaniu czystego cholesterolu. Stwierdzono jednak, że w sposobie według wynalazku czysty cholesterol nie nadaje się do zastosowania, ponieważ nie wpływa w sposób dostrzegalny na wzrost T. hyodysθitβiiae. W przeciwieństwie do powyższej znanej metody według wynalazku nie stosuje się czystego cholesterolu.

W opisie pateno^ym Stanów Zjedn. Ameeyki nr 4 100 272 przedstawiono sposób zwiększania odporności świń na dyzenterię przez podanie szczepionki lub bakteryny zawierającej zabite komórki T. hyodyseetθrile.

W sposobie tym hodowlę komórek T. hyodysenneriae prowadzono przy zastosowaniu surowicy z płodów cieląt. Surowicy tej nie można uważać za frakcję wołową bogatą w cholesterol typu takiego jaką stosuje się według wynalazku. Różnica ta jest szczególnie oczywista w przykładzie I niniejszego opisu, gdzie komórki T. hyodysenteriae początkowo hodowano w środowisku odżywczym, zawierającym płodową surowicę cielęcą. Otrzymaną kulturę maacerzystą następnie hodowano w środowisku odżywczym zawierającym surowicę jagnięcą /uważaną za równoważną płodowej surowicy cielęcej/. Otrzymaną rozwiniętą kulturę maaćerzystą dalej hodowano w dwóch partiach, z których keżda zawierała surowicę jagnięcą /rlwnoważną płodowej surowicy cielęcej/, przy czym do jednej z nich dodano frakcję wołową bogatą w cholesterol.

Komóóki otrzymane z tej ostatniej partii zawierały większą ioość żyjących komórek oraz korzystniejszą moofologię w porównaniu z komórkami hodowanymi, w samej surowicy jagnięcej .

Bakteryna otrzymαna sposobem opisanym w powyższym nr 4 100 272 nie była tak aktyna Jak bakteryna uzyskana sposobem według wynalazku. Oest to oczywiste w świetle faktu, że do uzyskania porównywalnych wyników leczenia, potrzebne było sześć dożylnych iniekcji, otrzymanych znanym sposobem, zaś tylko dwie iniekcja bakteryny otrzymanej sposobem według wynalazku.

Wobec niskiej aktywności iaktetyny według opisu nr 4 100 272, istniała potrzeba opracowania nowego sposobu otrzymania preparatu, który wymagałby rnint^jszej Hości iniekcji.

W publikacji Stantona, Biological Abstracts, Band 29, 1985, ref. nr 3274, Philadelphia, Ps, USA, zaty^^rom^ of blood cells and cholesterol by Treponema hyodysenteriae opisano sposób, w którym do pożywki BHI dodano przemyte komórki krwi, cholesterol i fosfatydylocholinę, w tym celu, aby otrzymać odpowiednie środowisko do hodowH T. hyodysenteriai. Sposób ten różni się od sposobu według wynalazku tym, że stosuje się, podobnie jak w wyżej opisanej mendzie R^^emcke i in., czysty cholesterol.

Znane jest stosowanie frakcji bogatych w cholesterol jako promotorów wzrostu niektórych mikroo rgan zzmów. W O .E^aac eerc^l. Vol. 135, nr 3, str. 818-827 /1978/ opisano zastosowanie frakcji bogatej w cholesterol Jako promotora wzrostu dla Mycoplasma pneιιoonίai i

156 487

Mycoplasma arthritidis. W O.Gan. Microbiology, Vol. 116, str. 539 - 543 /1980/ opisano zastosowanie USP cholesterolu w hodowli T. hyodysantariae. Nie znane natomiast było zastosowanie frakcji wołowych bogatych w cholesterol w celu podniesienia wydajności komórek T. hyodysenneriae, które następnie wykorzystuje się do preparowania bakteryny nadającej się do leczenia dyzennerri świń.