PL161863B1

PL161863B1 - Method of cultivating bacteriae of rhodococcus rhodochrus species

Info

Publication number: PL161863B1
Application number: PL89281740A
Authority: PL
Inventors: Hideaki Yamada; Toru Nagasawa
Original assignee: Hideaki Yamada; Nitto Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1988-10-06
Filing date: 1989-10-06
Publication date: 1993-08-31
Also published as: DE68923419T2; AR241936A1; US5089411A; RU1838408C; EP0362829A2; KR900006505A; CZ280901B6; KR100187512B1; CN1039030C; AU622489B2; EP0362829B1; EP0362829A3; AU4257389A; CN1041782A; DE68923419D1; ATE124992T1; CZ562189A3; ES2076944T3

Abstract

1. Sposób hodowania bakterii z gatunku Rhodococcus rhodochrous, znamienny tym, ze w procesie wytwarzania komórek bakterii o aktywnosci hydratazy nitrylowej, droga hodowania bakterii Rhodococcus rhodochrous zdolnych do wytwarzania hydratazy nitrylo- wej, do pozywki hodowlanej dodaje sie mocznik oraz jon kobaltu. 5. Sposób hodowania bakterii z gatunku Rhodococcus rhodochrous, znamienny tym, ze w procesie wytwarzania komórek bakterii o aktywnosci hydratazy nitrylowej, droga hodowania bakterii Rhodococcus rhodochrous zdolnych do wytwarzania hydratazy nitrylo- wej, do pozywki hodowlanej dodaje sie co najmniej jeden ze zwiazków wybranych z grupy obejmujacej pochodna mocznika o ogólnym wzorze R1R2NCONR3R4, w którym R1 , R2, R 3 i R4 niezaleznie oznaczaja atom wodoru, metyl lub etyl, z wylaczeniem zwiazków o wzorze R1R2NCONR3R4, w których R1 , R2, R3 i R4 sa jednakowe i oznaczaja atomy wodoru, pochodna mocznika o ogólnym wzorze R5R6NCOOC2H5, w którym R5 i R6 sa niezaleznie oznaczaja atom wodoru, metyl lub etyl, i pochodna mocznika o wzorze NH2CSNH2 oraz jon kobaltu. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób hodowania bakterii z gatunku Rhodococcus rhodochrous.

W ostatnich latach podjęto bardzo wiele prób wykorzystania drobnoustrojów i enzymów, jako takich lub w stanie unieruchomionym, jako katalizatorów w prostych lub złożonych reakcjach chemicznych.

Z Agric. Biol. Chem., 46 1165 /1982/ znana jest hydrataza nitrylowa jako enzym zdolny do uwadniania nitryli z wytworzeniem odpowiednich amidów. Jednym ż przykładów wykorzystania tego enzymu jest sposób wytwarzania amidów z nitryli w obecności bakterii wytwarzających hydratazę nitrylową. Sposób ten ujawniono w opublikowanym japońskim zgłoszeniu patentowym nr 37951/1984 i opisie patentowym StZjedn.Ameryki nr 4637982.

Ponadto z opublikowanego japońskiego zgłoszenia patentowego nr 231744/1988 i zgłoszenia patentowego St. Zjedn.Ameryki nr 243986 znany jest sposób wytwarzania amidów, szczególnie nadający się do wytwarzania amidów z nitryli aromatycznych. W tej sytuacji istnieje ogromne zapotrzebowanie na wysokowydajny sposób hodowania komórek bakterii Rhodococcus rhodochrous o wysokiej aktywności hydratazy nitrylowej.

Zapotrzebowanie to zostało spełnione dzięki sposobowi według wynalazku. Cechą tego sposobu hodowania bakterii z gatunku Rhodococcus rhodochrous o wysokiej aktywności hydratazy nitrylowej jest to, że w procesie wytwarzania komórek bakterii o aktywności hydratazy nitrylowej, drogą hodowania bakterii Rhodococcus rhodochrous zdolnych do wytwarzania hydratazy nitrylowej, do pożywki hodowlanej dodaje się co najmniej jeden ze związków wybranych z grupy obejmującej mocznik, pochodną mocznika o ogólnym wzorze R1R2NCONR3R4, w których Ri, Rj, R3 i R4 niezależnie oznaczają atom wodoru, metyl lub etyl, z wyłączeniem związków o wzorze R1R2NCONR3R4 w których Ri, R2, R3 i R4 są jednakowe i oznaczają atomy wodoru, pochodną mocznika o ogólnym wzorze R5RÓNCOOC2H5, w którym Rs i Ró niezależnie oznaczają atom wodoru, metyl lub etyl, i pochodną mocznika o wzorze NH2CSNH2, oraz jon kobaltu.

Dodanie do pożywki hodowlanej podczas hodowania bakterii Rhodococcus rhodochrous co najmniejjednego związku z grupy obejmującej mocznik i wyżej zdefiniowanejego pochodne, a także jonu kobaltu, znacznie zwiększa aktywność hydratazy nitrylowej w przeliczeniu na jednostkę płynu hodowlanego. Ten wzrost aktywności wynika prawdopodobnie ze wzrostu stężenia komórek /to jest wzrostu wydajności/ i/lub wzrostu aktywności komórek /to jest ilości zwiększenia hydratazy nitrylowej w komórkach/.

Zgodnie z wynalazkiem dodanie mocznika lub jego pochodnej i jonu kobaltu szczególnie skutecznie zwiększa aktywność komórek.

Stosowana w sposobie według wynalazku bakteria Rhodococcus rhodochrous wykazuje aktywność hydratazy nitrylowej i zdolność uwadniania nitryli, a w szczególności nitryli aromatycznych, z wytworzeniem odpowiednich amidów. Konkretnym przykładem takiej bakterii jest Rhodococcus rhodochrous szczepu J-l /FERM BP-1478/ ujawniony w‘japońskim zgłoszeniu patentowym nr 231744/1988 i zgłoszeniu patentowym StZjedn.Ameryki nr 243986. Charakterystykę szczepu J-l podano poniżej.

1. Pochodzenie i miejsce złożenia depozytu

Szczep J-l wyodrębniono z gleby pochodzącej z Sakyo-ku, Kioto, Japonia i złożono w dniu 18 września 1987 r. w depozyt w Agencji Nauk Przemysłowych i Technologii Instytutu Badawczego Fermentacji przy Japońskim Ministerstwie Międzynarodowego Handlu i Przemysłu, gdzie przyznano mu numer FERM BP-1478, zgodnie z Traktatem Budapesztańskim.

2. Charakterystyka bakteriologiczna lal Właściwości morfologiczne /1/ Kształt i wielkość komórek: /2/ Polimorfizm:

0,9 - 1,0 pm x 3-10 pm komórki w kształcie wydłużonych pręcików w początkowej fazie hodowli rosną z utworzeniem prostych, spękanych pałeczek, które następnie dzielą się na krótkie pałeczki, nieruchliwe nie wytwarzają dodatnie ujemna wykryto /3/ Ruchliwość:

/4/ Wytwarzanie spor:

/5/ Zabarwienie metodą Grama: /6/ Odporność na kwas:

/7/ Granulocyt heterofilowy:

/b/ Właściwości hodowlane w różnych pożywkach /w 30°C/ /1/ Hodowla na płytkach z agarem i bulionem: koło średnicy 1 mm /48 godzin/, nieregularne, gładkie, o raczej suchej powierzchni, płaskie, matowe, o barwie bladopomarańczowo-różowej /2/ Hodowla na skosie agarowo-bulionowym: włókienka o gładkiej powierzchni, nieco wypukłe, przekrój raczej suchy, o barwie bladopomarańczowo-różowej.

/3/ Ciekła pożywka bulionowa: obfity wzrost z utworzeniem błony. Płyn hodowlany staje się dość mętny i w miarę wzrostu komórek tworzy się osad.

/4/ Hodowla kłuta w bulionie z żelatyną: dobry wzrost na powierzchni w kształcie lejka wzdłuż wkłucia, lecz słaby wzrost podpowierzchniowy. Żelatyna nie ulega upłynnieniu.

/5/ Mleczko lakmusowe: brak zmian /c/ Właściwości fizjologiczne /1/ Redukcja azotanów: dodatnia /2/ Denitryfikacja: ujemna /3/ Test MP:

/4/Test VP: jemny

/5/Wytwarzanie indolu:	dodatnie
/6/ Wytwarzanie siarkowodoru:	dodatnie
/7/Hydroliza skrobi:	ujemna
/8/Wykorzystanie kwasu cytrynowego:
Pożywka Kocura:	ujemna
Pożywka Christiensena:	dodatnie
/9/Wykorzystanie nieorganicznego źródła azotu:
Azotan:	dodatnie
Sól amonowa:	dodatnie
/10/ Wytwarzanie pogmentów:	ujemne:
/11/ Ureaza:	dodatnia
/12/ Oksydaza:	ujemna
/13/K^^aza:	dodatnia
/14/ Hydroliza celulozy:	ujemna
/15/ Zakres wzrostu:	pH 5 -10, temperatura 10 -
/16/ Zachowanie wobec tlenu:	aerobowe
/17/ Rozkład tyrozyny:	dodatni
/18/ Rozkład adeniny:	dodatni
/19/ Fosfataza:	dodatnia
/20/ Hydroliza Tweenu 80:	dodatnia
/21/ testO-F:	O /słaby/
/22/ Odporność na ciepło
/w 10% mleku zbieranym,
w 72°C, w ciągu 15 minut/:	brak
/23/ Wytwarzanie kwasu i gazu z cukru:
Kwas	Gaz
L-arabinoza -	-
D-ksyloza -	-
D-glukoza +	-
D-mannoza -	-
D-fruktoza +	-
maltoza +	-
sacharoza +	-
laktoza -	-
trehaloza -	-
D-sorbit +	-
D-mannit +	-
gliceryna +	-
/24/ Wzrost na poszczególnych źródłach węgla:
inozyt	-
maltoza	+
D-mannit	+
ramnoza	-
D-sorbit	+
kwas m-hydroksybenzoesowy	+
adypinian sodowy	+
benzoesan sodowy	+
cytrynian sodowy	+
mleczan sodowy	+
testoteron	+
L-tyrozyna	+
1% /wagowo-objętościowo/ gliceryna	/+/
trehaloza	/+/
1% /wagowo-objętościowo/
kwas p-hydroksybenzoesowy	/+/
/+/: słabo dodatni

41°C /25/ Analiza kwasów tłuszczowych i ściany komórki: komórka zawiera nienasycone i nasycone prostołańcuchowe kwasy tłuszczowe oraz kwas tuberkulostearynowy. W chromatogramie cienkowarstwowym kwasu mikolowego pojedyńcza plamka.

Zgodnie z powyższą charakterystyką, zgodnie z klasyfikacją podaną w Bergy’s Manuał of Systematic Bacteriology /1986/, szczep J-l jest aerobową, Gram-dodatnią, słabo odporną na kwas, katalazo- dodatnią i nie wytwarzającą endospor pałeczką, bez flagellum. Szczep ten ma kształt wydłużonej pałeczki, w początkowej fazie wzrostu mycelium wzrasta.z rozgałęzianiem, a potem dzieli się na krótkie pałeczki. W świetle tych cech uważa się, że szczep J-l należy do bakterii typu Nocardia.

Analiza składu kwasów tłuszczowych wykazuje, że bakteria zawiera nienasycone prostołańcuchowe kwasy tłuszczowe, w tym kwas tuberkulostearynowy. Ze względu na to, że w chromatogramie cienkowarstwowym kwasu mikolowego występuje tylko jedna plamka o wartości Rf takiej jak w przypadku standardowej bakterii Rhodococcus rhodochrous /IFO 3338/, bakteria ta różni się od bakterii z rodzaju Mycobacterium. Różni się ona także od bakterii Nocardia pod względem składu /liczba atomów węgla/ kwasu mikolowego.

Zgodnie z wynikami badań innych właściwości biochemicznych bakterię tę zidentyfikowano jako Rhodococcus rhodochrous.

Zgodnie z wynalazkiem mocznik i jego wyżej zdefiniowane pochodne działają jako induktory enzymów, jednak w świetle dotychczasowej wiedzy, zgodnie z którą typowymi induktorami enzymów są nitryle lub amidy, między innymi krotonamid, skuteczne działanie indukujące hydratazę nitrylową jest w przypadku mocznika i jego pochodnych zupełnie niespodziewane. Nieoczekiwanie okazało się, że mocznik i jego pochodna, stosowane osobno i nie w obecności innych induktorów enzymów, wykazują o wiele wyższą skuteczność niż znane induktory enzymów. Co więcej, ze względu na niższy koszt mocznika od innych induktorów enzymów, sposób według wynalazku jest korzystny z ekonomicznego punktu widzenia jako odpowiedni do stosowania w skali przemysłowej.

Przykładami związków o wzorze R1R2NCONR3R4 są metylomocznik, etylomocznik, 1,1-dwumetylomoczniki 1,3-dwumetylomocznik.

Przykładami związków o wzorze R5R6NCOOC2H5 są uretan i metylouretan

Związkiem o wzorze NH2CSNH2 jest tiomocznik.

Mocznik i jego pochodne można dodawać do pożywki hodowlanej w jednej porcji naraz lub w mniejszych porcjach. Określenie dodawania w mniejszych porcjach obejmuje tu dodawanie ciągłe i okresowe.

Hydratazy nitrylowej nie można otrzymać po prostu dzięki dodaniu mocznika i jego pochodnych do pożywki hodowlanej, gdyż zgodnie z wynalazkiem do pożywki tej trzeba dodać także jon kobaltu. Jak podano w japońskim zgłoszeniu patentowym nr 231744/1988 i w opisie zgłoszenia patentowego StZjedn. Ameryki nr 243986 obecność jonu kobaltu jest niezbędna dla wytwarzania hydratazy nitrylowej przez bakterię stosowaną w sposobie według wynalazku.

Zazwyczaj jon kobaltu wytwarza się przez dodanie rozpuszczalnego związku kobaltu do pożywki hodowlanej, które jest środowiskiem wodnym. Rozpuszczalne w wodzie związki kobaltu są znane, toteż fachowcy z łatwością dobiorą odpowiednie.

Typowymi związkami kobaltu są te dające jon Co ⁺ lub Co³⁺, zwłaszcza Co2+, takie jak chlorek kobaltu, siarczan kobaltu, octan kobaltu, bromek kobaltu i boran kobaltu.

Ponadto jako źródło kobaltu można stosować witaminę B12 i kobalt metaliczny. Witamina B12 zawiera kobalt w postaci kompleksu, który jonizuje się drogą obróbki w autoklawie, kobalt metaliczny zaś ulega jonizacji pod wpływem działania utleniającego drobnoustrojów podczas hodowania.

Bakterie Rhodococcus rhodochrous można hodować w dowolnych odpowiednich dla tego celu warunkach, pod warunkiem, że do pożywki hodowlanej doda sie mocznik lubjego pochodne oraz jon kobaltu.

Przykładowo uprzednio określoną ilość mocznika lub jego pochodnych i jonu kobaltu dodaje się do podstawowych pożywek opisanych poniżej i hodowlę prowadzi się w temperaturze około 15 - 50°C, korzystnie około 20 - 45°C, a zwłaszcza około 30°C, przy pH 7 - 9, w ciągu około 30 godzin lub dłużej, a korzystnie w ciągu 40 godzin lub dłużej, do np. 120 godzin.

Całkowite stężenie mocznika lub jego pochodnych w pożywce wynosi około 1-30 g/litr, korzystnie około 2-20 g/litr, a zwłaszcza 5-15 g/litr, stężenie zaś jonu kobaltu wynosi około 5-15 mg/litr w przeliczeniu na C0CI2.

Skład podstawowych pożywek jest następujący:

Składnik Ilość /w 1 litrze pożywki/

K2HPO4 13,4 g

KH2PO4 6,5 g

NaCl 1,0 g

MgSO₄-7H2O 0,2 g

Mieszanina witamin 0,1 ml

W oda destylowana reszta /pH 7/

Mieszanina witamin ma następujący skład w przeliczeniu na 1 litr roztworu:

biotyna pantotenian wapnia inozyt kwas nikotynowy chlorowodorek darniny chlorowodorek pirydoksyny kwas p-aminobenzoesowy ryboflawina kwas foliowy woda destylowana

Pożywka hodowlana B:

K2HPO4

KH2PO4

MgSO4-7H,O ekstrakt drożdży woda destylowana

Pożywka hodowlana C:

glukoza

K2HPO4

KH2PO4

MgSO4'7H2O ekstrakt z drożdży peptan woda destylowana

Wg 0,4 mg 2,0 mg 0,4 mg 0,4 mg 0,4 mg 0,2 ng 0,2 mg 0,01 ng reszta.

0,5 g 0,5 g 0,5 g 3,0 g reszta /pH 7,2/.

g 0,5 g 0,5 g 0,5 g 1,0 g 7,5 g reszta /pH 7,2/.

Pomiary aktywności enzymu hydratazy nitrylowej prowadzono w następujący sposób.

Dwa ml roztworu reakcyjnego zawierającego 1,0 ml /20 mmoli/benzonitrylu, 1,0 ml /1 mol/ 3-cyjanoporydyny lub 1,0 ml /1 mol/ akrylonitrylu jako substratu, 0,5 ml /0,1 mola/ fosforanu potasowego jako buforu o pH 7,0 i z góry określoną ilość komórek bakteryjnych /wyizolowanych z płynu hodowlanego/ poddaje się reakcji w 20°C w ciągu określonego okresu czasu, po czym reakcję przerywa się przez dodanie 0,2 ml ln HC1.

Aktywność hydratazy nitrylowej, specyficzną /S.A7 i całkowitą /T.AJ zdefiniowano następująco:

S. A.: liczba gmoli produktu amidowego /ilość komórek w mg/minutę

T. A.: liczba gmoli produktu amidowego /ilość pożywki hodowlanej w ml/minutę.

Wynalazek ilustrują następujące przykłady.

Przykład I. Do podstawowej pożywki C zawierającej 10 mg/litr C0CI2 dodano określoną ilość mocznika. Do 60 ml tak otrzymanej pożywki hodowlanej dodano 4 ml płynu z wstępnej hodowli Rhodococcus rhodochrous /szczep J-l, FERM BP-1478/ w podstawowej pożywce C i przez 96 godzin prowadzono hodowlę wstrząsaną w 28°C. W celach porównawczych prowadzono podobną hodowlę w pożywce zawierającej albo sam mocznik, albo sam

CoCh. Wyniki prób zestawiono w tablicy 1. Z danych w tabeli wynika, iż dodanie zarówno mocznika, jak i CoCh jest niezbędne dla zwiększenia wytwarzania hydratazy nitrylowej.

Tabela 1

C0C12 /mg/litr/	Mocznik /g/litr/	Stężenie komórek /mg/ml/	Benzomtryl	3-Cyjanopirydyna	Akrylonitryl
TA	SA.	TA.	SA	TA	SA
0	0	4,61	0,11	0,02	0,75	0,16	3,59	0,70
0	7.5	5,53	0,11	0,02	1,00	0,18	4,31	0,78
10	0	5,28	1,09	0,21	3,70	0,70	17,7	3,35
10	2,0	5,17	25,2	4,87	39,6	7,66	189	36,5
10	5,0	5,03	65,6	13,0	162	32,2	774	154
10	7.5	4,99	210	42,1	519	104	2480	497
10	10	4,72	186	39,4	471	99,7	2250	477
10	15	4,26	191	44,9	515	121	2460	578
10	20	3,96	162	40,9	363	91,7	1740	438

Przykład Π. Szczep J-1 hodowano podobnie jak w przykładzie 1, w 28°C, w ciągu 48 - 120 godzin, w podstawowej pożywce C, w obecności 10 mg/litr C0CI2. Do pożywki nie dodawano lub dodawano określone ilości induktorów enzymu /mocznika i krotonamidu/. Wyniki podano w tablicy 2. Wartość T.A. i S.A. rejestrowano w momencie uzyskania w trakcie pomiarów aktywności maksymalnej wartości T.A. Jak wynika z tych danych zastosowanie samego mocznika jako induktora enzymu efektywnie przyczynia się do zwiększenia wytwarzania hydratazy nitrylowej.

Tabela 2

Pożywka hodowlana	CoCh /mg/litr/	Mocznik /g/litr/	Krotonamid /g/litr/	Benzomtryl
TA	SA
C	10	-	2,0	23,2	6,0
C	10	-	4.0	24,6	6,1
C	10	-	7,5	16,6	5,8
C	10	5,0	2,0	32,6	6,5
C	10	7.5	-	213	42,2

Przykład ΠΙ. Do podstawowej pożywki C zawierającej 10 mg/litr C0CI2 dodano w określonych ilościach poszczególne induktory enzymów. Do 60 ml powstałej pożywki hodowlanej dodano 4 ml płynu z wstępnej hodowli Rhodococcus rhodochrous /J-l, FERM BP-1478/ w podstawowej pożywce C i przez 96 godzin prowadzono hodowlę wstrząsową w 28°C. W celach porównawczych prowadzono też podobną hodowlę w pożywce zawierającej sam metylomocznik lub sam C0CI2. Wartość T.A. i S.A. rejestrowano w momencie uzyskania w trakcie pomiarów aktywności maksymalnej wartości T.A. Wyniki podano w tabeli 3, w której dla porównania podano też wyniki otrzymane dla mocznika użytego w stężeniu 7,5 g/litr. Jak wynika z danych w tablicy 3 zastosowanie zarówno pochodnej mocznika, jak i C0CI2 jest niezbędne dla zwiększenia ilości powstającej hydratazy nitrylowej.

Tabela 3

coce /mg/litr/	Induktor enzymu	Ilość induktora enzymu /g/litr/	Stężenie komórek /mg/ml/	3-Cyjanopirydyna
TA.	SA.
0	Metylomocznik	7,5	4,78	0	0
10	—	0	4,94	3,20	0,65
10	Metylomocznik	7,5	5,72	230	40,2
10	Etylomocznik	7,5	5,76	245	42,5
10	1,1 -Dwumetylomocznik	7,5	6,44	150	23,3
10	1,3-Dwumetylomocznik	7,5	4,16	104	25,0
10	Metylouretan	7,5	6,19	166	26,8
10	Tiomocznik	7,5	1,99	40,2	20,2

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 10 000 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób hodowania bakterii z gatunku Rhodococcus rhodochrous, znamienny tym, że w procesie wytwarzania komórek bakterii o aktywności hydratazy nitrylowej, drogą hodowania bakterii Rhodococcus rhodochrous zdolnych do wytwarzania hydratazy nitrylowej, do pożywki hodowlanej dodaje się mocznik oraz jon kobaltu.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się Rhodococcus rhodochrous szczepu J-l, FERM BP-1478.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się całkowite stężenie mocznika wynoszące 1-30 g/litr.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się 5-15 mg/litr jonu kobaltu w przeliczeniu na C0CI2.
5. Sposób hodowania bakterii z gatunku Rhodococcus rhodochrous, znamienny tym, że w procesie wytwarzania komórek bakterii o aktywności hydratazy nitrylowej, drogą hodowania bakterii Rhodococcus rhodochrous zdolnych do wytwarzania hydratazy nitrylowej, do pożywki hodowlanej dodaje się co najmniej jeden ze związków wybranych z grupy obejmującej pochodną mocznika o ogólnym wzorze R1R2NCONR3R4, w którym Ri, R2, R3 i R4 niezależnie oznaczają atom wodoru, metyl lub etyl, z wyłączeniem związków o wzorze R1R2NCONR3R4, w których Ri, R2, R3 i R4 są jednakowe i oznaczają atomy wodoru, pochodną mocznika o ogólnym wzorze R5R5NCOOC2H5, w którym Rs i Re są niezależnie oznaczają atom wodoru, metyl lub etyl, i pochodną mocznika o wzorze NH2CSNH2 oraz jon kobaltu.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że stosuje się Rhodococcus rhodochrous szczepu J-l, FERM BP-1478.
7. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że stosuje się całkowite stężenie pochodnych mocznika wynoszące 1-30 g/litr.
8. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że stosuje się 5 -15 mg/litr jonu kobaltu w przeliczeniu na C0CI2.