PL165919B1 - Srodek owadobójczy PL PL PL PL PL - Google Patents
Srodek owadobójczy PL PL PL PL PLInfo
- Publication number
- PL165919B1 PL165919B1 PL91289512A PL28951291A PL165919B1 PL 165919 B1 PL165919 B1 PL 165919B1 PL 91289512 A PL91289512 A PL 91289512A PL 28951291 A PL28951291 A PL 28951291A PL 165919 B1 PL165919 B1 PL 165919B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- protein
- gene
- cryiiic
- strain
- plasmid
- Prior art date
Links
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 title claims description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 343
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 189
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 40
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 97
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 15
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 14
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 13
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 11
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 9
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 8
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 8
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 5
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 5
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims 2
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 abstract description 46
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 abstract description 37
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 19
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 59
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 58
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 50
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 43
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 35
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 35
- 241000254173 Coleoptera Species 0.000 description 34
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 33
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 32
- 101710151559 Crystal protein Proteins 0.000 description 26
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 19
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 18
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 18
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 18
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 15
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 14
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 14
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 12
- 241000258916 Leptinotarsa decemlineata Species 0.000 description 12
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 11
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 10
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 10
- 101100061321 Bacillus thuringiensis subsp. japonensis cry8Ca gene Proteins 0.000 description 9
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 9
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 9
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 9
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 9
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 9
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 9
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 9
- 241000489975 Diabrotica Species 0.000 description 8
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 8
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 8
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 6
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 5
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 5
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 5
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 5
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 5
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 5
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 201000004283 Shwachman-Diamond syndrome Diseases 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 4
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 4
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 4
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000223782 Ciliophora Species 0.000 description 3
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 3
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 3
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 3
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 3
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 3
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 2
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 2
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 2
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 101150102464 Cry1 gene Proteins 0.000 description 2
- ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N D-alpha-tocopherylacetate Chemical compound CC(=O)OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N 0.000 description 2
- 241000489973 Diabrotica undecimpunctata Species 0.000 description 2
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 2
- 102100039385 Histone deacetylase 11 Human genes 0.000 description 2
- 108700038332 Histone deacetylase 11 Proteins 0.000 description 2
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241001143315 Xanthogaleruca luteola Species 0.000 description 2
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 235000021405 artificial diet Nutrition 0.000 description 2
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 210000004201 immune sera Anatomy 0.000 description 2
- 229940042743 immune sera Drugs 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 2
- 239000011343 solid material Substances 0.000 description 2
- 239000007362 sporulation medium Substances 0.000 description 2
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 2
- 101710191936 70 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 241000902874 Agelastica alni Species 0.000 description 1
- 241000254175 Anthonomus grandis Species 0.000 description 1
- 241001155998 Anthonomus rubi Species 0.000 description 1
- 101100340248 Arabidopsis thaliana SCRM gene Proteins 0.000 description 1
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 description 1
- 101000941928 Bacillus thuringiensis Pesticidal crystal protein Cry2Ac Proteins 0.000 description 1
- 241000219495 Betulaceae Species 0.000 description 1
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 101100458289 Drosophila melanogaster msps gene Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N L-norVal-OH Natural products CCCC(N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 241000215495 Massilia timonae Species 0.000 description 1
- 101710159910 Movement protein Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 101150054880 NASP gene Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000532856 Otiorhynchus sulcatus Species 0.000 description 1
- 241000364057 Peoria Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000589540 Pseudomonas fluorescens Species 0.000 description 1
- 241000124033 Salix Species 0.000 description 1
- 244000082988 Secale cereale Species 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 240000006394 Sorghum bicolor Species 0.000 description 1
- 241000254109 Tenebrio molitor Species 0.000 description 1
- 241000534944 Thia Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 239000002318 adhesion promoter Substances 0.000 description 1
- 238000007818 agglutination assay Methods 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 101150102059 cry3Aa gene Proteins 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000006481 glucose medium Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000002919 insect venom Substances 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- MIKKOBKEXMRYFQ-WZTVWXICSA-N meglumine amidotrizoate Chemical compound C[NH2+]C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO.CC(=O)NC1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C([O-])=O)=C1I MIKKOBKEXMRYFQ-WZTVWXICSA-N 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 231100001228 moderately toxic Toxicity 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 231100000654 protein toxin Toxicity 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 244000000000 soil microbiome Species 0.000 description 1
- 239000008247 solid mixture Substances 0.000 description 1
- 239000012265 solid product Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000002623 sporogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- CXVGEDCSTKKODG-UHFFFAOYSA-N sulisobenzone Chemical compound C1=C(S(O)(=O)=O)C(OC)=CC(O)=C1C(=O)C1=CC=CC=C1 CXVGEDCSTKKODG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
- C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
- A01N63/22—Bacillus
- A01N63/23—B. thuringiensis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/82—Proteins from microorganisms
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Catching Or Destruction (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
1 . Srodek owadobójczy zawierajacy substancje czynna i dopuszczalny do stosowania w rolnictwie nosnik, znamienny tym, ze jako substancje czynna zawiera bialko toksyczne dla owadów rzedu Coleoptera kodowane przez gen cryIIIC o sekwencji nukleotydów przed stawionej na fig. 1, w której region kodujacy obejmuje nukleotydy od 14 do 1972 i koduje sekwencje aminokwasów przedstawiona na fig. 1 . PL PL PL PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest środek owadobójczy toksyczny dla owadów rzędu Coleoptera, a zwłaszcza rodzaju Diabrotica.
Bacil^s thuringiensis (dalej określony jako B.t.) jest bakterią glebową gram-dodatnią, która wytwarza krystaliczne białka, które są specyficznie toksyczne dla owadów pewnych rzędów i rodzajów. Przedstawiano wiele różnych szczepów B.t., które wytwarzają owadobójcze krystaliczne białka. środki, które zawierają takie szczepy B.t. wytwarzające owadobójcze białka, są handlowo dostępne i stosowane jako dopuszczalne z uwagi na środowisko, insektycydy, ponieważ są toksyczne dla określonych owadów, natomiast są nieszkodliwe dla roślin i innych organizmów.
Dotychczas sklonowano pewną liczbę genów kodujących krystaliczne białka z kilku szczepów B.t. Dobry przegląd stanu techniki jest przedstawiony przez H.Hofte i wsp. w Milrdbidl. Lev., 53, str. 242-255 (1989). Aczkolwiek nie jest to stan techniki dla niniejszego wynalazku, daje jednak dobry przegląd genów i białek wytwarzanych przez B.t. i ich zastosowania: podaje również terminologię i schemat klasyfikujący geny B.t. i białka, a także zawiera obszerną bibliografię.
Krystaliczne białko B.t. jest aktywne w owadach tylko po połknięciu. Wówczas pH alkaliczne i proteolityczne enzymy w jelicie środkowym rozpuszczają kryształy uwalniające toksyczne składniki. Te toksyczne składniki rozrywają komórki jelita środkowego, powodując, że owady przestają Jeść, i ewentualnie, giną.
Rzeczyeiśler okazało się, że B.t. jest skutecznym i bezpiecznym dla środowiska insektycydem, który zwalcza różne szkodniki.
Jak zauważył Hofte i wsp., większość owadobójczych szczepów B.t. jest aktywna wobec owadów rzędu Lepidoptera, tj. owadów gąsienicowych. Inne szczepy B.t. są aktywne wobec owadów rzędu Diptera, tj. much i moskitów lub zarówno wobec owadów rzędu E^i^p^ża, jak i Diptera. Ostatnio donoszono o kilku szczepach B.t. wytwarzających krystaliczne białko, które Jest toksyczne wobec owadów rzędu Cdlroptera, tj. chrząszczy.
165 919
W publikacji A.Kriega i wsp., Z. angew. Ent., 96, str. 500-508 (1983) doniesiono po raz pierwszy o wyizolowaniu szczepu B.t. toksycznego wobec Coleoptera; patrz, także A.Krieg i wsp., Anz. Schaedlingskde, Pflanzenschutz, Umweltschutz, 57, str. 145-150 (1984) i opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 766 203.
Wiadomo, że szczep oznaczony jako B.t. var. tenebrionis, jest toksyczny dla larw owadów rzędu Coleoptera, Agelastica alni (hurmak olchowiec) i Leptinotarsa decemlineata (stonka ziemniaczana z Colorado). B.t. tenebrionis wytwarza owadobójcze białko krystaliczne o masie około 67 70 kDa (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 766 203; K.Bernhard, FEMS, Microbiol. Lett. 33, str. 261-265 /1986/).
a publikacji V.Sekara i wsp., Proce Natl. Acad. Sci. USA, 84, ótr. 7036-7040 (1987) przedstawiono klonowanie i charakterystykę genu białka krystalicznego toksycznego dla Coleoptera z B.t. tenebrionis. Wielkość białka, wydedukowana z sekwencji genu wynosiła 73 kDa, ale wydzielone białko zawierało głównie składnik 65 kDa. Z publikacji Hofte i wsp. , Nucleic Acids Research, 15, str. 7183 (1987) znana jest także sekwencja DNA klonowanego genu z B.t. tenebrionis, która Jest identyczna jak sekwencja podana przez Sekara i wsp. (1987).
McPherson i wsp., Bio/Technology, 6, str. 61-66 (1988) podali sekwencję DNA klonowanego genu z B.t. tenebrionis, która była identyczna jak sekwencja według Sekara i wsp. (1987). Okazało się, że komórki E. coli i Pseudomonas fluorescens, które były gospodarzem dla klonowanego genu, są toksyczne dla larw stonki ziemniaczanej z Colorado.
O szczepie toksycznym dla CoIiopIiig, oznaczonym jako B.t. var san diego, pisał C.Herrnstadt i wsp., Bio/Technology, 4, str. 305-308 (1986). Szczep ten wytwarza białko krystaliczne 64 kDa, które jest toksyczne dla różnych owadów Coleoptera: silnie toksyczne dla Pyrrhalta luteola, umiarkowanie toksyczne dla Anthonomus grandis (kwieciak bawełnowiec), Leptinotarsa decemlineata (stonka ziemniaczana z Colorado), Otiorhynchus sulcatus, Tenebrio molitor (mączniak młynarek) i Haltica tombacina i słabo toksyczne dla Diabrotica undecimpunctata undecimpunctata.
Sekwencja DNA klonowanego genu toksyny dla Coleoptera B.t. san diego Jest przedstawiona przez C.Herrnstadta i wsp., Gene, 57, str. 37-46 (1987); patrz także opis patentowy Stanów Zjedn. Ameryki nr 4 771 131. Ta sekwencja Jest identyczna Jak sekwencja według Sekara i wsp. (1987) genu toksyny dla Coleoptera z B.t. tenebrionis.
A. Krieg i wsp ., J. SppS. IEnt., 104, str. 417s424 (19 S7) w osas ciu o uS żne f^^^ty diagnostyczne twierdzi, że szczep B.t. san diego jest identyczny jak szczep B.t. 1enebllonis.
innym, nym,s ozyz spic e.t.. ot.,Sl<^r^^m jako jG21 SE, kt:}, y wyrw srzt krzsSaUdm biaeSo 73 kDa i jest owadobójczy wobec Conlop1erG, donosi W.P. Donovan i wsp., Mol. Gen. Genet., 214, str. 365-372 (1988).
Klonowano i sl2rlacjoaoraao gen kodujący toksynę ze szczepu B.t. EG2158 i okazało się, że ma on taką samą sekwencję jak podana przez Sekara i wsp. (1987) dla klonowanego genu toksyny dla ^I.opIug z B.t. Wlaebllonip. Hofte i wsp., Microbiol. Rev., 53, str. 242-255 (1989) oznaczyli gen tej toksyny jako gen cryUIA.
Z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 797 279 znany jest hybrydowy mikroorganizm B.t., zawierający plazmid z B.1. kurstaki z genem toksyny dla Lepidop1lra i plazmid z B.t. 1enebllonls z genem toksyny dla CoIiopIiig. Hybrydowy B.t. wytwarza krystaliczne białka o charakterystyce takiej jak wytworzone przez b.1. kurstaki i B.t. teaeblionip.
Z europejskiego zgłoszenia pa1lntorlgo w publikacji 0 303 379 znany jest nowy izolat B.t. oznaczony jako B.t. MT 104, który wykazuje aktywność owadobójczą wobec chrząszczy i owadów rzędu Lepidoptera.
W europejskim zgłoszeniu patentowym nr publikacji 0 318 143 opisane jest klonowanie, charakterystyka i selektywna ekspresja nienaruszonego częściowo modyfikowanego genu z B.t. Wenebrionis i przeniesienie klonowanego genu do mikroorganizmu gospodarza i nadanie au w ten sposób zdolności do wytwarzania białka toksycznego dla owadów rzędu chrząszczy.
Zestawienie to obejmuje także dane dla B.t. Wlnlblionis z innego źródła; B.t. tlneblionis wykazuje silną toksyczność wobec stonki ziemniaczanej z Colorado, umiarkowaną wobec Diab^^ca virgiflla, a słabą toksyczność wobec Diab^^ca uadecizpunbWata.
Z europejskiego zgłoszenia patentowego nr publikacji 0 324 254 znany jest nowy szczep b.1., oznaczony jako A30, o aktywności owadobójczej wobec chrząszczy.
165 919
W europejskim zgłoszeniu patentowym nr publikacji 0 378 363 opisany jest nowy mikroorganizm B.t., oznaczony Jako B.t. PS4001, który wykazuje aktywność owadobójczą wobec chrząszczy, a z europejskiego zgłoszenia patentowego nr 0 330 342 - nowy mikroorganizm B.t. oznaczony jako B.t. P5B6B1, który także wykazuje aktywność owadobójczą wobec chrząszczy.
Te ostatnie cztery publikacje nie stanowią stanu techniki dla niniejszego wynalazku.
B.t. tenebrionis, o którym po raz pierwszy doniósł A.Krieg 1 wsp., wyodrębniono w Darmstadt i w okolicy (Niemcy), a B.t. san diego (Herrnstadt i wsp.) w San Oiego w Kalifornii i w okolicy. Szczep B.t. EG2158, o którym pisał Donowan i wsp., wyizolowana z próbki pyłu z roślin uprawnych z Kansas. Zatem, wszystkie z różnych szczepów B.t., które wyizolowano w różnych dalekich geograficznie miejscach, zawierają identyczny gen toksyny dla Coleoptera, crylllA.
Nie ma jednak żadnych doniesień w literaturze odnośnie nowych genów toksyny dla Coleoptera z B.t. innych niż unikalny gen B.t. po raz pierwszy znaleziony ponad siedem lat temu w B.t. tenebrionis.
Ponadto, wśród różnych szczepów B.t., które są znane z tego, że wytwarzają krystaliczne białka o aktywności owadobójczej wobec owadów Coleoptera nie znaleziono żadnego, który byłby toksyczny dla larw i osobników dorosłych owadów rodzaju Oiabrotica, które obejmują Diabrotica wirgifera virgifera, Oiabrotica undecimpunctata howardi i Oiabrotica barberi.
środek owadobójczy według wynalazku charakteryzuje się tym, Ze jego substancja czynna zawiera białko toksyczne dla Coleoptera kodowane przez gen crylllC o sekwencji nukleotydowej przedstawionej na fig. 1, w której region kodujący obejmuje nukleotydy od 14 do 1972. Sekwencja aminokwasów białka CrylllC, wydedukowana z powyższej sekwencji nukleotydów, jest przedstawiona na fig. 1. Białko to wykazuje aktywność owadobójczą wobec owadów rzędu Coleoptera, zwłaszcza wobec stonki ziemniaczanej z Colorado i owadów rodzaju Oiabrotica.
środek owadobójczy według wynalazku zawiera w kombinacji z nośnikiem dopuszczalnym do stosowania w rolnictwie białko CrylllC lub bakterie szczepu B.t., który wytwarza to białko.
Biologicznie czysta kultura bakterii B.t. została zdeponowana w NRRL pcd nr NRRL B-18533 i Jest oznaczona jako szczep B.t. EG4961. Szczep B.t. EG4961 zawiera gen crylllC i wytwarza owadobójcze białko CrylllC.
środki według wynalazku mogą także zawierać inne bakterie B.t., które zawierają gen crylllC lub wytwarzane przez nie toksyczne białko. Białko toksyczne dla Coleoptera wytwarzają bakterie stransformowane zrekombinowanym plazmidem zawierającym gen crylllC, korzystnie bakterie B.t., jak również rośliny stransformowane genem crylllC.
Aktywność owadobójczą wobec Coleoptera środka według wynalazku, który zawiera białko CrylllC można zwiększyć dodając białko Cryl w skutecznej ilości. Takie środki, które zawierają białko Crylll i Cryl wykazują większą aktywność wobec owadów rzędu Coleoptera, zwłaszcza wobec stonki ziemniaczanej z Colorado i owadów rodzaju Oiabrotica.
Sposób zwalczania owadów Coleoptera polega na nanoszeniu na rośliny, na których te owady Zerują, owadobójcze skutecznej ilości białka CrylllC lub hodowli szczepu B.t., który wytwarza białko CrylllC. M ten sposób można zwalczać różne owady rzędu Coleoptera, w tym stonkę ziemniaczaną z Colorado, Pyrrhalta luteola, willow leaf bettle i Diabrotica.
Krótki opis rysunków.
Figura 1 obejmuje fig. 1-1 do 1-3 i przedstawia sekwencję nukleotydów genu crylllC i wydedukowaną sekwencję aminokwasów białka CrylllC. Wskazane jest przypuszczalne miejsce wiążące rybosom (RBS) i miejsca restrykcyjne Hlndlll i BamKI.
Na figurze 2 przedstawiono fotografię żelu agarozowego zabarwionego bromkiem etydyny zawierającego frakcje o różnej wielkości natywnych plazmidów szczepów B.t. EG2158, EG2838 i EG4961. Liczby pu prawej stronie fig. 2 oznaczają przybliżone wielkości w megadaltonach (MDa) plazmidów szczepu B.t. EG4961.
Na figurze 3 przedstawiono fotografię autoradiogramu wykonanego przez przeniesienie plazmidów przedstawionych na fig. 2 na filtr nitrocelulozowy, hybrydyzację filtru z sondą crylllB o długości 2,4 kz znakowaną radioaktywnie i naświetlenie filtru promieniami X. Liczba po prawej stronie fig. 3 oznacza wielkość w MDa plazmidu szczepu B.t. EG4961, który hybrydyzuje z sondą crylllB. Litera f po prawej stronie fig. 3 wskazuje fragmenty, które powstają z rozerwanego plazmidu hybrydyzującego z crylllB.
165 919
Na figurze 4 przedstawiono fotografię żelu agarozowego zabarwionego bromkiem etydyny zawierającego ONA ze szczepów B.t. EG2158, EG2838 i EG4961, który był trawiony HindIII + EcoRI i poddany frakcjonowaniu na drodze elektroforezy. Wielkość wzorcową przedstawia ścieżka oznaczona jako stnd.
Figura 5 przedstawia fotografię autoradiogramu wykonanego przez przeniesienie fragmentów ONA przedstawionych na fig. 4 na filtr nitrocelulozowy, hybrydyzację filtru z sondę cryIIIB o długości 2,4 kz znakowaną radioaktywnie i naświetlenie promieniami X. Liczby po prawej stronie fig. 5 oznaczają wielkość w kz fragmentów restrykcyjnych ONA szczepu B.t. EG4961, które hybrydyzują z sondą cryIIIB. Wielkość wzorcową przedstawia ścieżka oznaczona jako “stnd.
Na figurze 6 przedstawiono fotografię żelu poliakryloamidowego z dodecylosiarczanem sodu (SOS) barwionego Coomassie, na której widoczne są krystaliczne białka wydzielone ze 9zczepów B.t. EG2158, EG2838 i EG4961. Liczby po prawej stronie fig. 6 oznaczają przybliżone wielkości w kOa białek krystalicznych wytwarzanych przez szczep B.t. EG4961.
Na figurze 7 przedstawiono napę restrykcyjną plazmidu pEG258. Lokalizację i kierunek genu cryIIIC wskazano strzałką. Gen oznaczony jako cryX znajduje się w regionie oznaczonym linią przerywaną. Następujące skróty oznaczają enzymy restrykcyjne: Asp oznacza Asp 718, Bam - BamHI, H3 - HinniII, - - - Pstl. Na figurrz przeesttwioon ttkże działkę skali uiełkkśśi i kz.
Na figurze 8 u tej samej kżali jak na fig. 7 przedstawiona jest mapa restrykcyjna plazmidu pEG260, zawierającego fragment ONA o długości 8,3 kz ze szczepu B.t. EG4961, w którym gen cryIIIC jest wskazany strzałką, a gen cryX jest umieszczony w regionie oznaczonym kinią przerywaną. Na fig. 8 oprócz symboli określających enzymy restrykcyjne, przedstawionych powyżej w odniesieniu do fig. 7, (RV/Asp) oznacza fuzję w miejscach restrykcji EcoRV i Asp718 . (RV/Sst) oznacza fuzję w miejscach restrykcji EcoRV i SstI.
Na figurze 9, w tej samej sawli jak fig. 7, przedstawiona jest mapa restrykcyjna plazmidu pEG269 zawierającego gen cryIIIC wskazany strzałką, jako część fragmentu ONA ze zzeżombinowłnego szczepu E-coli EG7233. Znaczenia skrótów, które stosuje się w odniesieniu do pEG258 przedstawionego na fig. 7, odnoszę się także do tej figury. Ponadto Sph oznacza miejsce restrykcyjne SphI, w S3A/Bam oznacza fuzję w miejscach restrykcyjnych SauIIIA i BamHI.
Na figurze 0 0 zzesksaanlon o ^igra^i - źli u OknłaZΓklwanIOowgo o - OSt wyarmior^gg o a a o-mocą Cggmαttiź. UwiSgiznignź są pasma białek ztyntetyzowwnych przez następujące szczepy bakteryjne: E.cgli EG7221 (pUCU/Cry-)·, E.ioii EG7218 (pEG258/czwIIIC+ cr^*); B.t. EG7211 (pEG220/ /Cry-); B.t. EG4961 (cryIIIC* cryX+); B.t. EG7231 (pEG269/czwIIIC* cryX-) i B.t. EG7220 (pEG260/cryIIIC+ cryX+). Liczby po prawej stronie żelu oznaczają przybliżone wielkości, w kOa, białek krystalicznych wytwarzanych przez te szczepy.
Poniżej przedstawiono szczegółowy opis korzystnej realizacji wynalazku.
Sposób wydzielania i oczyszczania genu cryIII- t Crt3łkniezźggt głkżw- ryyIIIt ooksycznego dla Cglegpteza i charakterystyka nowego szczepu B.t. EG4961, wytwarzającego białko CryHIC oraz wykorzystanie tego szczepu i białka jako składnika środków owadobójczych są szczegółowo opisane w przykładach.
Przykłady ilustrują także synźzgistrieną poprawę aktywności owadobójczej białka CryIU przez dodatek białka CryI.
środki, które zawierają kombinację białek CryIU i CryI wykazują wyższą aktywność, zwłaszcza wobec larw i osobników dorosłych stonki eiemniaieanej w Colorado i Oiayrotica undźcim^n^ata howardi, jak również wobec innych owadów.
Gen cz^IIC typu ccwIH ma sekwencję nlklegtrSgwą przedstawioną na fig . 1. Region kodujący genu obejmuje nużlźotrdr w pozycjach od 14 do 1972.
Porównanie par zasad nukleotrdów regionu kodującego w genie cryIIIC z odpowiednim regionem kodującym genu cryIHA, znanego ze stanu techniki, wykazuje znaczne różnice między tymi dwoma genami. Gen cryUIC jest tylko w 75% homologiczny (identyczny pozycyjnie) z genem cryIIIA.
Porównanie par zasad nużlźotySów regionu kodującego w genie cryKIC z odpowiednim regionem kodującym genu crynIB, wydzielonego z odkrytego ostatnio szczepu B.t. EG2838 (NRRL B-18603) wykazuje, że gen cryUIC jest w 96% homologiczny (identyczny pozycyjnie) z genem cryIIIB.
165 919
Białko CryIIIC, typu CrylU, które jest kodowane przez gen cryIIIC, ma sekwencję aminokwasów przedstawioną na fig. 1. W niniejszym opisie określenia białko krystaliczne, toksyna białkowa, białko owadobójcze są synonimami, odnoszącymi się do białka CryIIIC, jeśli z kontekstu nie wynika inaczej. Wielkość białka CryIIIC, jak wydedukowano z sekwencji DNA genu cryIIIC, wynosi 74,4 kDa.
Wielkość białka CryIIIB, jak wydedukowano z sekwencji genu cryIIIB, wynosi 74,2 kDa. Znane ze stanu techniki białko CryIIIA, kodowane przez gen cryIIIA, ma wydedukowaną wielkość 73,1 kDa.
Mimo oczywistego podobieństwa w wielkości białek, porównanie sekwencji aminokwasów białka CryIIIC i znanego białka CryIIIA wykazuje między nimi znaczne ró2nice. Białko CryIIIC jest tylko w 69% homologiczne (miejscowo identyczne aminokwasy) z białkiem CryIIIA. Białko CryIIIC jest w 94% homologiczne z białkiem CryIIIB. Jednakże mimo oczywistej homologii białek CryIIIC i CryIIIB okazuje się, że białko CryIIIC jest inne niż CryIIIB i wykazuje znacznie lepszą aktywność owadobójczą w porównaniu z CryIIIB, wobec owadów rzędu Coleoptera, a zwłaszcza rodzaju Diabrotica. Białko CryIIIC jest pierwszym białkiem B.t., które wykazuje znaczącą aktywność owadobójczą wobec owadów rodzaju Diabrotica.
W zakres wynalazku wchodzą także środki, które zawierają białko toksyczne dla Coleoptera o zasadniczo takich samych właściwościach jak białko CryIIIC, wytwarzane przez mutanty i rekombinanty lub pochodne genu cryIIIC skonstruowane na drodze in2ynierii genetycznej.
Gen cryIIIC nadaje się także jako sonda do hybrydyzacji DNA w celu wykrywania podobnych lub pokrewnych genów typu cryUI. Gen cryIIIC lub jego części lub pochodne, można znakować konwencjonalnym sposobem, np. radioaktywnym znacznikiem, i stosować jako sondę do hybrydyzacji Sondę taką można stosować jak opisano w przykładach.
Gen cryIIIC i odpowiadające mu owadobójcze białko CryIIIC po raz pierwszy zidentyfikowano w nowym szczepie B.t. EG4961. Pełna charakterystyka szczepu B.t. EG 4961 jest opisana w przykładach. Porównanie plazmidów i innych danych charakterystycznych szczepu B.t. EG4961 z odpowiednimi danymi ostatnio odkrytego szczepu B.t. EG283B i znanego szczepu B.t. EG2158 wykazuje, że te trzy szczepy B.t. toksyczne dla owadów rzędu Coleoptera, wyraźnie się różnią.
Gen cryIIIC można wprowadzić do różnych mikroorganizmów gospodarzy stosując znane procedury transformowania odpowiednich gospodarzy w warunkach, które umożliwiają trwałe utrzymanie i ekspresję klonowanego genu crIlUC. Odpowiednimi gospodarzami, w których zachodzi ekspresja genu cryIIIC i powstaje białko CryIIIC, są Bacillus thuringiesis i inne gatunki Bacillus, takie jak B. subtilis lub B. megaterium. Oczywiście, genetycznie zmienione lub skonstruowane na drodze inżynierii genetycznej mikroorganizmy zawierające gen cryIIIC mogą także zawierać w tym samym organizmie inne geny toksyn, które równocześnie mogłyby wytwarzać krystaliczne białka owadobójcze, inne niż białko CryIIIC.
Opisany tu szczep Bacillus może być hodowany w konwencjonalnych podłożach i według standardowych technik fermentacji. Szczep B.t. zawierający gen cryIIIC może być hodowany, jak opisano w przykładach do stadium cyklicznego wzrostu komórek, gdy powstaje krystaliczne białko CryIIIC. W przypadku zarodnikotwórczych szczepów B.t., fermentację prowadzi się zwykle przez stadium sporulacji, gdy razem ze sporami tworzy się białko krystaliczne CryIIIC. Następnie hodowlę taką zbiera się przez odwirowanie, sączenie lub podobnie, wydzielając w ten sposób substancję stałą zawierającą krystaliczne białko CryIIIC z wodnego bulionu po hodowli.
Szczepy B.t. stosowane w przykładach są odmianami sporotwórczymi (tworzącymi spory), ale gen cryIIIC może być także wykorzystany w nie tworzących sporów szczepach Bacillus, tj. w szczepach, które wytwarzają krystaliczne białko bez wytwarzania sporów. Przez określenie hodowla fermentacyjna szczepów B.t. (zawierających gen cryIIIC) należy rozumieć hodowlę sporotwórczego B.t., tj. hodowlę B.t. zawierającą krystaliczne białko CryIIIC i spory i sporotwórczych szczepów Bacillus, które wytwarzają krystaliczne białko w stadium wegetacji, jak również hodowlę niewytwarzających sporów szczepów Bacillus, zawierających gen cryIIIC, prowadzoną do stadium wzrostu, w którym powstaje krystaliczne białko.
Wydzielone po fermentacji ciało stałe stanowi głównie krystaliczne białko CryIIIC i spory B.t., wraz z pewną ilością komórek debris, pewną ilością nienaruszonych komórek i resztkową ilością stałych substancji z podłoża fermentacji. W razie potrzeby krystaliczne białko można
165 919 oddzielić od innych odzyskanych substancji stałych konwencjonalnymi metodami, np. przez frakcjonowanie w gradiencie gęstości sacharozy.
Białko CryIIIC o wysokim stopniu czystości można otrzymać przez rozpuszczenie odzyskanego białka krystalicznego, i następnie wytrącenie biał^^^ z roztworu.
Białko CryIIIC, w przeciwieństwie do CrrIIIA i CrylllB, wykazuje dającą się zmierzyć aStywność owadobójczą wobec owadów Oiabrotica, np. corn rootworms, które są stosunkowo odporne ns inne krystaliczne białka toksyczne dls Coleoptera. Białko CryIIIC może stanowić substancję czynną środków owadobójczych według wynalazku. Może być stosowane w formie wyizolowanej lub oczyszczonej, np. w postaci krystalicznego białka jako takiego. Alternatywnie, może być w postaci stałego produktu oozzss-sngg po feenentacji, oZΓoyπasngg z hodzwli asczepu BbsIIIus, nn. Bacillus thurlngapntlt lub innego mikroorganizmu - gospodarza, zawierającego gen cryIIIC i zdolnego Zo wytwarzania białka CryIIIC. Korzystnym gospodarzem Bacillus jest szczep B.t. EG4961 i genetycznie poprawione szczepy B.t. pochodzące od szczepu B.t. EG4961, które można wytworzyć przez wprowadzenie plazmidu i/lub metodą koniugacji i zawierające plazmid z nstywnym genem cryIIIC ze szczepu B.t. EG4961. Można także stosować jako gospodarzy szczepy B.t. skonstruowane na drodze inżynierii genetycznej lub straatformowαne lub inne mikroorganizmy zawierające zop-ombanowsnI plazmid, w którym zachodzi ekspresja klonowanego genu cryIIIC, wytworzone metodami inżynierii genetycznej.
Pozi-IsZi takich toansfooaαatów obejmują szczepy B.t. EG7231 i EG7220, które zawierają klonowany gen cryIIIC w erekomblnowsaym plazmidzie.
Odzyskane po fermentacji ciało stałe zawiera głównie krystaliczne białko i spory (jeżeli jako gospodarza stosuje się szczep tooootwórczI); może także zawierać komórkowe Zebris i stałe pozostałości środowiska fermentacji. Odzyskany po fermentacji materiał stały, zawierający białko CryIIIC, można w razie potrzeby wysuszyć, przed wykorzystaniem go do receptury środka owadobójczego.
środki według wynalazku, zawierające jsko substancję czynną owadobójcze białko CryIIIC, stosuje się w skutecznej ilości, która zmienia się w zależności od takich czynników, jak np. konkretne owsZy Coleoptera, które mają być zwalczane, rodzaj traktowanych roślin i upraw i sposób stosowania środka owadobójczego.
środki owadobójcze według wynalazku wytwarza się przez połączenie substancji czynnej z dopuszczalnym w rolnictwie nośnikiem. środki mogą mieć postać proszku lub granulek lub zawiesiny w oleju (roślinnym lub mineralnym) lub wodzie lub emulsji olej/woda. Nośnikami odpowiednimi Zo stosowania w rolnictwie mogą być stałe lub ciekłe nośniki dobrze znane w technice.
Określenie nośnik dopuszczalny do stosowania w rolnictwie obejmuje wszystkie substancje pomocnicze, np. s-łaZniki obojętne, środki dyspergujące, powierzchniowo czynne, poprawiające przyczepność, więżące itd., które zwykle stosuje się do wytwarzania środków owadobójczych i które są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie.
środki zawierające białko CryIIIC i jeden lub więcej stałych lub ciekłych środków pomocniczych wytwarza się znanymi sposobami, np. przez homogeniczne zmieszanie razem, mipsesale i/lub rozdrabnianie aktywnego białka CryIIIC i odpowiednich substancji pomocniczych konwencjonalnymi metodami.
Białko CryIIIC i inne białka toksyczne dls Coleopters, takie jak CryIIIB i CryIIIA, można także stosować w kombinacji z białkiem CryI uzyskując nieoczekiwanie większą aktywność owadobójczą wobec owadów rzędu Colpooteoa. Aktywność białek CryIIIC, CryIIIB i CryIIIA wobec Coleoptera znacznie wzrasta, gdy do środka owadobójczego zawierającego takie białko CryIII doZsje się białko CryI.
Tę metodę można wykorzystać do wytworzenia syneoglttyzzaIZh środków owadobójczych zawierających białka CoiIII-CoiI poprzez fizyczną kombinację odpowiednich białek CryIII i CryI albo przez kombinację szczepów B.t. wytwarzających odpowiednie białka. Korzystnym białkiem CryI, nadającym się Zo zastosowania w tIaρogistIzenej kombinacji owadobójczej z białkiem CryIII jest CryIA, a zwłaszcza CryIA/c/, chociaż inne białka CryI mogą być także stosowane. Nieoczekiwanie okazało się, że nie wzrasta aktywność owadobójcza białka CryI wobec owadów rzędu Lppidopters, tj. wydaje się, że nie zachodzi tyaeogizm odwrócony w odniesieniu do białka CryI nadawany przez białko CryIII.
165 919
W razie potrzeby, kombinacje białek CryUIC (lub CrylllB) i Cryl można otrzymywać in situ z hodowli szczepów B.t. lub innych mikroorganizmów gospodarzy zawierających geny cryIII i cryI, zdolnych do produkowania białek CryIII i CryI. Takie szczepy lub takich gospodarzy nożna otrzymać przez wprowadzenie plazmidu i/lub metodami koniugacji, uzyskując szczepy B.t. lub inne lub mikroorganizmy, które zawierają zrekombinowany plazmid umożliwiający ekspresję klonowanych genów cryIII i cryI.
Obecność w środku owadobójczym białka CryI w ilości w przybliżeniu równoważnej ilości białka CryIII daje w efekcie dobry wzrost aktywności owadobójczej właściwej wobec owadów rzędu Coleoptera. Białko CryI w ilości mniejszej niż w stosunku CryI : CryIII jak 1:1 prawdopodobnie jeszcze w zadowalającym stopniu podniesie aktywność białka CryIII.
środki owadobójcze według wynalazku stosuje się w środowisku narażonym na atak owadów rzędu Coleoptera, zwykle na liście roślin lub upraw chronionych, nanosząc je konwencjonalnymi metodami, korzystnie przez oprysk. Można stosować także inne sposoby nanoszenia, zwłaszcza w przypadku owadów, które porażają korzenie lub łodygi. Takie sposoby nanoszenia są dobrze znane w technice.
Gen cryIIIC lub jego funkcjonalny równoważnik, dalej określany czasem jako gen toksyny można wprowadzić do różnych mikroorganizmów-gospodarzy. Ekspresja genu cryIIIC daje w rezultacie krystaliczne białko CryIUC o własnościach owadobójczych. Odpowiednim gospodarzem jest B.t. i inne gatunki Bacillus takie jak np. B.subtilis lub B.megaterium. Jako gospodarze dla genu cryIIIC mogą być stosowane także mikroorganizmy żyjące na roślinach lub korzeniach. Znane są dobrze różne procedury, które można zastosować do wprowadzania genu cryIIIC do mikroorganizmu gospodarza w warunkach, które zapewniają trwałe jego utrzymanie i ekspresję w uzyskanych transformantach.
Transforbanty, tj. mikroorganizmy-gospodarze, które zawierają klonowany gen w zrekombinowanym plazmidzie, można wyizolować konwencjonalnymi metodami, zwykle stosując technikę selekcji, według której pozwala się tylko na wzrost tych mikroorganizmów, które zawierają zrekombinowany, plazmid. Transforrnanty można wówczas testować na aktywność owadobójczą standardowymi metodami.
Komórki gospodarza wybrane w celu przeprowadzenia w nich produkcji, powinny spełniać następujące wymogi: łatwość wprowadzania do nich genu, dostępność układów ekspresji, skuteczność ekspresji, trwałość owadobójczego białka CryIIIC w komórkach gospodarza i obecność pomocniczych elementów genetycznych. Komórkowy gospodarz zawierający gen cryIIIC może być hodowany w dowolnym dogodnym podłożu, w którym w wyniku ekspresji genu cryIIIC wytwarzane jest białko CryIIIC, zwykle do stadium sporulacji.
Następnie także komórki w stadium sporulacji można zebrać konwencjonalnymi metodami, np. przez odwirowanie lub filtrację.
Gen cryIIIC można także wprowadzić do rośliny, w której może nastąpić ekspresja genu i wytwarzanie białka CryIIIC, nadając jej większą odporność na atak szkodników. Żądany DNA zawierający gen, można wprowadzić do tkanek lub komórek roślinnych stosując cząsteczki DNA o różnej postaci i różnego pochodzenia, dobrze znane w inżynierii genetycznej roślin. Przykład techniki wprowadzania DNA do tkanek roślinnych jest opisany w europejskim zgłoszeniu patentowym nr publikacji 0 289 479.
DNA zawierający gen cryIIIC lub zmodyfikowany gen cryIIIC, zdolny do wytwarzania białka CryIIIC, można wprowadzić do komórek lub tkanek roślinnych za pośrednictwem infekujących plazmidów, takich Jak Ti, plazmid z Agrobacterium tumefaciens, wirusów lub mikroorganizmów, takich jak A.tumefaciens, wykorzystując lizozomy lub lipozomy, przez mikrowstrzykiwanie metodami mechanicznymi oraz przy użyciu innych technik podobnych do znanych specjalistom od inżynierii roślin.
W sekwencjach nukleotydów genu cryIIIC można wprowadzać zmiany, ponieważ różne aminokwasy tworzące białko kodowane przez gen mogą być określone przez więcej niż jeden kodon.
Ponadto w regionie kodującym cryIIIC mogą być różne zmiany lub obcięcia, które nie przeszkadzają w ekspresji genu i wytwarzaniu funkcjonalnie równoważnej formy białka CryIIIC. Takie zmiany, które specjalista noże określić bez przeprowadzania specjalnych eksperymentów, także objęte są zakresem tego wynalazku.
165 919
Wynalazek jest opisany szczegółowo w następujących, nie ograniczających przykładach.
Nowy szczep B.t. EG4961 wyodrębniono według procedury opisanej w przykładzie I.
Przykład I. Wyodrębnianie szczepu B.t. EG4961.
Próbki pyłu z roślin uprawnych otrzymano z różnych źródeł na terenie Stanów Zjednoczonych i za granicą, zwykle z magazynów ziarna. Próbki zawieszano w wodnym roztworze buforu 1 ogrzewano zawiesinę w 60*C przez 30 minut, aby wzbogacić je w bakterie typu Bacillus tworzące spory odporne na ciepło, takie jak B.t. Tak traktowaną zawiesinę rozcieńczano wodnym roztworem buforu i rozcieńczone zawiesiny rozprowadzano na płytkach agarowych, na których powierzchni wyrastały kolonie poszczególnych bakterii z próbek. Następnie część każdej kolonii przeniesiono z płytki agarowej na filtr nitrocelulozowy. Filtr potraktowano NaOH w celu przeprowadzenia lizy kolonii i utrwalenia na filtrze DNA z każdej kolonii.
Proces hybrydyzacji kolonii B.t. prowadzono według procedury zmodyfikowanej, ponieważ okazało się, że standardowa metoda stosowana do E.coli jest nieodpowiednia dla B.t. Wyżej opisaną obróbkę należało prowadzić w specjalnych warunkach, które zapewniały wzrost kolonii B.t. do wegetatywnego stopnia rozwoju, w którym były one podatne na lizę za pomocą NaOH. Filtr celulozowy z naniesionymi koloniami umieszczono stronę z kolonią ku górze, na podłożu agarowym zawierającym 0,5% (wag./obj.) glukozy. Przeniesione kolonie hodowano na podłożu agar-glukoza przez 5 godz. w 30*C. 0,5% glukozy w pożywce agarowej i 5-godzinny cykl wzrostu w 30*C stanowiły warunki krytyczne zapewniające, że kolonie B.t. były w stadium wegetatywnym, a zatem były podatne na lizę.
Mimo jednej z naukowych opinii, że usiłowanie wykorzystania istniejącego genu toksyny dla owadów rzędu Coleoptera jako sondy do wykrycia nowego genu, który był toksyczny dla Diabrotica undecimpunctata, nie zakończyłyby się powodzeniem, zastosowano klonowany gen toksyny dla Coleo ptera jako specyficzną sondę w celu znalezienia innych nowych i rzadkich szczepów B.t. toksycz nych dla Coleoptera z próbek pyłu z roślin uprawnych.
Do hybrydyzacji kolonii zastosowano fragment restrykcyjny DNA o długości 2,9 kz uzyskany za pomocą enzymu HindIII, zawierający gen cryIIIA, znany poprzednio jako gen cryC szczepu B.t. EG215B, opisany przez Donovana i wsp., Mol. Gen. Genet., 214, str. 655-372 (1988).
Fragment DNA HindIII o długości 2,9 kz, zawierający całr enr rryIIIi nnakwannr railoaktyw -2 nie za pomocą alfa-P dATP i enzymu Klenowa, standardowymi metodami.
Filtry nitrocelulozowe, zawierające DNA z każdej zlizowanej kolonii lnkuboyαnk w 65*C przez (6 godzin w buforowanym roztworze, który zawierał jako sondę radioaktywnie znakowany fragment DNA z genem cryIIIA o długości 2,9 kz uzyskany za pomocą H^dIU, w celu hybrydyzacji DNA z kolonii z DNA z radioaktywnie znakowanej sondy. Hybrydyzację prowadzono w 65*C, aby zapewnić, że sonda DNA cryIIIA będzie hrbrydyzkwać tylko z DNA z kolonii, które zawierały gen podobny do cryIIIA w sondzie.
Sonda cryIIIA 2,9 kz hybryarzkwała z wieloma koloniami B.t. z różnych próbek pyłu z roślin uprawnych. Badanie tych kolonii wykazało nieoczekiwanie, że nie zawierają one genów typu cryIII, tatkmicst zawierają geny typu cryI. Geny typu cryl kodują białka krystaliczne toksyczne dla owadów rzędu Lepidkpkera, ale nietoksyczne dla Do^optem, o przybliżonej masie cząsteczkowej (30 kDa. Porównanie komputerowe sekwencji genu cryIIIA z sekwencją genów typu cryI wykazało, że -'-koniec genu cryIIIA jest częściowo homologiczny z częściami genów typu cryI. Popiera to twierdzenie, że -'-koniec genu cryIIIA powodował hybrydyzację sondy cryIIIA 2,9 kz z kklkticma B.t. zawierającymi geny typu cryI.
W związku z powyższym, sondę HindIII cryIIIA o długości 2,9 kz trawiono enzymem XbaI i oczyszczono fragment HinaIII-XbaI o długości 2,0 kz, który zawierał gen cryIIIA skrócony o koniec -'. Gdy do powtórnej hybrydyzacji kolonii użyto tego fragmentu o długości 2,0 kz, nie hybr^^ował on z koloniami B.t. zawierającymi gen cryI.
Około 48 000 kolonii typu Bacillus z próbek pyłu z roślin uprawnych pobranych w różnych miejscach, badano przy pomocy sondy HitdII|wXbαI cryIIIA o długości 2,0 kz, znakowanej radioaktywnie. Wykryto tylko jeden nowy szczep B.t. z próbki z Illinois, który specyficznie hybrydyzkwcł z sondą cryIIIA. Ten nowy szczep oznaczono jako EG2838 i zdeponowano pod numerem NRRL B-18603.
165 919
Następnie 50 000 dodatkowych kolonii typu Bocillus z próbek pyłu z roślin uprawnych poddano także selekcji za pomocą radioaktywnie znakowanej 9ondy HindIII-XboI cryIIIA o długości 2,0 kz, ale nie znaleziono ładnych innych szczepów zawierających nowe geny typu cryIII.
Stwierdzono, że szczep B.t. EG283B wykazuje aktywność owadobójczą wobec owadów rzędu Coleoptera, szczególnie, stonki ziemniaczanej z Colorado. Szczep B.t. EG2838 zasadniczo nie wykazywał aktywności owadobójczej wobec Diabrotica undecimputctaka howardi (suothern corn ^tworn). Ze szczepu B.t. EG2838 wydzielono gen oznaczony joko cryIIIB i określono jego sekwencję nukleotydową. Gen cryIIIB koduje białko krystaliczne, oznaczone joko CryIIIB, zawierające 651 cmitkkycsóy i o wyedukowanej wielkości 74 237 dcltknóy. Wielkość znanego białka CryIIIA określono na 73 116 daltknóy (644 aminokwasy). Gen cryIIIB jest homologaoznr w 75% z genem cryIIIA, o białko CryIIIB jest homologiczne w 68% z białkiem CryIIIA.
Około 40 000 kolonii typu Bacillus z 39 próbek pyłu z roślin uprawnych, pobranych w różnych miejscach na całym świecie, selekcjonowano przy pomooy sondy cryIIIB otrzymanej ze szczepu B.t. EG2838. Sondę cryIIIB znakowano radioaktywnie stosując procedurę opisaną powyżej w odniesieniu do sondy cryIIIA. Rodioakkyynie znakowana sonda cryIIIB składało się z fragmentu DNA ze szczepu B.t. EG2B3B o długości 2,4 kz uzyskanego przy pomocy enzymu restrykcyjnego SspI. Fragment zawiera cały region kodujący białko genu cryIIIB toksyny dla Coleoptera ze szczepu B.t. EG2838. W końcu w próbce pyłu z roślin uprawnych odkryto nowy szczep B.t., który specyficznie hybrydrzoyał z sondą cryIIIB i oznaczono go jako szczep B.t. EG4961.
W celu scharakteryzowania szczepu B.t. EG4961 przeprowadzono kilka badań. Jedną serię badań przeprowadzono w celu określenia Jego urzęsaonegk serotypu. Dodatkowe bodonio przeprowadzono w celu określenia wielkości naturalnych plazmidów w szczepie B.t. EG4961 i stwierdzenie, które plazmidy zawierają geny kodujące krystaliczne białka owadobójcze. Przeprowadzono analizę plamkową DNA (DNA blot onalysis) w celu stwierdzenia, czy któryś z naturalnych plazmidów szczepu B.t. EG4961 hybrydyzuje z sondą cryIIIB. Interesujące było także, czy element DNA ze szczepu B.t. EG4961 hybryarzuóąor z sondą cryIIIB, znajdował się na pojedynczym plazmidzie naturalnym w przeciwieństwie do elementów na wielokrotnych plazmidach lub na chromosomowym DNA. Ponadto szczep B.t. EG4961 oceniano też przez charakterystykę wytwarzanych białek krystalicznych i pomiar akyytośoi owadobójczej szczepu i wytwarzanych przez niego białek.
V przykładach II-VI przedstawiono procedury, według których charakteryzowano szczep B.t. EG4961, a przykłady VIII-XII ilustrują aktywność owadobójczą szczepu B.t. EG4961.
Przykład II. Charakterystyka urzęsionego serotypu szczepu B.t. EG4961.
Skonstruowano zestaw odczynników o charakterze przeciwciał dla urzęsiknego szczepu typu B.t. służących do badań serologicznych, stosując powszechnie dostępne szczepy typu B.t. Komórki HD1 (kurstoki, serotyp 3ob), HD2 (thuringiensis, serotyp 1), HD5 (kenyce, serotyp 4ac), HD11 (aizawoi, serotyp 7), HD12 (morrisoni, serotyp Bab) i HD13 (to^or^i, serotyp 9) szczepów typu B.t. hodowano w ciekłym podłożu (bez wytrząsanie), w takich warunkach, w jokich powstoją ruchome komórki wegetatywne. Z komórek odcięto urzęsione nitki przez wirowanie, komórki usunięto na drodze odwirowanie i z supernakantów zebrano urzęsione nitki no filtrach o wielkości porów 0,2 um. Oczyszczone preparaty urzęsaknych nitek poddano analizie na drodze elektroforezy w żelu pollakrrlkomlaoyym z dodecrlkslarczonem sodu (SDS-PAGE). Profil SDS-PAGE dla preparatów urzęslktych nitek z tych szczepów typu B.t. wykazał główne pasmo białka dla każdego z preparatów w zakresie 20 - 35 kDo.
Te oczyszczone preparaty urzęsionyh nitek stosowano do wytworzenia przeciwcioł u myszy standardowymi metoaama. Wytworzone surowice odpornościowe poddano selekcji no reakcję w standardowej próbie reakcji aglutynacji komórek z udziałem przeciwciało. W tej próbie wykonano serię rozcieńczeń surowic odpornościowych w kkrągaodetnej mikropaytoe z 96 dołkami. Do dołków wprowadzono zawiesinę komórek szczepów typu B.t. (lub szczepów, których serotyp określano) utrwalonych w formalinie, po czym pozostawiono je w spokoju, oż masa komórek była widoczna w pobliżu dna dołków. Wynik próby oceniono wizualnie oglądając aglutynację komórek z dna płytki przy pomocy lusterka powiększającego. Surowice odpornościowe, które dawały najsilniejszą swoistą reakcję z komórkami szczepu typu B.t. stosowano joko urzęsione odczynniki.
Do próby aglutynacji komórek, w której stosowano jako odczynniki zestaw u^ąsionych przeciwciał z sześciu szczepów typu B.t., wprowadzano oddzielnie próbki komórek z każdego ze szcze165 919 pów B.t. EG2158 i EG4961. Przeprowadzano też próby kontrolne z komórkami każdego szczepu typu B.t. Wyniki tego badania wykazały, Ze komórki HD1, HD2, HD5, HD11, HD12 i HD13 szczepów typu B.t. silnie i swoiście reagowały z ich odpowiednimi urzęsionymi przeciwciałami. Komórki szczepu B.t. EG2158 reagowały silnie i swoiście z urzęsionym przeciwciałem morrisoni (szczep B.t. HD12), ale komórki szczepu B.t. EG4961 nie reagowały z Żadnym z przeciwciał. Takie wyniki potwierdzają, że szczep B.t. EG2158 jest podgatunkiem morrisoni szczepu B.t. i wskazują, że szczep B.t. EG4961 nie jest podgatunkiem morrisoni, kurstaki, thuringiensis, kenyae, aizawai lub tolworthi.
Przykład III . e 1 selekcj a plazmidów EG496 1 z użyciem sondy cryIIIB.
Szczepy B.t. można charakteryzować przez frakcjonowanie ich plazmidów ze względu na wielkość, dobrze znanym sposobem zwanym elektroforezę w żelu agarozowym. Procedura obejmuje lizę komórek B.t. za pomocą lizozymu, elektroforezę plazmidów z lizatu przez żel agarozowy i barwienie bromkiem etydyny w celu uwidocznienia plazmidów. Miększe plazmidy, które poruszają się w żelu wolniej, znajduję się w górze, a mniejsze plazmidy przesuwają się ku dołowi.
Na fotografii żelu agarozowego na fig. 2 widać, że szczep B.t. EG4961 zawiera natywne plazmidy o wielkości w przybliżeniu 150, 95, 70, 50, 5 i 1,5 MDa, jak wskazują ciemne poziome pasma.
Wielkość plazmidów oceniano przez porównanie z plazmidami o znanej wielkości (nie przedstawionymi na figurze). Na fig. 2 widać także, że szczep B.t. EG2838 toksyczny dla Coleoptera zawiera natywne plazmidy o wielkości około 100, 90 i 37 MDa, a szczep B.t. EG2158 także toksyczny dla Coleoptera, zawiera natywne plazmidy o wielkości 150, 105, 88, 72 i 35 MDa. Niektóre z plazmidów, takie jak plazmidy 150 i 1,5 MDa ze szczepu B.t. EG4961 i 150 MDa ze szczepu B.t. EG2158 mogę nie być widoczne na fotografii, chociaż są widoczne w żelu. Figura 2 wykazuje, że natywne plazmidy ze szczepu B.t. EG4961 maję inne wielkości niż natywne plazmidy ze szczepów B.t. EG2158 i EG2838.
Plazmidy przedstawione na fig. 2 przeniesiono metodę blottingu z żelu agarozowego na filtr nitrocelulozowy, stosując technikę Southerna, J.Molec.Biol., 98, str. 503-517 (1975), a filtr poddano hybrydyzacji z radioaktywnie znakowaną sondę DNA cryIIIB o długości 2,4 kz, Jak opisano powyżej. Po hybrydyzacji filtr naświetlono na błonie promieniami X. Uzyskana fotografia jest przedstawiona na fig. 3, na której widoczny jest zaciemniony obszar wskazujący, że sonda cryIIIB hybrydyzowała z plazmidem szczepu B.t. EG4961 o długości 95 MDa. Wynik ten potwierdza, że plazmid ze szczepu B.t. EG4961 o długości 95 MDa zawiera sekwencję ONA, która jest co najmniej częściowo homologiczna z genem cryIIIB. Na figurze 3 widać także, że sonda cryIIIB hybrydyzowała , jak oczkkiwaoo, z plazmidem ze szczepu B.t . EG2158 o dłgośccl Bk MDa i z plazmidem ze szczepu B.t. EG2838 o długości 100 MDd.
Wiadomo było wcześniej, że plazmid ze szczepu B.t. EG2158 o długości 88 MDa zawiera gen cryIIIA toksyczny dla Coleoptera (patrz Donowan i wsp., Mol. Gen. Genet., 214, str. 365 - 372 /1988/). Stwierdzono, że plazmid z B.t. EG2838 o długości 100 MDa zawiera gen cryIIIB toksyny dla Coleoptera.
Sonda cryIIIB hybrydyzowała także z małymi pasmami DNA, w każdym ze szczepów B.t. EG4961, EG2838 i EG2158, które są wskazane literę f na fig. 3. Wcześniejsze doświadczenie wykazało, że duże plazmidy B.t. podczas elektroforezy często ulegają rozerwaniu na fragmenty. Fragmenty te zwykle poruszają się do pozycji pasm wskazanych literą f na fig. 3. Zatem, pasma wskazane literą f na fig. 3 najprawdopodobniej pochodzą z fragmentowania plazmidów szczepów B.t. EG4961, EG215B i EG2838 o długości odpowiednio 95 MDd, 88 MDd i 100 MDd.
Przykład IV. Analiza plamkowa (blot any^sie) DNA ze szczepu B.t. EG4961.
Ze szczepu B.t. EG4961 wyekstrahowano DNA chromosomowy i plazmidowy i trawiono Je enzymami restrykcyjnymi HindIII i EcoRI. Trawiony DNA frakcjonowano na drodze elektroforezy w żelu agarozowym i uwidoczniono fragmenty przez barwienie bromkiem etydyny. Figura 4 jest fotografią zabarwionego żelu agarozowego, który zawiera roztrakcjonowane fragmenty DNA ze szczepu B.t. EG4961 uzyskane za pomocą enzymów HindIII i EcoRI. Ola porównania takim samym sposobem traktowano DNA ze szczepów B.t. EG2158 i EG2838, toksycznych dla Coleoptera. ścieżka oznaczona
165 919 stnd zawiera fragmenty DNA o znanej wielkości, które służą jako wzorce wielkości. Figura 4 wykazuje, że w wyniku trawienia DNA z B.t. enzymami HindIII + EcoLI uzyskuje się setki fragmentów DNA o różnej wielkości.
DNA przedstawiony na fig. 4 przeniesiono z żelu agarozdwrgo na filtr nitrocelulozowy i filtr hybrydyzowano w 65*C w buforowanym wodnym roztworze zawierającym radioaktywnie znakowaną sondę DNA cryIIIB o długości 2,4 kz. Po hybrydyzacji filtr naświetlono promieniami X. Figura 5 przedstawia fotografię żelu, na której liczby po prawej stronie oznaczają wielkość w kz fragmentów DNA ze szczepu B.t. EG4961 hybrydyzujących z sondą cryIIIB, określone przez porównanie z DNA λ trawionym HindIII jako markerem wielkości w ścieżce oznaczonej sntd. Figura 5 wykazuje, że po trawieniu enzymami HindIII + EcoLI DNA ze szczepu B.t. EG4961 uzyskuje się fragmenty o długości w przybliżeniu 3,8 kz i 2,4 kz, hybrydyzujące z sondą cryIIIB, a po trawieniu DNA ze szczepu B.t. EG2838 za pomocą HindIII + EcoLI uzyskuje się fragmenty o długości w przybliżeniu 2,9 kz i 3,8 kz, hybrydyzujące z sondą cryIIIB. Z figury 5 wynika także, że przybliżone wielkości fragmentów DNA ze szczepu B.t. EG2158, hybrydyzujące z sondą cryIIIB wynoszą 1,6 i 0,7 kz.
Takie wyniki sugerują, że szczep B.t. EG4961 zawiera gen typu cryIII, który jest pokrewny z genem sondy cryIIIB. Fragmenty hybrydyzujące z cryIIIB ze szczepu B.t. EG4961 różnią się od fragmentów ze szczepów B.t. EG2838 i EG2158. Te wyniki i dalsze badania opisane poniżej w przykładach potwierdzają wyraźną różnicę między genem typu cryIII ze szczepu B.t. EG4961 i genem cryIIIB ze szczepu EG2838 oraz genem cryIIIA z EG2158.
Gen typu cryIII ze szczepu B.t. EG4961 oznaczono jako cryIIIC.
Przykład V. Charakterystyka krystalicznych białek wytwarzanych przez szczep B.t. EG4961.
Przeprowadzono hodowlę szczepu B.t. EG4961 w podłożu DSMG w 30*C, aż nastąpiła sporulacja i Liza komórek (3-4 dni wzrostu). Podłoże OSMG składa się z 0,4% (wag./obj.) bulionu odżywczego Difco, 25 mM K2HPO4, 25 mM KHjPO*, 0,5 mM Ca(NOj)2, 0,5 mM MgSO^, 10 uM FeSO^, 10 uM MnCl? i 0,5% (wag./obj.) glukozy. Hodowlę szczepu B.t. EG4961 w stadium sporulacji oglądano pod mikroskopem i obok sporów zauważono swobodnie poruszające się nieregularne kryształy. Praktyka wykazała, że kryształy B.t. zwykle składają się z białek, które mogą być toksyczne dla określonych owadów. Kryształy ze szczepu B.t. EG4961 różniły się wyglądem od płaskich, prostokątnych (lub romboidalnych) kryształów ze szczepu EG2158, ale częściowo były podobne do nieregularnie ukształtowanych kryształów ze szczepu B.t. EG2838.
Spory, kryształy i pozostałe zlizowane komórki z hodowli szczepu B.t. EG4961 zebrano przez odwirowanie. Kryształy z odwirowanej części stałej hodowli (zawierającej kryształy, spory i trochę komórek debris) solubilizoeano przez ogrzewanie stałej mieszaniny w roztworze solubilezsjąlym (0,13 M Tris pH 8,5, 2% (wag./obj.) SOS, 5% (obj./obj.) 2-merkaptoetanolu, 10% (obj./obj.) gliceryny, w 100*C przez 5 min. Solubilizoeane krystaliczne białka frakcjonowano ze względu na wielkość na drodze SDS-PAGE. Po frakcjonowaniu barwiono białka barwnikiem Coomassie. W celu porównania przeprowadzono takie samo postępowanie z hodowlami szczepów EG2158 i EG2838.
Na figurze 6 przedstawione są wyniki tych analiz, a liczby po prawej stronie oznaczają wielkość, w kDa, białek krystalicznych syntetyzowanych przez szczep B.t. EG4961. Główne białko o wielkości w przybliżeniu 70 kDa i drugie białko o wielkości około 30 kDa solsbelizoeano z części stałej uzyskanej po odwirowaniu hodowli po fermentacJl,zaeeerająlej spory szczepu B.t. EG4961 i kryształy. Białko ze szczepu B.t. EG4961 o wielkości około 70 kDa jest pod względem wielkości podobne do krystalicznego białka o wielkości 70 kDa toksycznego dla ^^op^ra, ze szczepu B.t. EG2158 i do krystalicznego białka 70 kDa toksycznego dla Coleoptera ze szczepu B.t. EG2838. Białko drugorzędne o wielkości około 30 kDa ze szczepu B.t. EG4961 jest z grubsza podobne pod względem wielkości do krystalicznych białek około 31 kDa i 29 kDa, wytwarzanych przez szczep B.t. EG2158 i do krystalicznych białek około 28 kDa i 32 kDa wytwarzanych przez szczep EG2838. Nie wiadomo, czy te małe białka są bliskie innym białkom.
Sposobem według przykładu IV przeprowadzono dalszą analizę plamkową DNA i okazało się, że sonda cryIIIB o długości 2,4 kz specyficznie hybrydyzuje z jednym fragmentem restrykcyjnym Asp718-PstI o długości 8,3 kz DNA ze szczepu B.t. EG4961. Wynik ten sugeruje, że fragment o długości 8,3 kz zawierał cały gen cryIIIC.
165 919
Wyizolowano i badano fragment ONA ze szczepu B.t. EG4961 o długości 8,3 kz otrzymany za pomocą enzymów restrykcyjnych Asp718-PstI w celu potwierdzenia, żp fragment zawierał gen typu cryIII oraz identyfikacji i określenia sekwencji nukleotydów genu coiIIIC. Sposób postępowania przedstawiono w przykładzie VI.
Przykład VI. Klonowanie i sekwencjonowanie genu cryUIC zp szczepu B.t. EG4961.
Ola klonu fragmentu 8,3 kz, opisanego w poprzednim przykładzie, skonstruowano bibliotekę plazmidu ze szczepu B.t. EG4961 przez ligację fragmentów ONA wybranych pod względem wielkości otrzymanych es pomocą restrykcji Asp71B-PstI e dobrze znanym wektorem pUC18 z E.coli. Procedura ta obejmowała najpierw uzyskanie całego ONA ze szczepu B.t. EG496I przez lieę komórek, następnie zebranie komórek, podwójne trawienie całego ONA enzymami restrykcyjnymi Asp718 i PstI, elektroforezę trawionego ONA w żelu agsrozowym, wycięcie płatków żelu zawierających wybrane fragmenty ONA o wielkości 7-9 kz i plucję tych fragmentów e żelu. Wybrane fragmenty zmieszano z wektorem plazmidowym pUC18 e E.coli, który także był trawiony Asp718 i PstI. wektor pUC18 zswiers gen oporności ns ampicylinę (Amp^ i replikuje w E.coli. Oo mieszaniny wybranych fragmentów restrykcyjnych ONA ze szczepu B.t. EG4961 i trawionego wektora pUC18 dodano ligseę ONA T4 i ATP w celu ligacji wektora pUC1B e fragmentami restrykcyjnymi ONA ze szczepu B.t. EG4961.
Bibliotekę plazmidową przeniesiono następnie do komórek E.coli, organizmu gospodarza, który nie zawierał danego genu, następującym sposobem. Po ligacji mieszaninę ONA inkubowano zp szczepem gospodarza E.coli wrażliwym na ampicylinę - E.coli HB101, który został potraktowany CaCl2 w celu umożliwienia wprowadzenia ONA do komórek. E.coli HB101 stosowano jsko gospodarza, ponieważ komórki tp łatwo się transformuje z^^i^nowanym plazmidem i ponieważ szczep E.coli HB101 normalnie nie zswiers genów krystalicznych białek B.t. Ponieważ wektor pUC18 nadaje oporność na ampicylinę, wszystkie komórki gospodarza, które przyjęły zrekombinowany plazmid, stały się oporne na ampicylinę. Następnie komórki E.coli rozprowadzono na podłożu agarowym, zawierającym ampicylinę. Z komórek, które przyjęły zrekomblaowαay plazmid na podłożu agarowym zawierającym ampicylinę, wyrosło kilka tysięcy kolonii E.coli. Przeniesiono je następnie na filtry nitrocelulozowe w celu selekcji es pomocą sondy.
Jako sondę ONA stosowano radioaktywnie znakowany gen cryIIIB o długości 2,4 kz, w warunkach, które umożliwiały specyficzne wiązanie e tymi transformowanymi koloniami gospodarza, które zawierały fragment ONA Asp718-Pstl o 8,3 kz zip szczepu B.t. EG4961. Z sondą cryIIIB o długości 2,4 ke specyficznie hyiOIZyzowało 12 kolonii E.coli. Jedną hybrydyzującą kolonię, oensceoną jsko szczep E.coli EG7218, badano dalej. Szczep ten zawiera eopkomilaowany plazmid, oznaczony jako pEG258, który składał się z pUC18 + fragment restrykcyjny ONA Asp718PstI, o długości 8,3 kz. Sonda crylllB specfiżcznie hybrydyzowała z fragmentem pEG258 o długości 8,3 kz. Msps restrykcyjna pEG258 jest przedstawiona na fig. 7.
Fragment pEG258 o długości 8,3 kz zawierał fragmenty HinZIII 2,4 kz i 3,8 kz i fragment BsmHI-XbaI o długości 4,0 kz, które specyficznie hyboyZIeowały e sondą cryIIIB. Fragment HindIII o długości 2,4 ke subklonowano do ONA tpkwpazjoaujązego wektora M13mp18. Fragment BamHI-XbaI o długości 4,0 ke subklonowano do ONA wektorów tPkwencjonującICh M13mp18 i M13mp19.
Określano sekwencję nukleotydów zasadniczej części każdego subklonowanego fragmentu ONA stosując standardową metodę Ssngera dideoksy. Obydwie nici ONA każdego ^bronowanego fragmentu spkwencjoaowαao stosując specyficzne Zla sekwencji 17-merowe poimprI oligonuklpotydowe w celu zapoczątkowania reakcji tekwencjonowαals ONA. Sekwencjonowanip wykazało, że fragment 8,3 kz zawierał otwartą rsmę odczytu i, szczególnie, nowy gen typu cryIII. Ten nowy gpn, oznaczony jako cryIIIC, różni się znacznie od genu cryIIIA. Jak wykazano poniżej, gen cryIIIC różni się także wyraźnie od genu cryIIIB.
Sekwencja ONA genu cryIIIC i wydedukowans sekwencja aminokwasów białka CryIIIC kodowanego prepz ten gen, jest przedstawiona na fig. 1. Ceęść genu cryIIIC kodująca białko zaczyna się od nukleotydu w pozycji 14 i kończy się w pozycji 1972. Prawdopodobne miejsce wiązania rybosomu jest wskazane na fig. 1-1 jako RBS. Wielkość białka CryIIIC, kodowanego przez gen cryIIIC, wydedukowana z otwartej ramy odczytu genu cryIIIC wynosi 74 393 dsltony (652 aminokwasów). Należy zauważyć, że rzeczywista wielkość białka CryIIIC, określona na drodze SOS-PAGE, wynosi około 70 kOa. Zatem białko CryIIIC w niniejszym opisie będeie określane wielkością około 70 kOa.
165 919
Wydedukowana wielkość znanego białka CryIIIA wynosi 73 116 daltonów (644 aminokwasy). Wielkość białka CryIIIB uprzednio określona wynosi 74 237 daltonów (651 aminokwasów).
Sekwencjonowanie DNA wykazuje obecność miejsc restrykcyjnych BamHI i HindIII w genie cryIIIC (patrz. fig. 1-2). Znajomość lokalizacji tych miejsc restrykcyjnych pozwoliła na precyzyjne określenie lokalizacji i orientacji genu we fragmencie 8,3 kz, jak wskazano strzałką na fig. 7.
W celu porównania sekwencji genów cryIIIC i cryIIIB i cryIIIA i wydedukowanych sekwencji aminokwasów odpowiadających im białek CryIIIC, CryIIIB i CryIIIA, wykorzystano program komputerowy Queen i Korn (C. Queen i L.j.Korn, Analysis of Biological Sequences on Small Computers, DNA, 3, str. 421-436 (1984).
Sekwencja nukleotydowa genu cryIIIC w 96% identyczna pozycyjnie z sekwencją nukleotydową genu cryIIIB i tylko w 75% z sekwencją nukleotydową genu cryIIIA. Tak więc, chociaż gen cryIIIC jest spokrewniony z genem cryIIIC i cryIIIA, jasne jest, że gen cryIIIC jest inny niż gen cryIIIB i zasadniczo różni się od genu cryIIIA.
Stwierdzono, że wydedukowana sekwencja aminokwasów białka CryIIIC była w 94% pozycyjnie identyczna z wydedukowaną sekwencją aminokwasów białka CryIIIB, ale tylko w 69% z wydedukowaną sekwencją aminokwasów białka CryIIIA. Te różnice, razem z różnicami w aktywności owadobójczej, jak zestawiono poniżej, wyraźnie wskazują, że białko CryIIIC kodowane przez gen cryIIIC jest inne niż białko CryIIIB lub CryIIIA.
Ponadto, nie wiążąc tego z żadną teorią, a opierając się na porównaniu sekwencji aminokwasów białka CryIIIC i CryIIIB, uważa się, że następujące reszty aminokwasów mogą mieć znaczenie dla zwiększenia aktywności białka CryIIIC wobec Diabrotica, przy czym po każdym symbolu określającym aminokwas podane są liczby wskazujące pozycję aminokwasu w sekwencji przedstawionej na fig. 1: His9, His231, Gln339, Phe352, Asn446, His449, Val450, Ser451, Lys600 i Lys624. Uważa się, że te reszty aminokwasowe są istotne dla toksyczności białka CryIIIC wobec Diabrotica, ponieważ po przeanalizowaniu sekwencji aminokwasów kilku innych białek CryIII, okazało się, że we wskazanych pozycjach prawie zawsze znajdują się inne aminokwasy niż te wymienione dla białka CryIIIC.
Przykład VII . Eksprjsj a klonowaneg o gen u cryll^IC.
Przeprowadzono badania w celu określenia wytwarzania białka CryIIIC przez gen cryIIIC.
W tablicy i przedstawiono charakterystykę szczepów B.t. i E.coli i stosowanych plazmidów.
Plus /*/ oznacza obecność wskazanych elementów, aktywność lub funkcję, a minus / / oznacza brak tych elementów. Oznaczenia s i r wskazują odpowiednio wrażliwość i oporność na antybiotyk, przy którym są podane. W tablicy stosuje się skróty o następujących znaczeniach: Amp (ampicylina), Cm (chloramfenikol), Cry (wytwarzający kryształy), Tc (tetracyklina).
Tablica 1 Szczepy i plazmidy
| Szczepy lub plazmidy | Charakterystyka |
| 1 | 2 |
| B. thuringiensis | |
| HD73-26 | Cry-, Cms |
| EG7211 | HD73-26 zawierający pEG220/Cry-/ |
| EG7220 | HD73-26 zawierający pEG260 /cryIIIC* cryX*/ |
| EG7231 | HD73-26 zawierający pEG269 /cryIIIC* cryX-/ |
| EG4961 | cryIIIC* cryX* |
| E.coli | |
| DH5 | Cry-, Amps |
| GM2163 | Cry-, Amps |
| EG7218 | DH5 zawierający pEG258 /cryIIIC* cryX*/ |
| EG7221 | DH5 zawierający pUC18/Cry-/ |
| EG7232 | DH5 zawierający pEG268/cryIIIC* cryX’/ |
| EG7233 | DH5 zawierający pEG269/cryIIIC* cryX/ |
165 919
c.d. tabeli 1
| 1 | 2 |
| Plazmidy | |
| PEG220 | Ampr, Tcr, Cmr, Cry', Bacil^s - E^oli wektor czółenkowy składający się z pBL322 rUgowanego z pNN101 w miejscu SphI |
| pUC18 | Ampr, Cry', wektor z E.coli |
| pNN101 | Cmr, tcO, Cry', wektor z Bacillus |
| pEG258 | Ampr, cryIIIC* cryX* zrrkdmbendeany plazmid z E.coli składający się z fragmentu cryIIIC* cryX* Asp718-PstI o długości 8,3 kz ze szczepu B.t. EG4961 zlegdeanrgd z pUC18 w miejscach Asp718-PstI |
| PEG260 | Tcr, Cmr, cryHIC* cryX* zrekombinowany plazmid z Bacil^s składający się z fragmentu cryIIIC* cryX* Asp71B-PstI o długości 8,3 kz ze szczepu B.t. EG4961 zligowanego lepkimi końcami z pNN101 w miejscu EcoLV |
| PEG260 | Ampr cryIIIC* cryX' zrekombinowany plazmid z E.coli składający się z fragmentu Sau3A o długości 5 kz ze szczepu B.t. EG4961 zligowanego z pBL322 w miejscu BamHI |
| pEG269 | Ampr/E.coli/, Tcr i Cmr /B.t./, cryIIIC* cryX zrekombinowany plazmid czółenkowy składający się z pNN101 zligowany z pEG268 w miejscu SphI |
Komórki E.coli zawierające klonowany fragment 8,3 kz, opisany w przykładzie VI, badano aby stwierdzić, czy wytwarzają krystaliczne białko CryIIIC o wielkości 70 kDa.
Doświadczenie wykazuje, że klonowane geny krystalicznego białka z B.t. słabo ulegają ekspresji w E.coli, natomiast dobrze w B.t. Zrekombinowany plazmid pEG258, skonstruowany jak opisano w przykładzie VI, replikuje w E.coli, ale nie replikuje w B.t. Aby uzyskać wysoki poziom ekspresji klonowanego genu cryIIIC, fragment cryIIIC o długości 8,3 kz przeniesiono z pEG258 do wektora plazmidowego pNN101 /T^ Cmr Cry'/, który jest zdolny do replikacji w B.t.
Konstrukcję plazmidową pEG258 wyizolowano ze szczepu E.coli EG7218 przez obróbkę lizozymem i SOS, następnie przez wytrącenie plazmidowego DNA etanolem, stosując standardowe metody. Następnie użyto plazmidu pEG258 do stransfoΓmowenla komórek szczepu E.coli GM2163 nadając im kompetencję działaniem chlorku wapnia, jak opisano w przykładzie VI. Szczep E.coli GM2163 jest krystalicznie ujemny /Cry'/ i jest wrażliwy na ampicylinę /Amp5/ i został skonstruowany według procedury H.G. Marinusa i wsp., Mol.Gen.Genrt., 192, str. 288-289 /1983/.
Znów wyizolowano plazmid pEG258, tym razem z transformoeanrgd szczepu E.coli GM2163, stosując opisaną właśnie procedurę. Wyizolowany plazmid pEG258 trawiono Asp718 i PstI. Trawiony plazmid poddano elektroforezie w żelu agardzdeym i z żelu eyelbdeand fragment cryIIIC Asp718Pstl o długości 8,3 kz. Nadano mu lepkie końce stosując polimerazę T4 i trifosforany ^oksynukleotydów w celu wypełnienia końców Asp718 i PstI.
Fragment z lepkimi końcami o długości 8,3 kz zmieszano z wektorem pNN101 z Bacil^s, który był trawiony EcoLV. Do mieszaniny dodano ligazę T4 i ATP w celu zligowania fragmentu 8,3 kz z lepkimi końcami z miejscami EcoLV wektora pNN1Ql. Po ligacji mieszaninę DNA dodano do zawiesiny komórek szczepu B.t. HD73-26. Komórki te są krystalicznie negatywne /Cry”/ i są wrażliwe na chloramfenikol /Cms/. Stosując technikę ^e^^pora^i nadano komórkom szczepu B.t. HD73-26 w mieszaninie zdolność pobrania zrekombinowanej konstrukcji plazmidu składającej się z pNN101 i zlegdeanegd fragmentu cryIIIC o długości 8,3 kz, także znajdującej się w mieszaninie. Tak więc zrekombinowany plazmid przeniesiono metodą elrktrdpdralje do szczepu B.t. HD73-26.
Po elektroporacji transformowane komórki B.t. rozprowadzono na podłożu agarowym zawierającym 5 ug chloramfenikolu i inkubowano w ciągu 16-18 godzin w 30*C. Z komórek, które przyjęły plazmid pNN101 wyrosły kolonie na podłożu agarowym z chloramfenikolem, podczas gdy komórki, które nie zaabsorbowały plazmidu nie rosły na tym podłożu. Kolonie Cmr przeniesiono na nitrocelulozę i poddano hybrydyzacji z radioaktywnie znakowaną sondą cryIIIB. Jedną kolonię, oznaczoną jako szczep B.t. EG7220, która specyficznie hybrydyzowała z sondą cryIIIB, badano dalej.
165 919
EG7220 zawierał plazmid, oznaczony jako pEG260, który składał się z fragmentu cryIIIC 6,3 kz wstawionego w miejsce EcoRV wektora pNNdU. Na figurze 8 jest przedstawiono mapa rest^^yjna plazmidu pEG260.
Prowadzono hodowlę komórek szczepu B.t. EG7220 w podłożu spkrulccyjtrm zawierającym chloromfenikol /5 ug/ml/ w 23 - 25C oż do stadium sporulocji i przeprowadzono lizę komórek /3-4 dni/. Bodcnie nakrkskopkye wykazało, że hodowla szczepu B.t. EG7220 zawierało spory i swobodnie unoszące się nieregularnie ukształtowane kryształy.
Spory, kryształy i debris komórkowe z hodowli w stadium sporulacji szczepu B.t. EG7220 zebrano przez odwirowanie. Kryształy rozpuszczono przez ogrzewanie odwirowanej stałej mieszanlny w buforze rozpuszczającym /0,13 M Tris pH 8,5, 2% ^og^odj./ SDS, 5% /obj/obj-/ 2-ιηβ^ kop^e^mlu, 10% /obj^^j./ gliceryny w 100C przez 5 min. Po ogrzewaniu mieszaninę naniesiono no żel pkllakrrloαmldkyr - SDS i frakcjonowano białka w mieszaninie ze względu no wielkość przez elektroforezę. Po rkzfrckcjktoyaniu uwidoczniono biołka przez barwienie barwnikiem Cokmassle. Fotografię takiego barwionego żelu przedstawia fig. 10.
Z figury 10 wynika, że szczep B.t. EG7220 wytworze główne białko o wielkości w przybliżeniu 70 kDo i białko drugorzędne o wielkości 30 kDo. Wydaje się, że są to białka o laetkyczw nej wielkości jak białko główne o wielkości około 70 kDo i białko drugorzędne około 30 kDa, wytwarzane przez szczep B.t. EG4961 /fig. 10/. Wynik ten świadczy o tym, że fragment pEG260 o długości 8,3 kz zawiera dwa geny krystalicznego białko: Jeden - białka o wielkości około 70 kDa i Jeden - białka o wielkości około 30 kDa.
Genem kodującym białko o długości ok. 70 kDa jest gen cryIIIC, a kodowanym białkiem jest białko CryIIIC. Gen kodujący krystaliczne białko o wielkości około 30 kDa został oznaczony joko cryX, a kodowane białko jako CryX.
Jak przewidywano i co zilustrowano na fig. 10, lzkgenlozny szczep kontrolny B.t., oznaczony jako EG7211, składający się ze szczepu B.t. HD73-26 i zawierający tylko wektor plozmldowy pEG220, nie wytwarzał białko o wielkości około 70 kDo cni białko o wielkości około 30 kDa. Plozmid pEG220 zawiera gen oporności na ampicylinę, no tetracyklinę, na chloramfenikol i czółenkowy wektor z krystalicznie ujemnego Ε.μ11 - Bacillus, składający się z pBR322 ligowanego do miejsce SphI pNNKU.
Komórki E.coli zawierające klonowany fragment o długości 8,3 kz, zawierający gen cryIIIC i gen cryX, poddano analizie w celu stwierdzenia, czy wytwarzają krystaliczne białka o wielkości około 70 kDo i 30 kDo. Komórki E^oll zawierające pEG258, oznaczone jako szczep EG7218, hodowcno do stadium późnej fezy stacjonarnej i zebrano je przez odwirowanie. Komórki te poddano lizie, a wszystkie białka komórkowe rozpuszczono przez ogrzewanie komórek w buforze białkowym. Okazało się, że uzupełniające białka otrzymane przez rozpuszczenie z komórek Ε.^ΐι EG7218 są identyczne jok uzupełniające białko uzyskane przez rozpuszczenie z ujemnego, kontrolnego szczepu Ε.»11, oznaczonego joko EG7221, który zawierał tylko wektor plazmidowy pUC18, jok zilustrowano no fig. 10. Wynik ten wykazuje, że komórki Ε.^ΙΙ zawierające klonowany fragment cryIIIC o długości 8,3 kz wytwarzają bardzo mało, jeśli w ogóle wytwarzają, krystalicznych białek o wielkości około 70 kDo lub około 30 kDo.
Do wydzielenie genu cryIIIC, odpowiedzialnego ze wytwarzanie białka CryIIIC o wielkości około 70 kDa, stosowano następujące procedury.
Fragment DNA Sau3A ze szczepu B.t. EG4961, który zawierał gen cryIIIC, ale nie zawierał genu cryX, klonowano stosując joko sondę gen cryIIIB. Przeprowadzono to przez częściowe trawienie DNA ze szczepu B.t. EG4961 zc pomocą Sou3A, elektroforezę trawionego DNA w żelu agorozowym i wycięcie płotków żelu zawierających fragmenty Scu3A o długości 4 kz - 9 kz. Fragmenty Scu3A odzyskano z płotków żelu no drodze elektroelucji i zmieszono je z wektorem plazmidowym pBR322, który był trawiony BamKI. Fragmenty Scu3A ligowono z wektorem pBR322. Mieszaninę do ligacjl Okupowano z komórkami szczepu Ε.^ΙΙ DH5rC traktowanymi CaC^, w celu pobrania przez komórki DNA plazmidu.
Po inkubacji komórki naniesiono no płytki agarowe zawierające ampicylinę i podłoże LB (1% ^g^obj./ tryp^u Difco, 0,5% /ycB./obJ./ ekstraktu drożdżowego Dafco, 0,5% /wag./^./ NaCl, pH 7,0) w celu selekcji tych komórek, które zaabsorbowały DNA plazmidu. Kilkaset stronsformowonych kolonii Ampr przeniesiono na filtry nitrocelulozowe i filtry poddano hybrydyzacji
165 919 z radioaktywnie znakowaną sondą cryIIIB, jak opisano powyżej w przykładzie I. Sonda hybrydyzowała z kilkoma koloniami. Dalej przedstawiono charakterystykę jednej z tych kolonii, oznaczonej jako EG7232. Szczep E^oli EG7232 zawierał plazmid, oznaczony jako pEG268, który składał się z pBR322 i wstawionego fragmentu DNA Sap3A-BamHI o długości ok. 5 kz. Wstawiony fragment DNA specyficznie hybrydyzował z radioaktywnie znakowaną sondą cryIIIB.
Plazmid pEG268 /Ampr/Tc5/ replikuje w E.coli, ale nie replikuje w B.t. Aby otrzymać pochodną plazmidu pEG268, która mogłaby replikować w B.t., p EG268 trawiono SphI, zmieszano z plazmidem pNN101 z Bacillus /CMr Tc^, który także trawiono SphI i mieszaninę poddano ligacj^ Mieszaninę tę kakubowano z zawiesiną komórek E.coli traktowanych CaCl^ w celu umożliwienia pobrania przez komórki DNA z plazmidu pEG268 zlkgowaazgo z eNN101. Po inkubacji komórki umieszczono na płytkach agarowych zawierających podłoże LB i tetracyklinę i wyhodowano kilkaset kolonii odpornych na tetracyklinę. Tylko komórki, które zaabsorbowały plazmid składający się z pEG268 i pNN101 rosły i tworzyły kolonie w obecności tetracykliny. Do dalszych badań wybrano jedną z kolonii Tcr, oznaczoną jako EG7233. Jak oczekiwano, szczep E.coli EG7233 zawierał plazmid, oznaczony jako pEG269, który składał się z pNN101 wstawionego w miejsce SphI plazmidu eEG265. Na figurze 9 przedstawiono mapę restrykcyjną pEG269.
Skonstruowany plazmid pEG269 wyodrębniono ze szczepu E.coli EG7233 przez obróbkę lizozymem i SDS, następnie wytrącenie DNA plazmidu etanolem, stosując standardowe procedury. Plazmid pEG269 był następnie wykorzystany do transformacji komórek szczepu E^oli GM2163, potraktowanych CdC12, jak opisano wcześniej.
Znów wyizolowano plazmid pEG269, tym razem z transformowanego szczepu E^oli GM2163. Wyizolowany plazmid pEG269 dodano do zawiesiny komórek szczepu B^ HD73-26, krystalicznie ujemnego, wrażliwego na chloramfenikol i przez mizszaaiaę przepuszczono prąd elektryczny transformując w ten sposób przez elektroporację plazmid pEG269 do komórek szczepu B.t. HD73-26. Komórki przeniesiono na płytkę agarową z podłożem LB i chloramfenikolem i, po inkubacji, wyhodowano kilkaset kolonii Cmr. Do badań wybrano jedną z tych kolonii oznaczoną jako EG7231. Jak oczekiwano, szczep B.t. EG7231 zawierał pEG269.
Komórki szczepu B.t. EG7231 hodowano przez 4 dni w 20-23‘C w podłożu DSMG zawierającym chloramfenikol. Badanie pod mikroskopem wykazało, że hodowla zawierała obok sporów cząstki przypominające kryształy B.t. Stały materiał zawierający spory, kryształy i komórki debris zbiera się przez odwirowanie i zawiesza się w wodnym roztworze w stężeniu 100 mg substancji M stałej z hodowli/ml. Część tej zawiesiny miesza się z buforem rozpuszczania (0,13 Tris pH 8,5, 2\ wag./obj. SDS, 5% obj./obj. 2-merkaptoetanolu, 10% obj./obj. gliceryny), ogrzewa się w 100’C przez 5 minut i mieszaninę poddaje się elektroforezie na żelu eolkakryloamkdowym - SOS w celu rozfrakZJoaowaaia białek ze względu na wielkość. Po frakcjonowaniu białka uwidoczniono przez barwienie żelu barwnikiem Coomassie. Na figurze 10 przedstawiono fotografię zabarwionego żelu.
Szczep B.t. EG7231 wytwarzał główne białko o wielkości ok. 70 kDa, które, jak się okazało, jest identyczne pod względem wielkości z białkiem CryIIIC 70 kDa, wytwarzanym przez szczep B.t. EG4961, jak przedstawiono na fig. 10. Szczep B.t. EG7231 nie wytwarzał wykrywalnej ilości krystalicznego białka o wielkości ok. 30 kDa /fig. 10/.
Wy nik ten wykazuje, że gen cryX krystalicznego białka o wielkości ok. 30 kDa znajduje się w regionie zaznaczonym linią przerywaną na fig. 7 i 8. Ponadto wykazuje też, że szczep B.t. EG7231 zawiera gen cryIIIC w postaci wyizolowanej.
W następujących przykładach VIII-XII opisany jest sposób oznaczania aktywności owadobójczej szczepu B.t. EG4961 i białka CryIIIC.
Przykład VIII . Procedury przygoiDnknl a preparatów 1 testowani a w bioprócach owadobójczych.
Koncentraty fermentacyjne. Szczepy B.t. EG4961 i EG2158 i B.t. tenebrionis /B.t.t./ hodowano w ciekłym podłożu sporulacyjnym w 30*C aż do stadium spo^^cji i lizy komórek. Było to znane typowe podłoże zawierające źródło białka, źródło węglowodanów i sole mineralne. Przed umieszczeniem w autoklawie do podłoża dodano NdOH w celu doprowadzenia pH do wartości 7,5. Płyn fermentacyjny zatężono przez odwirowanie i przed użyciem zamrożono.
165 919
Stosowany skrót CryIII oznacza krystaliczni białko o wielkości około 70 kDa otrzymane w hodowli każdego z badanych szczepów: B.t. EG4961, EGD58 i B.W.W. Krystaliczni białka CizIII wydzielono ze stałej substancji otrzymanej po fermentacji, wykorzystując gradienty gęstości sacharozy. Gdy w gradientach gęstości sacharozy rozdziela się składniki po hodowli B.t. do stadium pporulαbji, spory B.t. zbierają się na dole gradientu, a kryształy B.t. tworzę pasmo mniej więcej w środku gradientu. W ten sposób, stosując gradienty gęstości sacharozy, wydziela się krystaliczni białka B.t. u stosunkowo czystej postaci, oddzielając je od sporów B.t. i innych stałych substancji w płynie fermentacyjnym. Wydzielone krystaliczne białka CizIII przechowywano przed użyciem w CC.
Ilość białka CryIII we wszystkich badanych próbkach określano standardową metodą SDS-PAGE. Testowano następujące owady:
Diab^t^a undlbizpunb1a1a howardi /SCRW/
DlabrotlbG virgifira vlrglflla /WCRW/
Leptlao1alsα debemllnlatG /CPB/
Pyr^aHa luteola
P^g^dna vlrslbolorα
Przeprowadzono dwie biopróby, jedną, w której stosowano sztuczne pożywienie i drugą, w której stosowano moczone liście.
B^p^ba ze sztucznym pożywieniem.
Próbie poddano larwy SCRW, stosując porlllichaiorl zanieczyszczenie sztucznego pożywienia podobnego do opisanego przez Marrom i wsp., J.Econ. En^mol., 78, str. 290 - 293 /1985/, ale bez formaliny. Każda biopróba obejmowała 8 seryjnych rozcieńcz^ wodnych, których próbki nanoszono na powierzchnię pożywienia. Po wysuszeniu rozcieńczalnika /wodny roztwór 0,005% Triton Χ^ί^/, larwy w pierwszym stadium instar umieszczono na pożywieniu i to^bo^no w 2WC.
W jednej dawce testowano 32 larwy. Po 7 dniach określano śmiertelność. Dane z bioprób poddano analizie plobl1orej (R.J. Daum, Buli. En^mcl. Soc. Am., 16, str. 10 - 15 /1970/), przy czym śmiertelność skorygowano w odniesieniu do śmiertelności w próbie kontrolnej, w której stosowano tylko rozcieńczalnik (W.S. Abbett, J.Econ. Entom^, 18, str. 265-267 /1925/). Wyniki okreś2 loni są ilością krystalicznego białka powierzchni pożywienia, która odpowiada L^g, tj. stężeniu zabijającemu 50% badanych owadów. W nawiasach podano 95% przedziały ufności.
Larwy WCRW w pierwszym stadium instar badano na takim samym sztucznym pożywieniu, w jednej dawce. Śmiertelność określono po 48 godzinach.
Larwy CPB w pierwszym stadium instar badano w podobny sposób, z tą różnicą, żi pożywienie dla owadów BioSnve's nr 9380 zastąpiono płatkami ziemniaczanymi, które dodano do sztucznego pożywienia, śmiertelność określano po 3 dniach zamiast po 7.
Biopróby z moczonymi liśćmi.
Ola tych gatunków owadów lub dla owadów w takich stopniach rozwoju, dla których nie nadawało się sztuczne pożywienie przeprowadzono biopróby stosując moczenie odpowiedniego naturalnego pożywienia /liści/ w znanych koncentratach zawieszonych w wodnych roztworach 0,2% TrHon Χ-100. Po odciśnięciu liście pozostawiono do wyschnięcia. Liście moczone w 0,2% Triton Χ-100 służyły jako nie1lak1owanl próbki kontrolni. 5 lub 10 owadów umieszczono na płytci Pitriigo z traktowanymi liśćmi i pozwolono im żerować przez 48 godzin. W ten sposób badano osobniki dorosłe SCRW i CPB oraz larwy i osobniki dorosłe Pyr^aHa lutecla i larwy i osobniki dorosłe Plagiodira verpibclcra, stosując odpowiednie źródła pożywienia.
Odchylenia od powyższej metodologii podano wraz z odpowiednimi danymi.
Przykład IX. Aktywność owadobójcza białek CryIII wobec larw CPB, Pyr^aHa lutiola i Plagiodira vlrpibclola.
Szczep B.t. EG4961 ma podobną aktywność do wcześniej odkrytego szczepu B.t. EG2158 wobec larw CPB w teście przeprowadzonym na sztucznym pożywieniu, wyniki przedstawione są w tablicy 2.
165 919
Tablica 2
Aktywność owadobójcza szczepów B.t. EG4961 i EG2158 wobec larw w pierwszym stadium ^star stonki eiźmngaieαnej z Colorado w b^p^bie na sztucznym pożywieniu
| Próbka - typ | próby | LL. /95% C.I./* w ng Izryyy/m|2 | |
| EG4961 | EG2158 | ||
| ferm. konc. | 2 | 0,47 | 0,42 |
| /0,39 - 0 | 57/ /0,35 - 0,50/ | ||
| śmiertelność | kontrolna | 3,1% |
95% rzeźSigał ufności /C.I./ przedstawiony jest w nawiasach
Bio^by z moczonymi liśćmi wykazały także, że szczep B.t. EG4961 ma podobną aktywność do aktywności szczepu B.t. EG2158 i B.t.t. wobec larw i osobników dorosłych Syzzhalta luteola oraz wobec larw SlagigSźrw vźrtOioloza.
Przykład X· Aktywność owadobójcza szczepów B.t. i białek Czryyy wobec larw SCRW w bio^ba^ ze sztucznym pożywieniem.
Szczep B.t. EG4961 wykazuje wyjątkową aktywność wobec larw SCRW w porównaniu ze szczepem B.t. EG2158 i B.t.t. w biopzóyαih ze sztucznym pożywieniem, których wyniki są przedstawione w tablicy 3. Porównania oznaczone w tablicy 3 jako ferm. konc. nr 1 o ferm. konc. nr 2 oparto na różnych koncentratach fermentacyjnych szczepu B.t. EG4961. Ann szczep B.t. EG2158 ano B.t.t. noe powodował śmiertelności powyżej 15% w najwyższej badanej dawce. Natomiast dla szczepu B.t. EG4961 otrzymano wartości H50 /tj. 50% śmiertelności przy określonej dawce/ /tablica 3/.
Gdy yOgrzóyie poddano ocirtiiignź białko krystaliczne CryIm ze szczepu B.t. EG4961, obserwowana aktywność była tylko niźenaiinle niższa, nóż aktywność koncentratów fermentacyjnych szczepu B.t. EG4961 /zawierających spory i kryształy/. Na podstawie tego wyniku krystaliczne białko CryHIC egdentrliagwang jako substancję toksyczną w szczepie B.t. EG4961.
Rozwój larw, które przeżyły w biopzóyaih ze szczepem B.t. EG4961 /zarówno z koncentratami lźzmźntairjnymO jak i z oczyszczonym krystalicznym biakkgem/ był krańcowo zahamowany w porównaniu z nOźtzaktowanrmi larwami kontrolnymi.
Oczyszczone krystaliczne białko CryIHA badane samo nie wykazywało nawet niewielkiej aktywności wobec larw SCRW, jaką miał koncentrat fermentacyjny wytwarzającego je szczepu B.t. EG2158. Nawet przy 5okrgtnym zarżeniu oczyszczonego białka CryIHA, nie wystąpiła aktywność wobec SCRW. Minimalnw aktywność szczepu B.t. EG2158 w postaci koncentratu fermentacyjnego może zależeć od obecności sporów obok krystalicznego białka CryIIIA.
Tablica 3
Aktywność owadobójcza szczepu B.t. EG4961 wobec larw SCRW w yOorzóyαih ze sztucznym pożywieniem
| Typ próbki | Próby | Lt:50 | /95% C.I./ w ng CzryIy/mm2 | |
| EG4961 | EG2158 | B.t.t. | ||
| ferm. konc. nr 1 śmiertelność kontrolna nr 1 | 4 | 170/139-213/ 9,4% | 14% zabitych 1000 | nie badano |
| ferm. konc. nr 2 śmiertelność kontrolna nr 2 | 4 | 206/161-273/ 8,6% | nie badano | 15% zabitych 1000 |
| Oczyszczone | ||||
| kryształy białka śmiertelność kontrolna | 4 | 645/521-819/ 8,3% | 3% zabitych 1000 | nie badano |
165 919
W biopróbie ze sztucznym pożywieniem, w której badano koncentrat fermentacyjny szczepu B.t. EG4961 w jednej dawce wobec larw WCRW uzyskano śmiertelność podobną do obserwowanej z larwami SCRW. Szczep B.t.t. w przypadku larw SCRW powodował trochę większą śmiertelność niż w próbie kontrolnej.
Przykład XI. Aktywność owadobójcza szczepów B.t. EG4961, EG2158 i B.t.t. wobec dorosłych SCRW i CPB w biopróbach z moczonymi liśćmi.
Poza wyjątkową aktywnością wobec larw SCRM, szczep B.t. EG4961 wykazuje także wyjątkową aktywność owadobójczą wobec osobników dorosłych zarówno SCRW jak i CPB /tablica A/, na które nie działają szczepy B.t. EG2158 lub B.t.t. Uzyskane wyniki są przedstawione w tablicy 4.
Tablica 4
| Szczep | ug CryIII/ml | % zabitych osobników po 48 godz. | |
| SCRW | CPB | ||
| EG4961 | 2800 | 50 | 100 |
| 1400 | 37,5 | 98 | |
| 700 | 25 | 95 | |
| 350 | 10 | 70 | |
| EG2158 | 4350 | - | - |
| 2175 | - | 0 | |
| 1088 | - | 10 | |
| 544 | - | - | |
| B.t.t | 2250 | 0 | 0 |
| 1125 | 10 | 5 | |
| Śmiertelność | 563 | 0 | 0 |
| kontrolna | 0 | 0 |
/-/ nie testowano
Przykład XII . Aktywność owadobdjcza klonowanego genu cyIIIIC.
Prowadzono hodowlę szczepu B.t. EG4961 i stransformowanego szczepu B.t. EG7231, zawierającego klonowany gen cryIIIC ze szczepu B.t. EG4961, opisanego w przykładzie VII, na ciekłym podłożu sporulacyjnym, po czym zatężono przez odwirowanie, jak opisano w przykładach V - VII. Obydwa koncentraty badano wobec larw SCRW i Larw CPB na sztucznym pożywieniu stosując uprzednio opisane techniki, ale 3 dawki zamiast 8 i /dla CPB/ 16 larw /CPB na dawkę zamiast 32/. Wyniki przedstawione w tablicy 5 wykazują, że szczep B.t. EG7231 wytwarza krystaliczne białko CryIIIC o toksyczności równej toksyczności szczepu B.t. EG4961. Krystalicznie ujemny, sporulujący szczep B.t. EG7211, stosowany do wytwarzania szczepu B.t. EG7231, badano jako dodatkowy szczep kontrolny i okazało się, że jest to szczep nieaktywny. Ta biopróba zweryfikowała pogląd, że gen cryIIIC wytwarza białko krystaliczne toksyczne dla Coleoptera w szczepie B.t. EG4961.
Tablica 5
| Szczep | LC5q ng CryIII/mm2 /95% C.I./ | |
| SCRW | CPB | |
| EG7231 EG4961 EG7211 Próba kontrolna | 359 /238-593/ 421 /253-1086/ 9,4% zabitych 6,25% zabitych | 0,23 /0,05 - 0,49/ 0,32 /0,19 - 0,50/ 12,5% zabitych 3,125% zabitych |
165 919
Następujący przykład XIII dotyczy badań, w których aktywność owadobójcza białek CryIII wobec owadów reędu Coleoptera jest wyraźnie zwiększona preee kombinację e białkiem CryI. Kryształy białka CryIA/c/ nie są toksyczne dla owadów rzędu Coleoptera, ale wiadomo, że są aktywne wobec wielu gatunków owadów reędu Lpoazopteoa.
Przykład XIII . Synerglstyczne zwiększenie aktywność1 owadottójcjeJ białka Cyylli przez dodatek białka CryI.
Zrpkombaaowsay szczep B.t. EG1269, wytwarzający tylko kryształy białka CryIA/c/ hodowano na ciekłym podłożu tpooulacIjnya stosując techniki opisane w przykładach V-VII. Zrpkombinowany secepp B.t. EG1269 skonstruowano przee wprowadzenie plazmidu pEG157 Zo szczepu B.t. HO73-26. Plazmid pEG157 wytworzono przez ^bronowanie genu cryIA/c/ z pEG87 /szczep B.t. HO263-6/ do wektora czółenkowego pEG147. Kryształy białka CryIA/c/ oczyszczono w gradiencie Renografin i oznaczono ilościowo metodą SOS-PAGE. Równą ilość tych kryształów dodano Zo kryształów CryIIIC i e tską mieszaniną przeprowadzono b^p^bą ee sztucznym pożywieniem wobec larw SCRW. Mieszanina białek CryUIC-CryI była znacznie bardziej toksyczna niż same kryształy CryIIIC, jak to wyraźnie widać e tablicy 6.
Tablica 6
Aktywność owadobójcza maeteaaiay białek krystalicznych CryIIIC i CryIA/c/ wobec larw SCRW w b^p^bie ze sztucznym pożywieniem
| Obróbka | Próby | LC50 ng CryIIIC/mm2 /95% C.I./ |
| kryształy CryIIIC | 2 | 1180 /810 - 2000/ |
| kryształy CryIIIC + | ||
| kryształy CryIA/c/ | 2 | 309 /220 - 500/ |
| kryształy CryIA/c/ | 2 | 15,6% zabitych przy 571 ng/mm2 |
| śmiertelność kontrolna | 6,25% |
Stosowane szczepy bakteryjne zostały wcześniej zdeponowane w ARS Patent Collpction, Agricultural Research Culture Collection, Northern Regional Research Laborstory /NRRL/, 1815 North Uniwer^ty Street, Peoria, Illinois 61064, jak to przedstawiono w następującej tablicy 7.
Tablica 7
| Seceep bakteryjny | NRRL nr depozytu | Oats zdeponowania |
| B. thurlaglpatas EG2158 | B-18213 | 29 kwietnia 1987 |
| B. ^ur^gien^ s HO73-26 | B-18508 | 12 czerwca 1989 |
| B. thuolaglpatas EG4961 | B-18533 | 13 września 1989 |
| B. ^ur^gien^s EG2838 | B-18603 | 8 lutego 1990 |
| B. thurlaglpatlt EG7231 | B-18627 | 28 lutego 1990 |
| B. thuolaglpatls EG7231 | B-18627N | 17 kwietnia 1990 |
| E.coli EG7218 | B-18534 | 13 września 1989 |
| E.coli EG7222 | B-18607 | 8 lutego 1990 |
165 919 cryIIIC
US 919
FIG. 1-1
20 30 40 SO 60
GGGAGGAAGAAAAATGAATCCAAACAATCGAAGTGAACATGATACGATAAAGGTTACAec RBS MetAsnProAsnA&nArgSerGluHi sAapThr11eLyeYalThrPr
60 90 100 110 120
TAACAGTGAATTGCAAACTAACCATAATCAATATCCTTTAGCTGACAATCCAAATTCAAC oAsnSarGl uLeuGl nThrAenHi sAenOl nT yrProLeuAl «Α·ρ AenPreAsnSerTh
130 140 ISO 160 170 160
ACTAGAAGAATTAAATTATAAAGAATTTTTAAGAATGACTGAAGACAGTTCTACGGAAGT rLeuGl uGl uLauAsnTyrLyaGl uPheLeuAr gMetThr Gl uAapSerSerThrGl uVa
190 200 210 220 230 240
GCTAGACAACTCTACAGTAAAAGATGCAGTTGBGACABBAATTTCTGTTGTAGGGCABAT 1 LsuAspAenSerThrValLysAspAl aValGl yThr81 y X1 aSar Val Val Gl yGlηϊ1
250 260 270 260 290 300
TTTAGGTGTTGTAGGAGTTCCATTTGCTGGGGCACTCACTTCATTTTATCAATCATTTCT eLeuGl yVal Val Dl yVal ProPheAl aGl yAl aLeuThrSerPheTyrGl nSerPheLa
310 320 330 340 350 360
TAACACTATATGGCCAAGTGATGCTGACCCATGGAAGGCTTTTATGGCACAAGTTGAAGT uAsnThrXIaTrpProSerAspAl aAspProTrpLysAl aPheMatAlaGl nValGluVa
370 3Θ0 390 400 410 420
ACTGATAGATAAGAAAATAGAGGAGTATGCTAAAAGTAAAGCTCTTGCAGAGTTACAGGG 1 Leul 1 eAcpLysLyd 1 eGl uGl uTyr Al aLysSerLycAl aLeuAl aGl uLeuGl nGl
430 440 450 460 470 460
TCTTCAAAATAATTTCGAAGATTATGTTAATGCGTTAAATTCCTGBAAGAAAACACCTTT yLeuGlnAenAsnPheGluAspTyrVal AsnAl aLauAsnSarTrpLyeLyeThrProLe
490 500 510 520 530 540
AABTTTGCGAAGTAAAAGAAGCCAAGATCGAATAAGGGAACTTTTTTCTCAAGCAGAAAG uSerLBuArgSerLysArgSerGl nAsp Arg 11 eArgGl uLeuPheSerGl nAl aGl uSe
550 560 570 5Θ0 590 600
TCATTTTCGTAATTCCATGCCGTCATTTGCAGTTTCCAAATTCGAAGTGCTGTTTCTACC rHl ePheArg AcnSerMetProSerPheAl aVal SerLysPheGl uVal LsuPheLeuPr
610 620 630 640 650 660
AACATATGCACAAGCTGCAAATACACATTTATTGCTATTAAAAGATGCTCAABTTTTTGG oThrTyr Al aGl nAl aAl aAsnThrHi sLeuLeuLauLeuLysAspAl aGl nVal PheGl
670 660 690 700 710 720
AGAABAATBGGGATATTCTTCAGAAGATBTTGCTGAATTTTATCATAGACAATTAAAACT yGluGluTrpGlyTyrSerSerGl uAspValAlaGluPheTyrHIsArgGlnLeuLyeLe
730 740 750 760 770 760
TACACAACAATACACTGACCATTGTGTTAATTGGTATAATGTTGGATTAAATGGTTTAAG uThrGl nGlnTyrThrAspHi sCysValAsnTrpTyrAsnValGlyLeuAsnBIyLeuAr
790 B00 810 820 Θ30 840
AGGTTCAACTTATGATGCATGGGTCAAATTTAACCGTTTTCGCAGAGAAATGACTTTAAC gGl ySerT-hrTyr AspAl aTrpVal LysPheAsnArgPheArgArgGluMotThrLeuTh
650 660 870 880 690 900
TGTATTAGATCTAATTGTACTTTTCCCATTTTATGATATTCGGTTATACTCAAAAGGGGT rMalLeuAspLeuI 1 eValLeuPheProPheTyrAspll eArgLeuTyrSerLy®GlyVa cryIIIC
165 919
FIG. 1-2
910 920 930 940 950 960 TAAAACABAACTAACAAGAGACATTTTTACGGATCCAATTTTTTCACTTAATACTCTTCA 1LyeThrGluLeuThrArgAepI1ePheThrAepProI1ePheSerLeuAsnThrLeuGl
BomHI
970 980 990 1000 1010 1020 BBAGTATGGACCAACTTTTTTGABTATAGAAAACTCTATTCGAAAACCTCATTTATTTGA nGluTyrGlyProThrPheLouSerΣ1eGluAsnSerI1eArgLysProHlsLeuPheAs
1030 1040 1050 1060 1070 1080 TTATTTACAGGGGATTGAATTTCATACGCGTCTTCAACCTGGTTACTTTGGGAAAGATTC pTyrLeuGlnGlyI1eGluPheHleThrArgLeuGlnProGlyTyrPheGlyLysAspSe
1090 1100 1110 1120 1130 1140 TTTCAATTATTGGTCTGBTAATTATGTAGAAACTABACCTABTATAGGATCTAGTAAGAC rPheAenTyrTrpSerGlyAenTyrValGluThrArgProSerI1eGlySerSerLycTh
1150 1160 1170 1180 1190 1200 AATTACTTCCCCATTTTATBGAGATAAATCTACTBAACCTGTACAAAAGCTAAGCTTTBA rIIeThrBerProPheTyrGlyAepLyeSerThrBluProValGlnLygLeuSerPheAc
Hindlil
1210 1220 1230 1240 1250 1260 TGGACAAAAAGTTTATCGAACTATAGCTAATACAGACGTAGCGGCTTGGCCGAATBGTAA pGlyGlnLysValTyrArgThr11oAl aAsnThrAspValAlaAlaTrpProAsnGlyLy
1270 1280 1290 1300 1310 1320 GGTATATTTAGGTGTTACGAAAGTTGATTTTAGTCAATATGATGATCAAAAAAATGAAAC eValTyrLeuGlyValThrLyeValAepPheSerGlnTyrAspAspGlnLyeAsnBluTh
1330 1340 1350 1360 1370 1380 TABTACACAAACATATBATTCAAAAABAAACAATGGCCATGTAAGTBCACAGGATTCTAT rSerThrGlnThrTyrAepSerLyeArgΑβπΑβηΒΙyHi ®ValSerAlaGlnAspSer11
1390 1400 1410 1420 1430 1440 TGACCAATTACCGCCAGAAACAACAGATGAACCACTTGAAAAAGCATATAGTCATCAGCT eAepGlnLeuProProGluThrThrAepGluProLeuGluLyeAlaTyrSerHi eGlnLe
1450 1460 1470 14B0 1490 1500 TAATTACGCGGAATGTTTCTTAATGCAGGACCGTCGTGGAACAATTCCATTTTTTACTTG uAenTyrAlaGluCyePheLeuMetGlnAspArgArgGlyThrIleProPhePheThrTr
1510 1520 1530 1540 1550 1560 GACACATAGAAGTGTAGACTTTTTTAATACAATTGATGCTGAAAAGATTACTCAACTTCC pThrHieArgSerValAepPhePheAenThrI1sAspAlaGluLyel1eThrGlnLeuPr
1570 1580 1590 1600 1610 1620 ABTAGTGAAABCATATGCCTTBTCTTCAGGTBCTTCCATTATTBAABGTCCABGATTCAC oVal Val Ly sAl aTyr Al aLeuSer Ser Gl yAl aSer 11 el 1 eGl uGl yProGl yPheTh
1630 1640 1650 1660 1670 1680 AGBAGGAAATTTACTATTCCTAAAAGAATCTABTAATTCAATTBCTAAATTTAAAGTTAC rSlyGlyAenLeuLeuPheLeuLyeGluSer Ser AsnSer11sAlaLyePheLysValTh
1690 1700 1710 1720 1730 1740 ATTAAATTCABCABCCTTBTTACAACBATATCGTBTAABAATACGCTATBCTTCTACCAC rLeuAenSerAlaAlaLeuLeuGlnArgTyrArgValArglleArgTyrAlaSerThrTh
1750 1760 1770 1780 1790 1800 TAACTTACGACTTTTTGTGCAAAATTCAAACAATBATTTTCTTGTCATCTACATTAATAA rAenLeuArgLeuPheValGlnAsnSerAenAsnAepPheLeuVal21eTyr 21eAenLy
165 919 cryIIIC F1G. 1-3
1B10 1620 1B30 1640 1830 1B60
AACTATGAATAAAGATGATBATTTAACATATCAAACATTTBATCTCGCAACTACTAATTC BThrMetAsnLyBAspAspAspLeuThrTyrGlnThrPhoAepLauAlaThrThrAfinSe
1B70 1680 1690 1900 1910 1920
TAATATBGGGTTCTCGBGTBATAABAATBAACTTATAATAGGABCABAATCTTTCGTTTC r AenMetBlyPheSerGlyAspLyeAenGluLeuI1el1eGlyAlaGluSerPheVal5e
1930 1940 1930 1960 1970
TAATGAAAAAATCTATATAGATAAGATAGAATTTATCCCAGTACAATTGTAA r AsnGluLysI1eTyrI1eAepLye11eGl uPhel1eProValG1nLeuEnd
1C5 919
| a | CO «Μ |
| tn | Cl vo |
| r·4 | 00 os |
| Ol | |
| U | O U |
| ω | 63 fał |
| 00 | 00 | |
| in | n | *O |
| 1-4 | 00 | Os |
| Csl | Ci | |
| O | O | O |
| ω | H | t3 |
| ł | 1 | 1 |
FIG. 2
FIG. 3
165 919
FIG. 4
FIG. 5
165 919 a co i-i ιλ m so •Η CO OS
I
I
FIG. 6
165 919
I
I t
i
I
I
I
I «
Ułog/v£s
£H
m
CM o
UJ
o.
2H (ISd/AM>
WSV/AH oo £H ułog
2Hω°8/ν£ε qdS uiog
O
Ź
Z
o.
O ω
CM o
o.
MdS uk>8/V£S o%
PEG269 1WPBR322 \\\M PNNłOI
165 919
| 00 | •H | o | |||
| 40 | «Π | <H | |||
| €M | CM | 04 | CM | CM | |
| Γ* | r* | r* | r* | r> | |
| O | o | O | O | O | O |
| u | u | U | u | U | u |
| 1 | 1 | 1 | 1. | -.4. |
U ta
4$
FIG. 10
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 1,00 zł.
Claims (6)
- Zastrzeżenia patentowe1. środek owadobójczy zawierający substancję czynną i dopuszczalny do stosowania w rolnictwie nośnik, znamienny tym, że jako substancję czynną zawiera białko toksyczne dla owadów rzędu Coleoptera kodowane przez gen cryIIIC o sekwencji nukleotydów przedstawionej na fig. 1, w której region kodujący obejmuje nukleotydy od 14 do 1972 i koduje sekwencję aminokwasów przedstawioną na fig. 1.
- 2. środek według zastrz. 1, znamienny tym, 2e jako substancję czynną zawiera białko toksyczne dla owadów rzędu Coleoptera wytworzone w hodowli bakterii stransformowanych zrekombinowanym plazmidem, zawierającym gen cryIIIC według zastrz. 1.
- 3. środek weeług zzstrz. 2, znamienny tym, 2e zzwiera białko wytwórzonę w hodowli Baalilis thuuienlersle NNLL B--8627 lub NRRL B-18627N.
- 4. Śś^de ooeWłOójclz ZBawie^ącc suustanncę ccznną i ό^^ζο^Ι^ dd stosowania w ctwie nośnik, znamienny tym, ee jako substancję czynną zawiera bakterie Bacil^s thuringiensis NLLL B-18533 lub wytworzoną przez nie toksynę.
- 5. środek owadobójczy zawierający substancję czynną i dopuszczalny do stosowania w rolnictwie nośnik, znamienny tym, ee jako substancję czynną zawiera białko toksyczne dla owadów rzędu Coleoptera o sekwencji aminokwasów przedstawionej na fig. 1, wytworzone przez bakterie Bacillus thurengirnses NLLL B-18533.
- 6. środek według zastrz. 5, znamienny tym, ie białko t oksy czne dla ptera jest zawarte w bakteriach aacillus thurengirnses.* « «
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/496,568 US5187091A (en) | 1990-03-20 | 1990-03-20 | Bacillus thuringiensis cryiiic gene encoding toxic to coleopteran insects |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL289512A1 PL289512A1 (en) | 1991-12-16 |
| PL165919B1 true PL165919B1 (pl) | 1995-03-31 |
Family
ID=23973206
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL91289512A PL165919B1 (pl) | 1990-03-20 | 1991-03-20 | Srodek owadobójczy PL PL PL PL PL |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5187091A (pl) |
| EP (2) | EP0606110A1 (pl) |
| JP (1) | JP3078576B2 (pl) |
| KR (1) | KR930700664A (pl) |
| AT (1) | ATE125569T1 (pl) |
| AU (1) | AU645080B2 (pl) |
| CA (1) | CA2078571C (pl) |
| DE (1) | DE69111600T2 (pl) |
| ES (1) | ES2077223T3 (pl) |
| HU (1) | HUT62036A (pl) |
| NZ (1) | NZ237404A (pl) |
| PL (1) | PL165919B1 (pl) |
| RU (1) | RU2106409C1 (pl) |
| WO (1) | WO1991014778A2 (pl) |
Families Citing this family (103)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5187091A (en) * | 1990-03-20 | 1993-02-16 | Ecogen Inc. | Bacillus thuringiensis cryiiic gene encoding toxic to coleopteran insects |
| US5632987A (en) * | 1992-12-31 | 1997-05-27 | Mycogen Corporation | Bacillus thuringiensis toxins active against corn rootworm larvae |
| US5264364A (en) * | 1991-01-31 | 1993-11-23 | Ecogen Inc. | Bacillus thuringiensis cryIIIc(B) toxin gene and protein toxic to coleopteran insects |
| CA2101338A1 (en) * | 1991-01-31 | 1992-08-01 | William P. Donovan | Bacillus thuringiensis cryiiic(b) toxin gene and protein toxic to coleopteran insects |
| TW261517B (pl) * | 1991-11-29 | 1995-11-01 | Mitsubishi Shozi Kk | |
| WO1994016079A2 (en) * | 1992-12-31 | 1994-07-21 | Mycogen Corporation | Novel bacillus thuringiensis toxins active against corn rootworm larvae |
| WO1994028724A1 (en) * | 1993-06-10 | 1994-12-22 | Ecogen Inc. | Bacillus thuringiensis strains capable of producing large amonts of insecticidal crystal proteins |
| US5441884A (en) * | 1993-07-08 | 1995-08-15 | Ecogen Inc. | Bacillus thuringiensis transposon TN5401 |
| US5843744A (en) * | 1993-07-08 | 1998-12-01 | Ecogen Inc. | Bacillus thuringiensis Tn5401 proteins |
| US5369027A (en) * | 1993-07-12 | 1994-11-29 | Plant Genetic Systems, N.V. | Bacillus thuringiensis strains toxic to diabrotica species |
| US5527883A (en) * | 1994-05-06 | 1996-06-18 | Mycogen Corporation | Delta-endotoxin expression in pseudomonas fluorescens |
| US5508264A (en) * | 1994-12-06 | 1996-04-16 | Mycogen Corporation | Pesticidal compositions |
| EP0861021B1 (en) * | 1995-10-13 | 2009-09-23 | Dow Agrosciences LLC | Modified bacillus thuringiensis gene for lepidopteran control in plants |
| US6063756A (en) | 1996-09-24 | 2000-05-16 | Monsanto Company | Bacillus thuringiensis cryET33 and cryET34 compositions and uses therefor |
| US6093695A (en) | 1996-09-26 | 2000-07-25 | Monsanto Company | Bacillus thuringiensis CryET29 compositions toxic to coleopteran insects and ctenocephalides SPP |
| US6110668A (en) * | 1996-10-07 | 2000-08-29 | Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. | Gene synthesis method |
| US6103228A (en) | 1997-05-09 | 2000-08-15 | Agraquest, Inc. | Compositions and methods for controlling plant pests |
| PL198772B1 (pl) * | 1997-05-09 | 2008-07-31 | Agraquest | Biologicznie czysta kultura Bacillus subtilis, jej metabolit i supernatant z hodowli szczepu, kompozycje do ochrony roślin i owoców przed szkodnikami, sposób ochrony lub leczenia roślin i owoców, agrastatyny, sposób izolowania supernatantu o aktywności owadobójczej |
| US6391547B1 (en) * | 1997-09-09 | 2002-05-21 | Center For The Application Of Molecular Biology To International Agriculture | Microbial β-glucuronidase genes, gene products and uses thereof |
| US7087420B1 (en) | 1997-07-17 | 2006-08-08 | Cambia | Microbial β-glucuronidase genes, gene products and uses thereof |
| US6015553A (en) * | 1997-08-22 | 2000-01-18 | Agraquest, Inc. | Bacillus subtilis strain for controlling insect and nematode pests |
| US6027723A (en) * | 1997-08-22 | 2000-02-22 | Agraquest, Inc. | Rhodococcus globerulus strain for controlling corn rootworm |
| US6001637A (en) * | 1997-08-22 | 1999-12-14 | Agraquest, Inc. | Bacillus pumilus strain for controlling corn rootworm, nematode and armyworm infestations |
| US5906818A (en) * | 1997-08-22 | 1999-05-25 | Agraquest, Inc. | Bacillus mycoides strain for controlling corn rootworm |
| US6060594A (en) * | 1997-12-18 | 2000-05-09 | Ecogen, Inc. | Nucleic acid segments encoding modified bacillus thuringiensis coleopteran-toxic crystal proteins |
| US6023013A (en) * | 1997-12-18 | 2000-02-08 | Monsanto Company | Insect-resistant transgenic plants |
| ATE544857T1 (de) * | 1997-12-18 | 2012-02-15 | Monsanto Technology Llc | Insekten-resistente transgene pflanzen und verfahren zur verbesserung von der aktivität von delta-endotoxinen gegen insekten |
| US6063597A (en) * | 1997-12-18 | 2000-05-16 | Monsanto Company | Polypeptide compositions toxic to coleopteran insects |
| US6077824A (en) * | 1997-12-18 | 2000-06-20 | Ecogen, Inc. | Methods for improving the activity of δ-endotoxins against insect pests |
| CZ301915B6 (cs) * | 1998-08-19 | 2010-07-28 | Monsanto Technology Llc | Rekombinantní molekula DNA, transformovaná bunka, rostlina a zpusob zlepšení genové exprese |
| US6245551B1 (en) | 1999-03-30 | 2001-06-12 | Agraquest, Inc. | Strain of Bacillus pumilus for controlling plant diseases caused by fungi |
| HUP0200562A2 (en) | 1999-03-30 | 2002-06-29 | Agraquest Inc | A strain of baccilus pumilus for controlling plant diseases |
| US6501009B1 (en) | 1999-08-19 | 2002-12-31 | Monsanto Technology Llc | Expression of Cry3B insecticidal protein in plants |
| AU2001238152A1 (en) * | 2000-02-10 | 2001-08-20 | University Of Connecticut | Insecticidal compounds and methods for selection thereof |
| US7279547B2 (en) * | 2000-02-10 | 2007-10-09 | University Of Connecticut | Insecticidal compounds and methods for selection thereof |
| AU2001259260A1 (en) * | 2000-05-15 | 2001-11-26 | Monsanto Technology Llc | Polypeptide composionns toxic to anthonomus insects, and use thereof |
| JP2004518616A (ja) * | 2000-08-11 | 2004-06-24 | ザ レジェンツ オブ ザ ユニヴァースティ オブ カリフォルニア | 昆虫及び線虫のＢｔ毒素に対する抵抗性を遮断するための方法 |
| US8080496B2 (en) | 2000-10-06 | 2011-12-20 | Syngenta Crop Protection, Inc. | Method for reducing pest damage to corn by treating transgenic corn seeds with thiamethoxam pesticide |
| US6593273B2 (en) | 2000-10-06 | 2003-07-15 | Monsanto Technology Llc | Method for reducing pest damage to corn by treating transgenic corn seeds with pesticide |
| US6586365B2 (en) | 2000-10-06 | 2003-07-01 | Monsanto Technology, Llc | Method for reducing pest damage to corn by treating transgenic corn seeds with clothianidin pesticide |
| US7230167B2 (en) * | 2001-08-31 | 2007-06-12 | Syngenta Participations Ag | Modified Cry3A toxins and nucleic acid sequences coding therefor |
| JP4594080B2 (ja) * | 2002-05-10 | 2010-12-08 | カウンシル・オブ・サイエンティフィック・アンド・インダストリアル・リサーチ | ２′‐ｐ‐ヒドロキシベンゾイルムッサエノシド酸の肝臓保護活性 |
| JP2005538709A (ja) * | 2002-06-20 | 2005-12-22 | バイオ−キャンサー・トリートメント・インターナショナル・リミテッド | アルギニンを欠乏させることによってヒト悪性腫瘍を治療する医薬品及び方法 |
| EP1532247A4 (en) * | 2002-07-29 | 2006-08-30 | Monsanto Technology Llc | PAVING THE EVENT PV-ZMIR13 (MON863) AND COMPOSITIONS AND METHODS FOR DETECTING THEREOF |
| ES2601577T3 (es) * | 2007-03-28 | 2017-02-15 | Syngenta Participations Ag | Proteínas insecticidas |
| MX2011003185A (es) | 2008-10-01 | 2011-07-20 | Vestaron Corp | Formacion de toxinas del peptido. |
| MX2011013224A (es) | 2009-06-09 | 2012-06-01 | Pioneer Hi Bred Int | Promotor de endospermo temprano y metodos de uso. |
| CA2775582A1 (en) * | 2009-10-02 | 2011-04-07 | Syngenta Participations Ag | Insecticidal proteins |
| BR112012009044A2 (pt) | 2009-10-26 | 2015-09-01 | Pioneer Hi Bred Int | Molécula de ácido nucléico isolada, cassete de expressão, vetor, célula vegetal, planta, semente transgênica, método para expressão de um polinucleotídeo em uma planta ou célula vegetal e método para expressão de um polinucleotídeo, preferencialmente em tecidos somáticos de óvulo de uma planta |
| US9204603B2 (en) | 2011-12-21 | 2015-12-08 | The Curators Of The University Of Missouri | Soybean variety S05-11482 |
| US20130167262A1 (en) | 2011-12-21 | 2013-06-27 | The Curators Of The University Of Missouri | Soybean variety s05-11268 |
| WO2013103365A1 (en) | 2012-01-06 | 2013-07-11 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Pollen preferred promoters and methods of use |
| EP2800816A1 (en) | 2012-01-06 | 2014-11-12 | Pioneer Hi-Bred International Inc. | Ovule specific promoter and methods of use |
| NZ727213A (en) | 2012-03-09 | 2020-03-27 | Vestaron Corp | Toxic peptide production, peptide expression in plants and combinations of cysteine rich peptides |
| US11692016B2 (en) | 2012-03-09 | 2023-07-04 | Vestaron Corporation | High gene expression yeast strain |
| WO2014059155A1 (en) | 2012-10-11 | 2014-04-17 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Guard cell promoters and uses thereof |
| EA028528B1 (ru) | 2013-03-13 | 2017-11-30 | Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. | Внесение глифосата для борьбы с сорняками у brassica |
| WO2014153254A2 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-25 | Pioneer Hi-Bred International Inc. | Compositions and methods to control insect pests |
| CA2901316A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Phi-4 polypeptides and methods for their use |
| BR112016003225B1 (pt) | 2013-08-16 | 2022-10-25 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Polipeptídeo pip-47, polipeptídeo pip-47 quimérico, composição, proteína de fusão, método para controlar uma população de inseto-praga, método para inibir o crescimento ou matar um inseto-praga, construto de dna, polinucleotídeo isolado, cassete de expressão, método de obtenção de uma planta transgênica e método para controlar infestação de inseto |
| BR122020001770B1 (pt) | 2013-09-13 | 2022-11-29 | Pioneer Hi-Bred International, Inc | Construto de dna, método de obtenção de planta transgênica, proteína de fusão, método para controlar uma população de praga de inseto, método para inibir o crescimento ou matar uma praga de inseto |
| BR112016018103B1 (pt) | 2014-02-07 | 2024-01-16 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Polipeptídeo e seu uso, polinucleotídeo, composição, proteína de fusão, método para controlar uma população, método para inibir o crescimento, método para controlar a infestação, método para obtenção de uma planta ou célula vegetal, construto |
| CN106536545B (zh) | 2014-02-07 | 2026-03-03 | 先锋国际良种公司 | 杀昆虫蛋白及其使用方法 |
| CA2955828A1 (en) | 2014-08-08 | 2016-02-11 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Ubiquitin promoters and introns and methods of use |
| WO2016044092A1 (en) | 2014-09-17 | 2016-03-24 | Pioneer Hi Bred International Inc | Compositions and methods to control insect pests |
| CN113372421B (zh) | 2014-10-16 | 2024-08-06 | 先锋国际良种公司 | 杀昆虫蛋白及其使用方法 |
| BR112017012495A2 (pt) | 2014-12-12 | 2018-04-10 | Syngenta Participations Ag | composições e métodos para controle de pragas de plantas |
| US20170359965A1 (en) | 2014-12-19 | 2017-12-21 | E I Du Pont De Nemours And Company | Polylactic acid compositions with accelerated degradation rate and increased heat stability |
| CN114075267B (zh) | 2015-01-15 | 2025-03-18 | 先锋国际良种公司 | 杀昆虫蛋白及其使用方法 |
| CA2985198A1 (en) | 2015-05-19 | 2016-11-24 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
| EP3310803A1 (en) | 2015-06-16 | 2018-04-25 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods to control insect pests |
| BR112018002535A2 (pt) | 2015-08-06 | 2018-09-25 | Du Pont | polipeptídeo inseticida recombinante, polinucleotídeo recombinante, construto de dna, planta transgênica ou célula de planta, composição, proteína de fusão, método para controlar uma praga, método para inibir crescimento ou para exterminar uma população de pragas ou uma praga e uso do polipeptídeo |
| DK3341483T3 (da) | 2015-08-28 | 2020-03-16 | Pioneer Hi Bred Int | Ochrobactrum-medieret transformation af planter |
| CA3004056C (en) | 2015-12-22 | 2024-01-23 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Tissue-preferred promoters and methods of use |
| EP3445861B1 (en) | 2016-04-19 | 2021-12-08 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal combinations of polypeptides having improved activity spectrum and uses thereof |
| CA3018384A1 (en) | 2016-05-04 | 2017-11-09 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
| CA3022858A1 (en) | 2016-06-16 | 2017-12-21 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods to control insect pests |
| UA127388C2 (uk) | 2016-06-24 | 2023-08-09 | Піонір Хай-Бред Інтернешнл, Інк. | Регуляторний елемент рослини і спосіб його застосування |
| EP3478052B1 (en) | 2016-07-01 | 2021-08-25 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins from plants and methods for their use |
| WO2018013333A1 (en) | 2016-07-12 | 2018-01-18 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods to control insect pests |
| BR112019008023A2 (pt) | 2016-10-21 | 2019-07-09 | Vestaron Corp | peptídeo, proteína inseticida e/ou nematicida, polinucleotídeo, vetor, célula hospedeira, constructo de dna, planta, ou parte da mesma, e, método de controle de uma infecção por peste de uma planta. |
| EP3535285B1 (en) | 2016-11-01 | 2022-04-06 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
| BR112019012339A2 (pt) | 2016-12-14 | 2019-11-26 | Pioneer Hi Bred Int | polipeptídeo inseticida recombinante, composição, construto de dna, célula hospedeira, planta transgênica, método para inibir o crescimento ou extermínio de uma praga de inseto ou população de praga, polipeptídeo ipd093 quimérico e proteína de fusão |
| US11213028B2 (en) | 2016-12-22 | 2022-01-04 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
| WO2018140214A1 (en) | 2017-01-24 | 2018-08-02 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Nematicidal protein from pseudomonas |
| WO2018148001A1 (en) | 2017-02-08 | 2018-08-16 | Pioneer Hi-Bred International Inc | Insecticidal combinations of plant derived insecticidal proteins and methods for their use |
| RU2019140646A (ru) | 2017-05-11 | 2021-06-11 | Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. | Инсектицидные белки и способы их применения |
| CN111373046A (zh) | 2017-09-25 | 2020-07-03 | 先锋国际良种公司 | 组织偏好性启动子和使用方法 |
| US20200165626A1 (en) | 2017-10-13 | 2020-05-28 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Virus-induced gene silencing technology for insect control in maize |
| EP3759489A1 (en) | 2018-03-02 | 2021-01-06 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Plant health assay |
| US11332752B2 (en) | 2018-03-12 | 2022-05-17 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Use of morphogenic factors for the improvement of gene editing |
| CA3092078A1 (en) | 2018-03-14 | 2019-09-19 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins from plants and methods for their use |
| AU2019234562B2 (en) | 2018-03-14 | 2024-08-01 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins from plants and methods for their use |
| WO2019226508A1 (en) | 2018-05-22 | 2019-11-28 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Plant regulatory elements and methods of use thereof |
| CA3097915A1 (en) | 2018-06-28 | 2020-01-02 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods for selecting transformed plants |
| WO2020046701A1 (en) | 2018-08-29 | 2020-03-05 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
| US20210395758A1 (en) | 2018-10-31 | 2021-12-23 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods for ochrobactrum-mediated plant transformation |
| TWI906251B (zh) | 2020-02-04 | 2025-12-01 | 美商科迪華農業科技有限責任公司 | 具有殺有害生物效用之組成物及與其相關之方法 |
| BR112022027035A2 (pt) | 2020-07-14 | 2023-04-11 | Pioneer Hi Bred Int | Proteínas inseticidas e métodos para uso das mesmas |
| CN116096903A (zh) | 2020-08-10 | 2023-05-09 | 先锋国际良种公司 | 植物调节元件及其使用方法 |
| TW202345696A (zh) | 2022-05-18 | 2023-12-01 | 美商科迪華農業科技有限責任公司 | 具有殺有害生物效用之組成物及與其相關的方法 |
| WO2024020360A1 (en) | 2022-07-18 | 2024-01-25 | Pairwise Plants Services, Inc. | Mustard green plants named 'pwrg-1', 'pwrg-2,' and 'pwsgc' |
| EP4725303A1 (en) | 2024-10-11 | 2026-04-15 | Agrokray Limited Liability Company | Spelt, method of producing spelt plants, grain produced from spelt plant and food product produced therefrom |
Family Cites Families (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3346138A1 (de) * | 1983-12-21 | 1985-07-11 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Bacillus thuringiensis var. tenebrionis sowie ein insektizid wirkendes, hieraus erhaeltliches praeparat bzw. toxin sowie deren verwendung zur bekaempfung von coleoptera |
| US4695455A (en) * | 1985-01-22 | 1987-09-22 | Mycogen Corporation | Cellular encapsulation of pesticides produced by expression of heterologous genes |
| US4771131A (en) * | 1985-08-16 | 1988-09-13 | Mycogen Corporation | Cloning and expression of Bacillus thuringiensis toxin gene encoding a protein toxic to beetles of the order Coleoptera |
| GB8526774D0 (en) * | 1985-10-30 | 1985-12-04 | Sandoz Ltd | Bacillus thuringiensis hybrids |
| DE3713946A1 (de) * | 1987-04-25 | 1988-11-10 | Basf Ag | Verfahren zur gewinnung von insektenpathogenen proteinen und mikroorganismen des typs bacillus thuringiensis |
| TR27832A (tr) * | 1987-04-29 | 1995-08-31 | Monsanto Co | Zararli ucucu hasarata mukavim bitkiler. |
| US5024837A (en) * | 1987-05-06 | 1991-06-18 | Donovan William P | Coleopteran active microorganisms, related insecticide compositions and methods for their production and use |
| US5080897A (en) * | 1987-05-08 | 1992-01-14 | Ecogen Inc. | Novel bacillus thuringiensis strains, and related insecticidal compositions |
| US4910016A (en) * | 1987-08-03 | 1990-03-20 | Mycogen Corporation | Novel Bacillus thuringiensis isolate |
| NZ226442A (en) * | 1987-10-13 | 1991-08-27 | Lubrizol Genetics Inc | Anti-coleopteran toxin and gene |
| GB8800652D0 (en) * | 1988-01-13 | 1988-02-10 | Ici Plc | Bacterial strain |
| US4999192A (en) * | 1988-02-12 | 1991-03-12 | Mycogen Corporation | Novel coleopteran-active bacillus thuringiensis isolate |
| US4966765A (en) * | 1988-02-23 | 1990-10-30 | Mycogen Corporation | Novel coleopteran-active Bacillus thuringiensis isolate |
| US4996155A (en) * | 1988-03-04 | 1991-02-26 | Mycogen Corporation | Bacillus thuringiensis gene encoding a coleopteran-active toxin |
| US5055293A (en) * | 1988-03-09 | 1991-10-08 | Purdue Research Foundation | Biological pesticide |
| EP0382990A1 (en) * | 1989-02-15 | 1990-08-22 | Plant Genetic Systems, N.V. | Strains of bacillus thuringiensis |
| GB8910624D0 (en) * | 1989-05-09 | 1989-06-21 | Ici Plc | Bacterial strains |
| SK281286B6 (sk) * | 1989-11-17 | 2001-02-12 | Novo Nordisk A/S | Mutant mikroorganizmu bacillus thuringiensis deponovaný ako subsp. tenebrionis dsm 5480, spôsob jeho prípravy a pesticídny prostriedok, ktorý ho obsahuje |
| US5187091A (en) * | 1990-03-20 | 1993-02-16 | Ecogen Inc. | Bacillus thuringiensis cryiiic gene encoding toxic to coleopteran insects |
| PL295547A1 (pl) * | 1990-04-26 | 1992-10-05 | Plant Genetic Systems Nv | |
| CA2101338A1 (en) * | 1991-01-31 | 1992-08-01 | William P. Donovan | Bacillus thuringiensis cryiiic(b) toxin gene and protein toxic to coleopteran insects |
-
1990
- 1990-03-20 US US07/496,568 patent/US5187091A/en not_active Expired - Lifetime
-
1991
- 1991-03-12 NZ NZ237404A patent/NZ237404A/en unknown
- 1991-03-18 DE DE69111600T patent/DE69111600T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-03-18 AU AU75552/91A patent/AU645080B2/en not_active Expired
- 1991-03-18 KR KR1019920702265A patent/KR930700664A/ko not_active Ceased
- 1991-03-18 WO PCT/US1991/001786 patent/WO1991014778A2/en not_active Ceased
- 1991-03-18 EP EP94102819A patent/EP0606110A1/en not_active Withdrawn
- 1991-03-18 ES ES91907293T patent/ES2077223T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-03-18 JP JP03506608A patent/JP3078576B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-03-18 HU HU9202984A patent/HUT62036A/hu unknown
- 1991-03-18 CA CA002078571A patent/CA2078571C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-03-18 RU SU5053184A patent/RU2106409C1/ru active
- 1991-03-18 AT AT91907293T patent/ATE125569T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-03-18 EP EP91907293A patent/EP0522036B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-03-20 PL PL91289512A patent/PL165919B1/pl unknown
-
1992
- 1992-09-24 US US07/950,352 patent/US5382429A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69111600T2 (de) | 1996-02-29 |
| WO1991014778A3 (en) | 1991-12-12 |
| DE69111600D1 (en) | 1995-08-31 |
| EP0522036A1 (en) | 1993-01-13 |
| CA2078571A1 (en) | 1991-09-21 |
| US5382429A (en) | 1995-01-17 |
| US5187091A (en) | 1993-02-16 |
| EP0606110A1 (en) | 1994-07-13 |
| RU2106409C1 (ru) | 1998-03-10 |
| AU645080B2 (en) | 1994-01-06 |
| WO1991014778A2 (en) | 1991-10-03 |
| KR930700664A (ko) | 1993-03-15 |
| AU7555291A (en) | 1991-10-21 |
| CA2078571C (en) | 2004-06-01 |
| JPH05505109A (ja) | 1993-08-05 |
| HUT62036A (en) | 1993-03-29 |
| JP3078576B2 (ja) | 2000-08-21 |
| PL289512A1 (en) | 1991-12-16 |
| ES2077223T3 (es) | 1995-11-16 |
| ATE125569T1 (de) | 1995-08-15 |
| NZ237404A (en) | 1992-06-25 |
| EP0522036B1 (en) | 1995-07-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL165919B1 (pl) | Srodek owadobójczy PL PL PL PL PL | |
| EP0498537B1 (en) | Novel coleopteran-active bacillus thuringiensis isolate and a novel gene encoding a coleopteran-active toxin | |
| AU675628B2 (en) | Novel microorganism and insecticide | |
| US5436002A (en) | Bacillus thuringiensisisolate PS201T6 toxin | |
| EP0871736B1 (en) | PESTICIDAL COMPOSITION COMPRISING CryIF CHIMERIC AND CryIA(c) CHIMERIC BACILLUS THURINGIENSIS DELTA-ENDOTOXIN | |
| US5264364A (en) | Bacillus thuringiensis cryIIIc(B) toxin gene and protein toxic to coleopteran insects | |
| US5985267A (en) | Protein toxins active against lepidopteran pests | |
| US6294184B1 (en) | Process for controlling lepidopteron pests | |
| US5753492A (en) | Genes encoding nematode-active toxins from Bacillus thuringiensis strains | |
| US5888503A (en) | Materials and methods for the control of calliphoridae pests | |
| EP0584232B1 (en) | Novel bacillus thuringiensis isolates for controlling acarides | |
| US7790961B2 (en) | Pesticidal proteins | |
| JP2531913B2 (ja) | バシルス チュリンギエンシス（Ｂａｓｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ） ｃｒｙＩＩＩＣ（ｂ）毒素遺伝子及び甲虫類昆虫に毒性のタンパク質 | |
| AU709112B2 (en) | Bacillus thuringiensis isolates active against cockroaches | |
| CA2059242C (en) | Coleopteran-active bacillus thuringiensis isolate and a novel gene encoding a coleopteran-active toxin | |
| CA2325831C (en) | Bacillus thuringiensis cryiiic gene and protein toxic to coleopteran insects | |
| WO1993003619A1 (en) | Multi-targeted bacillus thuringiensis bioinsecticide |