PL168711B1 - Sposób wytwarzania rekombinantu nowego przeciwciala obejmujacego region wiazaniantygenu mysiego przeciwciala monoklonalnego BR 96 PL - Google Patents

Abstract

1 .Sposób wytwarzania rekombinatu nowego przeciwciala obejmujacego region wiaza- nia antygenu mysiego przeciwciala monoklonalnego BR 96 wykazujacego te sama specyfi- cznosc wiazania co przeciwcialo BR 96, znamienny tym, ze przylacza sie region wiazacy antygen pochodzacy z przeciwciala BR 96 z przynajmniej czescia drugiego bialka. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania rekombinantu nowego przeciwciała BR-96. Bardziej szczegółowo wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania rekombinantu przeciwciała obejmującego region wiązania antygenu mysiego, przeciwciała monoklonalnego BR 96. Klasa nowych przeciwciał, do których należy wytwarzany sposobem według wynalazku rekombinant przeciwciała BR 96 zdolna jest do reagowania z ludzkimi komórkami rakowymi. Mysie przeciwciała monoklonalne reagują z antygenem błony komórkowej związanym z wieloma ludzkimi rakami, włącznie z rakami okrężnicy, piersi, jajników i płuc. Mysie przeciwciało monoklonalne jest w wysokim stopniu specyficzne wobec raków, nie przejawiając żadnej lub bardzo niską reaktywność wobec normalnych tkanek ludzkich lub innych typów nowotworowych, takich jak chłoniaki lub mięsaki. Przeciwciała te mają kilka dodatkowych zalet. Po pierwsze, ulegają one internalizacji do komórek rakowych, z którymi się wiążą. Przeciwciała BR 96 są więc użyteczne do zastosowań terapeutycznych, na przykład, jako przeciwciałowy składnik koniugatów przeciwciało-lek lub przeciwciało-toksyna gdzie pożądana jest internalizacja koniugatu. Po drugie, przeciwciała pośredniczą w zależnej od przeciwciała cytotoksyczności komórkowej ADCC, i zależnej od dopełniacza cytotoksyczności CDC. Po trzecie, przeciwciała w formie nieskoniugowanej mogą zabijać antygenododatnie komórki nowotworowe, jeśli obecne są w dostatecznym stężeniu. Przeciwciała użyteczne są także w metodach diagnostycznych, takich jak wykrywanie raków metodami in vitro lub in vivo.

Przeciwciała monoklonalne na ludzkie różnicujące antygeny towarzyszące nowotworowi zapewniają możliwość ukierunkowywania różnych czynników antynowotworowych, takich jak radioizotopy, leki chemioterapeutyczne i toksyny. [Baldwin i Byers, (red.), w: Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, Londyn, Academic Press (1985)]. Ponadto, korzystną cechą pewnych przeciwciał monoklonalnych jest możliwość zabijania komórek nowotworowych przez ADCC lub CDC w obecności ludzkich komórek efektorowych lub surowicy [Hellstrom i in. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)], i niewiele jest przeciwciał monoklonalnych, które posiadają bezpośrednio aktywność przeciwnowotworową, niezależną od żadnego komponentu godpodarza [Drebin i in., Oncogene 2:387-394 (1988)].

168 711

Znanych jest wiele przeciwciał monoklonalnych reagujących z antygenami towarzyszącymi rakowi [patrz np. Papsidero, Recent Progress In The Immunological Monitoring Of Carcinomas Using Monoclonal Antibodies, Semin. Surg. Oncol., 1 (4): 171-81 (1985); Schlom i in., Potential Clinical Utility Of Monoclonal Antibodies In The Management Of Human Carcinomas, Important Adv. Oncol., 170-92 (1965); Allum i in., Monoclonal Antibodies In The Diagnosis And Treatment of Malignant Conditions, Surg. Ann., 18:41-64 (1986), 1 Houghton i in., Monoclonal Antibodies: Potential Applications To The Treatment Of Cancer, Semin, Oncol., 13(2): 165-79 (1986)].

Te znane przeciwciała monoklonalne mogą wiązać się z różnorodnymi antygenami towarzyszącymi rakowi włącznie z glikoproteinami, glikolipidami i mucynami (patrz np. Fink i in., Monoclonal Antibodies As Diagnostic Reagents for The Identification And Characterization Of Human Tumor Antigens, Prog. Clin. Pathol., 9:121-33 (1984)]. Na przykład, przeciwciała monoklinalne wiążące się z antygenami glikoproteinowymi na specyficznych typach raków obejmują te opisane w opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 4 737 579 (przeciwciała monoklonalne na nie-drobnokomórkowego raka płuc), opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 4 753 894 (przeciwciała monoklonalne na ludzkiego raka piersi), opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 4 579 827 (przeciwciała monoklonalne na ludzkiego raka żołądkowo-jelitowego) i opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 4 713 352 (przeciwciała monoklonalne na ludzkiego raka nerki). Przeciwciało monoklonalne B72.3, będące jednym z najbardziej badanych przeciwciał, rozpoznaje towarzyszący nowotworowi antygen mucynowy o masie cząsteczkowej wyższej niż 1 000 kd, który jest specyficznie eksprymowany na licznych różnych rakach. Wykazano zatem, że B72.3 reaguje z 84% raków piersi, 94% raków okrężnicy, 100% raków jajnika i 96% nie-drobnokomórkowych raków płuc [patrz Johnston, Applications of Monoclonal Antibodies In Clinical Cytology As Exemplified By Studies With Monoclonal Antibody B72.3 Acta Cytol., l(5):537-56 (1987) i opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 4 612 282 Schloma i in.]. Inne opatentowane przeciwciało monoklonalne, KC-4, [patrz opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 4 708 930], rozpoznaje antygen białkowy o masie cząsteczkowej 400 - 500 kd eksprymowany na licznych rakach, takich jak rak okrężnicy, prostaty, płuc i piersi. Okazało się, że ani przeciwciało B72.3 ani przeciwciało KC-4 nie ulega internalizacji do komórek rakowych z którymi reagują.

Ujawniono przeciwciała monoklonalne reagujące z antygenami glikolipidowymi towarzyszącymi komórkom nowotworowym. Na przykład, Young i in., Production Of Monoclonal Antibodies Specific For Two Distinct Steric Portions Of The Glycolipid Ganglio-N-Triosylceramide (Asialo GM2), Exp. Med., 150: 1008-1019 (1979) ujawniają wytwarzanie dwóch przeciwciał monolonalnych specyficznych wobec asialo GM₂, glikosfingolipidowego antygenu powierzchni komórkowej który, jak ustalono, jest markerem komórek BALB/c V3T3 stansformowanych wirusem mięsaka mysiego Kirstein. Patrz także Kniep i in., Gangliotriaosylceramide (Asialo GH2) A Glysossphingolipid Marker For Celi Lines Derived From Patients With Hadgkin's Disease, J. Immunol., 131(3): 1591-94 (1983) i opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 4 507 391 ( przeciwciało monoklonalne na ludzkiego czerniaka).

Inne przeciwciała monoklonalne reagujące z glikolipidowymi antygenami na komórkach rakowych obejmują te opisane przez Rosena i in., Analysis Of Human Small Cell Lung Cancer Differentiation Antigens Using A Panel Of Rat Monoclonal Antibodies, Cancer Research, 44:2052-61 (1984) (przeciwciała monoklonalne na ludzkiego drobnokomórkowego raka płuc). Varki'ego i in., Antigens Associated With a Human Lung Adenocarcinoma Defined by Monoclonal Antibodies, Cancer Research 44:681-67 (1984); (przeciwciała monoklonalne na ludzkiego gruczolakoraka płuc, żołądka i okrężnicy i czerniaka) i opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 4 579 827 (przeciwciała monoklonalne na ludzkiego gruczolakoraka okrężnicy). Patrz także Hellstrom i in., Antitumor Effects Of L6. An IgG2a Antibody That Reacts With Most Human Carcinomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:7059-63 (1986), którzy opisują przeciwciało monoklonalne L6 rozpoznające węglowodanowy antygen eksprymowany na powierzchni ludzkiego nie-drobnokomórkowego raka płuc, raka piersi i raka okrężnicy.

Dodatkowe przeciwciała monoklonalne przejawiające wysoką, specyficzną reaktywność wobec większości komórek z szerokiego zakresu raków są bardzo potrzebne. Jest tak z powodu

168 711 heterogenności antygenowej wielu raków, które często wymagają, w diagnozie lub terapii, stosowania licznych różnych przeciwciał monoklonalnych na ten sam guz nowotworowy. Istnieje dalsze zapotrzebowanie, zwłaszcza w terapii, na tak zwane przeciwciała internalizowane, tj. przeciwciała łatwo pobierane przez komórki nowotworowe, z którymi się wiążą. Przeciwciała tego typu znajdują zastosowanie w metodach terapeutycznych wykorzystujących koniugaty przeciwciało-lek lub przeciwciało-toksyna, w których przeciwnowotworowy czynnik terapeutyczny związany jest z przeciwciałem w celu dostarczenia do nowotworu, gdzie przeciwciało wiąże się z antygenem towarzyszącym nowotworowi, wobec którego jest ono reaktywne i uwalnia czynnik przeciwnowotworowy do wewnątrz komórek nowotworowych [patrz np. Embleton i in., Antibody Targeting Of Anti-Cancer Agents w: Monoclonal Antibodies For Cancer Detection and Therapy, str. 317-44 (Academic Press, 1985)]. Przeciwciała na antygeny towarzyszące nowotworowi nie są zdolne do internalizacji do komórek nowotworowych, z którymi się wiążą, i na ogół nie są użyteczne do przygotowywania koniugatów z lekami lub toksynami przeciwnowotworowymi, ponieważ mogłoby nie być zdolne do osiągnięcia swojego miejsca działania w komórce. Mogą być konieczne inne podejścia aby można użyć w terapii takie przeciwciała.

Znanych jest kilka mogących ulegać internalizowaniu przeciwciał reagujących z antygenami limfocytów. W przeciwieństwie, przeciwciała takie są rzadkie kiedy traktuje się masywne nowotwory. Jednym z nielicznych przykładów mogącego ulegać internalizowaniu przeciwciała reagującego z rakami jest przeciwciało ujawnione w Domingo i in., Transferrin Receptor As A Target For Antibody-Drug Conjugates Methods Enzymol. 112:238-47 (1985). Przeciwciało to reaguje z ludzką glikoproteiną będącą receptorem transferyny eksprymowaną na komórkach nowotworowych. Jednakże, ponieważ receptor transferyjny eksprymowany jest także na wielu normalnych tkankach, i często na wysokim poziomie, stosowanie przeciwciała skierowanego przeciwko receptorowi transferyny w koniugacie przeciwciało-lek lub lub przeciwciało-toksyna może wywierać znaczący wpływ toksyczny na normalne komórki. Wykorzystanie tego przeciwciała do specyficznego zabijania lub hamowania komórek nowotworowych jest dlatego sprawą sporną. Innym mogącym ulegać internalizowaniu przeciwciałem jest BR 64.

Odkrycie rekombinacji homologicznej w komórkach ssaków pozwoliło na skierowanie nowych sekwencji do specyficznych loci chromosomalnych. Rekombinacja homologiczna występuje gdy hodowane komórki ssaków integrują egzogenny DNA chromosomalnym w miejscu chromosomu zawierającym sekwencje homologiczne do sekwencji plazmidowych [Folger i in., Mol. Cell. Biol. 2: 1372-1387 (1982); Folger i in., Symp. Quant. Biol. 49: 123-138 (1984): Kucherlapati i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3153-3157 (1984); Lin i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82; 1391-1395 (1985); de Saint Vincent i in., Proc. Natl. Acad. Aci. USA 80:2002-2006 (1983); Shaul i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3781 -3784 (1985)]. Możliwość rekombinacji homologicznej w komórkach pozwala modyfikację genów endogennych in situ. Znaleziono warunki, w których sekwencje chromosomalne można modyfikować poprzez wprowadzanie do komórki plazmidowego DNA zawierającego odcinek DNA homologiczny do docelowego locus. i odcinek nowych sekwencji z pożądaną modyfikacją [Thomas i in., Cell 44: 419-428 (1986); Smithies i in., Nature 317 : 230-234 (1985); Smith i in., Symp. Quant. Biol. 49: 171-181 (1984)]. Wyniki rekombinacji homologicznej pomiędzy chromosomalnym DNA komórki ssaka i egzogennym DNA plazmidowym może być integracja plazmidu lub zastąpienie pewnych sekwencji homologicznymi sekwencjami plazmidowymi. Wynikiem tego może być umieszczenie pożądanej nowej sekwencji w endogennym locus docelowym.

Sposób rekombinacji homologicznej oceniano przy użyciu genów umożliwiających selekcję dominantów, takich jak NEO lub HPRT dla kilku typów komórek [Song i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 6820-6824 (1987); Rubinitz i Subramani. Mol. Celi Biol. 6: 1608-1614 (1986); i Liskay, Celi 35: 157-164 (1983)].

Najbardziej bezpośrednią drogą klinicznego stosowania przeciwnowotworowych przeciwciał monoklonalnych jest podawanie ich w formie niezmodyfikowanej, przy użyciu przeciwciał monoklonalnych przejawiających aktywność przeciwnowotworową in vitro lub w modelach zwierzęcych. Wydaje się. że większość przeciwciał monoklonalnych na antygeny nowotworowe nie posiada żadnej aktywności przeciwnowotworowej, lecz znane są pewne przeciwciała mono168 711 klonalne, które pośredniczą w zależnej od dopełniacza cytotoksyczności (CDC), tj. zabijające ludzkie komórki nowotworowe w obecności ludzkiej surowicy jako źródło dopełniacza [patrz np. Hellstrom i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 1499-1502 (1985)], lub zależnej od przeciwciała cytotoksyczności komórkowej (ADCC) wraz z komórkami efektorowymi, takimi jak ludzkie komórki Nk lub makrofagi. W celu wykrycia aktywności ADCC lub CDC testuje się zdolność przeciwciał monoklonalnych do lizowania hodowanych, znakowanych Cr nowotworowych komórek docelowych przez 4-godzinny okres inkubacji.

Komórki docelowe znakuje się ⁵¹Cr i następnie eksponuje przez 4 godziny na połączenie komórek efektorowych (w formie limfocytów ludzkich oczyszczonych przez zastosowanie podłoża rozdzielającego limfocyty) i przeciwciała, które dodaje się w stężeniach pomiędzy 0,1 gg/ml a 10 gg/ml. Jako dowód lizy komórek nowotworowych (cytotoksyczności) mierzy się uwalnianie ⁵¹Cr z komórek docelowych. Kontrole obejmują inkubację samych komórek docelowych, lub z albo limfocytami albo przeciwciałem momoklonalnym oddzielnie. Mierzy się całkowitą ilość ⁵¹Cr, który może zostać uwolniony i oblicza ADCC jako procent zabijania komórek docelowych obserwowany z przeciwciałem monoklonalnym plus komórki efektorowe w porównaniu z inkubowanymi samymi komórkami docelowymi. Procedura dla CDC identyczna jest do procedury stosowanej do wykrywania ADCC z tym wyjątkiem, że w miejsce komórek efektorowych dodaje się surowicę ludzką jako źródło dopełniacza (rozcieńczoną 1 : 3 do 1 : 6).

Terapeutyczne stosowanie przeciwciał monoklonalnych z aktywnością ADCC lub CDC rozważa się ponieważ często mają one aktywność przeciwnowotworową in vivo. Z drugiej strony, przeciwciała pozbawione in vitro aktywności ADCC i CDC, in vivo, o ile nie są zastosowane jako nośniki czynników przeciwnowotworowych, zazwyczaj są nieskuteczne. Zdolność przeciwciała monoklonalnego do aktywacji dopełniacza gospodarza może być korzystna terapeutycznie nie tylko dlatego że komórki nowotworowe mogą zostać zabite, lecz także dlatego ponieważ może wzrosnąć dopływ krwi do nowotworu, ułatwiając zatem pobieranie leków [patrz Hellstrom i in., Immunological Approaches to Tumor Therapy: Monoclonal Antibodies, Tumor Vaccines, and Anti-Idiotypes, w: Covalently Modified Antigens and Antibodies in Diagnosis and Therapy, Quash and Rodwell, red. Marcel Dekker, str. 15-18 (1989)]. Wśród mysich przeciwciał monoklonalnych, najpowszechniej z ADCC i CDC związane są izotopy IgG2a i IgG3. Przeciwciała posiadające zarówno aktywność ADCC jak i CDC z wysoką specyficznością zabijają tylko komórki nowotworowe z którymi się wiążą i jest nieprawdopodobne aby prowadziły do wpływów toksycznych jeśli zwiążą się niespecyficznie w płucach, wątrobie lub innych organach. Może to zapewnić takim przeciwciałom przewagę nad przeciwciałami znakowanymi radioaktywnie lub pewnymi typami immunokoniugatów.

Bardzo nieliczne przeciwciała same są zdolne do zabijania komórek nowotworowych, to jest w nieobecności komórek efektorowych lub dopełniacza jak w ADCC lub CDC. BR 96 jest takim przeciwciałem, ponieważ może ono samo zabijać komórki przy stężeniu przeciwciała około 10 gg/ml lub wyższym. Przeciwciała takie są szczególnie interesujące ponieważ mogą one interferować z pewnymi kluczowymi zdarzeniami w przeżywaniu komórek nowotworowych.

Jest zatem oczywiste, ze przeciwciało, które przejawia wyższych stopień specyficzności wobec szerokiego zakresu raków, samo posiada aktywność przeciwnowotworową i zdolne jest do łatwego ulegania internalizacji przez komórki nowotworowe, może być bardzo korzystne w terapii nowotworów.

Intemalizowane przeciwciała o wysokiej specyficzności wobec szeregu ludzkich raków a bardziej szczegółowo, nowe przeciwciała oznaczone jako przeciwciała BR 96, są mysim przeciwciałem monoklonalnym wiążącym się z antygenem błony komórkowej, którego obecność stwierdzono na ludzkich komórkach rakowych. Przeciwciała są w wysokim stopniu reaktywne wobec komórek rakowych, takich jak otrzymane z raka piersi płuc, okrężnicy i jajnika, nie przejawiając, lub przejawiając ograniczoną reaktywność z normalnymi komórkami ludzkimi lub innymi typami nowotworów, takimi jak chłoniaki lub mięsaki. Ponadto, przeciwciała te intemalizowane są przez komórki rakowe, z którymi się wiążą i same zdolne są do zabijania komórek nowotworowych, tj. w formie nieskoniugowanej i bez komórek efektorowych lub dopełniacza. Przeciwciała BR 96 są zatem szczególnie użyteczne w zastosowaniach terapeuty6

168 711 cznych, na przykład do reagowania z komórkami nowotworowymi, i w koniugatach jako specyficzny wobec celu nośnik różnych czynników posiadających wpływy przeciwnowotworowe, włącznie z lekami chemioterapeutycznymi, toksynami, modulatorami odpowiedzi immunologicznej, enzymami i izotopami radioaktywnymi. Przeciwciała można zatem stosować jako składnik różnych immunokoniugatów, włącznie z koniugatami przeciwciało-lek i przeciwciało-toksyna, gdzie szczegółowo korzystna jest internalizacja koniugatu, a po znakowaniu izotopem radioaktywnym jego dostarczenie do nowotworu. Ponadto przeciwciała użyteczne są w przeznaczonych do wykrywania raka metodach diagnostycznych in vitro in vivo.

Figura 1 jest wykresem słupkowym wyników testowania reaktywności BR 96 wobec glikolipidów, jak opisano w przykładzie II.

Figura 2 jest wykresem słupkowym wyników testowania reaktywności BR 96 wobec neoglikoprotein, jak opisano w przykładzie II.

Figura 3 jest wykresem przedstawiającym wpływy przeciwnowotworowe niezmodyfikowanego BR 96 na linię komórek nowotworowych H2987, jak opisano w przykładzie III.

Figura 4 jest wykresem słupkowym ilustrującym nieobecności nowotworów przy końcu leczenia zwierząt traktowanych BR 96, jak opisano w przykładzie III.

Figura 5 przedstawia wpływ dawek przeciwciała BR 96 po implantacji komórek H2707, określane poprzez objętość nowotworu, jak opisano w przykładzie III.

Przeciwciała BR 96 stosować można do izolowania i charakteryzowania antygenów z którymi się one wiążą. A zatem, przeciwciała BR 96 można stosować jako sondy do identyfikacji i charakteryzowania rozpoznawanych epitopów i do dalszego określania antygenów z którymi one reagują [patrz np. Nudelman i in., Characterization of Human Melanoma-Associated Ganglioside Antigen Defined By A Monoclonal Antibody, 4.2, J. Biol. Chem. 257 (1) 12752-56 (1982) iHakomori. Tumor Associated Carbohydrate Antigens, Ann. Rev. Immunol., 2:103-26 (1984)].

Wyniki wstępnych poszukiwań epitopów przeprowadzonych z przeciwciałem monoklonalnym wskazywały, że antygen na komórkach rakowych, z którym one się wiążą jest fukozylowaną odmianą antygenu Lewis Y. Antygen Lewis Y (Le^y) został opisany przez Abe i in., J. Biol. Chem. 258: 8934 (1983): Lloyd i in., Immunogenetics 17: 537 (1983); Brown i in., Biosci. Rep. 3: 163 (1983); Hellstrom i in., Cancer Res. 46: 3917 (1986). Fukozylowany antygen Lewis Y został opisany przez Abe i in., Caner Res. 46: 2639-2644 (1986).

Przeciwciało monoklonalne można wytwarzać stosując dobrze znane techniki z wykorzystaniem hybrydom po raz pierwszy wprowadzone przez Kohlera i Milsteina [patrz, Kohler i Milstein, Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Pre-Defined Specificity, Nature, 256: 495-97 (1975). Patrz także Brown i in., Structural Characterisation Of Humon Melanoma-Associated Antigen p97 with Monoclonal Antibodies J. Immunol., 127 (2): 539-46 (1981); Brown i in., Protein Antigens Of Normal And Malignant Human Cells Identified By Immunoprecipitation with Monoclonal Antibodies, J. Biol. Chem. 255: 4980-83 (1980); Yeh i in., Cell Surface Antigens Of Human Identified By Monoclonal Antibody, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76 (6): 297-31 (1979); i Yeh i in., A Cell-Surface Antigen Which is Present In the Gangliside Fraction And Shared By Human Melanoma, Int. J. Cancer. 29: 269-75 (1982)].

Techniki te obejmują iniekcję immunogenu (np. komórek lub ekstraktów komórkowych niosących antygen lub oczyszczonego antygenu) zwierzęciu (np. myszy), tak aby u zwierzęcia tego wywołać pożądaną odpowiedź immunologiczną (tj. przeciwciała). Po odpowiednim czasie otrzymuje się ze zwierzęcia limfocyty wytwarzające przeciwciała, albo ze śledziony, węzłów chłonnych albo z krwi obwodowej. Korzystnie, limfocyty otrzymuje się ze śledziony. Limfocyty pochodzące ze śledziony poddaje się następnie fuzji z linią komórek szpiczaka, zazwyczaj w obecności czynnika indukującego fuzję, takiego jak glikol polietylenowy (PEG). Zgodnie ze standardowymi technikami, do fuzji zostosować można każdą z licznych linii komórek szpiczaka, na przykład linie szpiczaka P3-NS1/1Ag4-1, P3-x63-Ag8 lub Sp2/0 Ag 14. Linie te dostępne są w American Type Culture Collection, (ATCC) w Rockville, Maryland.

Otrzymane komórki, obejmujące pożądane hybrydomy, hoduje się następnie na podłożu selekcyjnym, takim jak podłoże HAT, w którym niesfuzjowane rodzicielskie komórki szpiczaka lub ewentualnie limfocyty zamierają. Przeżywają tylko komórki hybrydomy, i można je hodo168 711 wać w warunkach ograniczających dla otrzymania wyizolownych klonów. Supernatanty hybrydom testuje się na obecność przeciwciał o pożądanej specyficzności np. technikami oznaczeń immunologicznych stosując antygen, który został użyty do immunizacji. Klony dodatnie można następnie subklonować w warunkach ograniczających i izolować można wytwarzane przeciwciała monoklonalne. Hybrydomy wytworzone według tych metod można namnażać in vitro i in vivo (w płynie puchlinowym z jamy otrzewnowej) stosując znane techniki [patrz Fink i in., supra str. 123, Fig. 6-11]. Powszechnie stosowane metody oczyszczania przeciwciał monoklonalnych obejmują wytwarzanie siarczanem amonu, chromatografię jonowymienną i chromatografię powinowactwa [patrz np. Zola i in., Techniques For The Production And Charakterization Of Monoclonal Hybridoma Antibodies, w: Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques And Applications, Hurell (red.), str. 51-52 (CRC Press 1982)].

Przeciwciało monoklonalne oznaczone BR 96, wytworzono poprzez opisane tu poniżej techniki z wykorzystaniem hybrydom stosując jako immunogen linię komórkową raka piersi 3396. Hybrydomę BR 96, przygotowaną jak opisano tu poniżej i wytwarzająca przeciwciało BR 96, zdeponowano 22 lutego 1989 w ATCC, gdzie jest w następujący sposób identyfikowana: BR 96 ArCC Nr identyfikacyjny: HB 10036.

Przeciwciało BR 96 należy do podklasy IgG3. Przeciwciało przejawia wysoką specyficzność wobec komórek raka różnych organów, na przykład nowotworów piersi, płuc, okrężnicy i jajnika, jak również hodowanych linii komórkowych założonych z różnych raków piersi, płuc i okrężnicy. Ponadto przeciwciało BR 96 nie przejawia wiązania z innymi typami komórek nowotworowych, takich jak linie komórkowe komórek T chłoniaka, CEM i MOLT-4, linia komórkowa komórek B chłoniaka P3HR-1 i linie komórkowe czerniaka. Przeciwciało BR 96 może być internalizowane przez antygenododatnie komórki nowotworowe, jest toksyczne wobec antygenododatnich komórek nowotworowych, pośredniczy w aktywności ADCC i CDC i, co zaskakujące, samo, tj. w formie niezmodyfikowanej, jest cytotoksyczne. Przeciwciała BR 96 wydają się rozpoznawać antygen Le^y.

Poprzez trawienie pepsyną oczyszczonego BR 96, można wytwarzać fragmenty F(ab')2 przeciwciałamonoklonalnego BR 96 [Nisonoff i in., The Antibody Molecule, Academic Press, New York (1975)]. Wykazano, że wiązanie fragmentów F(ab')2 z komórkami nowotworowymi (3396) i MCF7 porównywalne jest z wiązaniem całego przeciwciała monoklonalnego BR 96.

Używany tutaj termin przeciwciało BR96 obejmuje całe, nianaruszone przeciwciała poliklonalne monoklonalne, takie jak mysie przeciwciało monoklonalne wytwarzane przez hybrydomę ATCC Nr HB 10036. Opisane powyżej przeciwciało BR 96 obejmuje wszystkie jego fragmenty zawierające aktywny region wiązania antygenu przeciwciała, takie jak fragmenty Fab, F(ab')2 i Fv, stosując dobrze znane techniki [patrz np. Rouseaux i in., Optimal Conditions For The Preparation of Proteolytic Fragments From Monoclonal IgG of Different TRat IgG Subclasses w: Methods Enzymol., 121: 663-69 (Academic Press 1986)].

Ponadto stwierdzono, że przeciwciało BR 96 nie przejawia żadnego immunohistologicznie wykrywalnego wiązania z normalnymi tkankami ludzkimi z głównych organów, takich jak nerki, śledziona, wątroba, skóra, płuca, piersi, okrężnica, mózg, tarczyca, serce, węzły chłonne lub jajniki. Przeciwciało nie wiąże się także z leukocytami krwi obwodowej. Przeciwciało BR 96 przejawia ograniczone wiązanie z pewnymi komórkami w migdałkach i jądrami, i wiąże się z komórkami gronistymi w trzustce oraz z komórkami nabłonkowymi w żołądku i przełyku. A zatem, przeciwciało BR 96 przewyższa najbardziej znane przeciwciała przeciwnowotworowe wysokim stopniem specyficzności wobec komórek nowotworowych w porównaniu z komórkami normalnymi [patrz np. Hellstrom i in., Immunological Approaches To Tumor Therapy: Monoclonal Antibodies, Tumor Vaccines, And Antibodies In Diagnosis And Therapy, Quash/Rodwell (red.), str. 1-39 (Mercell Dekker, Inc., 1989) i Bagshawe, Tumor Markers - Where Do We Go From Here, Br. J. Cancer, 48: 167-75 (1983)].

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania rekombinantu nowego przeciwciała obejmującego region wiązania antygenu mysiego przeciwciała monoklonalnego BR 96 wykazującego tę samą specyficzność wiązania co przeciwciało BR 96, polegający na tym, że przyłącza się region wiążący antygen pochodzący z przeciwciała BR 96 z przynajmniej częścią drugiego białka.

168 711

Korzystnie jako drugie białko stosuje się białko ludzkie, przy czym jako drugie białko stosuje się białko wykazujące aktywność przeciwnowotworową i region wiążący antygen przeciwciała BR 96 łączy się z co najmniej funkcjonalnie czynną częścią tego drugiego białka. Jako drugie białko można stosować białko wybrane z grupy obejmującej enzymy, limfokiny, onkostatyny i toksyny, korzystnie stosuje się region wiążący antygen BR 96 rozpoznający część epitopu zawierającego fukozę α1-3 wariantu antygenu Le^y.

Przeciwciała te posiadają taką samą specyficzność antygenową co przeciwciała BR 96. lecz różniące się pochodzeniem gatunkowym, izotypem, powinowactwem wiązania lub funkcjami biologicznymi (np. cytotoksycznością). Można na przykład skonstruować klasy, izotypy lub inne warianty przeciwciał otrzymywanych sposobem według wynalazku posiadające region wiązania antygenu przeciwciała BR 96 stosując znane techniki rekombinacyjne zmiany klasy i tworzenia fuzji [patrz np. Thammana i in., .Immunoglobulin Heavy Chain Class Switch From IgM to IgG In a Hibridoma, Eur. J. Immunol., 13· 614 (1983); Spira i in., The Identification Of Monoclonal Class Switch Variants By Subselection And ELISA Assay, J. Immunol. Meth. 74: 307-15 (1984); Neuberger i in., Recombinant Antibodies Possessing Novel Effector Functions, Nature 312: 604-608 (1984); i Oi i in., Chimeric Antibodies, Biotechniques, 4 (3): 214-21 (1986)].

Rekombinant przeciwciała BR 96 użyteczny jest także do zastosowań diagnostycznych, zarówno in vitro jak i in vivo, do wykrywania ludzkich raków posiadających antygen wobec którego przeciwciała są specyficzne. Metody diagnostyczne in vitro obejmują immunohistologiczne wykrywanie antygenów komórek nowotworowych (np. na tkance ludzkiej, komórkach lub wyciętych próbkach nowotworów) lub serologiczne wykrywanie antygenów towarzyszących nowotworom (np. w próbkach krwi lub innych płynów biologicznych).

Techniki immunohistochemiczne obejmują barwienie próbek biologicznych, takich jak próbki tkanki, rekombinantem przeciwciała Br 96 a następnie wykrywanie na próbce obecności przeciwciała skompleksowanego z jego antygenem. Tworzenie takich kompleksów przeciwciało-antygen z próbką wskazuje na obecność w tkance komórek rakowych. Wykrywanie przeciwciała na próbce przeprowadzać można stosując znane techniki, takie jak techniki immunoenzymatyczne, np. technikę awidyna-biotyna (ABC), lub techniki immunoflourescencyjne [patrz np. Ciocca i in., Immunohistochemical Techniques Using Monoclonal Antibodies, Meth. Enzymol. 121: 562-79 (1986); Hellstrom i in., Monoclonal Mouse Antibodies Raised Against Human Lung Carcinoma, Cancer Research, 46: 3917-23 (1986); i Kimball (red.), Introduction To Immunology (wyd. II), str. 113-117 (Macmillan Pub. Co. (1986)].

Serologiczne techniki diagnostyczne obejmują wykrywanie i określanie ilościowe antygenów towarzyszących nowotworom, które uległy sekrecji lub zostały zrzucone do surowicy lub innych płynów biologicznych pacjentów cierpiących na raka. Antygeny takie można wykryć w płynach ciała stosując znane techniki, takie jak oznaczenia radioimmunologiczne (RIA) lub ELISA, w których przeciwciało reagujące ze zrzuconym antygenem stosowane jest do wykrywania obecności antygenu w próbce płynu [patrz np. Uotila i in., Two-Site Sandwich ELISA With Monoclonal Antibodies To Human AFP, J. Immunol. Methods, 42: 11 (1981) i Allum i in., supra na str. 48,51]. Oznaczeń tych, stosując ujawnione przeciwciała BR 96, można dlatego użyć do wykrywania w płynach biologicznych glikolipidowych antygenów reagujących z przeciwciałami BR 96, a zatem wykrywania ludzkiego raka u pacjentów. A zatem jak wynika z powyższych danych, przeciwciała BR 96 stosować można w większości oznaczeń obejmujących reakcje antygen-przeciwciało. Oznaczenia te obejmują, ale nie są ograniczone do standardowych technik RIA, zarówno na płynnej jak i stałej fazie, jak również oznaczeń ELISA, technik immunofluorescencyjnych i innych oznaczeń immunocytochemicznych [patrz np. Sikora i in. (red.), Monoclonal Antibodies, str. 32-52 (Blackwell Scientific Publications 1984)].

Zestawy diagnostyczne jakie można wytwarzać do oznaczeń opisanych powyżej, zawierają przeciwciało monoklonalne BR 96, jego fragmenty, fuzję białek lub koniugat zawierający czynnik specyficznie wiążący przeciwciało i znacznik zdolny do wytwarzania wykrywalnego sygnału. Odczynniki mogą także zawierać czynniki pomocnicze, takie jak czynniki buforujące i czynniki stabilizujące białka (np. polisacharydy). Zestawy diagnostyczne mogą dalej zawierać, tam gdzie jest to konieczne, inne składniki układu wywoływania sygnału włącznie z czynnikami

168 711 obniżającymi intergerencję z tłem, odczynnikami kontrolnymi lub aparatem bądź pojemnikiem do przeprowadzania testu.

Właściwości przeciwciała BR 96 oraz jego rekombinantów: a) bardzo wysoka specyficzność wobec komórek nowotworowych; b) internalizacja; c) toksyczność wobec antygenododatnich komórek nowotworowych samego przeciwciała, tj. w formie niezmodyfikowanej, jeśli używane jest w odpowiednich stężeniach; i d) aktywność CDC i ADCC, sugerują liczne zastosowania terapeutyczne in vivo. Przeciwciała można używać w połączeniu z odpowiednim czynnikiem terapeutycznym do traktowania raka ludzkiego. Na przykład, przeciwciało można użyć w połączeniu ze standardowymi lub konwencjonalnymi metodami leczenia, takimi jak chemioterapia, naświetlania, lub można skoniugować bądź związać z lekiem terapeutycznym lub toksyczną, jak również z limfokiną lub czynnikiem hamującym wzrost nowotworów w celu dostarczenia czynnika terapeutycznego do miejsca występowania raka. Techniki koniugowania takich czynników terapeutycznych z przeciwciałami są dobrze znane [patrz np. Amon i in., Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy, w: Monocklonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld i in. (red.), str. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom i in., Antibodies For Drug Delivery, w: Controlled Drugi Delivery (2 wyd.), Robinson i in. (red.), str. 623-53 (Mercel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review, w: Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, Pinchera i in. (red.), str. 475-506 (1985); i Thorpe i in., The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates, Immunol. Rev., 62:11958 (1982)]. Przeciwciało BR 96 jest szczególnie odpowiednie do stosowania w koniugacie terapeutycznym ponieważ jest ono łatwo internalizowane w komórkach rakowych z którymi się wiąże i może zatem dostarczać czynnik terapeutyczny do wewnątrzkomórkowych miejsc działania.

Alternatywnie, przeciwciało BR 96 można sprzęgać z czynnikami o wysokoenergetycznym promieniowaniu, np. izotopem promieniotwórczym takim jak ¹³¹I; który, po umieszczeniu przy miejscu nowotworu, powoduje zabijanie kilku warstw komórek [patrz np. Order, Analysis, Resuls, And Future Perspective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy, w: Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin i in. (red.), str. 303-16 (Academic Press (1985)].

Jeszcze inne zastosowania terapeutyczne przeciwciała BR 96 oraz jego rekombinantu obejmują koniugację lub związanie, np. poprzez techniki rekombinacji DNA, z enzymem zdolnym do przekształcania proleksu w lek cytotoksyczny i zastosowanie tego koniugatu przeciw-ciało-enzym w kombinacji z prolekiem do przekształcania proleksu w czynnik cytotoksyczny w miejscu występowania nowotworu [patrz np. Senter i in., Anti-Tumor Effects Of Antibody-ałkaline Phosphatase, Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 85: 4842-46 (1988); Enhancement of the in vitro and in vivo Antitumor Activities of Phosphorylated Mitomycin C and Etopside Derivatives by Monoclonal Antibody-Alkaline Phosphatase Conjugates, Cancer Research 49: 5789-5792 (1989); i Senter, Activation of Prodrugs by Antibody-Enzyme Conjugates: A New Approach to Cancer Therapy, FASEB J. 4:188-193 (1990)]. Jeszcze inne zastosowanie terapeutyczne przeciwciała BR 96 obejmuje zastosowanie w obecności dopełniacza lub jako część koniugatu przeciwciało-lek lub przeciwciało-toksyna, do usuwania komórek nowotworowych ze szpiku kostnego pacjentów z rakiem. Zgodnie z tym podejściem, autologiczny szpik kostny można oczyścić ex vivo przez traktowanie przeciwciałem i szpik ponownie wszczepić pacjentowi [patrz np. Ramsay i in., Bone Marrow Purging Using Monoclonal Antibodies, J. Clin. Immunol., 8(2):81-88 (1988)].

W celach terapeutycznych stosować można rekombinowane przeciwciała BR 96 otrzymane sposobem według wynalazku. Na przykład fuzję białka zawierające przynajmniej region wiążący antygen przeciwciała połączony z co najmniej aktywną funkcjonalnie częścią drugiego białka posiadającego aktywność przeciwnowotworową, np. limfokiną lub onkostatyną, zastosować można do leczenia ludzkiego raka in vivo.

Kompozycje farmaceutyczne do stosowania w leczeniu ludzkich raków zawierają skuteczną farmaceutycznie ilość rekombinantu przeciwciała BR 96 i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

168 711

Kompozycje przeciwciał można podawać używając konwencjonalnych sposobów podawania obejmujących, lecz nie ograniczonych do dożylnego, dootrzewnowego, doustnego, śródchłonnego lub bezpośrednie podawanie do nowotworu. Korzystnie jest podawanie dożylne.

Kompozycje przeciwciał mogą mieć różne formy dawkowania obejmujące, lecz nie ograniczone do ciekłych roztworów lub zawiesin, tabletek, pigułek, proszków, czopków polimerycznych, mikrokapsułek lub mikrovehiculum, liposomów i roztworów iniekcyjnych lub infuzyjnych. Korzystna forma zależy od sposobu podawania i zastosowania terapeutycznego.

Kompozycje przeciwciał mogą zawierać także konwencjonalne, farmaceutycznie dopuszczalne nośniki i znane adjuwanty, takie jak albumina surowicy ludzkiej, wymieniacze jonowe, tlenek glinu, lecytyna, substancje buforowe takie jak fosforany, glicyna, kwas sorbowy, sorbinian potasu, i sole lub elektrolity, takie jak siarczan protaminy.

Najbardziej skuteczny sposób podawania i dawkowania dla kompozycji zależy od przebiegu i zaawansowania choroby, zdrowia pacjenta i odpowiedzi na leczenie i orzeczenia leczącego lekarza. Przeto, dawkowanie kompozycji powinno być określane dla pojedynczego pacjenta. Niemniej jednak, dawka skuteczna kompozycji przeciwciał może pozostawać w zakresie od około 1 do około 2000 mg/m².

W celu umożliwienia pełniejszego zrozumienia opisanego tu wynalazku, poniżej przedstawia się następujące przykłady. '

Przykład I. Wytwarzanie monoklonalnego przeciwciała BR 96.

Monoklonalne przeciwciało BR 96 wytwarza się stosując technikę fuzji hybrydonowej, opisaną wcześniej przez M. Yeh. et al., Proc. Natl. Sci. USA (1979) supra i Yeh et al., Int. J. Cancer (1982) supra. W skrócie, trzymiesięczne myszy BALB/c uodporniano, stosując jako immunogen eksploatowane komórki hodowli gruczolakorakapiersi ludzkich, oznaczanego 3396 lub M 3396 (z gruczolakoraka piersi pochodzącego od pacjenta, hodowane w hodowli Oncogen, Leattle, Washington, St. Zjedn. Ameryki). Mysz otrzymała iniekcje przy pięciu okazjach, przy pierwszych czterech okazjach, mysz otrzymywała jedną iniekcją dootrzewnowo i 1 iniekcję podskórną w czterech miejscach na ciele myszy. Przy piątej okazji mysz otrzymywała tylko jedną iniekcję dootrzewnowo. Łączenie przy każdej okazji wstrzykiwano około 10⁷ komórek. W trzy dni po ostatnim szczepieniu usuwano myszy śledzionę i komórki śledziony zawieszano w pożywce hodowlanej RPMi. Następnie komórki śledziony poddawano fuzji z komórkami szpiczaka myszy P3-X63-Ag 8.653 w obecności glikolu polietylenowego (PRG) i pozwalano na wzrost komórek we wgłębieniach płytki do mikromiareczkowania w selektywnej pożywce MAT, jak opisano w publikacji Yeh et al., supra [patrz, Kohler and Milstein, Nature, 256: 495 - 97 (1975) i Eur. J. Immunol., 6:5511 - 19 (1976)]. Mieszaninę zaszczepiono tak, aby utworzyć hodowle o małej gęstości, pochodzące od pojedynczych komórek lub klonów, powstałych w wyniku fuzji.

Supernatanty z tych hodowli hydrodomowych poddano następnie skriningowi, aby określić bezpośrednio aktywność wiązania z linią komórkową raka piersi, 3396, i z linią komórkową fibroblastów uzyskaną na drodze biopsji skóry za pomocą próby ELISA, podobnej do opisanej w publikacji Donillard et al., EnzymeLinked Immunosorbent Assay For Screening Monoclonal Antibody Produktion Using Enzyme - Labeled Second Antibody, Meth. Enzymol., 92: 168 74(1983).

Zgodnie z tą próbą, antygen (z którym poddano skriningowi przeciwciało dla określenia jego reaktywności) unieruchomiono na płytkach do mikromiareczkowania i następnie inkubowanoz supematantami hybrydomowymi. Jeśli supernatant zawierał pożądane przeciwciało, było one wiązane z unieruchomionym antygenem i wykrywane przez dodanie konjugatu antyimmunoglobuliny z enzymem i podłoża przeciwciała enzymu, co prowadziło do dających się zmierzyć zmian gęstości optycznej. Podczas prowadzonych badań, komórki raka piersi lub kontrolne komórki fibroblastów umieszczono na płytce do hodowli tkankowej z 96 wgłębieniami (Costar Cambrige, MA) i inkubowano przez noc w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37°C (5% CO2). Komórki doprowadzono następnie do końcowego stężenia we wgłębieniu wynoszącego 0,5% za pomocą 100 μl świeżo przyrządzonego 1% aldehydu glutenowego i inkubowano w ciągu 15 minut w temperaturze pokojowej, po czym przemyto trzykrotnie 1 raz roztworem solanki buforowanej fosforanem (PBS). Następnie komórki blokowano w ciągu 30 minut 5%

168 711 białkiem surowicy bydlęcej (BSA) w PBS i ponownie przemyto trzykrotnie PBS. Następnie dodano supernatanty z hodowli hybrydomowych w ilości 100 gg/wgłębienie, zawarłośc wgłębień inkubowano w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej i komórki przemyto trzykrotnie PBS. Następnie dodano kozią antymysią peroksydazę chrzanową (Zymed, CA) rozcieńczoną w 0,1% BSA i PBS do stężenia 100 ).iwwj^^^ę:bie^ieie.

Mieszaninę reakcyjną inkubowano albo w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej albo w ciągu 30 minut w temperaturze 37°C, po czym komórki przemyto trzykrotnie PBS. Następnie dodano o-fenylceodwuamieę (OPD) w ilości 100 gl/wgłębienie i płytki inkubowano w ciemności w temperaturze pokojowej w ciągu 5-45 minut. Przeciwciała związane z komórkami wykrywane poprzez zmianę barwy we wgłębieniach, występującą w ciągu 10 -10 minut. Reakcję przerwano dodatkiem 100 gl H2SOwwgłęeiee ie i dokonano odczu tu abrbrbcncji na automatyeznym urządzeniu odczytującym Dynatech (Aleksadria VA/Microelisa przy 490 nm.).

Należy zauważyć, że próbę tę można przeprowadzić stosując nienaruszone komórki lub oczyszczone rozpuszczalne ekstrakty antygenowe lub komórkowe w postaci unieruchomionego antygenu. Gdy jako antygen stosowano rozpuszczalny antygen lub ekstrakty komórkowe, antygen umieszczano początkowo na płytkach w ilości 50 gl/wgłębienie w PBS i płytki przed rozpoczęciem próby inkubowano przez noc w temperaturze pokojowej. Gdy jako antygen stosuje się nienaruszone komórki, możnaje stosować świeże lub po unieruchomieniu. W każdym przypadku komórki umieszczano najpierw na płytkach w ilości 10⁴ komórek w 50 gl/wgłębienie w pożywce hodowlanej i inkubowano przez noc w inkubatorze w temperaturze 37°C (5% CO2).

W ten sposób wyselekcjonowano hybrydomy wytwarzające przeciwciało wiązane przez linię komórkową raka piersi a nie przez komórki ludzkich fibroblastów i badano je w urządzeniu do sortowania komórek FACS na leukocytach krwi obwodowej. Hybrydomy ujemne wobec PBLS klonowano, ekspandowano in vitro i badano dalej pod kątem specyficzności przeciwciał. Hybrydomy wytwarzające przeciwciała reagujące z rakiem piersi ludzkiej ponownie klonowano, ekspandowano i wstrzykiwano pierwotnie uczulonym trzymiesięcznym myszom BALB/c, gdzie wzrastały powodując wodobrzusze.

Postępując w opisany wyżej sposób, uzyskano hybrydomy linii komórkowej BR 96, klonowane i wstrzykiwane myszom w celu rozwinięcia się nowotworu powodujące wodobrzusze. Jak ujawniono poprzednio, hybrydomy BR 96 zdeponowano w kolekcji aTCc. Monokloealne przeciwciała BR 96 oczyszczano z płynów wodobrzusza za pomocą chromatografii powinowactwa na unieruchomionym rekombinantowym białku A (Repligen, Cambridge, Ma). Sklarowane płyny rozcieńczono równą objętością buforu wiążącego (1m fosforan potasowy, pH 8) i nanoszono na kolumnę z białkiem A, poprzednio zrównoważoną buforem wiążącym. Kolumnę obficie przemyto buforem wiążącym i następnie eluowano przeciwciało 50 milimolowym roztworem kwasu fosforowego, pH 3. Oczyszczoną frakcję zawierającą przeciwciało zobojętniono 1m roztworem Tris, pH 9, i następnie dializowano wobec roztworu soli buforowanego fosforanem. Oczyszczone BR 96 odsączono wreszcie w warunkach jałowości i przechowywano w stanie schłodzonym lub zamrożonym.

Przykład II. Oznaczenie reaktywności BR 96 wobec glikolipidów i glikopi^otein.

Przeciwciało BR 96 bada się pod względem reaktywności wobec rozmaitych unieruchomionych antygenów glikolipidowych o znanej strukturze węglowodanowej i syntetycznych wlikoproteie (tak zwanych neoglikoprotein) przy zastosowaniu ELISA, przy czym glikolipidów i glikoprotein oraz przeciwciała używa się w nadmiarze [Dr John Magnatii, Bioca^, Gaithersburg, MD; Lloyd i in., Immunogenetics, 17, 537 - 541 (1983)]. Glikolipidy suszy się z metanolu w mikrolitrowych dołkach przy 10 ng/dołek. Syntetycznymi glikoproteinami powleka się powierzchnie dołków przez inkubację glikoproteiny rozcieńczonej do 200 ng/dołek w roztworze soli buforowanym fosforanami, pH 7,4. Oczyszczone przeciwciało BR 96 badane w stężeniu 10 gg/ml w 0,01 M Tris-HCl, pH 7,4 zawierającym 1% BSA i 1% bydlęcej albuminy surowiczej, a przeciwciała z płynu puchlinowego w rozcieńczeniu 1: 100 w tym samym buforze. W tych wysokich stężeniach łatwo jest wykryć większość wiążących oddziaływań. Wartości aęsoręaecji oblicza się jako średnią z dwóch powtórkowych dołków. Wyniki analiz zostały przedstawione na figurach 1 i 2 i ujawniają one, że BR 96 reaguje z antygenem LcC

168 711

Stwierdzenia te wskazują na to, że BR 96 może wiążąc się z wariantową postacią antygenu Lewis Y/Fuc a 1 -2Gal β 1 -4/ Fuca 2-3/GlcNAc i że fukoza a 1 -3 przyłączona do GlcNAc tworzy część epitopu pokrewnego Le^y rozpoznawanego przez BR 96. Wysoka swoistość BR 96 wobec nowotworu i zdolność intenalizowania się (nie opisana iprzednio dla przeciwciał monoklonalnych reaktywnych z antygenami Le^y) sugeruje, że przeciwciało rozpoznaje epitop złożony, którego część obejmuje antygen Le^y.

Przykład III. Ocena działania przeciwciał BR 96 in vivo.

Siłę działania terapeutycznego niemodyfikowanego przeciwciała BR 96 w leczeniu nowotworów zbadano w serii doświadczeń z użyciem ksenograftów ludzkiego nowotworu u bezwłosej myszy. Zbadano ponadto pewne parametry, które mogłyby mieć wpływ na skuteczność działania BR 96 jako środka przeciwnowotworowego. Do tych parametrów należą poziom ekspresji antygenu w linii komórek docelowego nowotworu, okres czasu pomiędzy implantacją nowotworu i zapoczątkowaniem terapii oraz wpływ dawki.

We wszystkich doświadczeniach in vivo określonej liczbie myszy Balb/c nu/nu (Harlan Spraque Dawley, Indianapolis, Indiana, St. Zjedn. Ameryki) wszczepiono albo komórki z linii komórek ludzkiego raka gruczołowego płuc H2987, albo z linii nowotworu H2707. Komórki z tych linii nowotworowych, wyhodowane in vitro, zebrano, przemyto i wytworzono z nich ponownie suspensję w BPS, po czym każdej z myszy podano podskórnie 10 milionów komórek w boczną tylną część ciała. Myszy podzielono losowo na mniejsze grupy liczące po 8 - 10 zwierząt.

W celu zwiększenia szansy zaobserwowania wszelkich efektów działania BR 96, wziąwszy pod uwagę fakt, iż przeciwciało musi zlokalizować miejsce wszczepienia nowotworu, aby jakie kolwiek oddziaływanie rzeczywiście zaszło, terapię rozpoczęto w 24 godziny po wszczepieniu nowotworu, w dniu 2. Zarówno BR96, jak i kontrolny MAbs podawano w tej samej dawce i według tego samego planu, jakkolwiek w niektórych przypadkach następowały zmiany momentu zapoczątkowania terapii. Dawkę leczniczą w 0,2 ml PBs podawano dożylnie do żyły ogonowej myszy. Normalny plan obejmował podawanie dawki raz na trzy dni, ogółem 5 dawek (Q3Dx5). W dniu 19 i 21 od wszczepienia nowotworu H2987 w początkowym doświadczeniu przeprowadzono dodatkowe dwa wstrzyknięcia.

Działanie przeciwciała BR 96 na nowotwory 2987 i 2707.

Objętość nowotworów u każdego zwierzęcia określano raz w tygodniu, przy czym pomiary rozpoczynano zazwyczaj w ósmym dniu po wszczepieniu. Objętość nowotworu obliczano na podstawie pomiarów długości i szerokości pionowej, według wzoru:

objętość nowotworu = największa długość x (pionowa szerokość²(2)

Następnie obliczano wartości średnie dla grup i sporządzono wykresy w funkcji czasu od wszczepienia.

W początkowym doświadczeniu przedstawionym na fig. 3 w wyniku działania BR 96 uzyskano bardzo znaczące efekty pod względem działania przeciw linii komórek H2987. Jako negatywny środek kontrolny stosowano BR 64, które także ulega związaniu przez te komórki i jest przez nie intemalizowane. Nie zaobserwowano żadnego działania lub bardzo słabe działanie w porównaniu z działaniem wobec osobników kontrolnych traktowanych PBS.

W tabeli 1 zestawiono działanie wobec poszczególnych nowotworów pod koniec zabiegów w tym pierwszym doświadczeniu.

Tabela 1

Wpływ działania niemodyfikowanego BR 96 podawanego w różnych okresach czasu od wszczepienia H2987, doświadczenie 1, dzień 28.

Grupa	MAb	Reakcja nowotworu
pełna	częściowa	stała	postęp
1	BR 96	2	0	3	5
2	BR 64	0	0	1	9
3	PBS	0	0	0	10

168 711

Tylko w wyniku działania przeciwciała BR 96 nowotwór zniknął całkowicie. Dwa zwierzęta z tej grupy były wolne od nowotworu, zaś trzy zwierzęta wykazywały ustanie wzrostu nowotworu po podziałaniu przeciwciała BR 96. Dwie myszy wolne od nowotworu wykazywały brak jego oznak przez czas trwania doświadczenia.

Działanie przeciwnowotworowe przeciwciała BR 96 wobec nowotworów ustalonych. Jednym z celów końcowych terapii przeciwnowotworowej jest skuteczne zwalczanie nowotworów już ustalonych i rosnących. W celu stwierdzenia, czy BR 96 mogłoby mieć działanie przeciwnowotworowe przeciw ustalonym nowotworowym, zastosowano ksenografty linii komórkowych H2987 i H2707 u bezwłosych myszy. Ze względów na to, że obie te linie nowotworowe dają wyczuwalne nowotwory po 8 dniach od podskórnego podania 10 milionów komórek, metoda badania działania przeciwnowotworowego wobec ustalonych nowotworów była oparta na opóźnieniu rozpoczęcia terapii.

Tak więc w celu dalszego zbadania skuteczności niemodyfikowanego BR 96 przeprowadzono kilka dośwadczeń, w których zabiegi terapeutyczne rozpoczynano dopiero w 5 lub 8 dni od podskórnego wszczepienia nowotworu. Dzięki temu opóźnieniu rozpoczęcia zabiegów komórki nowotworowe miały czas na stanie się ustalonym nowotworem. W ten sposób uzyskuje się model zwierzęcy, którego leczenia jest trudniejsze, lecz stanowi on pełniejsze odzwierciedlenie rzeczywistej sytuacji klinicznej.

Protokół zabiegów przedsatwiono w tabeli 2. Trzem grupom myszy liczącym po 10 zwierząt podawano przeciwciało BR 96 począwszy od różnych dni w stosunku do dnia wszczepienia nowotworu. Myszy kontrolne dostawały albo FA6, albo PBS począwszy od dnia 2. FA6 jest mysim IgG3 skierowanym przeciw bakteryjnemu antygenowi nie występującemu u ssaków, działającemu jako niewiążące, negatywne kontrolne przeciwciało monoklonalne, zgodne z izotypem.

Te b e l a 2

Wpływ leczenia niemodyfikowanym BR 96 rozpoczynanego w różnych okresach czasu po wszczepieniu H2987 i H2707, zabiegi według planu Q3Dx5, i.v.

Grupa	MAb	Dawka (mg)	Dni wstrzyknięć
1	BR 96	1	2,	5,	7,	11,	14
2	BR 96	1	5,	8,	11,	14,	17
3	BR 96	1	8,	11,	14,	17,	20
4	FA6	1	2,	5,	8,	11,	14
5	PBS	0,2	2,	5,	8,	11,	14

Wyniki doświadczeń prowadzonych według powyższego protokółu dla linii komórkowych nowotworów H2987 i H2707 przedstawiono nadif. 4, stanowiącej wykres przedstawiający liczbę zwierząt bez nowotworów w funkcji czasu rozpoczęcia terapii od chwili wszczepienia nowotworu. Brak nowotworu, za który przyjmowano brak wyczuwalnego nowotworu, oceniano po zakończeniu terapii w każdej z grup. Dni, w których stwierdzano brak nowotworu były różne, gdyż terapię zaczynano w różnych dniach od wszczepienia nowotworu. Wczesne rozpoczęcie terapii było najwyraźniej skuteczniejsze, zaś skuteczność zmniejszała się w miarę wydłużenia okresu między wszczepieniem nowotworu i rozpoczęciem terapii. Opóźnienie terapii pozwala na większy wzrost i lepsze ustalenie się nowotworu, tak więc obniżenie skuteczności terapii przy późniejszym jej rozpoczęciu odzwierciedla rosnące trudności w leczeniu większych i lepiej ustalonych nowotworów.

Uzyskane rezultaty świadczą o tym, że BR 96 wykazuje działanie przeciwnowotworowe przeciw dwu różnym liniom komórkowym nowotworów. Działanie przeciwnowotworowe obserwowano wyłącznie w grupach traktowanych BR 96, podczas gdy u zwierząt traktowanych FA6 i PBS działanie takie nie wystąpiło.

Jest znaczące, iż różnice w skuteczności wobec lepiej ustalonych nowotworów są większe w przypadku linii nowotworu H2707 o wyższej ekspresji antygenu. Fakt, że H2707 jest bardziej

168 711 podatny na leczenie BR 96 niż H2987 jest zgodny z założeniem, ze ilość ulegającego ekspresji antygenu może wpływać na skuteczność terapii Br 96. Z powyższych danych wynika, że BR 96 wykazuje działanie przeciwnowotworowe przeciw ustalonym nowotworom.

Wpływ dawki przeciwciała BR 96

W innym doświadczeniu badano wpływ dawki BR 96 na linię nowotworu H2707. W doświadczeniu tym BR 96 podawano w ilości malejącej półlogarytmicznie od 1 mg/dawkę do 0,032 mg/dawkę. Wykres średniej objętości nowotworu w wersji czasu od wszczepienia nowotworu przedstawiono na fig. 5. Zwierzętom kontrolnym podawano wyłącznie najwyższą dawkę monoklonalnego przeciwciała FA6, 1 mg/dawkę. U tych zwierząt kontrolnych nie stwierdzono żadnego działania przeciwnowotworowego, podczas gdy w przypadku podawania BR 96 w wybranym zakresie dawkowania wystąpiła reakcja zależna od dawki.

Absorbancja przy długości fali 450 nm 1 2

'JKŚsSSi

Fg. 1

168 711

Absorbancja przy długości fali A 50 nm

LNFI	» 0,203
LNFII	0,1 99
LNFIII	msmmsmsmmsmissmsa 1.47
LNDI	0,18
MALTOZA	0,21 1
LAKTOZA-	0,147
LNT	0,203
LNnT	M 0,181
LNH	M 0,25
LNnH	0,129
MELIBIOZA	0,159
KOLOBIOZA	0,137
A-tri	0,184
B-tri	0,174
A-TETROZA	M 0,206
2’-FUC0	m 0,159
A HEPTA	® 0,117
GANGLIO	0,122
ANTYGEN T	0.241
3’—SL	0,148
6’—SL	0,155
LSTa	o; 135
LSTb	0,143
LSTc	0,131
S Le y	0,278
DISIALYL	0,124
CHITOTRIOSE	O 0,181
MAN 1-3M	0,147
MAN 1-2M	® 0,119
BIANT OCTA	& 0,107
GLOBOTRI	O 0,177
GLOBOTET	^0,134
Le y _	^2
GM1OCTA	m 0,159
L Le x	0,117
ślepa próba	S8S 0,1 6
KONTROLA	S 0,09

Fig.2 objętość nowotworu

Fig. 3

168 711

Fig. 4

Fig. 5

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 1,50 zł

Claims (5)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1.Sposób wytwarzania rekombinatu nowego przeciwciała obejmującego region wiązania antygenu mysiego przeciwciała monoklonalnego BR 96 wykazującego tę samą specyficzność wiązania co przeciwciało BR 96, znamienny tym, że przyłącza się region wiążący antygen pochodzący z przeciwciała BR 96 z przynajmniej częścią drugiego białka.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako drugie białko stosuje się białko ludzkie.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako drugie białko stosuje się białko wykazujące aktywność przeciwnowotworową i region wiążący antygen przeciwciała BR 96 łączy się z co najmniej funkcjonalnie czynną częścią tego drugiego białka.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym że jako drugie białko stosuje się białko wybrane z grupy obejmującej enzymy, limfokiny, onkostatyny i toksyny.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, albo 2, albo 3, albo 4, znamienny tym, że stosuje się region wiążący antygen BR 96 rozpoznający część epitopu zawierającego fukozę a 1-3 wariantu antygenu Le^y.