PL169105B1

PL169105B1 - Sposób wytwarzania szczepionki przeciwnowotworowej PL PL PL PL PL PL PL

Info

Publication number: PL169105B1
Application number: PL91307929A
Authority: PL
Inventors: Alan N Houghton; Setaluri Vijayasaradhi
Original assignee: Sloan Kettering Inst Cancer
Priority date: 1990-03-22
Filing date: 1991-03-22
Publication date: 1996-06-28
Also published as: NO311366B1; DE69131829D1; JP3336006B2; PT97103A; PL289550A1; SK282873B6; FI113786B; NZ237532A; NO923659D0; HK1014732A1; US20050037462A1; GR3032804T3; JPH06501837A; EP0522078A1; PT97103B; ES2141089T3; HU218416B; DE69131829T2; US6168946B1; PL169168B1

Abstract

1. Sposób wytwarzania szczepionki przeciwnowotworowej stymulujacej albo wzma- gajacej wytwarzanie przeciwcial skierowanych przeciw antygenowi gp 75 w organizmie osobnika, któremu podaje sie szczepionke, znamienny tym, ze izoluje sie cDNA dla kwasu nukleinowego kodujacego sekwencje aminokwasowa antygenu gp 75 o sekwencji nukleoty- dowej przedstawionej czesciowo w tabeli 2 i wytwarza sie wektor ekspresyjny zawierajacy sekwencje DNA niezbedna do replikacji tego wektora polaczona ze wspomnianym cDNA, który to wektor przystosowany jest do ekspresji w organizmie osobnika, dla którego przezna- czona jest szczepionka i tak wytworzony wektor ekspresyjny laczy sie ze skuteczna iloscia adiuwanta oraz z dopuszczalnym farmakologicznie nosnikiem. PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania szczepionki przeciwnowotworowej. Szczepionka wytworzona sposobem według wynalazku, stymuluje albo wzmaga wytwarzanie przeciwciał skierowanych przeciw antygenowi gp 75 w organizmie osobnika, któremu się ją podaje. Służy ona do leczenia, zapobiegania rozwojowi lub do opóźniania nawrotów nowotworu, zwłaszcza czerniaka.

Identyfikacja molekularna immunogennych determinant na ludzkich komórkach nowotworowych stanowi podstawę do wyjaśnienia odpowiedzi immunologicznej na nowotwór. Przedmiotem szczególnego zainteresowania stały się dwie klasy entygenów na komórkach czerniaka ludzkiego jako cele rozpoznania immunologicznego:

1/ unikalne antygeny wydzielane jedynie przez autologiczne komórki czerniaka oraz 2/ antygeny różnicowania, wydzielane normalnie przez komórki wywodzące się z melanocytów. Pierwsza klasa antygenów jest opisana przez L.J.Odd’a, 1981, Cancer immunology: The search for specifity, G.H.A. Clowes Memorial Lecture.Cancer Res. 1981, 41 361/, T.E.Carey’a i wsp./Carey T. E., Takahashi T., Resnick L.A. Osttegen H.F. i L.J. Old: Celi surface antigens of human malignant melanoma. I.Mixed hemadsorption assay for humoral immunity to cultured

169 105 autologeus melanoma cells, Proc.Natal.Acad.Sci. USA, 1976, 73 3278/. Real’a F. X. i wsp. /Real F.X., Nattes M.J., Houghton A.N., Oettgen H.F., Lloyd K.O. i Old L.J.,, Class 1 /unique/ antigens of human melanoma. Identification of a 90 000 dalton cell surgace glycoprotein by autologous antibody, J. Exp.Med. 1984, 160 1219/. Piśmiennictwo na temat drugiej klasy antygenów to: Houghton A. N. Taormina M.C., Ikeda H., Watanabe T., Oettgen H.F. i Old L.J. Serological survey of normal humans for natural antibody to cell surface antigens of melanoma, Proc. Natl.Acad.Sci. USA, 1980,77, 4260; Houghton A.N., Eisinger M., Albino A.P., Cairncross J.G., i Old L.J.: Surface antigens of melanocytes and melanomas. Markers of melanocyte differentiation and melanoma subsets, J. Exp.Med., 1982.156.1755; Houghton A.N., Real F.X., Davis L.J. Cardon-Cardo C. i Old L.J.: Pf^^i^<^^ypic heterogeneity of melanoma: Relation to the differentiation program of melanoma cells. J. Exp.Med. 1987, 164 817. Antygeny różnicowania melanocytów definiuje się na podstawie ich powiązań z innymi dobrze zdefiniowanymi cechami fenotypowymi, ujawniającymi się podczas różnicowania się melanocytów, przy czym najbardziej wyraźną cechą jest synteza barwnika melaniny w melanosomach. Zagadnienie to jest opisane w następujących pracach: Houghton A. N., Eisinger M., Albino A.P., Cairnoross J. G. i Old L. J., Surface antigenes of melanocytes and melanomas. Merkers of melanocyte differentiation and melanoma subsets, J. Exp.Med., 1987, 156. 1755; Houghton A.N., Real F.X., Davis L.J., Cardon-Cardo C. i Old L.J., ^l^^^otypic heterogeneity of melanoma: Relation to the differentiation program of melanoma cells, J.Exp.Med. 1987, 164, 812.

W oparciu o obserwacje kliniczne sugeruje się, że odpowiedź immunologiczna na antygeny wydzielane przez normalne komórki barwnikowe może mieć wpływ na przebieg czerniaka przerzutowego. Bielactwo i niedobarwliwość u pacjentów chorych na czerniaka szczególnie kojarzy się z dobrym prognozowaniem choroby. Donosi o tym wielu autorów: Nordlund J.J., Kirkwood J.M., Forget B.M., Milton G., Albert D.M., i Lerner A.B. Yitiligo in patients with metastatic melanoma: a good prognosis sign. J.Am.Acad. Dermatol., 1983, 9, 689; Bystryn J.C., Rigel D., Friedman R.J. i Kopf A. Prognostic significance of hypopigmentation in malignant melanoma. Arch. Dermatol. 1987, 123, 1053. Pod tym względem antygeny mealnosomalne mogą być rozpoznawane przez układ immunologiczny. Dowodem na to jest immunoprecypitacja antygenu gp 75 z autologicznych komórek czerniaka przez przeciwciała IgG surowicy pacjentów chorych na czerniaka przerzutowego. Doświadczenie to zostało opisane przez Matters’a J.M. i wsp. /Mattes J.M., Thomson T.M., Old L.J., i Lloyd K.O., A pigmentation - associated, differentiation antigen of human melanoma defined by a precipitating antibody in human serum Int. J.Cancer. 1983,22,717/. Antygen gp 75jest polipeptydem melanosomalnym, występującym w największej ilości jako glikoproteina syntetyzowana przez ubarwione melanocyty i komórki czerniaka/Tai T., Eisinger M., Ogata S i Lloyd K.O., Glycoproteins as differentiation markers in human malignant melanoma and melanocytes, Cancer Res. 1983, 43, 2773; obserwacje niepublikowane/. Melanocyty naskórka, łagodne zmiany zabarwione oraz czerniaki pierwotne i przerzutowe wydzielają gp 75, lecz inne typy komórek nie wydzielają tego białka /Thompson T.M., Real F.X., Murakami S., Cardon-Caro C., Old L.J. i Houghton A.N. Differentiation antigens of melanocytes and melanoma: Analisys of melanosome and cell surface markers of human pigmented cells with monoclonal antibodies, J. Invest.Dermatolog. 1988,90, 459/. Jak wykazują badania wykonane przez twórców wynalazku, cDNA antygenu gp 75 wykazuje identyczność w około 90% z wyprowadzonymi sekwencjami aminokwasowymi i sekwencjami nukleotydowymi genu mysiego występującego w locus b /brunatne/. Locus brunatne jest miejscem determinującym barwą skóry lub powłoki i wpływającym na typ syntetyzowanej melaniny, co wskazuje na to, że gp 75 może regulować lub wpływać na typ syntetyzowanej melaminy.

Zjawisko immunoprecypitacji antygenu gp 75 przez przeciwciała IgG w surowicy pacjentów chorych na czerniaka przerzutowego świadczy o tym, że możliwe jest przezwyciężenie tolerancji na gp 75. W celu realizacji tego zamierzenia opracowano wektory ekspresyjne zawierające cDNA dla gp 75, przeznaczone do stosowania jako szczepionka przeciw czerniakowi, przy czym określono sekwencje aminokwasowe peptydów na podstawie polipeptydu gp 75, który wyizolowano i oczyszczono z użyciem mysiego przeciwciała monoklonalnego TA99,

169 105 ponadto wyizolowano klony cDNA metodą skriningu z oligonuklotydami opartymi na tych sekwencjach peptydowych.

Na figurze 1 przedstawione są wyniki immunoprecypitacji i analizy składu peptydowego białek rozpoznawanych przez mAb TA99 i surowicę AU. A. Jednokierunkowa elektroforeza SDS-PAGE immunoprecypitatów ze znakowanych kodem ¹²⁵J lizatów SK-MEL-19 strącanych przeciwciałem mAb TA99 /pasmo 1/, normalnej surowicy ludzkiej /pasmo 2/ i z surowicy AU z 1 /75 /pasmo 3/ oraz z 10/76 /pasmo 4/. B. Pasma odpowiadające gp 75 albo gp 75 traktowanemu Endo H /częściowo zdeglikozylowanemu/ wycięto z żelu SDS-poliakryloamidowego i analizowano skład peptydowy poprzez ograniczone trawienie proteazą V8 z S. aureus na SD-PAGE. Znak oznacza gp 75, znak + oznacza gp 75 częściowo zdeglikozylowany przez Endo H. Ekspozycja autoradiograficzna trwała 2 dni dla TA99 i 5 dni dla peptydów AU.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania szczepionki przeciwnowotworowej stymulującej albo wzmagającej wytwarzanie przeciwciał skierowanych przeciw antygenowi gp 75 w organizmie osobnika, któremu podaje się szczepionkę, polegający na tym, że izoluje się cDNA dla kwasu nukleinowego kodującego sekwencję aminokwasową antygenu gp 75 o części sekwencji nukleotydowej przedstawionej częściowo w tabeli 2, wytwarza się wektor ekspresyjny zawierający sekwencję DNA niezbędną do replikacji tego wektora połączoną ze wspomnianym cDNA, który to wektor przystosowany jest do ekspresji w organizmie osobnika, dla którego przeznaczona jest szczepionka, i tak wytworzony wektor ekspresyjny łączy się ze skuteczną ilością adiuwanta oraz z dopuszczalnym farmakologicznie nośnikiem.

Korzystnie w sposobie według wynalazku stosuje się cDNA komplementarny do kwasu nukleinowego kodując ego sekwencję aminokwasową fragmentu antygenu gp 75 i którą to sekwencję stanowiąnastępujące sekwencje aminokwasowe: asn-thr-val-glu-gly-tyr-ser-asp-prothr-gly-]ys-tyr-asp-pro-ala-val;

met-phe-val-thr-ala-pro-asp-asn-leu-gly-tyr-thr-tyr-glu; oraz asn-phe-asp-ser-thr-leu-ileu-ser-pro-asn-ser-val-phe-ser.

Ponadto korzystnie stosuje się wyizolowany cDNA dla cząsteczki kwasu nukleinowego kodującego gp 75 jak również fragment cząsteczki cDNA dla fragmentu cząsteczki kwasu nukleinowego kodującego gp 75. Fragment ten posiada sekwencję nukleotydową przedstawioną w tabeli 2.

W sposobie według wynalazku stosuje się wektor ekspresyjny przystosowany do ekspresji w organizmie człowieka. Wektorem ekspresyjnym może być wirus krowianki albo korzystnie wektor Imclone.

Leczenie nowotworów u ludzi dotkniętych tą chorobą polega na podawaniu chorym szczepionki wytworzonej sposobem według wynalazku w dawce skutecznie leczącej nowotwór.

Zapobieganie rozwojowi nowotworu u ludzi dotkniętych tą chorobą polega również na podawaniu chorym szczepionki wytworzonej sposobem według wynalazku w dawce skutecznie zapobiegającej rozwojowi nowotworu. Można też opóźnić nawroty nowotworu u ludzi podatnych na tę chorobę poprzez podawanie chorym szczepionki wytworzonej sposobem według wynalazku w dawce skutecznie opóźniającej nawrót nowotworu.

Leczenie, zapobieganie i opóźnianie nawrotów nowotworu może być zastosowane do nowotworu takiego jak czerniak. Szczepionka wytworzona sposobem według wynalazku jest użyteczna do zapobiegania nawrotom takimjak czerniak u pacjentów o wysokim ryzyku nawrotu lub rozwoju czerniaka pierwotnego.

W metodach leczenia stosuje się go 75 który może być związany z adiuwantem. Dodatkowo, przed podaniem szczepionki, pacjentowi podaje się efektywną ilość cyklofosfamidu.

Przykład. Hodowla tkankowa

Prowadzono wzrost linii komórkowej czerniaka SK-MEL-19 na podłożu MEM z dodatkiem 1 % niepodstawowych aminokwasów, penicyliny i streptomycyny, z tym, że zamiast płodowej surowicy bydlęcej /FBS/ stosowano 10% /objętościowo/ Serum Plus z firmy Hezelton Research Products Inc., Lenexa, K8. Izolowanie i oczyszczanie gp 75: Izolowano post-jądrową frakcję błonową z linii komórek czerniaka SK-MEL-19 przez homogenizację komórek w roztworze o składzie: 20 mM Tris HCl /pH = 7,5/, 5 mM MgCh i 2 mM PMSP i wirowanie /10 000 xg/. Błony rozpuszczono w roztworze o składzie: 20 mM Tris HCl /pH = 7,5/, 3 M KCl

169 105 i 5 mM EDTA i odwirowano /100 000 xg/. Frakcję nierozpuszczalnego białka zawieszono w 20 mM Tris HCl /pH = 7,5/ z dodatkiem 0,5% dezoksycholanu sodowego. Białka rozpuszczalne w detergencie zebrano przez odwirowanie /100 000 xg/ Supernatant dializowano wobec 20 mM Tris HCl /pH = 7,5/ z dodatkiem 0,15 M NaCl i 2 mM CHAPS i podano na kolumnę Mono Q /HR 5/5, Pharmaci LKB Biotechnology Inc. Piscatway, NJ/ zrównoważoną roztworem o składzie: 20 mM Tris HCl /pH = 7,5/, 0,15 M NaCl i 2 mM / 3-[/3-cholamidopropylo/dwumetylo-amonio]1-propanosulfonianu /CHAPS/ /bufor AJ. Związane białka eluowane w liniowym gradiencie 0-1,0 M NACl w buforze A. We frakcjach oznaczono gp 75 metodą kompetytywnego hamowania. Frakcje zawierzające gp 75 zebrano, dializowano wobec buforu stosowanego do kolumny Con A /10 mM Tris HCl /pH = 6,5/, zawierający 1 mM CaCb, 1 mM MnCh i 2 mM PMSF/ i podano na kolumnę wypełnioną Con-A-Sepharozą. Niezwiązane białka usunięto przez przemywanie buforem stosowanym do kolumny. Białka związane z kolumną Con A eluowano 0,25 M roztworem α-D-metylomannopiranozylu w buforze kolumny Con A. Frakcje zawierające gp 75 zebrano i dializowano wobec roztworu o składzie: 10 mM Tris HCl /pH = 7,5/, 2 mM CHAPS i 2 mM PMSF /CB/ i podano na kolumnę powinowactwa Affi-Gel 10 zawierającą mysie przeciwciała monoklonalne /mAb/ TA99 /Thomson T.M. Mattes J.M. Roux L., Old L.J. i Lloyd K.O., Pigmentation-associated glycoprotein of human melanoma and melanocytes: Definition with a mouse monoclonal antibody. J.Inwest.Dermatol., 1985, 85, 169/. Żel przemyto kolejno 6 ml: CB, CB + 1 M NaCl, CB i cB + 2 mM CHAPS. Związany gp 75 eluowano z kolumny 0,1 M roztworem chlorowodorku glicyny o pH 3,1 zawierającym 2 mM CHAPS. Oznaczanie gp 75 w próbie kompetytywnego hamowania.

Podczas oczyszczania, gp 75 monitorowano i oznaczano ilościowo na podstawie zdolności frakcji do hamowania wiązania mAb TA 99 /300 mg/ml/ z komórkami SK-MEL -19 utrwalonymi w mieszaninie metanol-aceton /1: 1 objętościowo/ w immunologicznej próbie enzymatycznej ELISA w sposób opisany przez Houghton’a A.N. i wsp. /Houghton A.N. Brooks H., Cote R.J. Taormina M.C., Oettgen H.F. i OldL.J., Detection of cell surface and intracellular antigens by human monoclonal antibodies: hybrid cells derived from lymphocytes of patients with malignat melanoma, J.Exp.Med. 1983, 158. Immunoprecypitacja, elektroforeza żelowa i mapowanie peptydu.

Jodowanie frakcji białkowej SK-MEL-19 związanej na kolumnie Con-A-Sepharose metodą z użyciem chloraminy T i immunoprecypitację przeciwciałem mAb TA99 i surowicę AU wykonano w sposób opisany przez Mattes’a i wsp. /Mattes J.M.Thomson T.M., Old L.J. i Lloyd K.O., A gigmentationasociated, differenttation antigen of human melanoma defined by a precipitating antibody in human serum Int.J.Cancer, 1983, 32 717/. Białka analizowano przez elektroforezę w żel SDS-akryloamidowym /SDS-PACGE/ w sposób opisany przez Laemmli ’ ego /Laemmli U.K.,Cleavage of structural proteins during assembley of the head of bacteriophage T4 Nature, 1970,227,680/. W celu trawienia endoglukozydazą H /Endo H/, immunoprecypitaty zawieszono w 0,4% SDS, ogrzewano do temperatury 100°C w ciągu 5 minut i trawiono jedną jednostką międzynarodową Endo H /Genzyme Corporation, Boston, MA/ w 100 mM buforze cytrynianowym ŻpH = 5,5/ w ciągu 16 godzin w temperaturze 37°C. Dwu-kierunkową elektroforezę z zastosowaniem amfolin o pH 5-7, produkcji LKB-Produkter, Bromma, Szwecja, przeprowadzono w sposób opisany przez O’Farrel’a /O’Farrel P.H., High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins J.Biol.Chem., 1975, 250 4007/.

Mapowanie peptydów immunoprecypitatu gp 75 prowadzono metodą ograniczonej protelizy za pomocą proteazy VB/VB protease/ ze Staphylococcus sureus firmy Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN, w SDS-PAGE według Cleveland’a i wsp. /Cleveland

D.W., Fischer S.G., Kirschner M.W. i Laemmli U.K., Peptide mapping by limited proteolysis in sodium dodecyl sulphate and analysis by gel elektrophoresis. J. Biol. Chem. 1977, 252. 1102/. Sekwencjonowanie peptydów.

Sekwencjonowanie peptydu przeprowadzono w zestawie Harward University Microchemistry Facility. Oczyszczony gp 75 /12 pg/ po elektroforezie - naniesiony na filtr nitro celulozowy trawiono proteazą VB /1:20, wagowo/ w sposób podany przez Aebersold’a R. /Aebersold R.H., Leavitt J., Saavedra R.A. i Hood L.E., Internal amino acid sequence analysis of proteins separated by one- or two-dimensional gel elektrophoresis after in situ protease

169 105 digestion on nitrocelulose. Proc. Natl.Acad.Sci USA, 1987, M, 6970/ i uzyskane peptydy rozdzielono na kolumnie C8 Brownlee RP-300 o wymiarach 2,1 x 100 mm, w temperaturze 38°C. Kilka pików z trawienia proteazą V8 zebrano i wysuszono. Przeprowadzono całkowitą redukcję i alkilowanie przez dodanie 50 pl 8 M mocznika w 0,4 M buforze dwuwęglanu amonowego o pH = 8,0 i 5 pl 100 mM ditiotreitolu i ogrzewano w temperaturze 50°C w ciągu 15 minut. Następnie próbkę inkubowano z 5 pl 45 mM kwasu jodooctowego w ciągu 15 minut w temperaturze pokojowej i rozcieńczono 140 pl wody destylowanej. Dalsze trawienie trypsyną zredukowanej i zalkilowanej frakcji peptydu /1:25, wagowo/ prowadzono w ciągu doby w temperaturze 37°C. Frakcje przeznaczone do sekwencjonowania naniesiono bezpośrednio na filtry ze wstępnie modyfikowanego heksadimetryną /polybrene/ włókna szklanego sekwencjonowano w zestawie do sekwencjonowania białek ABI 477A. Aminokwasy rozdzielone metodą w systemie on-line w zestawie ABI 120A. Dla każdego peptydu przeprowadzono minimum 20 cykli. Powtarzalność wyników MPLC w rutynowych warunkach laboratoryjnych wynosiła 93%. Sekwencje aminokwasowe podano tylko dla tych peptydów, dla których uzyskano wyniki o najwyższej powtarzalności. Klonowanie i sekwencjonowanie cDNA dla gp 75:

Bank cDNA skonstruowano z linii komórek czerniaka SK-MEL 19. Do izolacji dwu klonów cDNA gp 75 stosowano sondy oligonuklotydowe, postępując w sposób opisany poprzednio /Bouchard B., Fuller B., Vijayasaradhi S. i Houghton A.N., Induction of pigmentation in mouse fibroblasts by expression of human tyrosinase, J. Exp.Med. 1989, 169, 2029/. Budowa sond oligonukleotydowych była następująca: 5’ CTCGAAGGTGAACCCAGGTTGTCGGGGGCGGTCACGAACATCTC 3’. Metodą Sangera i wsp. /Sanger F., Nicklen S. I Coulson A.R., DNA sequencing with chain terminating inhibitors, Proc. Natl.Asad.Sci. USA, 1977, 24, 5463; Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA/, zsekwencjonowano dwa klony cDNA /1,8 kb i 2,0 kb/. Na podstawie przeprowadzonych prób stwierdzono, że zarówno mysie mAb TA99 jak i surowica AU od pacjentów z czerniakiem strącają antygen o wielkości 75 kDa, a mAb TA 99 oczyszcza wstępnie antygen gp 75 strącony przez surowicę AU /Thomson T.M., Mattes J.M., Roux L., Old L.J. i Lloyd K.O. Pigmentation-asociated glycoprotein of human melanoma and metanocytes: Definition with a mouse monoclonal antibody. J.Invest.Dermatol. 1985, 85, 169/. Chociaż mAb TA99 użyto do oczyszczania gp 75 z linii komórek czerniaka SK-MEL-19, bardzo ważne jest potwierdzenie faktu, że mAb TA99 wykrywa jedynie antygen gp 75 rozpoznawany przez surowicę AU. W poprzednich badaniach wykazaliśmy, że mAb TA99 nie reaguje z ludzką tyrozynazą glikoproteiną o wielkości 75-80 kDa, również wydzielaną w zabarwionych melanocytach /Bouchard B., Fuller R., Vijayasaradhi S. i Houghton A.N.: Induction of pigmentation in mouse fibroblast by expression of human tyrosinase. J.Exp.Med., 1989, 169, 2029/. Jednakże na podstawie tamtych doświadczeń nie można było wykluczyć możliwości, że mAb TA99 reaguje krzyżowo z innymi polipeptydami wydzielanymi przez komórki SK-MEL-19.

Białka po immunoprecypitacji przez przeciwciała mAb TA99 i znajdujące się w surowicy AU analizowano metodą jedno- i dwukierunkowej elektroforezy SDS-PAGE oraz przez mapowanie peptydów z użyciem ograniczonej prc^t^^olizy proteazą V8 z S.aureus. Białka strącone zarówno przez mAb TA99 jak i przez przeciwciała surowicy AU mają identyczną masę cząsteczkową /75 kFa/ punkt izoelektryczny /5,5-5,9/ /dane nie przedstawione/ i skład peptydowy /figura 1/, co potwierdza, że TA99 i surowica AU rozpoznają tę samą cząsteczkę gp 75.

Antygen gp 75 oczyszczono w sposób opisany wyżej. Oczyszczony metodą powinowactwa gp 75 stosowano do sekwencjonowania peptydów. Sekwencje aminokwasowe trzech wewnętrznych peptydów uzyskano przez rozszczepienie proteolityczne oczyszczonego gp 75 proteazą V8 i t^psyną. Sekwencje tych trzech peptydów przedstawiono w tabeli 1. Okazało się, że istnieje 90 procentowa identyczność tych sekwencji z sekwencjami aminokwasowymi wyprowadzonymi z klonu mysiego cDNA, pMT4 wyizolowanego przez Shibahara’ę i wsp. /identyczność ta występuje w pozycjach aminokwasów 247-260,333-349 i 428-441 pMT4/. /Shibahara S., Tomita Y. Sakakura T., Nagar C., Chaudhuri B., Muller R.: Cloning and expresson of cDNA encoding mouse tyrosinase. Nucleic Acid Res. 1986, 14 2413/. Sondy oligonukleotydowe pochodziły z sekwencji peptydowych z gp 75 i były użyte do skriningu banku cDNA skonstruowanego z linii komórkowych czerniaka ludzkiego SK-MEL-19. Z tego

169 105 banku cDNA wyizolowano dwa klony cDNA, o wielkości 1,8 i 2,0 kilozasad. Częściowe sekwencje nukleotydowe klonów cDNA /GP 75-1 i GP 75-2/, z których jedną przedstawiono w tabeli 2, wykazują 88,6 procentową identyczność z pMT4 /między nukleotydami 649 a 1437, w otwartej fazie odczytu/. Sekwencja aminokwasowa wyprowadzona na podstawie GP 75-1 i GP 75-2 wykazuje 93,6 procentową identyczność z sekwencją aminokwasową wyprowadzoną z pMT4 pomiędzy sekwencjami aminokwasowymi 219 a467. Istnieje 55,3 procentowa identyczność między sekwencjami cDNA dla gp 75 a sekwencjami dla ludzkiej tyrozynazy /Bouchard B., Fuller B., Vijaysaradhi S. i Houghton A.N.: Induction of pigmentation in mouse fibroblastasby expression of human tyrosinase J.Exp. Med. 1989,169.2029/pomiędzy nukleotydami 618 a 1344 dla tyrozynazy /dane nie przytoczone/.

Tabela 1

Sekwencje aminokwasowe trzech peptydów pochodzących z gp 75

1. 2. 3.

Asn-Thr-Val-Glu-Gly-Tyr-Ser-Asp-Pro-Thr-Gly-Lys-Tyr-Asp-Pro-Ala-Val Met-Phe-Val-Thr-Ala-Pro-Asp-Asn-Leu-Glv-Tyr-Thr-Tyr-Glu Asn-Phe-Asp-Ser-Thr-Leu-Ileu-Ser-Pro-Asn-Ser-Val-Phe-Ser

Podkreślono te reszty aminokwasowe, które różnią się od reszt wyprowadzonych na podstawie mysiego cDNA z pMT4 /Shibahara S., Tomita Y., Sakakura T., Nagar C., Claudhuri

B. i Muller R.; Cloning and expression of cDNA encoding mouse tyrosinase. Nucleic Acid Res. 1986, 14 2413/.

Tabela 2

Częściowa sekwencja cDNA dla antygenu gp 75

GGACCAGCTTTTCTCACATGGCACAGGTACCACCTCCTGCGTCTGGAGAAAGACATGC

AGGAAATGTTGCAAGAGCCTTCTTTCTCCCTTCCTTACTGGAATTTTGCAACGGGGAA

AAATGTCTGTGATATCTGCACGGATGACTTGATGGGATCCAGAAGCAACTTTGATTCC

ACTCTAATAAGCCCAAACTCTGTCTTTTCTCAATGGCGAGTGGTCTGTGACTCCTTGG

AAGATTATGATACCCTGGGAACACTTTGTAACAGCACCGAGGATGGGCCAATTAGGAG

AAATCCAGCTGGAAATGTGGCCAGACCAATGGTGCAACGTCTTCCTGAACCACAGGAT

GTCGCTCATGTCTTGGAAGTTGGTTTATTTGACACGCCTCCTTTTTATTCCAACTCTA

CAAACAGTTTCCGAAACACAGTGGAAGGTTACAGTGACCCCACGGGAAAGTATGACCC

TGCTGTTCGAAGTCTTCACAATTTGGCTCATCTATTCCTGAATGGAACAGGGGGACAA

ACCCATTTGTCTTCCCAAGATCCTATTTTTGTCCTCCTGCACACCTTCACAGATGCAG

TCTTTGATGAATGGCTAAGGAGATACAATGCTGATATATCCACATTTCCATTGGAAAA

TGCCCCTATTGGACATAATAGACAATACAACATGGTGCCATTCTGGCCCCCAGTCACC

AACACAGAAATGTTTGTTACTGCTCCAGACAACCTGGGATACACTTATGAA

Ścisła homologia między ludzkim antygenem gp 75 oraz produktem wyprowadzonym z mysiego genu pMT4 rzuca pewne światło na możliwą strukturę i funkcję gp 75. Klon pMT4 wyizolowano z mysich komórek melanocytamych /Shibahara S., Tomita Y., SakakuraT., Nagar

C. , Chaudhuri B. i Muller R.: Cloning an experssion of cDNA encoding mouse tyrosinase, Nucleic Acid Res. 1986, 14. 2413/.

Początkowo uważano, że cDNA z pMT4 koduje mysią tyrozynazę, dla której pozycja w mapie genetycznej znajduje się w mysim locus c /albino/. Późniejsze badania wykazały jednak, że pMT4 różni się od genu dla tyrozynazy mysiej /Yamamoto H., Takeuchi S., Kudo T., Vakino K., Nakata A., Shinoda A i Takeuchi T.: Cloning and seąuencing of mouse tyrosinase cDNA, Japan J. Genetics, 1987, 62, 271; Muller G., Ruppert S. Schimd E. i Schutz G.: Functional analysie of altematively spliced tyrosinase gene transcripts, Eur.Mol. Biol.Organ.J. 1988, 2, 2723; Jackson I.J.: A cDNA encoding tyrosinase-related protein maps to the brown locus in mice, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 1988, 85, 4392/. Podobnie, sekwencja gp 75 różni się od sekwencji ludzkiej tyrozynazy, aczkolwiek istnieje ograniczony zakres identyczności /43,1%/ pomiędzy gp 75 a wyprowadzoną sekwencję aminokwasową ludzkiej tyrozynazy /pomiędzy resztami aminokwasowymi 208-459/.

Funkcję gp 75 i produktu pMT4 próbuje się określić na podstawie odkrycia, że miejscem pMT4 w mapie genetycznej jest locus b /brown/ u myszy /Jackson I.J.:A cDNA encoding tyrosinase-related protein maps to the brown locus in mice. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1988,

16!» 105

85, 4392/ a więc region, który określa barwę powłoki /Silvers W.K.: Comparative geneties of coat colour in mammals, The Coat Colors in Mice. Springer Verlag, Nowy Jork, 1979/.

Homologia pomiędzy gp 75 a sekwencją aminokwasową wyprowadzoną z pMT4 pozwala na formalną identyfikację ludzkiego homologu produktu genu z mysiego locus b/brown/. Opierając się na lokalizacji w melanosomach i podobieństwie strukturalnym do tyrozynazy, można wysunąć wniosek, że cząsteczka gp 75 reguluje proces syntezy melaniny i określa typ syntetyzowanej melaniny.

Dotychczas zakładano, że determinanty melanosomalne i inne antygeny wewnątrzkomórkowe nie stanowią potencjalnego celu w immunologicznym leczeniu czerniaka. Ostatnio jednak znaleziono dowody, że wewnątrzkomórkowe białka mogą być przetwarzane do peptydów stanowiących cel dla cytotoksycznych komórek T /CTL/ przez komórki będące nośnikami antygenu /Townsend A.R.M. i Bodmer H.: Antigen recognition by class I-restricted T lymphocytes, Ann.Rev.Immunol. 1989,7,601/. Odkrycie to stwarza teoretyczną możliwość ukierunkowania odpowiedzi komórki T na czerniaka przeciwko cząsteczkom wydzielanym w komórce nowotworowej. Alternatywnie, komponenty melanosomalne, które są normalnie transportowane poza melanocyty w procesie dojrzewania, mogą się akumulować w przestrzeni poza-komórkowej wokół komórek nowotworowych lub też, nekroza miejscowej tkanki może prowadzić do uwalniania i odkładania się produktów wewnątrzkomórkowych. Potwierdzeniem dostępności gp 75 jest fakt, że znakowany radioaktywnie TA99 mAb swoiście lokalizuje się w przeszczepach czerniaka ludzkiego w myszach nu/nu, co wskazuje, że antygen ten jest dostępny dla przeciwciała w miejscu nowotworu /Welt S., Mattes J.A., Grando R., Thomson T.M.,Leonard R.W., Zanzonico P.B., Bigler R.E., Yeh S., Oettgen H.F.i Old L.J.: Monoclonal antibody to an intracellular antigen images human melanoma transplante in nu/nu mice, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1987, 84, 4200/.

Przeciwciała IgG u pacjentów z czerniakiem AU rozpoznają determinanty na gp 75, które są wspólne dla komórek czerniaka i dla normalnych melanocytów /Mattes J.M., Thomson T.M., Old L.J., i Lloyd K.O.: A pigmentation-associated differentiation antigen of human melanoma defined by a precipitating antibody in human serum. Int. J. Cancer, 1983, 32, 717/. Izolacja klonów cDnA, które kodują gp 75 umożliwi badanie strategii aktywnej immunizacji przeciw gp 75. Istnieją co najmniej dwa warunki efektywnego indukowania odpowiedzi komórek CTL na gp 75:1/musi być przezwyciężona tolerancja na gp 75 i 2/peptydy gp 75 muszą być przetworzone i efektywnie prezentowane przez główne antygeny zgodności tkankowej na komórkach czerniaka. Alternatywnie, jest możliwe, że antygeny różnicowania melanocytów są nośnikami unikalnych determinant. Geny kodujące produkty wydzielane przez normalne melanocyty mogłyby być mutowane lub przegrupowywane w procesie transformacji prowadzącej do uzłośliwienia generując nowe epitopy będące celem rozpoznawanym przez CTL i przeciwciała. W tym kontekście, najlepiej scharakteryzowanym unikalnym antygenem na komórkach ludzkiego czerniaka jest determinanta na melanotransferynie, glikoproteinie o wielkości 95-97 kDa, wydzielanej na hodowanych melanocytach i na komórkach czerniaka /Real F.X., Mattes

A.J.,Houghton A.N., Oettgen H.F., Llyod K.O. i Old L.J.: Class 1 /unique/ antigens of human melanoma. Identyification of a 90 000 dalton cell surgace glycoprotein by autologous antibody, J.Exp.Med. 1984, 160, 1219; Furakawa K.S., Furakawa K., Real F.X., Old L.J. i Lloyd K.O.: A unique antigenic epitope of human melanoma is carried on the common melanoma glycoprotein gp 75/p97 J.Exp.Med. 1989, 169. 535/. Na potwierdzenie tej możliwości, wykryto zmiany genetyczne występujące z dużą częstością i w szerokim rozprzestrzenianiu w genomie komórek czerniaka ludzkiego /Dracopoli N.C., Houghton A.N., i Old L.H.: Loss of polymorphic restriction fragments in malignant melanoma: Implications for tumor heterogeneity. Prof.Natl.Acad.Sci. USA 1985, 82, 1470; Dracopoli N.C., Alhadeff B., Houghton A.N. i Old L.J.: Loss of heterozygosity at autosomal and x-linked loci during tumor progression in a patient with melanoma, Cancer Res. 1987, 47, 3995/.

169 105

97Hz# »»

Α Β

Μ x10‘³ 1 2 3 4 ΜχΙΟ'³ ^99 AU ♦ih ¹⁸‘ - 1 * · · **

Fig.1

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 2,00 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania szczepionki przeciwnowotworowej stymulującej albo wzmagającej wytwarzanie przeciwciał skierowanych przeciw antygenowi gp 75 w organizmie osobnika, któremu podaje się szczepionkę, znamienny tym, że izoluje się cDNA dla kwasu nukleinowego kodującego sekwencję aminokwasową antygenu gp 75 o sekwencji nukleotydowej przedstawionej częściowo w tabeli 2 i wytwarza się wektor ekspresyjny zawierający sekwencję DNA niezbędną do replikacji tego wektora połączoną ze wspomnianym cDNA, który to wektor przystosowany jest do ekspresji w organizmie osobnika, dla którego przeznaczona jest szczepionka i tak wytworzony wektor ekspresyjny łączy się ze skuteczną ilością adiuwanta oraz z dopuszczalnym farmakologicznie nośnikiem.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się cDNA komplementarny do kwasu nukleinowego kodującego sekwencję aminokwasową fragmentu antygenu gp 75.
3. Sposób według zastrz. 1, albo 2, znamienny tym, że stosuje się cDNA komplementarny do kwasu nukleinowego kodującego sekwencję aminokwasową asn-thr-val-glu-gly-tyr-ser-asppro-thr-gly-lys-tyr-asp-pro-ala-val.
4. Sposób według zastrz. 1, albo zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się cDNA komplementarny do kwasu nukleinowego kodującego sekwencję aminokwasową met-phe-val-thr-alapro-asp-asn-leu-gly-tyr-thr-tyr-glu.
5. Sposób według zastrz. 1, albo zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się cDNA komplementarny do kwasu nukleinowego kodującego sekwencję aminokwasową asn-phe-asp-ser-thrleu-ileu-ser- pro-asn-ser-val-phe-ser.
6. Sposób według zastrz. 1, albo zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się cDNA o sekwencji nukleotydowej przedstawionej w tabeli 2.
7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się wektor ekspresyjny przystosowany do ekspresji w organizmie człowieka.
8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się adiuwant wiążący gp 75.
9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako wektor ekspresyjny stosuje się wirus krowianki.
10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako wektor ekspresyjny stosuje się wektor Imclone.