PL169635B1

PL169635B1 - Mikrobiologiczny sposób wytwarzania kwasu 5-hydroksypirazynokarboksylowego PL PL PL

Info

Publication number: PL169635B1
Application number: PL92294938A
Authority: PL
Inventors: Andreas Kiener
Original assignee: Lonza Ag
Priority date: 1991-06-21
Filing date: 1992-06-17
Publication date: 1996-08-30
Also published as: CZ188592A3; MX9202930A; ZA923876B; IE72211B1; JPH05244967A; CZ279302B6; CA2069596A1; IE921680A1; SK188592A3; BG61510B1; IL102071A; FI922125A7; HU9202069D0; FI922125A0; EP0519512B1; US5273893A; SK278570B6; DK0519512T3; DE59205377D1; RO109865B1

Abstract

1. Mikrobiologiczny sposób wytwarzania kwasu 5-hydroksypirazynokarboksy- lowego i/lub jego soli, znamienny tym, ze kwas pirazynokarboksylowy i/lub jego sole, jako substrat, przeprowadza sie za pomoca mikroorganizmów z rodzajów Pseudomonas i/lub Achromobacter, i/lub Bacillus, i/lub Azorhizobium, i/lub Sarcina, i/lub Mycobacte- rium w kwas 5-hydroksypirazynokarboksylowy i/lub jego sole, przy czym ten ostatni nagromadza sie w srodowisku. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest nowy sposób wytwarzania kwasu 5-hydroksypirazynokarboksylowego i/lub jego soli za pomocą mikroorganizmów zużytkowujących kwas nikotynowy i/lub jego sole, stosując jako związek wyjściowy kwas pirazynokarboksylowy i/lub jego sole.

W podanej następnie części opisu pod określeniami: kwas nikotynowy, kwas pirazynokarboksylowy i kwas 5-hydroksypirazynokarboksylowy rozumie się też ich sole, takie jak ich sole litowcowe lub sole amoniowe.

Kwas 5-hydroksypirazynokarboksylowy można przykładowo stosować jako produkt pośredni do wytwarzania farmaceutyków, np. do wytwarzania analogów nukleozydów pirazynowych o działaniu cytostatycznym (M. Bobek, J. Heterocyclic Chem., 1991, 28, strona 1131).

Wiadomo, że kwas 5-hydroksypirazynokarboksylowy w metabolizmie psów i ludzi tworzy się z amidu pirazyny poprzez kwas pirazynokarboksylowy (J. Pharmacol. Exp. Ther., 1972, 180(2), 411-434).

Przykładowo omawia się (J. Heterocyclic Chem. 19, 1982, strona 402) 5-etapowy chemiczny sposób wytwarzania kwasu 5-hydroksypirazynokarboksylowego z wyjściowego furfuryloglioksalu. Ma on jednak tę wadę, że nie nadaje się do prowadzenia w skali wielkoprzemysłowej.

Mikrobiologiczny sposób wytwarzania kwasu 5-hydroksypirazynokarboksylowego nie był dotychczas znany.

169 635

Celem wynalazku jest opracowanie łatwego, ekonomicznego i ekologicznego sposobu wytwarzania kwasu 5-hydrazynokarboksylowego.

Osiąga się ten cel za pomocą sposobu, który według wynalazku polega na tym, że kwas pirazynokarboksylowy i/lub jego sole, jako substrat, przeprowadza się za pomocą mikroorganizmów, które rosną wraz z kwasem nikotynowym i/lub jego solami jako jedynym źródłem węgla, azotu i energii, w kwas 5-hydroksypirazynokarboksylowy i/lub jego sole, przy czym ten ostatni nagromadza się w środowisku.

Zasadniczo dla tego sposobu odpowiednie są wszystkie mikroorganizmy, które degradują kwas nikotynowy poprzez kwas 6-hydroksynikotynowy. Mikroorganizmy te można za pomocą znanych technik mikrobiologicznych wyodrębniać np. z oczyszczalni ścieków z kwasem nikotynowym jako substratem wzrostowym. Przykładowo można stosować mikroorganizmy z rodzajów Pseudomonas, Achromobacter, Bacillus, Azorhizobium, Sarcina i Mycobacterium, które już omówiono w opisie EP-A nr 152 948. Reakcję tę można w warunkach jałowych lub niejałowych przeprowadzać zarówno za pomocą mieszanin jak i czystych izolatów tych mikroorganizmów.

Celowo sposób ten przeprowadza się za pomocą mikroorganizmów gatunku Pseudomonas acidovorans DSM 4746, Achromobacter xylosoxydans DSM 2402, Achromobacter xyłosoxydans DSM 2783, Pseudomonas putida NCIB 10521, Pseudomonas putida NCIB 8176 oraz ich potomstwa i mutantów, korzystnie za pomocą Pseudomonas acidovorans DSM 4746.

Mikroorganizmy gatunku Pseudomonas acidovorans DSM 4746 złożono w dniu 25 lipca 1988 r. w Niemieckiej Kolekcji Mikroorganizmów i Kultur Komórkowych GmbH (o oryginalnej nazwie: die Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) z siedzibą w D-3300 Brunświk, Mascheroderweg 1b, RFN.

Mikroorganizmy gatunku Achromobacter xylosoxydans DSM 2402 i DSM 2783 są również złożone we wspomnianym wyżej instytucie i są już omówione w opisie EP-A nr 152 948.

Mikroorganizmy gatunku Pseudomonas putida NCIB 10521 i NCIB 8176 są złożone w szkockiej kolekcji o nazwie National Collection of Industrial Bacteria, Torry Research Station, z siedzibą w Aberdeen AB98DC, 135 Abbey Road, Szkocja.

Zazwyczaj przed właściwą reakcją przeprowadza się hodowlę (hodowanie) jak i indukcję tych mikroorganizmów za pomocą kwasu nikotynowego.

Hodowanie (hodowla) i indukcja korzystnie zachodzi za pomocą kwasu nikotynowego jako jedynego źródła węgla, azotu i energii.

Przed dodaniem substratu (kwasu pirazynokarboksylowego) można wówczas mikroorganizmy te albo zebrać za pomocą znanych sposobów rozdzielania i ponownie przeprowadzić w stan zawiesiny w świeżym środowisku, albo można substrat (kwas pirazynokarboksylowy) dodawać bezpośrednio do mikroorganizmów w pierwotnym środowisku wzrostowym. Dla właściwego sposobu w zawiesinie komórkowej wówczas nastawia się przy 650 nm celowo absorbancję rzędu 1-100, korzystnie 10-30.

Jako środowiska, zarówno dla hodowania jak i dla reakcji właściwej, można stosować środowiska uznawane przez fachowców. Korzystnie stosuje się środowisko, którego skład podano niżej w tabeli.

Substrat (kwas pirazynokarboksylowy) można dodawać jednorazowo lub nieprzerwanie.

Celowo to dodawanie substratu następuje tak, żeby stężenie substratu nie przewyższyło 20% wagowych, korzystnie 5% wagowych. Reakcja kwasu pirazynokarboksylowego i/lub jego soli, prowadząca do kwasu 5-hydroksypirazynokarboksylowego i/lub jego soli, zachodzi zwykłe za pomocą śpiących komórek.

Celowo reakcję tę przeprowadza się w warunkach aerobowych wobec odczynu o wartości pH rzędu 4-10, korzystnie wobec odczynu o wartości pH=6-8.

Reakcję prowadzi się celowo w temperaturze 10-60°C, korzystnie w temperaturze 15-45°C.

169 635

Po upływie znanego czasu trwania reakcji rzędu 4-100 godzin, można produkt strącić drogą zakWaszenia roztworu pozbawionego komórek i otrzymać za pomocą metod obróbki znanych dla fachowca. W przypadku soli sodowej kwasu 5-hydroksypirazynokarboksylowego produkt strąca się już podczas reakcji.

Przykład I. Pseudomonas acidovorans DSM 4746 hodowano w środowisku soli mineralnych (patrz tabela 1 niżej) w warunkach nieprzerwanego dodawania nikotynianu sodowego (0,6 g/l/h) w fermentorze wobec odczynu o wartości pH=7,0 i w temperaturze 30°C, aż do osiągnięcia absorbancji 10 przy 650 nm. Następnie komórki te odwirowano i ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w 2 litrach roztworu, zawierającego 1 mol (146 g) soli sodowej kwasu pirazynokarboksylowego i wykazującego odczyn o wartości pH=7,0. Absorbancja przy 650 nm wynosiła wówczas 20. Po okresie inkubacji rzędu 16 godzin w warunkach aerobowych wobec odczynu o wartości pH=7,0 i w temperaturze 30°C nie. można było za pomocą spektroskopii w nadfiolecie wykryć już żadnej substancji wydzielanej. Część utworzonej soli sodowej kwasu 5-hydroksypirazynokarboksylowego wykrystalizowała już w tych warunkach postępowania. Wytrącony produkt odwirowano wraz z biomasą.

Utworzony osad ponownie przeprowadzono następne w stan zawiesiny w 500 ml wody i znowu odwirowano. Pozbawione komórek ciecze znad osadu połączono, zatężono za pomocą wyparki obrotowej do objętości 300 ml i ochłodzono do temperatury 0°C. Utworzone kryształy odsączono i osuszono. Łącznie można było wyodrębnić 0,67 mola (108 g) soli sodowej kwasu 5-hydroksypirazynokarboksylowego, co odpowiadało 67% wydajności, w odniesieniu do wprowadzonej soli sodowej kwasu pirazynokarboksylowego.

Przykład II. Pseudomonas acidovorans DSM 4746 hodowano w środowisku soli mineralnych (patrz tabela 1 niżej) w warunkach nieprzerwanego dodawania nikotynianu sodowego (0,6 g/1/h) w fermentorze wobec odczynu o wartości pH=7,0 i w temperaturze 30°C, aż do osiągnięcia absorbancji 10 przy 650 nm. Następnie komórki te odwirowano i ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w 100 ml roztworu, zawierającego 0,056 mola (7,9 g) soli amoniowej kwasu pirazynokarboksylowego i wykazującego odczyn o wartości pH=7,0. Absorbancja przy 650 nm wynosiła wówczas 20. Po okresie inkubacji rzędu 24 godzin w warunkach aerobowych wobec odczynu o wartości pH=7,0 i w temperaturze 30°C nie można było za pomocą spektroskopii w nadfiolecie wykryć już żadnej substancji wydzielanej. Pozbawioną komórek ciecz znad osadu zakwaszono stężonym kwasem siarkowym do odczynu o wartości pH=2, by strącić kwas 5-hydroksypirazynokarboksylowy. Następnie zawiesinę ochłodzono do temperatury 4°c i przesączono. Pozostałość po sączeniu przemyto dwukrotnie porcjami po 10 ml wody i osuszono. Łącznie można było wyodrębnić 0,054 mola (7,56 g) kwasu 5-hydroksypirazynokarboksylowego, co odpowiadało 96% wydajności, w odniesieniu do wprowadzonej soli amoniowej kwasu pirazynokarboksylowego. Według cieczowej chromatografii ciśnieniowej zawartość kwasu 5-hydroksypirazynokarboksylowego wyniosła powyżej 90%.

Tabela 1

MgCl₂-6H2O	0,8 g/l
CaCl2	0,16 g/l
Na₂SO4	0,25 gH
KH2PO4	0,4 g/U
NH2HPO4	0,9 gU
SLF	1 ml/1
FeEDTA	15 ml/1
Skład mikropierwiastków (S
KOH	5 g/I
EDTANa2 · 2H2O	100g/l
ZnSO4 · 7H2O	9 gH
MnCl2 · 4H2O	4 gH

Skład środowiska soli mineralnych

169 635

H3BO3 2,7 gH

CoCl2 · 6H2O 1,8 jgl

CuCl2 · 2H2O 1,8 ggl

NiCl2 · 6H2O 0,18 g/1

Na^MoO₄ · 2H2O 028 g/1.

Skład FeEDTA:

EDTANa2 · 2H2O 8 gfl

FeSO4 · 7H2O 2 g/1.

(Odczyn roztworu nastawiono na wartość pH=7,0).

Przykład III. Mikroorganizm Bacillus sp. hodowano tak, jak opisuje Ensing & Rittenberg (J. Biol. Chem., tom 239, nr 7 1964, strona 2285). Następnie komórki odwirowano odpowiednio do przykładu I i przeprowadzono do środowiska soli mineralnych (tabela l), zawierającego 0,65 mola (94,9 g) soli sodowej kwasu pirazynokarboksylowego. Biotransformacja zachodziła w warunkach analogicznych do przykładu I. Łącznie można było wyodrębnić 0,34 mola (54,8 g) kwasu 5-hydroksypirazynokarboksylowego, co odpowiadało 52,3% wydajności.

Przykład IVI V. Mikroorganizmy Achromobacter xylosoxydans DSM 2783 i Pseudomonas putida NCIB 10521 hodowano odpowiednio do opisu EP-A 152 948 i następnie analogicznie do przykładu I stosowano do biotransformacji. Wyniki zestawiono w tabeli 2.

Tabela 2

Mikroorganizm	Edukt	Produkt	Wydajność
Achromabacter xylosoxydans DSM 2783	Sól sodowa kwasu pirazynokarboksylowego (0,73 moli; 106,5 g)	Kwas 5-hydroksypirazyno- karboksylowy (0,59 moli; 63,7 g)	80%
Pseudomonas putida NCIB 10521	Sól sodowa kwasu pirazynokarboksylowego (0,85 moli; 124,1 g)	Kwas 5-hydroksypirazynokarboksylowy (0,67 moli; 72,4 g)	78,8%

169 635

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 2,00 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Mikrobiologiczny sposób wytwarzania kwasu 5-hydroksypirazynokarboksylowego i/lub jego soli, znamienny tym, że kwas pirazynokarboksylowy i/lub jego sole, jako substrat, przeprowadza się za pomocą mikroorganizmów z rodzajów Pseudomonas i/lub Achromobacter, i/lub Bacillus, i/lub Azorhizobium, i/lub Sarcina, i/lub Mycobacterium w kwas 5-hydroksypirazynokarboksylowy i/lub jego sole, przy czym ten ostatni nagromadza się w środowisku.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że reakcję tę przeprowadza się za pomocą mikroorganizmów gatunku Pseudomonas acidovorans DSM 4746 lub ich potomstwa i mutantów.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że reakcję tę przeprowadza się za pomocą mikroorganizmów gatunku Pseudomonas putida NCIB 10521 i/lub za pomocą mikroorganizmów gatunku Pseudomonas putida NCIB 8176 lub jego potomstwa i mutantów.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że reakcję tę przeprowadza się za pomocą mikroorganizmów gatunku Achromobacter xylosoxydans DSM 2402 i/lub za pomocą mikroorganizmów gatunku Achromobacter xy!osoxydans DSM 2783 lub ich potomstwa i mutantów.
5. Sposób według zastrz. 1, albo 2, albo 3, albo 4, znamienny tym, że reakcję tę prowadzi się w warunkach jednokrotnego lub nieprzerwanego dodawania substratu tak, żeby stężenie substratu nie przewyższało 20% wagowych.
6. Sposób według zastrz. 1, albo 2, albo 3, albo 4., znamienny tym, że reakcję tę przeprowadza się w warunkach aerobowych wobec odczynu o wartości pH rzędu 4-10 i w temperaturze 10-60°C.