PL169859B1

PL169859B1 - Sposób hamowania tworzenia sie w ziemniakach skrobi typu amylopektyny PL

Info

Publication number: PL169859B1
Application number: PL91299927A
Authority: PL
Inventors: Per Hofvander; Per T Persson; Anneli Tallberg; Olle Wikstroem
Original assignee: Amylogene Hb
Priority date: 1990-12-21
Filing date: 1991-12-20
Publication date: 1996-09-30
Also published as: AU9109791A; SE467160B; EP0563201A1; SE9004095L; WO1992011375A1; SE9004095D0

Abstract

Sposób hamowania tworzenia sie w zie- mniakach skrobi typu amylopektyny, znamien- ny tym, ze prowadzi sie modyfikacje ziemniaka technika inzynierii genetycznej poprzez wpro- wadzenie do genomu tkanki ziemniaka kons- trukcji antysensownej zawierajacej promotor specyficzny dla bulw o sekwencji oznaczonej jako ID nr 1, poczatek transkrypcji i pierwszy egzon genu kodujacego tworzenie sie enzymu rozgaleziajacego (genu BE) w ziemniakach, przy czym ten egzon jest wlaczony w kierunku antysensownym. P L 169859 B 1 PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób hamowania tworzenia się w ziemniakach skrobi typu amylopektyny.

Modyfikacja ziemniaka techniką inżynierii genetycznej według wynalazku prowadzi do wytworzenia zwiększonej ilości skrobi typu amylozy w porównaniu ze skrobią typu amylopektyny normalnie występującą w ziemniaku. Modyfikacja ta polega na włączeniu do ziemniaka fragmentu genu zawierającego początek transkrypcji oraz część genu kodującego powstawanie w ziemniaku enzymu rozgałęziającego (gen BE), przy czym tego włączenia dokonuje się w kierunku antysensownym łącznie z promotorem specyficznym dla bulw.

Skrobia w różnych jej formach ma ogromne znaczenie w przemyśle spożywczym i papierniczym. W przyszłości będzie miała również ogromne petencjalne zastosowanie do produkcji polimerów ulegających degradacji przeznaczonych np. na materiały opakowaniowe. Znanych jest wiele różnych produktów skrobiowych wytwarzanych przez modyfikacje skrobi naturalnej pochodzącej między innymi z kukurydzy i z ziemniaków. Skrobia ziemniaczana i kukurydziana współzawodniczą ze sobą na głównych obszarach rynków zbytu.

W bulwie ziemniaczanej skrobia stanowi największą część substancji stałych. W skrobi ziemniaczanej około 1/4 do 1/5 zawartości stanowi amyloza a resztę - amylopektyna. Te dwa składniki skrobi mają odmienne zastosowania, a zatem możliwość wytwarzania albo czystej amylozy albo czystej amylopektyny jest bardzo interesująca. Te dwa składniki skrobi można wytwarzać ze zwykłej skrobi; wymaga to jednak wieloetapowego procesu przetwarzania i w konsekwencji jest kosztowne i skomplikowane.

Obecnie okazało się, że metodą inżynierii genetycznej możliwa jest taka modyfikacja ziemniaka, w której zmienia się wzajemne proporcje między tymi dwoma składnikami skrobi (amylozy i amylopektyny) w bulwach ziemniaczanych. W wyniku, uzyskuje się skrobie o takiej jakości, że mogą one współzawodniczyć w takich dziedzinach, w których dotychczas skrobia ziemniaczana nie była stosowana. Skrobia z ziemniaków modyfikowanych metodą inżynierii genetycznej ma ogromne potencjalne znaczenie jako dodatek do żywności, gdyż nie poddaje się jej żadnym procesom obróbki chemicznej.

Synteza skrobi

Synteza skrobi i procesy regulacji tej syntezy są obecnie wnikliwie badane zarówno na poziomie badań podstawowych jak i ze względu na zastosowanie przemysłowe. Jakkolwiek zebrano już wiele wiadomości na temat udziału pewnych enzymów w transformacji sacharozy do skrobi, biosynteza skrobi nie została jeszcze wyjaśniona. Wykonując badania przede wszystkim na kukurydzy udało się jednak wyjaśnić część dróg syntezy i określić enzymy biorące udział w tych reakcjach. Najważniejszymi enzymami syntetyzującymi skrobię z następnym wytwarzaniem ziaren skrobi jest syntetaza skrobi oraz enzym rozgałęziający. W kukurydzy, dotychczas stwierdzono

169 859 obecność i zbadano trzy formy syntetazy skrobi, z których dwie są rozpuszczalne a jedna wstępuje w formie nierozpuszczalnej, związanej z ziarnami skrobi. Również enzym rozgałęziający w kukurydzy składa się z trzech form, prawdopodobnie kodowanych przez trzy różne geny.

Enzym rozgałęziający w różnych gatunkach roślin

Ziarna skrobi zawierają mieszaninę cząsteczek liniowych i rozgałęzionych, tworzących składnik skrobi: amylozę i amylopektynę. Amylopektyna powstaje w interakcji pomiędzy syntetazą skrobi i enzymem rozgałęziającym, cr-l,4-glukanem i α-l,4ggluknno--gglukozylotransferazą (EC 2.4. -.-8). Enzym rozgałęziający (BE) hydrolizuje wiązania a-1,4 i syntetyzuje wiązania a-1,6 (Mac Donald i Preiss, -985; Preiss, -988).

Bielmo zwykłej kukurydzy zawiera trzy formy białka BE, oznaczone jako BE I, BE Ila i BE Ilb. Czynnik wydłużający łańcuchy amylozy (ae) hamuje aktywność enzymu BE Ilb, co prowadzi do zmniejszenia zawartości amylkpeUtynz i odpowiedniego wzrostu zawartości amzlkoy. Bielmo ae zawiera zatem inną proporcję amylozy do amylopeptyny niż ta, która występuje w zwykłej kukurydzy, to znaczy 65:35 zamiast 25:75 (De Vries Kuranda, ł987).

Jakkolwiek podobieństwo między tymi trzema formami enzymu jest duże, każda z tych form, posiada właściwości związane z własną strukturą pierwszorzędową, co sprawia, że jest niepowtarzalna. Dotychczas nie zostały zidentyfikowane geny dla każdej formy enzymu, ale każdy gen według wszelkiego prawdopodobieństwa można scharakteryzować poprzez izolację klonów cDN A dla każdej z form enzymu BE.

W normalnym grochu zidentyfikowano dwie formy enzymu rozgałęziającego (BE). Mutacja w locus r, dająca pofałdowania ziarna grochu wpływa na aktywność enzymu BE, hamując jedną formę tego enzymu. W wyniku daje to zmieniony skład skrobi z 30% zawartością amylopektyny i 70% zawartością amylozy, w porównaniu z odwrotną proporcją występującą w normalnym, okrągłym grochu (Smith, ł988).

Enzym rozgałęziający ziemniaka (BE) jest białkiem mnaomeIyconzm, to znaczy, jest pojedynczą formą enzymu. Ciężar cząsteczkowy BE z ziemniaka wynosi od 79 do -03 kD, zależnie od zastosowanego sposobu oczyszczania. Istnieją wskazówki, że BE ziemniaka powinna składać się z wielu form, lecz prawdopodobnie wiele z tych form jest produktami degradacji rzeczywistego białka (Vks-Scheperkeuter, -989; Blennow i Johansson, -990).

Sekweacjnnnwαnie peptydów trzech form BE, rozdzielonych metodą elektroforezy wykazało tak dużą hkmklogię między tymi formami enzymu, że przypuszcza się, iż pochodzą one z tego samego źródła. Przypuszczenie to popierają próby serologiczne, gdyż antysurowice uzyskane z tych trzech form enzymu dają ze sobą reakcje krzyżowe.

Hamowanie enzymu rozgałęziającego

Przez hamowanie jednej z form enzymu rozgałęziającego w kukurydzy i w grochu zmienia się skład skrobi w taki sposób, że silnie wzrasta zawartość amylozy z jednoczesnym zanikiem produkcji amylopektyny.

W ziemniaku nie znaleziono dotychczas naturalnego genotypu o zwiększonej zawartości amylozy. Możliwe jest jednak zmniejszenie zawartości BE w zmiennym stopniu, co powoduje zmianę składu skrobi w bulwach ziemniaka w kierunku zwiększenia zawartości amylozy w porównaniu ze zwykłym ziemniakiem.

Hamowanie powstawania enzymu można prowadzić kilkoma drogami, na przykład przez:

- traktowanie mutagenem, co powoduje modyfikację sekwencji genu kodującej powstawanie tego enzymu;

- wprowadzenie transpozomu do sekwencji genu kodującej enzym;

- modyfikowanie techniką inżynierii genetycznej polegające na modyfikowaniu ekspresji genu kodującego enzym na drodze tak zwanego αntysenskwaego hamowania genu.

Fig. - przedstawia specyficzną supresję normalnej ekspresji genu polegającą na tym, że poddaje się hybrydyzacji komplementarny nukleotyd aatyseasowny z mRNA dla genu docelowego. Ten aatyseaskwny nukleotyd jest aatysensowaym RNA, którego tianskrypcja zachodzi in vivo z „odwróconej sekwencji genu (Izant, -989).

169 859

Stosując technikę antysensowną hamowano wiele różnych funkcji genu w roślinach. Antysensowne konstrukcje dla syntetazy chalkonowej, poligalakturonazy i acetylotransferazy fosflnotrycyny stosowano do hamowania odpowiednich enzymów w putenii, pomidorach i w tytoniu (Van

Krol i wsp., 1990; Sheehy i wsp., 1988; Corneli:

ιωοοί

Stwierdzono, ze jest możliwe zmienne zwiększanie produkcji amylozy w bulwach ziemniaka przez zastosowanie techniki antysensownego hamowania genu.

Przedmiotem wynalazku jest sposób hamowania tworzenia się w ziemniakach skrobi typu amylopektyny, polegający na tym, że prowadzi się modyfikację ziemniaka techniką inżynierii genetycznej poprzez wprowadzenie do genomu tkanki ziemniaka konstrukcji antysensownej zawierającej promotor specyficzny dla bulw o sekwencji oznaczonej jako ID nr 1, początek transkrypcji i pierwszy egzon genu kodującego tworzenie się enzymu rozgałęziającego (genu BE) w ziemniakach, przy czym ten egzon jest włączony w kierunku antysensownym.

Zgodnie ze sposobem według wynalazku funkcję genu BE, a zatem i wytwarzanie amylopektyny w ziemniaku hamuje się w zmiennym stopniu przez zastosowanie nowych konstrukcji antysensownych. Takie konstrukcje antysensowne zawierają promotor specyficzny dla bulw, początek transkrypcji i pierwszy egzon genu kodującego powstawanie enzymu rozgałęziającego (genu BE) w ziemniaku, włączone w kierunku antysensownym.

Sposób według wynalazku powoduje hamowanie tworzenia się skrobi typu amylopektyny w ziemniakach, dzięki czemu w bulwach ziemniaka powstaje zwiększona ilość skrobi typu amylozy, przy czym wzrost tej ilości jest zmienny.

Sposób według wynalazku jest bardziej szczegółowo opisany w odniesieniu do załączonych rysunków, na których fig. 1 przedstawia zasadę antysensownego hamowania genu, a fig. 2 przedstawia konstrukcje antysensowne stosowane w sposobie według wynalazku (według Bevan'a, 1984), zaś fig. 3 przedstawia sekwencję promotora specyficznego dla bulw, pod nazwą: sekwencja ID nr 1.

Izolowanie genomowego genu BE ziemniaków

W oparciu o znaną sekwencję peptydu będącego produktem genu BE w ziemniakach wytwarza się dwa syntetyczne oligonukleotydy częściowo się nakładające. Te dwa oligonukleotydy (wytworzone w Instytucie Biologii Komórki w Upsali, Szwecja) stosuje się do identyfikacji klonów cDNA z banku cDNA w lambda gt 11 (przygotowanego przez Clontech, Stany Zjednoczone). Te klony cDNA stosuje się do izolowania genomowego genu BE z banku genomowego w EMBL 3 (wytworzonego w Clontech, Stany Zjednoczone).

Konstrukcje antysensowne

Korzystny jest zmienny stopień wzrostu zawartości amylozy w bulwach ziemniaka, dlatego też konstruuje się różne typy genów antysensownych, które w większym lub mniejszym stopniu hamują ekspresję genu BE in vivo. Wychodzi się z izolowanego genomowego genu BE, dzięki czemu konstrukcje antysensowne zawierają części genu BE odpowiadające sekwencjom regionu promotora, początku transkrypcji i pierwszego egzonu.

W celu uzyskania zarówno zmienności w zawartości amylozy jak również specyficzności tkankowej, co oznacza, że wytwarzanie amylopektyny powinno być ograniczone jedynie do bulw, sprzęga się różne promotory specyficzne dla bulw z genem antysensownym. Poza własnym promotorem BE bulw, stosuje się następujące promotory w różnych kombinacjach: 35S CaMV, patatyny 1 (uzyskany od dr M.Bevan's, W.Brytania) i promotor genu GBSS ziemniaka.

Promotor GBSS jest włączony do genu ziemniaka kodującego tworzenie się syntetazy skrobi związanej z ziarnami skrobi. Jest to enzym w głównej mierze odpowiedzialny za tworzenie się amylozy w ziemniaku.

Jako bazę do wszystkich konstrukcji genowych stosuje się binarne plazmidy Ti, pBI 121 i pBI 101 (dostarczone przez Clontech, Stany Zjednoczone) (fig. 2), co oznacza, że NPT-II i gen GUS są markerami selekcyjnymi. Gen GUS jest genem kodującym β-glukuronidazę.

169 859

Transformowanie

Uzyskane konstrukcje antysensowne przenosi się do bakterii dogodnie metodą „zamrażania odmrażania (An. i wsp., 1988). Przeniesienie rekombinantowej bakterii do tkanki ziemniaka zachodzi na drodze inkubacji tkanki ziemniaka z rekombinantową bakterią w odpowiedniej pożywce po uprzednim pewnym rodzaju uszkodzenia tej tkanki. Podczas inkubacji, T-DNA z bakterii wchodzą do DNA gospodarza roślinnego. Po inkubacji bakterie zabija się i tkankę ziemniaka przenosi się do stałego podłoża do hodowli kallusa i prowadzi się inkubację hodując kallus.

Po szeregu hodowli na dalszych odpowiednich pożywkach tworzą się kiełki, które wycina się z tkanki ziemniaka.

Jako pierwszy sprawdzian, czy konstrukcje antysensowne zostały przeniesione do tkanki ziemniaka prowadzi się analizę na obecność użytego markera.

Następne sprawdziany polegają na testowaniu ekspresji konstrukcji antysensownych i ich przeniesienia do genomu ziemniaka metodami hybrydyzacji Southern'a i Northern'a (Maniatis i wsp., 1982). Ilość kopii konstrukcji antysensownych, które zostały przeniesione oznacza się metodą hybrydyzacji Southern'a.

Oznaczanie ekspresji na poziomie białka dogodnie prowadzi się na mikrobulwach wyhodowanych in vitro na transformowanych odroślach, co pozwala na przeprowadzenie oznaczenia tak szybko jak to tylko możliwe.

Oznaczanie skrobi

Skład skrobi w mikrobulwach jest identyczny z tym, jaki występuje w zwykłych bulwach ziemniaka, a więc, wpływ konstrukcji antysensownych na wytwarzanie amylopektyny oznacza się w mikrobulwach. Proporcję amylozy do amylopektyny oznacza się spektrofotometrycznie (np. metodą opisaną przez Hovenkamp-Hermelink'a i wsp., 1988).

Ekstrakcja amylozy z ziemniaków amylozowych

Ekstrakcję amylozy z tak zwanych ziemniaków amylozowych (ziemniaków, w których w różnym stopniu zostało ograniczone wytwarzanie amylopektyny przez insercję konstrukcji antysensownych) prowadzi się w znany sposób.

Derywatyzacja amylozy

Zależnie od ostatecznego przeznaczenia amylozy, modyfikuje się jej własności fizyczne i chemiczne przez derywatyzację. Pod pojęciem derywatyzacji rozumie się tu traktowanie chemiczne, fizyczne i enzymatyczne skrobi oraz połączenia tych metod (skrobie modyfikowane).

Derywatyzację chemiczną, to jest chemiczną modyfikację amylozy można prowadzić w różny sposób, np. przez utlenianie, kwaśną hydrolizę, dekstrynizację, różne formy eteryfikacji, takie jak kationizacja, hydroksypropylowanie i hydroksyetylowanie, różne formy estryfikacji, np. octanem winylowym, bezwodnikiem octowym albo przez tworzenie pochodnych monofosforanowych, dwufosforanowych albo przez działanie oktenylobursztynianem lub przez połączenie tych sposobów.

Fizyczną modyfikację amylozy można prowadzić np. przez suszenie rurowe lub wytłaczanie.

W derywatyzacji enzymatycznej uzyskuje się degradację (zmniejszenie lepkości) i modyfikację chemiczną amylozy przez działanie dostępnymi układami enzymatycznymi.

Derywatyzację prowadzi się w różnych temperaturach, zależnie od żądanego produktu końcowego. Najczęściej stosuje się zakres temperatur 20-45°C lecz możliwe jest stosowanie temperatur do 180°C.

Sposób według wynalazku jest bardziej szczegółowo opisany w poniższych przykładach.

Przykład I. Wytwarzanie mikrobulw z włączonymi konstrukcjami antysensownymi

Konstrukcje antysensowne ( fig. 2) przenosi się do Agrobacterium tumefaciene LBA 4404 metodą „zamrażania-rozmrażania (An i wsp., 1988). Przeniesienie do tkanki ziemniaka wykonuje się postępując według zmodyfikowanego przepisu podanego przez Rocha-Sosa'ę i wsp. (1989).

169 859

Krążki liści z hodowanych in vitro roślin ziemniaka inkubuje się w ciemności, w czasie 2 dni, w ciekłej pożywce MS (Murashige i Skoog, ł962) z dodatkiem 3% sacharozy i 0,5% MES łącznie z ilością W0pl zawiesiny rekombinαntowegk Agrobacterium na ł0 ml pożywki. Po tych dwóch dniach bakterie zabija się. Krążki liści przenosi się do stałego podłoża do indukowania powstawania kallusa i inkubuje się przez 4-6 tygodni, zależnie od wzrostu kallusa. Stosuje się stałe podłoże o następującym składzie:

Podłoże MS + 3% sacharozy rybozyd zeatyny “NAA“ „GA 3“ antybiotyk „Claforan kanamycyna „Gellan mg/litr 0,02 mg/iitr 0,02 mg/ihr 500 mg/litr 50 mg/litr 0^225%

Następne krążki liści przenosi się na podłoże o innym składzie hormonów, zawierające: MS + 3% sacharozy „NAA“ 5 mg/litr “BAP“ 0,1 mg/ikr „Elaforan 500 mg/litr kanamycyna 50 mg/litr „Gellan 0,25%

Krążki liści przechowuje się w tym podłożu przez około cztery tygodnie, po czym przenosi się je do podłoża, w którym stężenie „Elaforanu jest zmniejszone do 250 mg/litr. O ile zachodzi potrzeba, krążki liści przenosi się do świeżego podłoża co 4 do 5 tygodni. Po utworzeniu się odrośli, wycina się je krążków liści i przenosi do identycznego podłoża.

Fakt przeniesienia konstrukcji anty/sensownej do krężków liści początkowo potwierdza się analizując obecność genu GUS. Ekstrakty liści z regenerowanych odrośli analizuje się na aktywność glukuronidazy metodą oznaczania substratu opisaną prze Jefferson'a i wsp. (ł987). Aktywność oznacza się przez ocenę wizualną.

Następne testy ekspresji konstrukcji antyensownych i ich przeniesienie do genomu ziemniaka prowadzi się metodami hybrydyzacji Sothern'a i Nor^er^a, według Maniatisa i wsp. (ł982). Ilość kopii konstrukcji aaiysensowaych, które zostały przeniesione oznacza się metodą hybrydyzacji So^hem^.

Po ustaleniu, że konstrukcje antysensowne zostały przeniesione do genomu ziemniaka i że zachodzi ich ekspresja, rozpoczyna się oznaczenia tej ekspresji na poziomie białka. Testy prowadzi się na mikrobulwach, których wzrost na transformowanych odroślach został indukowany in ytom. Dziki temu unika się czekania na rozwój całkowitej rośliny ziemniaka z bulwami.

Kawałki łodyg z octnośi1 ziemniaka wycina się przy węzłach i umieszcza w modyfikowanym podłożu MS. Tam, po o-3 tygodniówce inkubncji w ciemnnecil w 1611^^1^'/! m-Cpowstaaą mikrobulwy (Bourque w wsp., ł987). Pożywka ta ma następujący skład:

MS + 6% sacharozy kinetyna 2,5 mg/litr ‘ΌΗ^ 2,5 mg/iitr

Wpływ konstrukcji αatysensownych na funkcję genu BE w odniesieniu do aktywności białka BE analizuje się metodą elektroforezy na żelu poliakryloamidowym (HoveaCamp-Hermellnk i wsp., ł987). Z mikrobulw ekstrahuje się skrobię i analizuje się ją na obecność białka BE.

Skład skrobi, to znaczy proporcję amylozy do amylopektyny oznacza się spektrofotometryczme, metodą Hoveakamp'a-Hetmeliak'a i wsp. (-988), wyliczając zawartość każdego składnika skrobi na podstawie wykresów standardowych.

Przykład II. Ekstrakcja amylozy z ziemniaków amylozowych

Ziemniak, w którym głównym składnikiem skrobi jest amyloza, poniżej zwany ziemniakiem amylozowym, modyfikowany techniką inżynierii genetycznej według wynalazku uciera się uwalniając skrobię ze ścian komórkowych.

169 859

Ί

Oddziela się ściany komórkowe (włókna) od soku owocowego i skrobi na sitach wirówki. Sok owocowy oddziela się od skrobi w dwu etapach: początkowo w hydrocyklonach a potem w specjalnie skonstruowanych pasmowych filtrach próżniowych. Następnie prowadzi się końcową rafinację w hydrocyklonach, gdzie oddziela się pozostałą ilość soku owocowego i włókna.

Produkt suszy się w dwóch etapach, najpierw susząc wstępnie na fritrze próżniowym a następnie w przepływie gorącego powietrza.

Przykład III. Chemiczna derywatyzacja amylozy

Amylozę rozrabia się wodą użytą w takiej ilości, aby jej stężenie wynosiło 20-50%. Odczyn zawiesiny doprowadza się do wartości pH 10,0-12,0 i dodaje się czwartorzędowy związek amoniowy w takiej ilości, aby osiągnąć stopień podstawienia w zakresie 0,004-0,2. Temperaturę reakcji utrzymuje się w zakresie 20-45°C. Po zakończeniu reakcji doprowadza się pH do wartości 4-8, po czym produkt przemywa się i suszy. Otrzymuje się kationową pochodną skrobi, eter 2-hydroksy-3trójmetylo-amoniowy propylo - skrobi.

Przykład IV. Chemiczna derywatyzacja amylozy

Amylozę zarabia się wodą użytą w takiej ilśoci, aby jej zawartość w mieszaninie wynosiła 10-25% (wagowo). Odczyn mieszaniny doprowadza się do wartości pH 10,0-12,0 i dodaje się czwartorzędowy związek amoniowy w takiej ilości, aby stopień podstawienia w końcowym produkcie wynosił 0,004-0,2. Temperaturę reakcji utrzymuje się w zakresie 20-45°C. Po zakończeniu reakcji doprowadza się pH do wartości 4-8. Końcowy produkt jest eterem 2-hydroksy-3trójmetyloamoniowym propyloskrobi.

Przykład V. Chemiczna derywatyzacja amylozy

Amylozę zarabia się wodą do stężenia 20-50% (wagowo), doprowadza się pH mieszaniny do wartości 5,0-12,0 i dodaje się podchloryn sodowy w takiej ilości, aby uzyskać żądaną lepkość końcowego produktu. Temperaturę reakcji utrzymuje się w zakresie 20-45°C. Po zakończeniu reakcji doprowadza się pH do wartości 4-8, po czym produkt przemywa się i suszy. Uzyskuje się utlenioną skrobię.

Przykład VI. Fizyczna derywatyzacja amylozy

Amylozę zarabia się wodą do stężenia 20-50% (wagowo), po czym breję podaje się do grzanego cylindra i suszy się ją do utworzenia warstwy skrobi.

Przykład VII. Chemiczna i fizyczna derywatyzacja amylozy

Amylozę poddaje się modyfikacji chemicznej w procesach opisanych w przykładach III-V, a następnie derywatyzacji fizycznej prowadzonej według przykładu VI.

FIG. 2 Konstrukcje antysensowne. Poza RB i IB jako pBIN19

^glukuronidaza (GUS) N0S~t6r

Promotor

CaMV 35S

FIG.3

AACCATCCTT CCTTTTAGCA GTGTATCAAT TTTGTAATAG AACCATGCAT 50 ACTCAATCTT AATACTAAAA TGCAACTTAA TATAGGCTAA ACCAAGTAAA 100 GTAATGTATT CAACCTTTAG AATTGTGCAT TCATAATTAG ATCTTGTTTG 150 TCGTAAAAAA TTAGAAAATA TATTTACAGT AATTTGGAAT ACAAAGCTAA 200 GGGGGAAGTA ACTAATATTC TAGTGGAGGG AGGGACCAGT ACCAGTACCT 250 AGATATTATT TTTAATTACT ATAATAATAA TTTAATTAAC ACGAGACATA 300 GGAATGTCAA GTC-GTAGCGT AGGAGGGAGT TGGTTTAGTT TTTTAGATAC 350 TAGGAGACAG AACCGGACGG CCCATTGCAA GGCCAAGTTG AAGTCCAGCC 400 GTGAATCAAC AAAGAGAGGG CCCATAATAC TGTCGATGAG CATTTCCCTA 450 TAATACAGTG TCCACAGTTG CCT7CTGCTA AGGGATAGCC ACCCGCTATT 500 CTCTTGACAC GTGTCACTGA AACCTGCTAC AAATAAGGCA GGCACCTCCT 550 CATTCTCACT CACTCACTCA CACAGCTCAA CAAGTGGTAA CTTTTACTCA S00 TCTCCTCCAA TTATTTCTGA TTTCATGCA 629

7Me

FIG. 1 5' Gppp AUGGCAAG AAAAAAAA 3' mRNA

Gen będący celem antysensownego RNA

Przetwarzanie Transkrypcja transport i translacja

EATCGCAAGj^

Promotor

Białko powstające w procesie translac j i

Konstrukcja anty sensowna hamuje \pkspresję genu mRNA

5' Gppp AUGGCAAG AAAAAAAA 3' ' I I I I I

3' UACCGUUC 5'

Antysensowny RNA iCTTGCCATK /f GAACGGTALMI [Gen antysensowny wytwarzający antysensowny (jRNA____

Departament Wydawnictw UP RP Nakład 90 egz. Cena 2,00 zł

Claims

Zastrzeżenie patentowe

Sposób hamowania tworzenia się w ziemniakach skrobi typu amylopektyny, znamienny tym, że prowadzi się modyfikację ziemniaka techniką inżynierii genetycznej poprzez wprowadzenie do genomu tkanki ziemniaka konstrukcji antysensownej zawierającej promotor specyficzny dla bulw o sekwencji oznaczonej jako ID nr 1, początek transkrypcji i pierwszy egzon genu kodującego tworzenie się enzymu rozgałęziającego (genu BE) w ziemniakach, przy czym ten egzon jest włączony w kierunku antysensownym.