PL169957B1

PL169957B1 - Sposób wytwarzania kwasu nukleinowego kodujacego bialko z Theobroma cacao PL PL

Info

Publication number: PL169957B1
Application number: PL91309171A
Authority: PL
Inventors: Margaret E Spencer; Rachel Hodge
Original assignee: Mars Uk Ltd
Priority date: 1990-06-11
Filing date: 1991-06-07
Publication date: 1996-09-30
Also published as: HU216905B; GB2260327A; HU9203912D0; CA2084058A1; BR9106558A; PT97897A; AU659410B2; FI925612A0; GB2260327B; FI105204B; PT97897B; PL168529B1; DE69128647D1; KR930701602A; FI925612L; ES2113885T3; NO924737L; HUT65581A; PL169138B1; IE74903B1

Abstract

1 . Sposób wytwarzania kwasu nukleinowego kodujacego bialko z Theobroma cacao o masie 23 kDa lub jego fragment o co najmniej 20 aminokwasach, przy czym kwas nukleinowy ma co najmniej czesc sekwencji przedstawiona na fig. 2, znamienny tym, ze sprzega sie kolejne nukleotydy i/lub dokonuje sie ligacji oligo- lub polinukleotydów. 17. Sposób wytwarzania kwasu nukleinowego kodujacego bialko z Theobroma cacao o masie 21 kDa lub jego fragment o co najmniej 20 aminokwasach, przy czym kwas nukleinowy ma co najmniej czesc sekwencji przedstawiona na fig. 2, znamienny tym, ze sprzega sie kolejne nukleotydy i/lub dokonuje sie ligacji oligo- lub polinukleotydów. P L 169957 B 1 PL PL

Description

Przedmiotem wynalazkujest sposób wytwarzania kwasu nukleinowego kodującego biało z Theobroma cacao o masie 23 kDa i o masie 21 kDa lub jego fragment.

Ziarna kakaowca (Theobroma cacao) stanowią surowiec do produkcji kakao, czekolady oraz naturalnych kakaowych i czekoladowych esencji smakowo-zapachowych. Jak opisał Rohan [Processing of Raw Cocoa for the Market, FAO/UN (1963)], surowe ziarna kakaowe oddziela się od zebranych owoców kakaowca, z których zwykle usuwa się owocnię, po czym ziarna poddaje się fermentacji trwającej kilka dni, podczas której ziarna ulegają zabiciu, a z liścieni uwalnia się purpurowy barwnik. Podczas fermentacji powstają nieznane związki, które podczas wypalania dają charakterystyczny kakaowy smak i zapach. Rohan sugeruje, że w wytwa4

169 957 rzaniu prekursora smaku i zapachu biorą udział polifenole i teobromina. Po zakończeniu fermentacji ziarna suszy się; podczas tego suszenia powstaje charakterystyczne, brązowe zabarwienie, a następnie wysuszone ziarna magazynuje się i wysyła.

Biehl i wsp., 1982, badali rozkład białka podczas beztlenowej inkubacji ziarna kakaowego i zidentyfikowali białka o masie 26 kDa i 44 kDa, które akumulowały się podczas dojrzewania ziaren i ulegały degradacji podczas kiełkowania. Biehl założył, że były to białka zapasowe i sugerował, że te białka mogą być przyczyną powstawania peptydów o specyficznym smaku i zapachu.

Biehl i wsp., 1985 twierdził, że aminokwasy i peptydy są ważne jeśli chodzi o zapach i smak.

Fritz i wsp., 1985, zidentyfikowali polipeptydy o masie 20 kDa i 28 kDa pojawiające się w cytoplazmatycznej frakcji ekstraktów ziarna kakaowego w około 100 dni po zapyleniu. Wydaje się, że białko o masie 20 kDa wykazuje aktywność acylotransferazy glicerylowej.

Pettipher i wsp., 1990 sugerował, że peptydy są istotne dla kakaowego zapachu i smaku i wskazywał na zapasowe białka o masie 48 kDa i 28 kDa.

Pomimo opisanych wyżej wątpliwości w tej dziedzinie wiedzy, dopiero obecnie zidentyfikowano białka rzeczywiście odpowiedzialne za powstawanie smaku i zapachu ziarna kakaowego. Ponadto odkryto, że wbrew przypuszczeniu Fritz'a, jakoby poziomy mRNA ziarna kakaowego są wyjątkowo niskie w porównaniu z innymi roślinami (cytat), możliwe jest stosowanie technik rekombinacji DNA do wytwarzania takich białek.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania kwasu nukleinowego kodującego białko z Theobroma cacao o masie 23 kDa lub jego fragment o co najmniej 20 aminokwasach, przy czym kwas nukleinowy ma co najmniej część sekwencji przedstawioną na fig. 2, polegający na tym, że sprzęga się kolejne nukleotydy i/lub dokonuje się ligacji oligo- polinukleotydów.

Odmianą wynalazku jest sposób wytwarzania kwasu nukleinowego rekombinowanego lub izolowanego kodującego białko z Theobroma cacao o masie 23 kDa lub jego fragment o co najmniej 20 aminokwasach, przy czym kwas nukleinowy ma co najmniej część sekwencji przedstawioną na fig. 2, polegający na tym, że sprzęga się kolejne nukleotydy i/lub dokonuje się ligacji oligo- lub polinukleotydów.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania rekombinowanego lub izolowanego DNA kodującego białko z Theobroma cacao o masie 23 kDa lub jego fragment o co najmniej 20 aminokwasach, przy czym DNA ma co najmniej część sekwencji przedstawioną na fig. 2, polegający na tym, że sprzęga się kolejne nukleotydy i/lub dokonuje się ligacji oligo- lub polinukleotydów.

Ponadto przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania kwasu nukleinowego w postaci wektora ekspresyjnego kodującego białko z Theobroma cacao o masie 23 kDa lub jego fragment o co najmniej 20 aminokwasach, przy czym kwas nukleinowy ma co najmniej część sekwencji przedstawioną na fig. 2, polegający na tym, że sprzęga się kolejne nukleotydy i/lub dokonuje się ligacji oligo- lub polinukleotydów, przy czym sekwencja kodująca białko lub jego fragment jest połączona w sposób umożliwiający działanie z promotorem.

Białko o masie 23 kDa można przetwarzać in vivo, w wyniku czego powstaje polipeptyd o masie 21 kDa.

W związku z tym przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania kwasu nukleinowego kodującego białko z Theobroma cacao o masie 21 kDa lub jego fragment o co najmniej 20 aminokwasach, przy czym kwas nukleinowy ma co najmniej część sekwencji przedstawioną na fig. 2, polegający na tym, że sprzęga się kolejne nukleotydy i/lub dokonuje się ligacji oligo- lub polinukleotydów.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania kwasu nukleinowego rekombinowanego lub izolowanego kodującego białko z Theobroma cacao o masie 21 kDa lub jego fragment o co najmniej 20 aminokwasach, przy czym kwas nukleinowy ma co najmniej część sekwencji przedstawioną na fig. 2, polegający na tym, że sprzęga się kolejne nukleotydy i/lub dokonuje się ligacji oligo- lub polinukleotydów.

Również, analogicznie, przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania rekombinowanego lub izolowanego DNA kodującego białko z Theobroma cacao o masie 21 kDa

169 957 lub jego fragment o co najmniej 20 aminokwasach, przy czym DNA ma co najmniej część sekwencji przedstawioną na fig. 2, polegający na tym, że sprzęga się kolejne nukleotydy i/lub dokonuje się ligacji oligo- lub polinukleotydów.

Kolejną odmianą sposobu według wynalazku jest także sposób wytwarzania kwasu nukleinowego w postaci wektora ekspresyjnego kodującego białko z Theobroma cacao o masie 21 kDa lub jego fragment o co najmniej 20 aminokwasach, przy czym kwas nukleinowy maco najmniej część sekwencji przedstawioną na fig. 2, polegający na tym, że sprzęga się kolejne nukleotydy i/lub dokonuje się ligacji oligo- lub polinukleotydów, przy czym stosuje się sekwencję kodującą białko lub jego fragment połączoną w sposób umożliwiający działanie z promotorem.

We wszystkich wymienionych odmianach sposobu według wynalazku sprzęganie prowadzi się w komórce gospodarza. Korzystnie jako komórkę gospodarza stosuje się komórkę Saccharomyces cerevisiae lub komórkę E. coli.

Używane tu określenie fragment, stosowane do białek lub peptydów dotyczy fragmentu, w którym występuje wystarczająca liczba reszt aminokwasowych, aby fragment taki był użyteczny. Zwykle w takim fragmencie może występować co najmniej cztery, pięć, sześć lub nawet co najmniej 10 lub 20 aminokwasów. Użyteczne fragmenty to te, które są takie same, podobne, albo równoważne fragmentom wytwarzanym naturalnie w etapie fermentacji podczas obróbki ziarna kakaowego. Uważa się, że takie fragmenty biorą udział w reakcjach Maillard'a podczas wypalania, w których powstaje co najmniej kilka ze składników smakowo-zapachowych kakao.

Białka kodowane przez kwas nukleinowy otrzymywany sposobem według wynalazku mogą być białkami syntetycznymi, można je syntetyzować chemicznie, lub korzystnie, stosując techniki rekombinacji DNA. Białka tak wytworzone można zatem nazwać rekombinowanymi białkami. Białka rekombinowane mogą być glikozylowane lub nieglikozylowane: nieglikozylowane białka będą wynikiem ekspresji w układach prokariotycznych.

Theobroma cacao występuje w dwóch podstawowych podgatunkach, Th. cacao i Th. cacao spaerocarpum. O ile białka otrzymywane sposobem według wynalazku mogą pochodzić z tych podgatunków, to wynalazek nie ogranicza się jedynie do wymienionych podgatunków. Na przykład, różne odmiany kakaowca są hybrydami różnych gatunków, przykładem takiej hybrydy jest odmiana trinitario.

Kwas nukleinowy może być otrzymywany także w procesie degradacji kodu kwasu białka dzikiego typu, i taki, który koduje konserwatywne lub inne nieszkodliwe mutanty. Kwas nukleinowy otrzymywany sposobem według wynalazku hybrydyzuje z kwasem dzikiego typu.

Kwas nukleinowy otrzymywany sposobem według wynalazku stanowi na ogół rekombinowany kwas nukleinowy, lecz także wyizolowany kwas nukleinowy. Często, kwas nukleinowy jest wstawiony do wektora (ekspresyjnego lub innego), takiego jak plazmid. Odpowiednie wektory ekspresyjne zawierają odpowiedni promotor, dobrany w zależności od przewidzianego gospodarza ekspresyjnego. Odpowiednim promotorem dla drożdży jest promotor kinazy pirogronianowej (KP), zaś dla bakterii - silny promotor lambda.

Produkt ekspresji może ulegać sekrecji lub nie. Preferuje się produkt ekspresji ulegający sekrecji, zwłaszcza w eukariotycznych układach ekspresyjnych; w takim przypadku obecna jest odpowiednia sekwencja sygnałowa. Sekwencje sygnałowe pochodzące od gospodarza ekspresyjnego (takie jak z drożdżowego czynnika alfa w przypadku drożdży) mogą okazać się dogodniejsze niż natywne sekwencje sygnałowe kakao.

Ponadto w sposobie według wynalazku stosuje się komórki gospodarzy zawierających opisany wyżej kwas nukleinowy. Manipulacje genetyczne mogą być korzystniejsze w prokariotach. Ekspresja natomiast jest korzystniejsza w gospodarzach dopuszczonych do spożycia. Szczególnie preferuje się drożdże Saccharomyces cerevisiae.

cDNA może znaleźć zastosowanie nie tylko do uzyskiwania ekspresji białka, ale także w badaniach polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP). Do takich badań wytwarza się cDNA znakowany tak, aby możliwe było jego wykrywanie (na przykład znakowany radiologicznie). W takim przypadku preparuje się DNA roślin uprawnych do analizy i trawi się go za pomocą enzymów restrykcyjnych. W celu odkrycia genetycznych korelacji pomiędzy

169 957 roślinami uprawnymi stosuje się technikę blottingu Southern ze znakowanym cDNA. Można wówczas wnioskować odnośnie korelacji fenotypowych.

Wynalazek zostanie zilustrowany poniższymi przykładami, które nie ograniczają jego zakresu. Przykłady odnoszą się do załączonych rysunków, na których:

Figura 1 przedstawia mapę klonu cDNA o pełnej długości, hybrydyzującego z sondą oligonukleotydową dla białka o masie 21 kDa, wraz z regionami zsekwencjonowanego DNA;

Figura 2 przedstawia sekwencję cDNA kodującą białko o masie 21 kDa i przewidywaną sekwencję aminokwasową kodowanego prekursora o masie 23 kDa.

Figura 3 przedstawia porównanie pomiędzy białkiem o masie 21 kDa a inhibitorami trypsyny z innych roślin;

Figura 4 przedstawia mapę plazmidu pJLA502;

Figura 5 przedstawia dwa drożdżowe wektory ekspresyjne stosowane w niniejszym wynalazku, wektor A jest przeznaczony do uzyskiwania ekspresji wewnętrznej, a wektor B - do uzyskiwania ekspresji wraz z sekrecją.

Figura 6a przedstawia, w odniesieniu do wektora A, część genu drożdżowej kinazy pirogronianowej, wskazując miejsce do klonowania w wektorze A oraz zastosowanie łączników Hin-Nco do składania genu dla 21 kDa;

Figura 6b przedstawia, w odniesieniu do wektora B, część sekwencji sygnałowej drożdżowego czynnika a, wskazując miejsce do klonowania w wektorze B oraz zastoso wanie łączników Hin-Nco do wytwarzania fuzji w fazie odczuty; oraz

Figura 7 przedstawia napę plazmidów pMY9 i pMY10, o których mowa w przykładzie 16.

Przykład 1. Identyfikacja najważniejszych białek ziarna.

W praktyce nie stosuje się bezpośredniego ekstrahowania białek z ziaren kakao z powodu wysokiej zawartości tłuszczów i polifenoli, dlatego też białka ekstrahowano z proszków acetonowych wytworzonych jak następuje: Dojrzałe ziarna kakaowca z Afryki Zachodniej (Theobroma cacao amelonada) zliofilizowano i wstępnie rozdrobniono w moździerzu za pomocą tłuczka. Lipidy wyekstrahowano metodą ekstrakcji Soxhlet'a eterem dwutlenowym w dwóch czterogodzinnych ekstrakcjach, ziarno suszono i dalej rozdrabniano między ekstrakcjami. Następnie usunięto polifenole i barwniki na drodze kilku ekstrakcji 80% acetonem, 0,1% kwasem tioglikolowym. Masę poekstrakcyjną wysuszono pod próżnią i rozdrobniono na miałki proszek.

Wszystkie białka rozpuszczono przez wymieszanie proszku z buforem ekstrakcyjnym (0,05 M fosforan sodowy, pH 7,2; 0,01 M 2-i^^i^ł^^jot<^^t^^nol; 1% SDS) w ręcznym homogenizatorze, 5 mg/ml. Zawiesinę ogrzewano w ciągu 5 minut w temperaturze 95°C i odwirowano w temperaturze 18 K w ciągu 20 minut, usuwając w ten sposób substancje nierozpuszczalne. Tak otrzymany klarowny supernatant zawierał około 1 mg/ml całego białka. W wyniku elektroforezy 25 μΐ na żelu SDS-PAGE (Laemmli, 1970) otrzymano 3 główne pasma, z których jedno odpowiadało masie 21 kDa i zawierało około 30% wszystkich białek. Przypuszcza się, że białko o masie 21 kDa stanowi podjednostkę polipeptydową głównego białka zapasowego.

Właściwości polipeptydu zapasowego.

Rozpuszczalność polipeptydu o masie 21 kDa określono wstępnie, wykonując jedno lub dwa szybkie doświadczenia. Dializa roztworu polipeptydu wobec buforu ekstrakcyjnego pozbawionego SDS wykazała nierozpuszczalność pewnych polipeptydów, co oceniono na podstawie ich zdolności do przechodzenia przez 0,22-mikronową błonę, podczas gdy polipeptyd o masie 21 kDa pozostał rozpuszczony. Z proszku acetonowego wyekstrahowano za pomocą wody i rozcieńczonych buforów jedynie polipeptyd o masie 21 kDa, co wskazuje na to, że białko to można zaklasyfikować jako albuminę.

Oczyszczanie głównego polipeptydu.

Polipeptydy o masie 21 kDa oczyszczono w dwóch etapach chromatografii żelowej na kolumnie Superose-12 do szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC) firmy Pharmacia, lub przez elektroeluowanie pasm otrzymanych w wyniku preparatywnej elektroforezy (Słowa: Superose i Pharmacia są znakami towarowymi). Z 50 mg proszku acetonowego na 1 ml buforu ekstrakcyjnego przygotowano zatężone ekstrakty białkowe, i 1-2 ml ekstraktów naniesiono na żele SDS-PAGE o grubości 2 mm. Po przeprowadzeniu elektroforezy, powierzchnię żelu zabarwiono za pomocą wodnego błękitu Coomassie Blue, i wycięto skalpelem główne pasma.

169 957

Kawałki żelu poddano 24-godzinnej elektroelucji w torebkach do dializy, w przepływającym buforze do elektroforezy, pod napięciem 15 V, a dializat poddano dalszej dializie wobec 0,1% SDS. Próbki można było zatężyć przez liofilizację.

Przykład 2. Dane odnośnie sekwencji aminokwasowej białka.

Próbki białka (około 10 gg) poddano znanemu sekwencjonowaniu N-końcowych aminokwasów. Dla białka o masie 21 kDa otrzymano sekwencję 12 aminokwasów, i na podstawie tych danych skonstruowano sondę oligonukleotydową (Woods i wsp., 1982; Woods, 1984).

Przykład 3. Wytwarzanie przeciwciał przeciwko polipeptydowi o masie 21 kDa.

Wytworzono przeciwciała poliklonalne przy zastosowaniu metody Catty'ego i Raykundalia'i (1988). Surowicę podzielono na próbki o objętości 1 ml i przechowywano w temperaturze -20°C.

Określenie właściwości przeciwciał przeciwko polipeptydowi o masie 21 kDa.

Surowicę natychmiast zbadano przy zastosowaniu techniki podwójnej dyfuzji Ochterloney'ego. Antygeny i przeciwciała dyfundują w kierunku do siebie od ścianek wyciętych w żelu agarozowym w buforze sól fizjologiczna - boran. Linie precypitacyjne powstają w miejscach, w których przeciwciało rozpoznaje antygen. Ten test uwidocznił że wytworzono przeciwciała przeciwko antygenowi jakim było białko o masie 21 kDa.

Frakcję gamma-globulinową surowicy oczyszczono częściowo przez wytrącenie 50% siarczanem amonowym, rozpuszczenie w soli fizjologicznej buforowej fosforanem (PBS), i chromatograficznie na kolumnie do bibułowej chromatografii jonowymiennej DE 52, jak opisał Hill, 1984. Frakcje zawierające gamma-globulinę obserwowano przy 280 nm (OD280 wynoszącą 1,4 odpowiada 1 mg/ml gamma globuliny) i przechowywano w temperaturze -20°C.

Skuteczne miano przeciwciał zmierzono przy zastosowaniu techniki wykrywania reakcji antygen-przecćwciało przy użyciu przeciwciał związanych z enzymem (ELlSA). Studzienki polistyrenowej płytki do mikrooznaczeń pokryto antygen (10 -1000 ng) i odstawiono na noc w temperaturze 4°C pokryte buforem węglanowym. Studzienki przemyto za pomocą PBS-Tween i dodano badaną gamma globulinę w stężeniach: 10,1 i 0,1 gg/ml (rozcieńczenia w przybliżeniu: 1 : 100, 1 : 1000 i 1 : 10000). Jako rozcieńczalnik zastosowano PBS-Tween zawierający 2% Poliwinylopirolidon (PVP) i 0,2% BSA. W charakterze próbek kontrolnych zastosowano przedtem immunizowaną surowicę tego samego zwierzęcia. Wiązanie zachodziło w temperaturze 37°C w ciągu 3-4 godzin. Studzienki przemyto jak wyżej i dodano drugie przeciwciało (kozia pirzeciwkrólicza IgG związana z zasadową fosfatazą) w stężeniu 1 gg/ml, stosując te same warunki, jak w przypadku pierwszego przeciwciała. Studzienki znowu przemyto i dodano substratu zasadowej fosfatazy (p-nitrofenylofosforan, 0,6 mg/ml, w buforze dwuetanol-amina, pH 9,8). W ciągu 30 minut powstało żółte zabarwienie wskazujące na reakcję dodatnią, po czym reakcję zakończono za pomocą 3 M NaOH. Zabarwienie określono ilościowo przy 405 nm. Więcej szczegółów odnośnie tej metody ujawnia Hill, 1984. Zastosowanie tej metody potwierdziło, że wszystkie przeciwciała mają wysokie miano i że mogą być stosowane w stężeniu 1 gg/ml.

Przykład 4. Izolowanie całego RNA z niedojrzałych ziaren kakaowca.

Materiał wyjściowy dla RNA, zawierający dużą ilość mRNA białek zapasowych stanowiły niedojrzałe ziarna kakaowca, w wielu około 130 dni po zapyleniu. Wcześniejsza praca sugerowała, że synteza białek zapasowych w tym okresie osiąga swój szczyt (Biehl i wsp., 1982). Ziarna w tym wieku są lekko pofałdowane i bladoróżowo-purpurowe.

Wstępnym warunkiem, jaki musiał spełniać cały preparat RNA z ziaren kakaowca było to, aby: po pierwsze nie zawierał on zanieczyszczeń, co oceniono za pomocą widma UV, zwłaszcza w dalekim UV, gdzie czysty RNA można rozpoznać z dużą dokładnością dzięki głębokiemu skokowi przy 230 nm (stosunek 260 nm : 230 nm wynosi w przybliżeniu 2,0), po drugie, aby był on nieuszkodzony, co oceniono metodą elektroforezy próbek zdenaturowanych termicznie w żelu agarozowym, w wyniku której powinny powstać czyste pasma rRNA. Przy wytwarzaniu nieuszkodzonego RNA niezbędne jest zachowanie absolutnej czystości oraz rygorystycznych środków ostrożności przeciwko RNA-azom, które są powszechnie występującymi i bardzo trwałymi enzymami. Szkło laboratoryjne na ogół wypraża się w wysokich temperatu8

169 957 rach, a roztwory i aparaturę poddaje się działaniu inhibitora RNA-azy w postaci eteru dwuetylowego kwasu pirowęglowego (DEPC, 0,1 %) przed obróbką w autoklawie.

Zwykle, ekstrakcji roślinnego (i zwierzęcego) RNA dokonuje się przez ekstrahowanie białek za pomocą fenolu/chloroformu w obecności SDS, prowadzące do zniszczenia kompleksów białko-kwas nukleinowy i do hamowaniaenzymów RNA-az, które występują powszechnie w materiale roślinnym. Po ekstrakcji fenolem, RNA poddaje się obróbce w gradiencie chlorku cezowego, przed lub po precypitacji etanolem. Tym sposobem wytworzono bardziej lub mniej nieuszkodzony RNA, jednakże był on bardzo zanieczyszczony ciemno-brązowym zabarwieniem, prawdopodobnie utlenionymi polifenolami i taninami, które zawsze pozostawały razem z RNA. Wysokie zawartości polifenoli stanowią najważniejszy problem w przypadku tkanek Theobroma.

Z tego powodu zastosowano metodę, w której unika się używania fenolu, a mianowicie matodę Halla i wsp. (1978), która polega na rozbijaniu tkanki w gorącym buforze SDS-boranowym, trawieniu białek proteinazą K i wybiórczej precypitacji RNA za pomocą LiCl. Sposób ten zapewniał uzyskanie wysokich wydajności stosunkowo czystego, nieuszkodzonego RNA. Ponieważ jednak zanieczyszczenia w dalszym ciągu stanowiły problem, sposób zmodyfikowano przez zastosowanie powtarzających się etapów wytrącenia w LiCl, przy czym po każdym etapie osad rozpuszczono w wodzie i klarowano przy użyciu mikrowirówki. W wyniku takiego postępowania otrzymano preparaty RNA o idealnych widmach, które sprawdziły się dobrze w dalszych testach na ich działanie, takich jak translacja in vitro.

Preparowanie mRNA z całego RNA.

Frakcję mRNA oddzielono od całego RNA na drodze chromatografii powinowactwa na małej (1 ml) kolumnie oligo-dT, przy czym mRNA wiązał się z kolumną poprzez swój koniec poli A, RNA (1-2 mg) zdenaturowano przez ogrzewanie w temperaturze 65°C i naniesiono na kolumnę w buforze o wysokiej zawartości soli. Poli A+ eluował wraz z buforem o niskiej zawartości soli i zebrano go przez precypitację etanolem. Sposób ten zasadniczo jest taki, jak opisali Aviv i Leder (1972), a zmodyfikowali Maniatis i wsp. (1982). Z 1 mg całego RNA otrzymano około 10 - 20 μg poli A+ RNA (1 - 2%).

Translacja mRNA in vitro.

Dobrym wskaźnikiem czystości i braku uszkodzeń mRNA jest jego zdolność do translacji in vitro. Przy użyciu kolumny oligo-dT dokonuje się selekcji jedynie kwasów mRNA z nieuszkodzonym końcem poli A (koniec 3'), natomiast zdolność wydajnej translacji mają tylko kwasy mRNA posiadające także nieuszkodzony koniec 5' (początek translacji). Translację in vitro przeprowadzono przy użyciu lizatu z kiełków pszennych, pozbawionego RNA (Amersham International), a syntezę nowo powstającego białka kontrolowano przez włączanie metioniny znakowanej S³⁵ (Roberts i Paterson, 1973). Początkowo szybkość syntetyzowania nowo-powstającego białka mierzono przez włączanie metioniny-S³⁵ do substancji, którą można wytrącić za pomocą TCA, zatrzymywanej na sączkach w włókien szklanych (GFC, Whatman). Rzeczywiście produkty translacji badano metodą elektroforezy w żelu SDS-PAGE, żel nasycono fluorem, suszono i badano autoradiograficznie. Preparaty mRNA były zdolne do wydajnej translacji, a uzyskane produkty translacji obejmowały szeroki zakres mas cząsteczkowych, co wskazywało na to, że otrzymano nieuszkodzone kwasy mRNA nawet dla największych białek. Żaden z głównych produktów translacji nie odpowiadał wielkością polipeptydowi o masie 21 kDa zidentyfikowanemu w dojrzałych ziarnach, tak więc stało się oczywiste, że nowo powstający polipeptyd musi ulegać znacznemu procesowaniu, w wyniku którego tworzy się forma dojrzała.

Przykład 5. Identyfikacja prekursora dojrzałego polipeptydu przez immunoprecypitację.

Z uwagi na to, że zapasowy polipeptyd o masie 21 kDa nie był widoczny wśród produktów translacji mRNA z rozwijających się ziaren kakaowca, do identyfikacji prekursorów w mieszaninie translacyjnej zastosowano technikę immunoprecypitacji przeciwciałami swoistymi wobec polipeptydu o masie 21 kDa. Zrobiono tak z dwóch powodów: po pierwsze - w celu potwier169 957 dzenia, że odpowiedni mRNA był obecny przed klonowaniem, a po drugie - w celu uzyskania informacji odnośnie przewidywanej wielkości genu kodującego.

Immunoprecypitację przeprowadzono metodą Cuming'a i wsp., 1986. Produkty translacji in vitro, znakowane S ³’ poddano dysocjacji w SDS i dopuszczono do wiązania się ich ze swoistym przeciwciałem w PBS + 1% BSA. Następnie mieszaninę przeciwciało-antygen zmieszano z białkiem A-Sepharose i inkubowano na lodzie aby IgG związała się z białkiem A. Zawiesinę umieszczono w strzykawce jednorazowego użytku o pojemności 1 ml i niezwiązane białka usunięto, przemywając PBS + 1% Nonidet P-40. Związane przeciwciało wypłukano 1 M kwasem octowym, a białka wytrącono za pomocą TCA. Kompleks przeciwciało-antygen zdysocjowano w sDs i poddano elektroforezie SDS-PAGE oraz fluorografii uwidaczniającej, które znakowane antygeny związały się ze swoistymi przeciwciałami.

Wyniki wskazywały na to, że przeciwciało anty-21 kDa wytrącało prekursor o masie 23 kDa. Masa prekursora odpowiadała głównemu pasmu produktów translacji in vitro.

Przykład 6. Syntezy cDNA z preparatów mRNA.

Syntezy cDNA dokonano przy zastosowaniu zestawu firmy Amersham International. Pierwszą nić cDNA zsyntetyzowano przy użyciu enzymu odwrotnej transkryptazy, czterech zasad nukleotydowych DNA (dATP, dTTP, dGTP, dCTP i startera oligo-dT. Drugą nić zsyntetyzowano metodą Gubler'a i Hoffman'a (1983), w której nić RNA rozrywa się w wielu miejscach za pomocą RNA-azy H, a pozostałe fragmenty stosuje się do syntezy na drodze wymiany nowej nici DNA, którą to syntezą kieruje enzym polimeraza DNA I E.coli. Wystające końce 3' DNA wypełnia się przy użyciu polimerazy T4. Cały proces kontrolowano przez dodanie do wyjściowej mieszaniny nukleotydów małej ilości dCTP[‘P³²] i mierzenie w % włączania znakowanego nukleotydu do DNA. Zakładając, że nukleotydy nieznakowane ulegają włączaniu z taką samą szybkością i że cztery zasady ulegają włączaniu równomiernie, można ocenić przebieg syntezy cDNA. Z 1 pg mRNA zsyntezyzowano w przybliżeniu 140 ng cDNA. Produkty analizowano na alkalicznym 1,4% żelu agarozowym tak, jak ujawniono w sposobach Amersham'a. cDNA globiny, który syntetyzowano w zestawie jako kontrolę, przepuszczono przez ten sam żel, który wysuszono i poddano autoradiografii. Masy cząsteczkowe cDNA z kakaowca wahały się w pewnym zakresie, przy czym jest on dłuższy od cDNA globiny zasadniczo o więcej niż 600 bp.

Przykład 7. Klonowanie cDNA w wektorze plazmidowym metodą przyłączania identycznych zasad do końca 3' cząstki DNA (Homopolymer Tailing).

Sposób klonowania cDNA w wektorze plazmidowym polegał na tym, że koniec 3' cDNA przedłużono resztami dC przy użyciu enzymu terminalnej transferazy (Boehringer Corporation Ltd) i zhybrydyzowano z plazmidem przeciętym przez Pstl i przedłużonym na końcu 5' (Maniatis i wsp., 1982, Eschenfeldt i wsp., 1987). Optymalna długość przedłużenia dC wynosi 12-20 reszt. Reakcję przedłużania (warunki jak podane przez wytwórców) kontrolowano przy użyciu fragmentu restrykcyj nego o długości 1,5 kb z tępymi końcami,_pobierając próbki co pewien czas i obserwując włączanie małych ilości dCTP znakowanego [T^]. Próbkę cDNA (70 ng) przedłużono w ustalonych z góry warunkach.

Wektor plazmidowy z przedłużeniem dG (pUC9 z przedłużeniem 3' -ollgo(dG) zakupiono w firmie Pharmacia. 15 ng wektora poddano hybrydyzacji z 0,5 -5 ng cDNA w temperaturze 58°C w ciągu 2 godzin w buforze do hybrydyzacji: 5 mM Tris-HCl, pH 7,6; 1 mM EDTA, 75 mM NaCl w całkowitej objętości 50 pl. Mieszaniną poddaną hybrydyzacji stransformowano E.coli RRI (Bethesda Research Laboratories), a transformanty wyselekcjonowano na agarze-α + 100 pg/ml ampicyliny. Otrzymano około 200 transformantów na 1 ng cDNA. Transformanty utrzymywano przez hodowanie ich w 100 pl pożywki L, w studzienkach płytki do mikrooznaczeń, dodając 100 pl 80% glicerolu i przechowując w temperaturze -20°C.

Pewną ilość cDNA przedłużonego o dC wyselekcconowano w oparciu o wielkość przez elektroforezę w 0,8% żelu agarozowym, wycięcie kawałków żelu z miejsc odpowiadających 0,5, 1,0 i 1,5 kb, wstawienie bibuły DE81 i kontynuowanie elektroforezy do momentu, aż cDNA wniknął na bibułę DE81. Następnie DNA wypłukano z bibuły za pomocą buforu o wysokiej zawartości soli sposobem Dretzen'a i wsp. (1981).

169 957

Przykład 8. Konstrukcja sond oligonukleotydowych dla genu 21 kDa.

N-koniec polipeptydu o masie 21 kDa określony wyżej w przykładzie 2 był następujący: Ala - Asn - Ser - Pro - Leu - Asp - Thr - Asp - Gly Asp - Glu.

Jego region optymalny do zsyntetyzowania sondy z 17 reszt był następujący:

Asp -	Thr -	Asp -	lyly -	Asp -	Glu
5' GAC	ACC	GAC	GGC	GAC	GA 3
T	T	T	T	T
	A		A

G G

Skonstruowana 17-meiOwa sondajest przedstawioną poniżej sekwencją: w rzeczywistości stanowi ona mieszaninę 128 różnych odcinków 17-merowych, z których jeden musi być rzeczywistą sekwencją kodującą. Sondę zsyntetyzowano przy użyciu urządzenia Applied Biosystems.

Sondę dla 21 kDa oczyszczono elektroforetycznie na 20% żelu akryloamidowym, a pasma wykrywano przez zacienianie UV i eluowano przy zastosowaniu dializy wobec wody.

Przykład 9. Zastosowanie oligonukleotydów do sondowania biblioteki cDNA.

Sondy oligonukleotydowe znakowano na końcach 5' za pomocą y[’P³²]dATP i enzymem kinazą polinukleotydową (Amersham International). Stosowano metodę Woods'a (1982, 1984) z takim wyjątkiem, że do znakowania około 40 ng sondy w 10 nM MgCh, 100 mM Tris-HCl, pH 7,6; używano mniejszej ilości izotopu (15 gCi) oraz 20 nM 2-merkaptoetanolu.

Bibliotekę cDNA namnożono na nylonowych błonach GeneScreen (new England Nuclear) umieszczonych na powierzchni płytek z agarem L+ 100 gg/ml ampicyliny. (Słowo GeneScreen jest znakiem towarowym). Kolonie przeniesiono z płytek do mikrooznaczeń na błony przy użyciu urządzenia z wypustkami 6x85, dopasowanego do Studzianek połówki płytki do mikrooznaczeń. Kolonie hodowano w ciągu nocy w temperaturze 37°C, zlizowano przy użyciu wodorotlenku sodowego i związano z błonami jak opisał Woods (1982, 1984). Po wysuszeniu płytki przemyto dokładnie w 3 x SSC/0,1% SDS o temperaturze 65°C i poddano hybrydyzacji ze znakowaną sondą przy użyciu urządzenia Hybaid firmy Hybaid Ltd., PO Box 82, Twickenham, Middlesex. (Słowo Hybaid jest znakiem towarowym). Stosowano warunki hybrydyzacji jak opisali Mason i Williams (1985), a Td obliczono dla każdego oligonukleotydu według wzoru:

Td = 4°C na parę zasad GC + 2°C na parę zasad AT (w przypadku pozycji złożonych stosowano najniższą wartość).

Hybrydyzację prowadzono w Td: -5°C. Przemywano w 6 x SSC, 0,1% SDS, początkowo w temperaturze pokojowej w urządzeniu Hybaid, a następnie w temperaturze hybrydyzacji (Td: -5°C) w ciągu kilku godzin i ostatecznie w temperaturze Td w ciągu dokładnie 2 minut. Błony poddano autoradiografii na filmie do promień X-Fuji, przeszukując intensywnie w temperaturze -70°C. (Słowo Fuji jest znakiem towarowym). Po 24 - 48 godzinach powstały dodatnie kolonie w postaci wystających kropel na podłożu.

Przykład 10. Analiza klonów dodatnich dla polipeptydu 21 kDa.

Za pomocą sondy 21 kDa otrzymano kilka dodatnich klonów, a większość z nich zawierała wstawkę o długości 0,9 kb, co ujawniło się przez trawienie za pomocą Pstl (pierwotne miejsce Pstl wektora przetworzono metodą przyłączania dG/dC (tailing). Wstawki mają taki sam obraz restt^2^1^(^;yjny i są dostatecznie duże, aby kodować prekursor o masie 23 kDa, tak więc jest prawdopodobne, że stanowią one klony o pełnej długości. Mapę wstawki przedstawiono na figurze 1.

Fragment Pstl o długości 0,9 kb oddzielono od wektora przez elektroforezę w żelu agarozowym na bibule DE81 (Dretzen i wsp., 1981), o około 500 ng poddano przemieszczeniu pęknięć przy użyciu zestawu do przemieszczania pęknięć Amersham. Otrzymana sonda wykazywała ~ 4 x 10cpm, a 10⁶ cpm zastosowano do dalszego sondowania biblioteki cDNA metodą hybrydyzacji opisaną przez Wahl'a i Berger'a (1987). Stosowano 50% formamid i temperaturę 42°C. Otrzymano nieco więcej niekompletynych klonów dodatnich, które zastosowano w następnym sekwencjonowaniu.

169 957

Przykład 11. Sekwencjonowanie sklonowanych wstawek.

Strategia st^l^'^^3in^j(^inowania polegała na klonowaniu wstawek i klonowaniu odpowiednich ich subklonów w wielokrotnym miejscu do klonowania plazmidów pTZ18R/pTZ18/19R (Pharmacia). Plazmidy te są skonstruowane w oparciu o lepiej znane wektory pUC18/19 (Norrander i wsp., 1983), lecz zawierają jednoniciowy początek replikacji pochodzący w włókienkowatego faga f1. Superinfekcja fagami w tej samej grupie indukuje jednoniciową replikację plazmidu, a pojedyncze nici są upakowywane i w postaci fagów wydzielane do otoczenia. Znanymi sposobami dla fagów M13 (Miller, 1987) można z tych fagów wypreparować DNA i sekwencpnować metodą Sanger'a (1977) przy użyciu odwróconego startera do sekwencjonowania. Stosowany do superinfekcji fag M13KO7 pochodzi od faga M13, ulega słabej replikacji i dlatego nie współzawodniczy z plazmidem, a ponadto zawiera marker selekcyjny w postaci oporności na kanamycynę. Dalsze szczegóły sposobów wytwarzania pojedynczych nici z plazmidów pTZ oraz fagów pomocniczych dostarcza firma Pharmacia. Sekwencję DNA zestawiono i przeanalizowano stosując zestaw programów komputerowych Staden'a (Staden, 1986) na komputerze Prime 9955. (Słowo Prime jest znakiem towarowym).

Przykład 12. Cechy cDNA dla 21 kDA i wprowadzona sekwencja aminokwasową prekursora o masie 23 kDa.

Sekwencję cDNA dla 21 kDa i przewidywaną sekwencję aminokwasową kodowanego prekursora o masie 23 kDa przedstawiono na figurze 2. cDNA ma 917 zasad, wyłączając koniec 3' poli A. Kodon startu ATG znajduje się w pozycji 21, a po nim następuje otwarta faza odczytu 221 kodonów, zakończona kodonem stopu w pozycji 684. Dalej znajduje się 233-zasadowy region nieulegający translacji, który zawiera stosunkowo dużo AT (60%) i kilka kodonów stopu we wszystkich trzech fazach odczytu. W pozycjach 753 i 887 znajdują się dwa sygnały poliadenylacji (AATAAA) (Proudfoot i Brownlee, 1976). W pozycji 99 znaleziono sekwencję odpowiadającą sondzie oligonukleotydowej, a w pozycji 167 doświadczalnie wykryto miejsce Cla.

Przewidywany polipeptyd prekursora o masie 23 kDa zawiera 221 aminokwasów, a jego masa cząsteczkowa wynosi 24003. Dojrzały N-koniec znaleziono w pozycji 27, a pierwsze 26 reszt to reszty wysoko hydrofobowe, co jest charakterystyczne dla sekwencji sygnałowej rozpoznawanej przez białka odpowiedzialne za translokację nowo-syntetyzowanych białek przez błony w procesie podziału (kreil, 1981). Dojrzale białko ma 195 reszt i masę cząsteczkową wynoszącą 21223, zgodną z masą uzyskaną na żelach poliakryloamidowych. Skład aminokwasowy dojrzałego białka jest typowy dla białek rozpuszczalnych; - 24% reszt obdarzonych ładunkiem i około 20% reszt hydrofobowych.

Homologie pomiędzy białkiem o masie 21 kDa a innymi znanymi białkami.

Poszukiwania prowadzone w danych identyfikacyjnych białek (PIR) (National Biomedical Research Foundation, Washington DC) przy użyciu programu do zestawiania sekwencji FASTP (Lipman i Pearson, 1985) wykazały wysoki stopień homologii pomiędzy białkiem o masie 21 kDa a inhibitorami Kunitz'a proteazy i a-amylazy, znalezionymi w dużych ilościach w nasionach niektórych gatunków, zwłaszcza warzyw strączkowych i zbóż. Przykłady przedstawione na figurze 3 obeemują inhibitor a-amylazy/subtylizyny jęczmienia, B-ASI (Svendsen i wsp., 1986), inhibitor α-rmylazy/subtylizyny pszenicy, W-ASI (Maeda, 1986), inhibitor chymotrypsyny. Pscophocarpus tetragonolobud, W-C.I (Shibata i wsp., 1988), inhibitor trypsyny Pscophocarpus tetragonolobus W-TI (Yamamoto i wsp., 1983), inhibitor trypsyny soi, S-TI (Koide i Ikenaka, 1973b), inhibitor trypsyny Erythrina latissima, E-TI (Joubert i wsp., 1985).

Wszystkie inhibitory Kunitz'a mają tę samą wielkość i oś wzdłuż całej swojej długości. Tak więc białko o masie 21 kFa musi należeć do tej klasy.

Przykład 13. Ekspresja polipeptydów o masach 23 kDa i 21 kDa w E.coli.

DNA kodujący polipeptydy o masach 23 kDa i 21 kDa (to jest z hydrofobowym peptydem sygnałowym i bez niego) subklonowano w wektorze ekspresyjnym E.coli, pJLA502 (Schauder i wsp., 1987) sprzedawanym przez Medac GmbH, Postfach 303629, D-7000, Hamburg 36 (patrz figura 4). Wektor zawiera silne promotory lambda, Pl i Pr, sekwencję liderową i miejsce wiążące rybozomy genu etpE E.coli ulegającego bardzo wydajnej translacji. Zawiera on również represor cl wrażliwy na temperaturę, tak więc ekspresja ulega reprasji w temperaturze 30°C, a aktywacji

169 957 w temp. 42°C. Wektor posiada miejsce Ncol (zawierające kodon ATG: CCATGG) prawidłowo umiejscowione względem miejsca wiążącego rybozomy; obce sekwencje kodujące łączy się w tym miejscu. Sekwencja kodująca 23 kDa nie posiada miejsca Ncol w początku ATG, tak więc miejsce takie wprowadzono techniką mutagenezy in vitro.

Mutagenezę in vitro przeprowadzono za pomocą zestawu sprzedawanego przez firmę Amersham International metodą Eckstein'a i wsp. (Taylor i wsp., 1985). Po sparowaniu mutagennego startera z jednoniciowym DNA, podczas syntezy drugiej nici w miejscach dCTP włączaniu ulegał alfa-tio-dCTP. Po przedłużeniu i zligowaniu do zamkniętej postaci kolistej, plazmid trawiono enzymem NciI, który nie rozrywa DNA zawierającego tio-dC. Tak więc, jedynie pierwotna nić ulegała rozrywaniu i kolejnemu trawieniu egzonukleazą III. Następnie ponownie zsyntetyzowano pierwotną nić, przy czym jako startery służyły pozostałe fragmenty DNA, uzupełniając zmutowaną pozycję w pierwotnej nici. Następnie plazmidami transformowano E.coli i kontrolowano przy zastosowaniu minipreparatów plazmidowych.

Miejsce Ncol wprowadzono do cDNA dla 23 kDa w plazmidzie pMSIOl (w wektorze pTZ19R, tak, że jednoniciowy DNA mógł powstawać z łatwością) przy użyciu startera mutagennego: 5' ACTTAACCATGGAGACC 3', otrzymując plazmid pMS 106. Starter wybrano tak, aby uniknąć znaczącej hybrydyzacji w innych miejscach plazmidu.

Region kodujący 23 kDa klonowano w wektorze ekspresyjnym E.coli pJLA502 we fragmencie Ncol-Ecol (PMS 107). Następnie region kodujący klonowano znowu w pTZ19 we fragmencie Xhol (w kierunku w górę od Ncol) -EcoRI. Tak powstaje plazmid pTZ-23 kDa (pMS 108) z wyeliminowanym regionem poli G/C, który prawdopodobnie przerywa transkrypcję w wektorze pomiędzy promotorem T7 a regionem kodującym. W wyniku transkrypcji in vitro przy użyciu polimerazy RNA T7 powstał w dużych ilościach RNA, który ulegał translacji w kiełkach pszennych dając białko o masie 23 kDa. Dowodzi to, że w plazmidzie obecny jest działający gen, zdolny do wytwarzania białka o przewidywanej wielkości.

Hydrofobową sekwencję sygnałową usunięto z plazmidu pM 108 przez delecję przy użyciu mutagennego startera wiążącego się z każdą stroną proponowanej delecji: 5' TGGAGACTGCCATGGCAAACTCTCCTGTG 3'. Otrzymany plazmid pMS 111 miał zachowane miejsce Ncol w miejscu startu ATG, region kodujący 21 kDa subklonowano w pJLA502 we fragmencie Ncol-BamHI (pMSl 13).

Dwoma wektorami ekspresyjnymi stransformowano E.coli UT580. Stransformowane szczepy hodowano w pożywce L z ampicyliną (100 μg/ml) w temp. 30°C do osiągnięcia logarytmicznej fazy wzrostu (ODóio = 0,5), następnie temperaturę zwiększono do 42°C i co pewien czas pobierano próbki. Próbki rozpuszczono we wrzącym buforze SDS i przepuszczono przez żele SDS-PAGE. Stosowano elektroblotting białek na błonach nitrocelulozowych (To wbin i wsp., 1979) i znalizowano metodą Western blotting przy użyciu przeciwciała przeciwko peptydowi o masie 21 kDa wytworzonego jak opisano wyżej w przykładzie 3 (2 μg/ml), a w charakterze drugiego przeciwciała stosowano kozią przeciwkróliczą IgG w połączeniu z alkaliczną fosfatazą (Scott i wsp., 1988).

W przypadku wektora pMS 107, przeciwciało wykryło swoiste białko o masie cząsteczkowej wynoszącej około 23 kDa, jednakże obecne były także mniejsze pasma, z których jedno odpowiadało masie 21 kDa, co sugerowało, że E.coli częściowo odszczepiała sygnałową sekwencję hydrofobową. Większą ilość białka obserwowano po 18 godzinach - wynosiła ona co najmniej 1 - 2 mg/litr. W przypadku próbek kontrolnych zawierających jedynie wektor nie powstawały białka wykrywalne metodą immunologiczną. W przypadku wektora pMS113, uzyskano podobny wynik, z tym jednak wyjątkiem, że obserwowano jedynie białko o masie 21 kDa: nie było dowodu świadczącego o wyższej ekspresji pod nieobecność sekwencji sygnałowej. Jednakże, w wyniku transformacji tymi wektorami szczepu CAG 629 z defektem proteazy (Dr C.A. Gross), w obu przypadkach uzyskano o wiele wyższy poziom ekspresji, rzędu 5-10 mg/litr.

Przykład 14. Ekspresja polipeptydów 21/23 kDa w drożdżach. (Saccharomyces cerevisiae).

Zastosowano dwa drożdżowe wektory ekspresyjne, oba oparte o wahadłowy wektor drożdżowo-E.coli zawierający miejsca początku replikacji z drożdży i z E.coli oraz odpowiednie markery selekcyjne (oporność na ampicylinę dla E.coli i auksotrofię leucynową dla drożdży).

169 957

Oba wektory zawierają drożdżowy promotor kinazy pirogronianowej (PK) i sekwencję liderową oraz posiadają miejsce do klonowania HindlU znajdujące się w kierunku w dół od promotora. Jeden z tych wektorów - wektor A - przeznaczony jest do ekspresji wewnętrznej, a drugi - wektor V - do ekspresji wraz z sekrecją i posiada część sekwencji sygnałowej drożdżowego płciowego czynnika α, położoną w kierunku w dół od promotora, oraz miejsce Hindlll służące do wytwarzania białek fuzyjnych przy użyciu dołączanych sekwencji kodujących. Wektory te przedstawiono na figurze 5.

Aby wydajnie stosować wektory, pożądane jest wprowadzenie obcego regionu kodującego; w przypadku wektora A - regionu od miejsca do klonowania HindlU do startu ATG, takiego samegojak drożdżowy gen PK, a w przypadku wektoraB - reszty sekwencji sygnałowej czynnika a, włącznie z lizyną w punkcie rozszczepienia. W praktyce osiągnięto to przez zsyntetyzowanie dwóch kompletów łączników HindlU-Ncol służących do zlikwidowania luki pomiędzy miejscem do klonowania HindlU w wektorze i NcoI w miejsce startu ATG sekwencji kodującej. W przypadku wektora B, w którym sekwencja kodująca ma być złożona z sekwencją sygnałową drożdżowego czynnika a, stosowano region kodujący polipeptyd o masie 21 kDa (to jest z usuniętą sekwencją sygnałową kakaowca). Konstrukcje przedstawiono na figurze 6. Dla ułatwienia konstruowania wektorów drożdżowych najpierw klonowano łączniki Hindin-NcoI w odpowiednich plazmidach pTZ, a potem w wektorach drożdżowych klonowano łączniki wraz z regionem kodującym, we fragmentach HindUI-BamHI.

Drożdżowe plazmidy ekspresyjne przeniesiono do drożdżowych sferoplastów metodą Johnston'a (1988). Jako gospodarza do transformacji zastosowano szczep AH22 LEU i wyselekcjonowano transformanty na minimalnej pożywce bez leucyny. Transformanty LEU+ występowały w postaci pasm pojedynczych kolonii, które hodowano w 50 ml pożywki yEpD (johnston, 1988) w temp. 28°C w celu zbadania zasięgu i rozkładu obcego białka. Z hodowli zebrano komórki w przedtem zważonych probówkach przy użyciu wirówki i przemyto 10 ml buforu lizującego (200 mM Tris, pH 8,1; 10% glicerol). Substancję komórkową zebrano i zatężono 10-25 razy w minizatężaczu Amicon (Słowo Amicon jest znakiem towarowym). Przemyte komórki zważono i ponownie zawieszono w buforze lizującym z dodatkiem inhibitorów proteazy (1 mM fenylometylosulfonylofluorku (PMSF); 1 μg/ml transylolu; 0,5 gg/ml leupeptyny) w stężeniu 1g/ml. Dodano jedną objętość kulek szklanych przemytych kwasem i rozbijano komórki przez wirowanie trwające 8 minut, stosując jednominutowe impulsy i jednominutowe przerwy, na lodzie. Po sprawdzeniu pod mikroskopem, czy komórki zostały rozbite, mieszaninę odwirowano w ciągu 3 minut z szybkością 7000 obrotów/minutę w celu osadzania szklanych kulek. Supernatant usunięto do schłodzonej przedtem probówki do wirowania i wirowano w ciągu 1 godziny z szybkością 20000 obrotów/minutę. (Małe próbki można wirować w mikrowirówce, w niskiej temperaturze). Supernatant tworzy rozpuszczalną frakcję. Osad ponownie zawieszono w 1 ml buforu lizującego z dodatkiem 10% SDS i 1% merkaptoetanolu i ogrzewano w temp. 90°C w ciągu 10 minut. Po 15-minutowym odwirowaniu w mikrowirówce powstał supernatant tworzący jednorodną frakcję.

Próbki każdej frakcji i zatężonej pożywki badano metodą blottingu Western. Plazmid pMS116, przeznaczony do ekspresji wewnętrznej wytwarzał oba polipeptydy - o masach 23 kDa i 21 kDa w rozpuszczalnej frakcji lizatu komórkowego, a w pożywce znaleziono znaczne ilości (2-5 mg/litr) polipeptydu o masie 21 kDa. Tak więc drożdże rozpoznają sekwencję sygnałową kakaowca i transportują białko przez błonę, przy czym w trakcie tego procesu sekwencja sygnałowa ulega odszczepieniu. Miejsce odszczepieniajest prawidłowe, co potwierdza wielkość końcowego białka.

Plazmid pMS 117, przeznaczony do ekspresji z sekrecją dawał raczej podobne wyniki, przy czym w pożywce występowała większa ilość polipeptydu o masie 21 kDa. Ani we frakcji rozpuszczalnej, ani w cząsteczkowej nie znaleziono dowodu na obecność nierozszczepionego polipeptydu z przyłączoną sekwencją sygnałową drożdżowego czynnika α.

Przykład 15. Zwiększenie skali produkcji białka o masie 21 kDa w fermentorze o pojemności 5 litrów.

Aby ocenić wydajność wytwarzania na większą skalę białka o masie 21 kDa przez drożdże AH22 zawierające plazmid pMS117, szczep hodowano w bioreaktorze o pojemności 5 litrów

169 957 firmy Life Technologies Inc. Tak jak w hodowli na małą skalę, stosowano pożywkę YEPD, a jako inokulum użyto 10 ml jodowli w późnej fazie logarytmicznej wzrostu (ODsoo wynosiło 4,0). Szybkość napowietrzania wynosiła 2 litry/minutę, a mieszanina - 350 obrotów/minutę, ponadto dodano 10 ml oleju szafranowego w celu zapobiegania tworzenia się piany w wyniku napowietrzania i mieszania. Komórki reszty w logarytmiczną fazę wzrostu po 10 godzinach, faza ta zakończyła się po 15 godzinach wraz z zanikiem glukozy i zbieraniem się etanolu. Jednakże wzrost trwał aż do momentu zbierania, które nastąpiło po 60 godzinach wraz z jednoczesnym utlenienim etanolu. Ostatecznie uzyskano biomasę 28 g/litr mokrej masy i 7,3 g/litr suchej masy. Analiza pożywki metodą blottingu Western wykazała, że białko o masie 21 kDa najpierw powoli ulegało sekrecji do pożywki, jednakże w późnej fazie stałej gromadziło się szybko, a w czasie zbierania ilość białka zwiększyła się do około 20 - 30 mg/litr.

Pod koniec doświadczenia komórki drożdżowe usunięto z pożywki stosując filtrowanie z poprzecznym przepływem przez 0,2 μm błonę, a składniki białkowe (lub wielkocząsteczkowe) pożywki zatężono na drodze filtrowania z poprzecznym przepływem przez błonę do ultrafiltracji oddzielającą masę cząsteczkową 10 kDa. Stosowano urządzenie do filtrowania z poprzecznym przepływem firmy Sartorius GmbH, Goettingen, RFN. Białko o masie 21 kDa można dalej wstępnie oczyszczać przez wytrącanie 80% siaczanem amonowym, ponowne rozpuszczanie w wodzie i dializę.

Pewne zwiększenie wydajności osiągnięto w procesie z okresowym zasilaniem, w którym poziom glukozy zwiększano do 2% zatężonego roztworu w momencie, gdy spadał on poniżej 0,1%. Przeprowadzono cztery takie zasilania po 16, 23, 34 i 37 godzinach, a wzrost kontynuowano do 58 godziny. Uzyskano zwiększoną wydajność białka o masie 21 kDa, wynoszącą do 50 mg/litr pod koniec doświadczenia.

Przykład 16. Ekspresja białka o masie 23 kDa/21 w Hansenula polymorpha.

Metylotroficzne drożdże Hansenula polymorpha jako gospodarz do ekspresji białek heterologicznych mają szereg zalet w porównaniu z Saccharomyces cerevisiae (Europejskie zgłoszenie patentowe nr EP-A-O 173378 oraz Sudbery i wsp., 1988). Drożdże hoduje się na metanolu, jako jednym źródle węgla; w tych warunkach enzym oksydaza metanolowa (MOX) może stanowić do 40% całego białka komórkowego. Tak więc, promotor MOX jest bardzo silnym promotorem, który można stosować w wektorze do kierowania syntezą białek heterologicznych, przy czym jest on wydajny mawet w postaci pojedynczej kopii. Umożliwia to stosowanie wektorów trwale zintegrowanych. Hansenula może także wzrastać na źródłach o dużej zawartości węgla takich jak glukoza, w którym to przypadku promotor MOX ulega całkowitej represji. To oznacza, że komórki zawierające heterologiczny gen można hodować aż do osiągnięcia wysokiej gęstości na glukozie i indukować wytwarzanie obcego białka przez usunięcia glukozy i dodanie metanolu.

Konstrukcje (p.MYlO i pMY9), zawierające gen dla 23 kDa i 21 kDa umieszczony pomiędzy promotorem MOX a sekwencją termi nacji MOX, wykonano w drożdżowym plazmidzie episomalnym YEp13. Obie zawierały sygnał sekrecji inwertazy, złożony z regionem kodującym genu kakaowca, jak przedstawiono nafigurze 7. Tymi konstrukcjami transformowano Hansenula i w obu przypadkach, w warunkach indukujących, następowała sekrecja do pożywki białka 21/23 kDa, jednakże pMYD, zawierający drożdżową a nie roślinną sekwencję sygnałową, był wydajniejszy.

Hansenula stransformowane konstrukcją pMY10 hodowano także na większą skalę w fermentorze, i po indukcji metanolem uzyskano biomasę 45 g/litr suchej masy. Po indukcji, w pożywce występowało białko o masie 21 kDa w ilości dochodzącej do 50 mg/litr.

Szczepy E.coli

RR1 F'vb’Mb ara-14 proA2 leuB6 lacY1 galK2 vpsL 20 (str^r) xyl-5 mtl-1 supE44

CAG629 lacam tvpam phoam htpRam mal rpsl lon supCts

UT580 (lac-pro) supE thi hsdD5/F'tra D36 proA+U lacf lacZ M15

169 957

Odnośniki literaturowe

Aviv, H., i Leder, P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69,1408 - 1412 (1972). Purification of biologically active globin mRNA by chromatography on oligo dT cellulose.

Biehl, B„ Wewetzer, C., i Passern, D. J. Sci. Fod Agric. 33, 1291 - 1304 (1982). Vacuolar (Storage) Proteins of Cocoa Seeds and their Degradation during Garmination and Fermentation.

Biehl, B., Brunner, E., Passern, D., Quesnel, V.C. i Adomako, D. J. Sci. Food Agric. 36 583 598 (1985). Acidification, Proteolysis and Flavour Potential in Fermenting Cocoa Beans.

Catty, D. i Raykundalia, C. Production and Quality control of Polyklonal Antibodies, in: Antibodies: A Practical Approach Vol. I, IRL Press (1988)

Cuming, A.C., Williams, R.S., i Cullimore, J.V. Immunology in Plant Science, Wyd. Wang, T.L., Cambridge University Press, 1986. The use of Antibodies in Molecular Biology.

Dretzen, G., Bellard, M., Sassone-Corsi, P., i Chambon, P. Analytical Biochemistry 112, 295-298 (1981). A reliable method for the recovery of DNA fragments from agarose and acerylamide gels.

Eschenfeldt, W.H., Puskas, R.S., i Berger, S.L. Methods in Enzymology 152, 337 - 342 (1987). Homopolymeric Tailing.

Fritz i wsp. (J. Food Sci. 50 946 - 950 (1985))

Gubler, U., i Hoffman, BJ. Gene 25, 263 (1983). A simple and very efficient method for generating cDNA libraries.

Hall, T.C., Ma, Y., Buchbinder, B.U., Pyme J.W., Sun, S.M., i Bliss, F.A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 3196 - 3200 (1978). Messenger RNA for G1 protein of French bean seeds: cell-free translation and product charakterisation.

Hill, S.A. Method in Plant Virology, Blackwell 1984.

Johnston, J.R., Yeast: Apractical approach, Wyd.:Campbell, I., i Duffus. J.H. IRL Press, 1988, Yeast Genetics, Molecular Aspects.

Joubert, F.J., Henssen, C. i Dowdle, E.B.D. J. Biol. chem. 260, 12948 - 12953 (1985) The complete amino acid sequence of trypsin inhibitor DE-3 from Erythrina latissima seeds.

Koide, T. i Ikenaka, T. Eur. J. Biochem. 32, 417 - 431 (1973b). Amino-acid sequence of the carbocyl-terminal region and the complete amino-acid sequence of the soybean trypsin inhibitor (Kunitz).

Kreil, G. Annual Rev. Biochem. 50. 317 - 348 (1981). Transfer of proteins across membranes.

Laemmli, U.K. Nature 227, 680 (1970). Cleavage of structual proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.

Lipman, D.J., i Pearson, W.R. Science 227, 1435 - 1441 (1985). Rapid protein sequence similatiry searches.

Maeda, K. Biochim. Biophys. Acta 871, 250 - 256 (1986). The complete amino-acid sequence of the endogenous a-amylase inhibitor in wheat.

Maniatis, T., Fritsch, E.F., i Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, 1982.

Mason, P.J., i Williams, J.G., Nucleic Acid Hybridisation : A Practical Approach, Wyd.: Harnes, B.D., i Higgins, S.J. IRL Press 1985. Hybridisation in the Analysis of Recombinant DNA.

Meinhoth, J., i Wahl, G.M. Analytical Biochemistry 138, 267 (1984). Methods of Southern blotting and DNA probing.

Miller, H. Methods in Enzymology 152, 145 - 170 (1987). Practical Aspects of Preparing Phage and Plasmid DNA : Growth, Maintenance and Storage of Bacteria and Bacteriophage.

169 957

Norrander, J., Kempe, T., i Messing, J. Gene 26, 101 (1983). Construction of improved M13 vectors using oligodeoxynucleotide-directed mutagensis.

Pettipher, G.L. Cafe Cacao The XXXIV 23 - 26 (1990). The Extraction and Partial Purtftcatton of Cocoa Storage Proteins.

Proudfoot, M. J., I Brownlee, G.G. Nature 263,211 -214 (1976). 3'Non-coding region sequences in enkayotic messenger RNA.

Roberts, B.E., i Peterson, B.M. Proc. Natl. Acad. Sci. Usa 70, 2330 (1973). Efficient translation of tobacco mosaic virus RNA and rabbit globin 9S RNA in a cell- free system from commercial wheat germ.

Sanger, F., Nicklen, S., i Coulson, A.R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 - 5467 (1977). DNA sequencing with chain-teirninating inhibitors.

Schauder, B., Blocker, H., Frank, R., i McCarthy, J.E.G. Gene 52, 279 - 283 (1987). Inducible expression vectors incorporating the E.coli aptE translation Initiation region.

Scott, R., Jefferson, R., Dury, G., i Jacob, L., Plant Genetic Transformation and Gene Expression: A Laboratory Manual. Wyd.: Draper, J., Scott, R., Armitage, P., Walden, R. Blackwell 1988. Analysis of gene organisation and ekpression in plants.

Shibata, H., Hara, S. i Ikenaka, T. J, Biochem. (Tokyo) 104, 537 - 543 (1988). Amino-acid sequence of winged bean (Psophocarpus tetragonolobus) chymotrypsin inhibitor, WCI-3.

Staden, R. Nucleic Acids Res. 14, 217 - 231 (1986). The current status and portability of our sequence handling soft-ware.

Sudbery, P.E., Gleoson, M.A., Veale, R.A., Lederboer, A.M., i Zoetmulder, M.C.M. Biochem. Soc. Trans 16 1081 - 103 (1988). Hansenula polymorpha as a novel yeast system for the expression of heterologous genes.

Svendsen, I., Hejgaard, J. i Mundy, J. Carlsberg. Res. Commun. 51, 43 -50 (1986). Complete amino-acid sequence of the α-amylase/subtilisin inhibitor from barley.

Taylor, J.W., Ott, J., i Eckstein, F. Nucleic Acids Res. 13, 8765 - 8785 (1985). The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothoate-modified DNA.

Towbin, H. Staehelin, T., i Gordon, J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350 - 4534 (1979). Electrophoretic transfer of proteins from polyacryloamide gels to nitrocellulose sheets : procedure and some applications.

Von Heije, G. Eur. J. Biochem 133, 17-21 (1983). Patterns of Amino-acids near Signal-Sequence Cleavage Sites.

Wahl, G.M., i Berger, S.L. Methods in Enzymology 152, 415 - 423 (1987). Screening colonies of Plaques with RadioactNe Nucleic Acid Probes.

Woods, D.E. Focus (Bethesda Research Labs) 6, 3 (1984). Oligonucleotide Screening of DNA Libraries.

Woods, D.E., Markham, A.F., Ricker, A.T., Goldberger, G., i Colten, H.R. Proc. Natl. Acad. Aci. USA 79, 5561 (1982).

Yamamoto, M, Hara, S. i Ikenaka, T. Biochem. (Tokyo) 94, 849 - 863 (1983). Amino-acid sequences of two trypsin inhibitors from winged bean seeds (Psophocarpus tetragonolobus).

169 957

MKTATAVVLLLFAF

CAGCAACATTTCACTTAACCATGAAGACCGCAACAGCCGTAGTTTTACTCCTCTTCGCCT

20 30 40 50 60

T S K S Y FF GVANa4aNSPVLDT TCACATCAAAATCATATTTCTTTGGGGTAGC-AACGCTGCAAACTCTCCTGTGCTTGACA

80 90 100 110 120

DGDELQTGVQYYVLSSISGA

CTGATGGTGATGAGCTCCAAACTGGGGTTCAATATTACGTCTTGTCATCGATATCGGGTG

130 140 150 160 170 180

GGGGLALGRATGQSCPEXVV CTGGGGGTGGAGGGCTAGCCCTAGGAAGGGCTACAGGTCAAAGCTGCCCAGAAATTGTTG 190 200 210 220 230 240

FIG.2A

QRRSDLDNGTPVIFSNADSK

TCCAAAGACGATCCGACCTTGACAATGGTACTCCTGTAATCTTTTCAAATGCGGATAGCA

250 260 270 280 290 300

DDVVRVSTDVNIEFVPIRDR

AAGATGATGTTGTCCGCGTATCTACTGATGTAAACATAGAGTTCGTTCCCATCAGAGACA

310 320 330 340 350 360

LCSTSTVWRLDMYDNSAGKW

GACTCTGCTCAACGTCAACTGTGTGGAGGCTTGACAATTATGACAACTCGGCAGGCAAAT

370 380 390 400 410 420

169 957

F/G .2B

MVTTDGVKGEPGPNTLCSW

GGTGGGTGACAACTGATGGGGTTAAAGGTGAACCTGGTCCTAACACTTTGTGCAGTTGGT

430 440 450 460 470 480

KIEKAGVLGYKFRFCPSVC

TTAAGATTGAGAAGGCCGGAGTACTCGGTTACAAATTCAGGTTCTGTCCTTCTGTCTGTG

490 500 510 520 530 540

SCTTLCSDIGRHSDDDGQi: ATTCGTGCACAACTTTATGCAGCGATATTGGAAGACATTCAGATGATGATGGACAAATAC 550 560 570 580 590 600

LALSDNEWAWMFKKASKTI gtttggctctcagtgacaatgaatgggcatggatgtttaagaaagcaagtaagacaataa

610 620 630 640 650 660

QVVNAND*

AACAAGTTGTTAACGCGAACGATTAATTTTAAGTTTAATGTACGAAGTGTACGTCCAAAG 670 680 690 700 710 720

CAGCAATACTAGCCGGTCGTCACTTTCCACra{AATAA/}AGTTAAGTATGTGGTTCCCAGC 730 740 750 760 770 780

CCAGTGTTGTAATGCTATGCCTATGTAGTCAGTGTCTTGTTTGAGGGTGGAGATGCTTAA 790 800 810 820 830 840

AGGGTGTGTCTTCACAGTCCCAGCTTCGTAGTCTTTCAGCTTTATG 850 860 870 880

890 ?GATTTGC

900

CTCTTGCCTCTTTTATT

910

169 957 o Ot o M Ot OT W V» •Λ OOP !>{ot OT|> > > > > > >> > > >

o* cu o» o» o« CJ CJ U U U ttjXei(ł»HeH O « « 00 Μ M OT U ϋ ϋ X k X M »- m ae O o o O «c o o *· fr- ·* *· β[» a» ® *m>MMOTOTOT» iw - wl· · Q '

I I I Q< OT OT OT |OT OT OT OT wĄt^OTl fr- O O << Oi co ot OT J > * < > «<

EO CJ CJ CJ CJ Cjf fr* fr· *o wUal»r Ot » t > » I » e o i i i i i i ^«^ΗΟ.α.χα

E3·- - “ “-Ξ

r- ot OT — *· — “» i < <C CJ fr· fr· fr· a

CM OT OT w- ·- ·— — » « Mt CJ fr· ·« fr·

CJ I I · » » · fr· ca 8fr * * OT M

169 957

O Μ Μ > tt tt tt c» tt tt ae μ lj* < <«|tt » Λ i i o o κ m o o

i · u >J -a *a

Q° o “·Θ**Ξ β « tt «a tt o «ο |a. a· o.|x μ μ M O a> m O »J B O

ca o o tgofoo]

*-£=1»· ·· |u cs cs ta o ca cal l~p-5i·-- ~ « i I tt i » · <*>

o £

jo o o) w o o o ~tt O j*

Ιο α u u OM OJ

I O OO}> tt > tt «3 ~ — > tt tt luooul Ί±ύtsssppp £ « i i i ń

169 957 ^PR^,PL

FIG.4

Αηρ

βι· j«c· Ncol RBS

Start

GGAGACTGCCATGG «••ad w kierunku w gór· od . apt.

E.coli

169 957

F/G.5

EcoRI

Pstl

EcoRI

Hind III

BamHI

169 957

Ł			CJ
U	c	B	Ł
(9 2	żn	8	ε u
8			2

g e

	f-ł W 9 Ή V *		4 •-ł
>1 N <0	»·§ 4 η β		< >1
c «Η X Τ-» φ	U ϋ C β 0 > «	8 Z	fi Τ» >c
? i	ś -2 β	1 z H	Φ M Ol
«« 4 Ό ń H C 0 0 Μ. M ¹⁰ g β M 5 -2.	4 Λ «Η C C 0 β *«4 M fi M 9 0 «Η > β -P M fi	n X fi N 0 s	• X • u 0- X i

« •s

169 957

3 U
rt *C
O o
o>«<
u u	o
	<
ta 2	Ej
	O
u 2	U O
ttt-i	O U
a <	< fi
< u	o b

a o o

i «Ή > O rt o u o rt 3 2 n rt < (M U O

I I

QQ <O ó

u.

«

Q

X «Μ 4J Ol X

N O

Φ β M > Ή 0 C

	c
«	>1
c	N	O
0»	0	U
>1		Z
•	0	1
	3»	Z
<	Φ	H
m	>	a
O	0
C	44	X
•	Ό	•W
>	44	C
X	0	N
Φ	u	O
(0	*3	*

σ»

-u φ o o et φ Tł •H 3 s S w X > 9 c

« o τ> «Η N CT

S

169 957

>
N 4 «Μ M 0) 3 fi •H O 3	4
0	O
	3
•O	0
«Ν	4
0	X
M	4	4
Ό	X	Q
4	4	X
3	3	w
0	0	<N
iM	iM
4	4	>1
fi	C	U
σι	σ»
>1		•n
u	4	9
4	4	*0 0
•n	*rt	X
U	O
c	fi	fi
«	Φ	0
3	3
X	X	σ'
V	©	4)
4	4	06

Ó

Łu

N

U

X g* hO §

CU

O >o.

O t—i >Σ O.

169 957

F/G. 1 (-1-1-1-1-1-1-1-1-Γ

O 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 kb _H . ---------- ... γ. -_T-----,S C Sc Hg

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 4,00 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania kwasu nukleinowego kodującego białko z Theobroma cacao o masie 23 kDa lub jego fragment o co najmniej 20 aminokwasach, przy czym kwas nukleinowy ma co najmniej część sekwencji przedstawioną na fig. 2, znamienny tym, że sprzęga się kolejne nukleotydy i/lub dokonuje się ligacji oligo- lub polinukleotydów.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że sprzęganie prowadzi się w komórce gospodarza.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jako komórkę gospodarza stosuje się komórkę Saccharomyces cerevisiae.
4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jako komórkę gospodarza stosuje się komórkę E. coli.
5. Sposób wytwarzania kwasu nukleinowego rekombinowanego lub izolowanego kodującego białko z Theobroma cacao o masie 23 kDa lub jego fragment o co najmniej 20 aminokwasach, przy czym kwas nukleinowy ma co najmniej część sekwencji przedstawioną na fig. 2, znamienny tym, że sprzęga się kolejne nukleotydy i/lub dokonuje się ligacji oligo- lub polinukleotydów.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że sprzęganie prowadzi się w komórce gospodarza.
7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że jako komórkę gospodarza stosuje się komórkę Saccharomyces cerevisiae.
8. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że jako komórkę gospodarza stosuje się komórkę E. coli.
9. Sposób wytwarzania rekombinowanego lub izolowanego DNA kodującego białko z Theobroma cacao o masie 23 kDa lub jego fragment o co najmniej 20 aminokwasach, przy czym DNA ma co najmniej część sekwencji przedstawioną na fig. 2, znamienny tym, że sprzęga się kolejne nukleotydy i/lub dokonuje ligacji oligo- lub polinukleotydów.
10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że sprzęganie prowadzi się w komórce gospodarza.
11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że jako komórkę gospodarza stosuje się komórkę Saccharomyces cerevisiae.
12. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że jako komórkę gospodarza stosuje się komórkę E. coli.
13. Sposób wytwarzania kwasu nukleinowego w postaci wektora ekspresyjnego kodującego białko z Theobroma cacao o masie 23 kDa lub jego fragment o co najmniej 20 aminokwasach, przy czym kwas nukleinowy ma co najmniej część sekwencji przedstawioną na fig. 2, znamienny tym, że sprzęga się kolejne nukleotydy i/lub dokonuje się ligacji oligo- lub polinukleotydów, przy czym stosuje się sekwencję kodującą białko lub jego fragment połączoną w sposób umożliwiający działanie z promotorem.
14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że sprzęganie prowadzi się w komórce gospodarza.
15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że jako komórkę gospodarza stosuje się komórkę Saccharomyces cerevisiae.
16. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że jako komórkę gospodarza stosuje się komórkę E. coli.
17. Sposób wytwarzania kwasu nukleinowego kodującego białko z Theobroma cacao o masie 21 kDa lub jego fragment o co najmniej 20 aminokwasach, przy czym kwas nukleinowy

169 957 ma co najmniej część sekwencji przedstawioną na fig. 2, znamienny tym, że sprzęga się kolejne nukleotydy i/lub dokonuje się ligacji oligo- lub polinukleotydów.
18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że sprzęganie prowadzi się w komórce gospodarza.
19. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że jako komórkę gospodarza stosuje się komórkę Saccharomyces cerevisiae.
20. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że jako komórkę gospodarza stosuje się komórkę E. coli.
21. Sposób wytwarzania kwasu nukleinowego rekombinowanego lub izolowanego kodującego białko z Theobroma cacao o masie 21 kDa lub jego fragment o co najmniej 20 aminokwasach, przy czym kwas nukleinowy ma co najmniej część sekwencji przedstawioną na fig. 2, znamienny tym, że sprzęga się kolejne nukleotydy i/lub dokonuje się ligacji oligo- lub polinukleotydów.
22. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że sprzęganie prowadzi się w komórce gospodarza.
23. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że jako komórkę gospodarza stosuje się komórkę Saccharomyces cerevisiae.
24. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że jako komórkę gospodarza stosuje się komórkę E. coli.
25. Sposób wytwarzania rekombinowanego lub izolowanego DNA kodującego białko z Theobroma cacao o masie 21 kDa lub jego fragment o co najmniej 20 aminokwasach, przy czym DNA ma co najmniej część sekwencji przedstawioną na fig. 2, znamienny tym, że sprzęga się kolejne nukleotydy i/lub dokonuje się ligacji oligo- lub polinukleotydów.
26. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że sprzęganie prowadzi się w komórce gospodarza.
27. Sposób według zastrz. 26, znamienny tym, że jako komórkę gospodarza stosuje się komórkę Sacchoromyces cerevisiae.
28. Sposób według zastrz. 26, znamienny tym, że jako komórkę gospodarza stosuje się komórkę E. coli.
29. Sposób wytwarzania kwasu nukleinowego w postaci wektora ekspresyjnego kodującego białko z Theobroma cacao o masie 21 kDa lub jego fragment o co najmniej 20 aminokwasach, przy czym kwas nukleinowy ma co najmniej część sekwencji przedstawioną na fig. 2, znamienny tym, że sprzęga się kolejne nukleotydy i/lub dokonuje się ligacji oligo- lub polinukleotydów, przy czym stosuje się sekwencję kodującą białko lub jego fragment połączoną w sposób umożliwiający działanie z promotorem.
30. Sposób według zastrz. 29, znamienny tym, że sprzęganie prowadzi się w komórce gospodarza.
31. Sposób według zastrz. 30, znamienny tym, że jako komórkę gospodarza stosuje się komórkę Saccharomyces cerevisiae.
32. Sposób według zastrz. 30, znamienny tym, że jako komórkę gospodarza stosuje się komórkę E. coli.