PL170938B1

PL170938B1 - Sposób wytwarzania szczepionki przeciwko infekcjom Salmonella PL PL

Info

Publication number: PL170938B1
Application number: PL92296702A
Authority: PL
Inventors: Ian G Charles; Steven N Chatfield; Neil F Fairweather
Original assignee: Wellcome Found
Priority date: 1991-03-05
Filing date: 1992-03-05
Publication date: 1997-02-28
Also published as: HU219535B; US5683700A; DK0574466T3; CA2099841A1; NO932423D0; CZ285118B6; GR3030778T3; FI933757L; ATE180280T1; EP0574466A1; CZ100593A3; SK55593A3; HUT66833A; CA2099841C; US5547664A; WO1992015689A1; FI110008B; KR100240182B1; DE69229221T2; JPH06505158A

Abstract

1. Sposób wytwarzania szczepionki przeciwko infekcjom Salmonella, znamienny tym, ze transformuje sie atenuowana bakterie konstruktem DNA zawierajacym promotor, którego aktywnosc jest indukowana przez warunki beztlenowe, w usuwalny sposób polaczony z sekwencja DNA kodujaca obcopochodne bialko antygenowe, namnaza sie hodowle bakterii w warunkach tlenowych, i miesza sie bakterie z farmaceutycznie dopuszczalnym nosnikiem lub rozcienczalnikiem. PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania szczepionki przeciwko infekcjom Salmonella zawierającej atenuowane bakterie, posiadające zdolność ekspresji białka obcopochodnego.

Zjadliwe szczepy Salmonella mogą być atenuowane przez wprowadzenie specyficznych mutacji do genów niezbędnych dla ich przeżycia oraz wzrostu in vivo. Atenuowano odmiany, które wywołuj ąsamoograniczające, nieznaczące klinicznie infekcje, mogą być brane pod uwagę jako potencjalne żywe szczepionki doustne przeciwko infekcjom Salmonella. TY21ajest atenuowaną odmianą Salmonella typhi, w której siedliskiem mutacji jest ga1E i inne nieznane uszkodzenia atenuujące, i która jest w wielu krajach dopuszczona do stosowania jako żywa doustna szczepionka przeciw durowi.

Ostatnio jako eksperymentalne szczepionki doustne testowano na kilku organizmach celowych genetycznie zdefiniowane szczepy Salmonella, w których siedliskiem specyficznych mutantów były różne geny. Wykazano na przykład, że mutanty Salmonella aro, które mająauksotroficzne wymagania kilku związków aromatycznych, są skuteczne jako doustne szczepionki dla myszy, owiec, bydła, kurcząt, a ostatnio wykazano że są atenuowane i immunogenne w badaniach na ochotnikach. W patencie europejskim 322237 ujawniono podwójne mutanty Salmonella aro aro. Skutecznymi szczepionkami doustnymi są również podwójne mutanty Salmonella cva crp.

Atenuowane Salmonellae oprócz tego, że mogą być same szczepionkami przeciwko salmonellozie mogąbyć również brane pod uwagę jako nośniki antygenów obcopochodnych dla

170 938 doustnych systemów immunologicznych. Jest to spowodowane tym, że Salmonellae mogą być dostarczane drogą doustną i są silnymi immunogenami, posiadając zdolność stymulowania systemicznych i miejscowych odpowiedzi komórkowych i przeciwciał. Przy użyciu szczepionek Salmonella do organizmu gospodarza mogą być dostarczane antygeny obcopochodne z bakterii, wirusów i pasożytów.

Jedna z potencjalnie poważnych wad stosowania tego typu żywych szczepionek do dostarczania antygenu dotyczy problemów ze stabilnością ekspresji obcego antygenu in vivo. Wynikiem nieuregulowanej ekspresji w bakteriach wysokich poziomów obcego białka z plazmidów wielokrotnie skopiowanych jest zwykle gwałtowna utrata plazmidu lub wyrażanego genu z komórek. Problem ten może być regulowany w fermentorach przez zastosowanie indukowalnych systemów promotora, takichjak trp lub lac w ceiu umożliwienia kontrolowanej indukcji ekspresji genu po osiągnięciu odpowiedniej biomasy. Oczywiście, gdy bakterie wzrastają w tkankach gospodarza podczas samoograniczającego się wzrostu po zaszczepieniu, promotory te nie mogą być indukowane przez egzogennie stosowane induktory, takie jak PP lub IPTG.

Niestabilność plazmidu in vivo podczas szczepienia żywymi wektorami bakteryjnymi była istotnie opisana przez wielu badaczy (Maskell et al., Microb. Path. 2,295-305,1987; Nakayama et al., Bio/technology 6, 693-697, 1988; Tite at al., Immunology 70, 540-546, 1990). Podjęto wiele prób pokonania problemu, łącznie z zastosowaniem systemów integracyjnych do ekspresji antygenu obcopochodnego z chromosomu bakteryjnego (Hone et al., Aicrob Path. 5, 407-418, 1988; Strugnell at al., Gene 88, 57-63,1990). Jednakże takie podejście nadaje się do stosowania tylko z niektórymi antygenami, ponieważ poziomy ekspresji są często dość niskie (Maskell et al., 1987). Nakayama i inni opisali zastosowanie łączenia genu właściwego do plazmidu ekspresji w ceiu stabilizowania ekspresji in vivo. Chociaż podejście to charakteryzuje się wysoką skutecznościtą, nie zapobiega ono generacji wolnych odmian plazmidu, ale po prostu zapewnia, że one nie przeżywają. Dalszy stabilny lecz konstytutywny wysoki poziom ekspresji obcego antygenu w szczepie szczepionki Salmonelli mógłby zwolnić szybkość wzrostu, a co za tym idzie, potencjalnie wpłynąć na immunogenność żywej szczepionki.

Według wynalazku sposób wytwarzania szczepionki, polega na tym, że (i) transformuje się atenuowćanąbakterię konstruktem DNA zawierającym promotor, którego aktywnośćjest indukowana przez warunki beztlenowe, w usuwalny sposób połączony z sekwencj ąDN A koduj ącą obcopochodne białko antygenowe, (ii) namnaża się hodowlę bakterii w warunkach tlenowych, i (iii) miesza się bakterię z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem lub rozcieńczalnikiem.

Stabilna ekspresja białka obcopochodnego może być uzyskana in vivo. Atenuowana bakteria może być zatem zastosowana jako szczepionka. Do wytwarzania szczepionki może być stosowana dowolna bakteria, na przykład bakteria Gram-ujemna. Niektóre bakterie Gramujemne, takie jak Salmonella, dokonują inwazji i wzrastają wewnątrz komórek eukariotycznych i kolonizują powierzchnie śluzówki.

Atenuowana bakteria może być zatem wybrana z rodzaju Salmonella, Bordetella, Vibrio, Haemophilus, Neisseria i Yersinia. Alternatywnie, jako atenuowana bakteria może być zastosowany atenuowany szczep enterotoksycznej Escherichia coli. W szczególności można wymienić następujące gatunki: S. typhi - przyczyna duru ludzkiego; S. typhimurium - przyczyna salmonellozy u kilku gatunków zwierząt; S. enteritidis - przyczyna zatruć pokarmowych u ludzi; S. choleraesusis - przyczyna salmonellozy u świń; Bordetella pertussis - przyczyna kokluszu; Haemophillus influenzae - przyczyna zapalenia opon mózgowych; Neisseria gonorrhoeae przyczyna rzeżączki; i Yersinia - przyczyna zatruć pokarmowych.

Atenuacj a bakterii może być spowodowana nieodwracalną mutacj ą genu w szlaku biosyntezy aminokwasów aromatycznych bakterii. Co najmniej dziesięć genów zaangażowanych jest w syntezę choryzmianu, kluczowego związku w szlaku biosyntezy aminokwasów aromatycznych. Kilka z nich umiejscowionych jest w znacznie różniących się pozycjach genomu bakteryjnego, na przykład aroA (syntaza 5-enolopirogronianoszikimiano-3-fosforanowa), aroC (synteza choryzmianowa), aroD (dehydrataza 3-dehydrochinianowa) i aroE (dehydrogenaza szikimianowa). Mutacja może zatem zachodzić w genie aroA, aroC, aroD i aroE.

170 938

Korzystnie jednakże miejscem nieodwracalnej mutacji atenuowanej bakterii są dwa oddzielne geny w szlaku biosyntezy aminokwasów aromatycznych. Bakterie takie są ujawnione w europejskim opisie patentowym nr 322237. Odpowiednimi podwójnymi mutantami aro są bakterie mutanty aroA aroC, aroA aroD i aroA aroE. Zastosowanie mająjednakże inne bakterie, mające mutacje w innych kombinacjach aroA, aroC, aroD i aroE. Szczególnie korzystne są mutanty Salmonella podwójne aro, na przykład podwójne aro mutanty S. typhi lub S. typhimurium, w szczególności mutanty aroA aroC, aroA aroD i aroA aroE.

Alternatywnie, miejscem nieodwracalnej mutacji atenuowanej bakterii może być gen, związany z regulacją jednego lub więcej innych genów (europejski opis patentowy 400958). Korzystnie mutacja zachodzi w genie ompR lub innym genie związanym z regulacją. Istnieje duża liczba innych genów, które są związane z regulacją. i o których wiadomo jest, że odpowiadająna bodźce z otoczenia (Ronson et al, Celi 49, 579-581).

Ten typ atenuowanej bakterii może mieć miejsce drugiej mutacji w drugim genie. Korzystnie drugim genem jest gen kodujący enzym biorący udział w podstawowym szlaku biosyntezy, w szczególności gen biorący udział w przedchoryzmianowej części szlaku biosyntezy związków aromatycznych. Druga mutacja zatem korzystnie znajduje się w genie aroA, aroC lub aroD.

Innym typem atenuowanej bakterii jest bakteria, w której osłabienia dokonuje się przez obecność nieodwracalnej mutacji DNA bakterii, który koduje lub reguluje ekspresję DNA kodującego białko wytwarzane w odpowiedzi na stres środowiskowy. Takie bakterie są ujawnione w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym 91/15572. Nieodwracalną mutacją może być delecja, insercja, inwersja lub substytucja. Mutacja poprzez delecję może być generowana przy użyciu transpozonu.

Przykładami białek, wytwarzanych w odpowiedzi na stres środowiskowy są białka szoku cieplnego (które są wytwarzane w odpowiedzi na wzrost temperatury powyżej 42°C); białka pozbawienia składników pokarmowych (które są wytwarzane w odpowiedzi na spadek poziomów podstawowych składników odżywczych, takich jak fosforany lub azot, do poziomów niższych od poziomów niezbędnych do przeżycia organizmu); białka stresu toksycznego (które są wytwarzane w odpowiedzi na związki toksyczne, takie jak barwniki, kwasy i być może wysięki roślinne); lub białka przerwania metabolizmu (które sąwytwarzane w odpowiedzi na takie fluktuacje, na przykład fluktuacje poziomu jonów wpływających na zdolność organizmu do regulacji osmozy, lub poziomu witamin lub poziomy koczynników, które przerywają metabolizm).

Korzystnie białkiem szoku cieplnego jest białko kodowane przez gen htrA, charakteryzowany również jako degP. Inne białka są kodowane przez geny, o których wiadomo, że są zaangażowane w odpowiedzi na stres, takie jak grpE, groEL, (moPA), dnaK, groES, 1 on i dnaJ. Istnieje wiele innych białek, kodowanych przez geny, o których wiadomo, że są indukowane w odpowiedzi na stres środowiskowy (Ronson et al, Celi 49, 579-581). Pośród nich można wymienić następujące: układ ntrB/ntrC E. coli, który jest indukowany w odpowiedzi na pozbawienie azotu i dodatnio reguluje gnlA i nifLA (Buck et al. Nature 320, 374-378; 1986; Hirschmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 7525, 1985; Nixon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 7850-7854, 1986; Reitzer and Magansanik, Cell, 45, 785, 1986); układ phoR/phoB E. coli, który jest indukowany w odpowiedzi na pozbawienie fosforanów (Makino et al., J. Mol. Biol. 192, 549-556, 1986b); system cpxA/sfrA E. coli, który jest indukowany w odpowiedzi na barwniki i inne związki toksyczne (Albin et al., J. Biol. Chem. 261,4698,1986; Drury et al., J. Biol. Chem. 260, 4236-4272, 1985). Analogicznym układem w Rhizobium jest układ dctB/dctD, który jest odpowiedzialny za kwasy 4C-dikarboksylowe (Ronson et al., J. Bacteriol. 169, 2424 i Cell 49, 579-581, 1987). Układ wirulencji tego typu został opisany w Agrobacterium. Jest to układ virA/virG, który jest indukowany w odpowiedzi na wysięki roślinne (le Roux et al;., EMBO J. 6, 849-856, 1987; Stachel i Zambryski., Am. J. Vet. Res. 45, 59-66, 1986; Winans et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 8278, 1986). Podobnie układ bvgC-bvgA w Bordetella pertussis (poprzednio znany jako vir) reguluje wytwarzanie determinantów wirulencji w odpowiedzi na fluktuacje poziomów Mg2+ i kwasu nikotynowego (Arico et al, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6671-6675).

170 938

Bakteria atenuowana do stosowania w postaci żywej szczepionki nie powinna ulegać rewersji z powrotem do stanu zjadliwego. Prawdopodobieństwo takiego zdarzenia przy mutacji pojedynczej sekwencji DNA jest uważane za małe. Jednakże ryzyko wystąpienia rewersji w bakterii atenuowanej przez obecność mutacji w każdej z dwóch oddzielonych sekwencji DNA jest uważane za nieznaczne. Korzystną atenuowaną bakterią jest zatem bakteria, w której atenuacji dokonuje się przez obecność mutacji w sekwencji DNA kodującej lub regulującej ekspresję DNA kodującego białko, wytwarzane w odpowiedzi na stres środowiskowy oraz przez obecność mutacji w drugiej sekwencji DNA.

Druga sekwencja dNa korzystnie koduje enzym biorący udział w podstawowym szlaku auksotroficznym lub jest sekwencją, której produkt kontroluje regulację genów odpowiedzialnych osmotycznie, na przykład ompR (Infect and Immun. 1989, 2136-2140). Najkorzystniej mutacja występuje w sekwencji DNA dotyczącej szlaku biosyntezy aminokwasów aromatycznych, a zwłaszcza sekwencji DNA kodującej aroA, aroC lub aroD.

Atenuowana bakteria może być skonstruowana przez wprowadzenie mutacji do sekwencji DNA metodami znanymi specjalistom (Maniatis, Molecular Cloning and Laboratory Manual, 1982). Mutacje nieodwracalne mogą być wprowadzone przez wprowadzenie transpozonu hybrydowego TnphoA na przykład do szczepów S. typhimurium. TnphoA może generować aktywne enzymatycznie fuzje białek fosfatazy alkalicznej do białek periplazmatycznych lub białek błony komórkowej. Transpozon TnphoA przenosi gen kodujący oporność na kanamycynę. Selekcji transduktantów opornych na kanamycynę dokonuje się przez namnazanie kolonii w odpowiednim medium selekcyjnym.

Do metod alternatywnych należą klonowanie sekwencji DNA w wektorze, na przykład plazmidzie lub kosmidzie, włączenie selekcyjnego genu markerowego do klonowanej sekwencji DNA, czego wynikiem jest jego inaktywacja. Plazmid noszący inaktywowaną sekwencję DNA i różniący się marker selekcyjny mogą być wprowadzone do organizmu za pomocą znanych technik (Maniatis, Molecular Cloning and Laboratory Manual, 1982). Następnie poprzez odpowiednią selekcję możliwa jest identyfikacja mutanta, w którym inaktywowana sekwencja DNA uległa rekombinacji z chromosomem mikroorganizmu i sekwencja DNA typu dzikiego w wyniku procesu określanego jako wymiana alleliczna została uczyniona niefunkcjonalną. W szczególności zastosowany wektor jest korzystnie niestabilny w mikroorganizmie i będzie spontanicznie utracony. Zmutowana sekwencja DNA i sekwencja DNA typu dzikiego mogą. być zmienione w wyniku procesu wymiany genetycznej typu cross-over. Dodatkowe metody wykluczają wprowadzenie obcego DNA do szczepów szczepionki w miejscu mutacji i wprowadzenie do szczepów markerów opornych na antybiotyki.

Obcopochodny antygen, do ekspresji którego zdolna jest atenuowana bakteria zawiera na przykład determinantę antygenową organizmu patogennego. Antygen może być otrzymany z wirusa, bakterii, grzyba, drożdży lub pasożyta. Obcopochodne białko typowo zawiera zatem sekwencję antygenową, otrzymaną/, wirusa, bakterii, grzyba, drożdży lub pasożyta. W szczególności sekwencja antygenowa może być otrzymana z ludzkiego wirusa niedoborów immunologicznych (HIV) typu HIV-1 lub HIV-2, wirusa zapalenia wątroby typu A lub B, ludzkiego rinowirusa takiego jak typ 2 lub typ 14, wirusa opryszczki pospolitej, wirusa polio typ 2 lub 3, wirusa pryszczycy, wirusa grypy, wirusa Coxsackie, komórkowego antygenu powierzchniowego CD4 i Chlamydia trachomatis. Antygen może zawierać miej see wiążące antygen CD4 z HIV -1 lub 2. Do innych użytecznych antygenów należą labilna termicznie podjednostka B E. coli (LT-B), antygeny E. coli K88, białko P. 69 z B. pertussis, fragment C toksyny tężcowej i antygeny przywr, obleńców, tasiemców, wirusa wścieklizny i rotawirusów.

Korzystnie jako promotor do kontrolowania ekspresji białka obcopochodnego stosuje się promotor nirB. Promotor nirB został wyizolowany z E. coli, gdzie kieruje ekspresją operonu, zawierającego gen reduktazy azotynowej nirB (Jaya-raman et al., J. Mol. Biol. 196, 781-788, 1987) i nirD, nirC i cysG (Peakman et al., Eur. J. Biochem. 191, 315-323, 1990). Jest on regulowany zarówno przez azotyn jak i zmiany ciśnienia tlenu w środowisku, stając się aktywny przy pozbawieniu tlenu (Cole, Biochem. Biophys. Acta, 162, 356-368, 1968). Odpowiedź na

170 938 anaerobiozę wywierana jest za pośrednictwem białka FNR, działającego jako aktywator transkrypcji według mechanizmu wspólnego dla wielu genów oddychania beztlenowego.

Część promotora, odpowiadającą wyłącznie anaerobiozie wyizolowano poprzez delecję i analizę mutacjonalną, a poprzez porównanie z innymi promotorami regulowanymi anaerobowo zidentyfikowano miejsce wiążące FNR (Bell et al., Nuci. Acids Res. 17, 3865-3874, 1989; Jayaraman et al, Nuci. Acids res. 17, 135-145, 1989). Wykazano również, że odległość między przypuszczalnym miej scem wiązania FNR a regionem homologowym 10 jest krytyczna (Bell et al, Molec. Microbiol. 4, 1753-1763, 1990). Korzystnie zatem stosuje się tylko część promotora nirB, która odpowiada wyłącznie za anaerobiozę. Stosowane tu odniesienia do promotora nirB odnoszą się do samego promotora lub jego części lub pochodnej, zdolnej do promowania ekspresji kodowanej sekwencji w warunkach beztlenowych. W rzeczywistości stosowaliśmy następującą sekwencję, zawierającą promotor nirB:

AATTCAGGTAAATTTGATGTACATCAAATGGTACCCCTTGCTGAATCGTTA

AGGTAGGCGGTAGGGCC

Atenuowarnąbakterię stosowaną w sposobie według wynalazku wytwarza się w ten sposób, że transferuje się atenuowaną bakterię konstruktem DNA zawierającym promotor, którego aktywność jest indukowana przez warunki beztlenowe, taki jak promotor nirB, połączony w sposób usuwalny z sekwencją DNA kodującą białko obcopochodne. Stosuje się dowolną odpowiednią technikę transformacji, takąjak elektroporacja. W ten sposób otrzymuje się bakterie, zdolną do ekspresji białka obcopochodnego dla bakterii. Hodowlę atenuowanej bakterii namnaża się w warunkach tlenowych. W ten sposób otrzymuje się bakterię w ilości wystarczającej do przygotowania preparatu szczepionki przy minimalnej ekspresji białka obcopochodnego.

Jako konstrukt DNA stosuje się zwykle zdolny do replikacji wektor, zawierający promotor nirB, połączony w sposób usuwalny z sekwencją dNa kodującą białko obcopochodne. Promotor nirB może być włączony do wektora ekspresji, który ma już w miejsce istniejącego promotora regulującego ekspresję białka włączony gen kodujący białko obcopochodne. Wektor ekspresji powinien oczywiście być kompatybilny z atenuowaną bakterią, do której wektor ma być włączony.

Wektor ekspresji posiada odpowiednie elementy regulacji transkrypcji i translacji, oprócz promotora nirB oraz kodonów początku i zakończenia translacji. Posiada odpowiednie miejsce wiążące rybosomy. Wektor zwykle zawiera sekwencję origin of replication i w razie potrzeby selekcyjny gen markerowy, taki jak gen oporności na antybiotyki. Jako wektor może być stosowany plazmid.

Szczepionka korzystnie ma formę liofilizowaną, na przykład w postaci kapsułki do doustnego podawania pacjentom. Takie kapsułki mogą być zaopatrzone w powłokę nierozpuszczalnąw soku żołądkowym, wykonanąna przykład z Eudragitu S, Eudragitu L, octanu celulozy, ftalanu celulozy lub hydroksypropylocelulozy. Kapsułki te mogą być stosowane jako takie lub alternatywnie liofilizowany materiał może być przed użyciem roztwarzany na przykład do postaci zawiesiny. Roztwarzanie korzystnie przeprowadza się w buforze przy pH odpowiednim dla zapewnienia żywotności organizmów. W celu zabezpieczenia kwaśnego środowiska żołądka przed każdym podaniem szczepionki korzystnie podaje się preparat węglanu sodowego. Alternatywnie, szczepionka może być przygotowana do podawania pozajelitowego, donosowego lub dosutkowego.

Szczepionka wytworzona sposobem według wynalazku może być zastosowana w profilaktycznym działaniu na gospodarza, w szczególności na gospodarza ludzkiego, ale także na gospodarza zwierzęcego. W ten sposób przez podanie skutecznej dawki szczepionki wytworzonej sposobem według wynalazku można zapobiegać infekcji spowodowanej przez mikroorganizm, w szczególności patogen. W bakterii w szczepionce zachodzi następnie ekspresja białka obcopochodnego, zdolnego do zwiększania poziomu przeciwciał przeciwko mikroorganizmowi. Zastosowana dawka będzie zależna od różnych czynników, w tym od wielkości i wagi gospodarza, postaci szczepionki oraz rodzaju białka obcopochodnego. Jednakże dla atenuowanej S. typhi na ogół dogodna jest dla dorosłego gospodarza ludzkiego dawka doustna zawierająca od 10⁹do 10¹¹ organizmów S. typhi.

170 938

Poniższy przykład ilustruje wynalazek. W załączonych rysunkach:

Figury 1 do 4 przedstawiają zdolności izolatów S. typhimuri do wzrostu in vivo odpowiednio w wątrobie, śledzionie, płytkach Peyersa i krezkowych węzłach chłonnych myszy BALB/c. Na osi X zaznaczono ilość dni po iniekcji, na osi Y ilość żywych organizmów na organ, A oznacza izolaty BRD509, oznacza izolaty BRD847, oznacza izolat BRD743,-oznacza próbę bez ampicyliny, a-----oznacza próbę z (^(^dannm ampicyliny.

Figura 5 przedstawia miana fragmentu C toksyny przeciwtężcowej w surowicy myszy. Oś X przedstawia typ bakterii użytych do prowokacji myszy. Liczba dawek jest podana w nawiasach. Na osi Y podano odczyty absorbancji przy 492 nm.

Przykład. Konstrukcja pTETnirl 5

Plazmid ekspresji pTETnir15 skonstruowano z pTETtac115 (Makoff et al., Nuci. Acids Res. 17, 10191-10202, 1989) przez zastąpienie regionu EcoRI-Apal (1354 bp) zawierającego gen lacI i promotor tac następującą parą oligosekwencji 1 i 2:

oligo-1 ' -AATTCAGGTAAATTTGATGTACATCAAATGGTACCCCTTGCTGAATC oligo-2 ’ -GTCCATTTAAACTACATGTAGTTTACCATGGGGAACGACTTAGGTTAAG GTAGGCGGTAGGGCC-3 ’

CAATTCCATCCGCCATC-5’

Oligonukleotydy /syntetyzowano na urządzeniu Pharmacia Gene Assembler, a strukturę uzyskanych plazmidów potwierdzono przez sekwencjonowanie (Makoff et al, Bio/Technology 7, 10-43-1046, 1989). Konstrukcja SL1334 aroA aroD zawierającego pTETnirl 5

W ceiu skonstruowania szczepu szczepionki Salmonella zdolnego do ekspresji fragmentu C toksyny tężcowej pod kontrolą promotora nirB, szczep pośredni, S. typhimurium LB5010 (r‘m⁺) (Bullas and Ryo, J. Bact. 156, 471-474, 1983) przekształcono za pomocą pTETnir15. Kolonie zdolne do ekspresji fragmentu C wykrywano przez selekcję antybiotykiem, a następnie wydzielono za pomocątechniki immunoblotting z fragmentem C surowicy toksyny przeciwtężcowej. Kolonie namnażano przez noc, po czym indukowano przez inkubowanie przed immunoblottingiem przez cztery godziny w warunkach beztlenowych. Jeden ze szczepów, który był zdolny do ekspresji fragmentu C w sposób stabilny zastosowano do wytworzenia plazmidu DNA. Użyto go do transformacji i wydzielenia S. typhimurium SL1344 aroA, aroD oznaczonego jako BRD509 przez elektroporację. Szczep, który był zdolny do ekspresji fragmentu C w sposób stabilny (sprawdzono za pomocą techniki immunoblotting, jak opisano powyżej) wybrano do badań in vivo i oznaczono.

Porównanie kinetyki in vivo BRD743 i BRD847 u myszy BALB/c.

Porównano zdolność BRD743 (BRD509 zawierający pTET85) i BRD847 do wzrostu in vivo po podaniu doustnym myszom BALB/c. pTET85 skonstruowano z pTETtac115 (Makoff et al, Nuci. Acids Res. 17, 10191-10202, 1989) przez delecję fragmentu 1, 2 kb EcoRI noszącego gen lacI. W wyniku tego uzyskano konstytutywną ekspresję fragmentu C w szczepach Salmonella. Zliczano ilość bakterii w wątrobach, śledzionach, płytkach Peyersa i krezkowych węzłach limfatycznych. Oceniano również zdolność bakterii wyizolowanych z myszy do wzrastania na płytkach zawierających ampicylinę jako wskaźnik ilości organizmów, które zatrzymały jeszcze plazmid posiadający zdolność ekspresji fragmentu C. Wyniki przedstawiono na figurach 1 do 4.

Przy użyciu podobnych początkowych ilości mikroorganizmów (5 Χ10⁹) do zainfekowania myszy stwierdzono, że zarówno BRD743 jak i 847 były zdolne do inwazji i przetrwania we wszystkich badanych tkankach mysich, ale przy niższych poziomach niż BRD509. Jednakże interesującą jest to, że ilość mikroorganizmów opornych na ampicylinę, otrzymanych z myszy zainfekowanych BRD743 znacznie się zmniejsza i wszystkie uzyskane organizmy były w dniu 14 wrażliwe na ampicylinę. Wskazuje to, że selekcja in vivo bardzo szybko powoduje utratę pTET85 ze szczepu szczepionki Salmonelli. W przeciwieństwie do tego zliczenia dla BRD847 zarówno z ampicyliną jak i bez ampicyliny były zasadniczo takie same w czasie, w którym infekcje obserwowano. Wskazuje to na dodatkową zaletę pTETnir15 w szczepie szczepionki S.

170 938 typhimurium, dzięki której uzyskuje się organizmy o potencjale ekspresji fragmentu C in vivo przez dłuższy okres czasu, co ma oczywiste zalety w odniesieniu do immunogenności. Szczepienie myszy BALB/c przy użyciu szczepów Salmonella zawierających pTET85 (BRD743) lub pTETniri 5 (BRD847).

Grupę dwudziestu myszy zaszczepiono doustnie przy użyciu BRD743, BRD847 albo BRD509 w ilości 5 x 10⁹ komórek na mysz. 25 dnia pobrano surowicę od wszystkich myszy i przeprowadzono analizę przeciwciał przeciwtężcowych przy pomocy testu ELISA. Wszystkie myszy zaszczepione BRD847 miały 25 dnia wykrywalne przeciwciała przeciwko fragmentowi C, podczas gdy myszy szczepione BRD743 lub BRD509 nie miały takich przeciwciał (fig. 5). Dnia 25 dziesięciu myszom z każdej grupy podano dodatkowo doustnie podobną ilość organizmów homologowych. Analiza ELISA surowicy pobranej od tych myszy dnia 46 wykazała, że odpowiedzi przeciw fragmentowi C zwiększyły się dla grup zaszczepionych BRD743 i BRD847. Miana dla myszy, którym podano dodatkowe ilości BRD847 były znacznie wyższe niż dla myszy, którym podano dodatkową ilość BRD743. Myszy, którym podano doustnie dodatkową ilość BRD509 nie wytwarzały przeciwciał przeciw fragmentowi C w wykrywalnej ilości.

Prowokacja toksyną tężcową myszy zaszczepionych doustnie BRD847 i 743.

Myszy zaszczepione doustnie za pomocąBRD743,847 i 509 przetestowano na odporność na prowokację toksyną tężcową po jednej lub dwóch dawkach szczepu uodparniającego. Grupy dwudziestu myszy otrzymały jedną pojedynczą dawkę doustną 5 x 109 organizmów, a grupy dziesięciu myszy prowokowano 25 dnia 500 dawkami 50% śmiertelnej dawki toksyny tężcowej (patrz tabela 1). Myszy szczepione BRD847 były całkowicie zabezpieczone przeciwko prowokacji po pojedynczej dawce doustnej, podczas gdy myszy szczepione BRD743 były jedynie częściowo zabezpieczone (2/10 osobników przeżyło). Pozostałe grupy po 10 myszy otrzymały drugą dawkę organizmów (5 x 109) dnia 25 i były prowokowane dnia 46 (po pierwszej dawce). Ponownie myszy szczepione BRD847 były całkowicie zabezpieczone po prowokacji toksyną tężcową, podczas gdy szczepione BRD743 były tylko częściowo zabezpieczone (5/10). Wszystkie myszy zaszczepione 1 lub 2 dawkami BRD509 i prowokowane toksyną tężcową zmarły. BRD847 jest skuteczną w jednej dawce doustną szczepionką przeciwko prowokacji toksyną tężcową u myszy. Grupy myszy poddawano również prowokacji toksyną tężcową po otrzymaniu 1 lub 2 dożylnych dawek 10⁵ organizmów BRD847 i BRD743. Wszystkie myszy były całkowicie zabezpieczone przeciwko prowokacji toksyną tężca po 1 lub 2 dawkach szczepu szczepionki.

Tabela 1

Doustne szczepienie myszy przeciwko tężcowi przy użyciu S. typhimurium SL1344 aroA aroD pTET85 i S typhimurium SL1344 aroA aroD pTETnir15.

Szczepionka	Dawka	Liczba dawek	Liczba myszy, które przeżyły prowokację tężcową
SL1344 aroA aroD	8,6 x 109	1	0/10
(BRD509)	7,4 x 10’	2	0/10
SL1344 aroA aroD	6,4 x 10⁹	1	2/10
pTET85 (BRD743)	8,2 x 10’	2	5/10
SL1344 aroA aroD	9,5 x 10’	1	10/10
pTETnirl5 (BRD847)	7,5 x 10’	2	9/10

170 938

χ

170 938

χ

170 938

Fig. 5

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 4,00 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania szczepionki przeciwko infekcjom Salmonella, znamienny tym, ze transformuje się atenuowaną bakterię konstruktem DNA zawierającym promotor, którego aktywność jest indukowana przez warunki beztlenowe, w usuwalny sposób połączony z sekwencją DNA kodującą obcopochodne białko antygenowe, namnaża się hodowlę bakterii w warunkach tlenowych, i miesza się bakterię z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem lub rozcieńczalnikiem.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako atenuowaną bakterię stosuje się atenuowany szczep Salmonella.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jako atenuowaną bakterię stosuje się atenuowany szczep Salmonella typhi lub Salmonella typhimurium.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się atenuowaną bakterię, w której atenuacja jest spowodowana nieodwracalną mutacja w genie szlaku biosyntezy aminokwasów aromatycznych.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się atenuowaną bakterię, w której atenuacja spowodowana jest nieodwracalną, mutacją w DNA bakterii, kodującym lub regulującym ekspresję DNA kodującego białko, wytworzone na stres środowiskowy.
6. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że stosuje się atenuowaną bakterię, w której miejscem nieodwracalnej mutacji są oba z dwóch oddzielnych genów w jej szlaku biosyntezy aminokwasów aromatycznych.
7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że jako atenuowaną bakterię stosuje się mutant aroA aroC, aroA aroD lub aroA aroE.
8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że promotorem jest promotor nirB.
9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że białko obcopochodne zawiera sekwencję antygenową otrzymaną z wirusa, bakterii, grzybów, drożdży lub pasożytów·'.
10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że białko obcopochodne jest białkiem P.69 z Bordetella pertussis lub fragment C toksyny tężcowej.

* * *