PL171637B1 - Sposób wytwarzania kompozytowych lateksów polipirolowych - Google Patents

Abstract

Sposób wytwarzania kompozytowych lateksów polipirolowych, znamienny tym, że powierzchnię lateksu polipirolowego pokrywa się polimerem zawierającym grupy funkcyjne zdolne do kowalencyjnej immobilizacji białek i innych związków, zwłaszcza pierwszorzędowe grupy aminowe, prowadząc polimeryzację rodnikową w wodzie monomerów winylowych, wybranych z grupy obejmującej akroleinę, monomery akrylowe i/lub ahdoaminowe rozpuszczalne w wodzie, inicjowaną rozpuszczalnymi w wodzie inicjatorami lub promieniowaniem jonizującym, przy stężeniach monomerów niższych niz 0,5% (w/v), w obecności lateksu polipirolowego o stężeniach w zakresie od 1 do 2% (w/v).

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania kompozytowych lateksów poiipirolowych, których powierzchnia pokryta jest polimerem zawierającym grupy funkcyjne zdolne do kowalencyjnej immobilizacji białek, przez polimeryzację rodnikową w wodzie monomerów winylowych. Lateksy te można przechowywać w wodzie lub w buforach.

Lateksy i mikrosfery polimerowe znalazły szerokie zastosowanie jako nośniki związków biologicznie czynnych, w szczególności białek, stosowane w diagnostyce medycznej oraz do celów terapeutycznych (P. Guiot, P. Couvreur Polymeric Nanoparticles and Microspheres, 1986, Boca Raton, FL, CRC, A. Rembaum, Z Tckes Microspheres: Medical and Biological Applications, Boca Raton, FI., CRC, M. Rosoff Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems New York, N.Y., VCH). W diagnostyce dogodnie jest stosować lateksy bardzo intensywnie zabarwione, łatwe do obserwowania w płynach ustrojowych i tkankach. Zainteresowanie silnie zabarwionymi lateksami wynika z ich przydatności do suchych testów diagnostycznych, w których odpowiednio przygotowane lateksy umieszczane są na stałym podłożu, a jedyną używaną cieczą jest badana surowica lub inny płyn ustrojowy. Za szczególnie przydatny do takich zastosowań uznano lateks polipirolowy (P.J. Tarcha, D. Misun, D. Finley, M. Wong, J.J. Donovan, ACS Symp. Ser. 492, 347 (1992)). Lateks polipirolowy ma bardzo intensywne czarne zabarwienie, jest dogodny do obserwacji na podłożach stosowanych w testach bibułowych i aglutynacyjnych. Lateks stosowany w pracy Tarcha i współpracowników (P.J. Tarcha, D. Misun, D. Finley, M. Wong, J.J. Donovan, ACS Symp. Ser. 492, 347, (1992)) otrzymywano na drodze polimeryzacji pirolu pod działaniem FeCh prowadzonej w wodzie wobec polialkoholu winylowego lub poliwinylopirolidonu według metody opisanej przez Armes'a (S.P. Armes, J.F. Miller, B. Vincent, J. Colloid Interface Sci., 118, 410, (1987)). W tej postaci lateks polipirolowy wiąże niewielkie ilości białka. Tarcha wykazał, że do immobilizacji białek przydatne są funkcjonalizowane pochodne (bromoacetylowa, karboksylowa, aminowa) lateksu polipirolowego. Wadą dotychczasowej metody otrzymywania lateksu polipirolowego zdolnego do wiązania białek jest pracochłonna i czasochłonna procedura wymagająca wymiany rozpuszczalnika w jakim otrzymywany jest lateks (woda) na rozpuszczalnik organiczny, w którym prowadzono bromoacetylowanie, a w wypadku otrzymywania lateksu z grupami karboksylowymi lub aminowymi, konieczność poddawania bromoacetylowej pochodnej dalszym reakcjom. Na każdym etapie konieczne jest oczyszczanie produktu. Ponadto, na poszczególnych etapach następuje agregacja lateksu i w celu ponownego otrzymania jednorodnej zawiesiny niezbędne jest stosowanie pomocniczych środków powierzchniowo czynnych. Istotnym utrudnieniem w użyciu lateksu z grupami bromoacetylowymi wykorzystywanymi do bezpośredniego wiązania białek jest to, że grupy te są w wodzie nietrwałe i przed użyciem lateks bromoacetylowany musi być chroniony przed kontaktem z wodą. Podczas prowadzonej w buforach wodnych immobilizacji białek na lateksie bromoacetylowanym część grup bromoacetylowych ulega

171 637 hydrolizie przed reakcją z białkiem obniżając efektywność immobilizacji. Wykorzystanie do immobilizacji białek pochodnych lateksu polipirolowego z grupami karboksylowymi i aminowymi wymaga użycia aktywatorów (odpowiednio karbodumidu i aldehydu glutarowego).

Biorąc powyższe pod uwagę szukano innych, prostszych sposobów otrzymywania pochodnych lateksu polipirolowego zdolnych do kowalencyjnej immobilizacji białek, w szczególności pochodnych, które można przechowywać w wodzie lub w buforach i wykorzystywać do immobilizacji białek bez aktywacji.

Nieoczekiwanie, okazało się, że sposobem według wynalazku, można w sposób prosty otrzymać lateks polipirolowy, którego powierzchnia pokrytajest polimerem zawieraj ącym grupy funkcyjne zdolne do immobilizacji białek bez lub po aktywacji, który można przechowywać w wodzie lub w buforach.

Sposób otrzymywania kompozytowych lateksów polipirolowych, według wynalazku polegama tym, że powierzchnię lateksu polipirolowego pokrywa się polimerem zawierającym grupy funkcyjne immobilizujące białko bez lub po aktywacji, prowadząc polimeryzację rodnikową w wodzie monomeru winylowego wybranego z grupy obejmującej akroleinę, monomery akrylowe i/lub alliloaminowe rozpuszczalne w wodzie, inicjowaną rozpuszczalnymi w wodzie inicjatorami lub promieniowaniemjonizującym, przy stężeniach monomeru niższych niż 0,5% (w/v), w obecności lateksu polipirolowego o stężeniach w zakresie od 1 do 2 % (w/v).

Stwierdzono, że w sposobie według wynalazku nie powstają nowe cząstki lateksu, natomiast polimer utworzony z monomeru pokrywa cząstki lateksu polipirolowego modyfikując ich powierzchnię.

Sposób według wynalazku, korzystnie stosuje się do otrzymywania kompozytowych lateksów polipirolowych zawierających cząstki pokryte warstwą poliakroleiny, polimetakrylanu hydroksyetylu), poli(akrylanu hydroksyetylu), jak również kopolimerami zawierającymi jednostki monomeryczne alliloaminy.

Modyfikacja lateksów polipirolowych prowadząca do lateksów z grupami funkcyjnymi, według wynalazku nie wymaga wymiany ośrodka (wody) na rozpuszczalnik organiczny i jest procesem jednoetapowym. Otrzymywane lateksy zawierają grupy funkcyjne (hydroksylowe, aminowe) umożliwiające immobilizację białek przy użyciu aktywatorów (odpowiednio cyjanobromu i aldehydu glutarowego) lub, w wypadku lateksów z grupami aldehydowymi, immobilizację białek bezpośrednio, bez użycia aktywatorów.

Stężenie 1% (w/v) oznacza 1 g monomeru w 100 ml zawiesiny.

Sposób otrzymywania kompozytowych lateksów polipirolowych według wynalazku ilustrują poniższe przykłady, nie ograniczające jednakże jego zakresu.

Przykład I. Otrzymywanie kompozytowego lateksu polipirolowego z poliakroleiną na powierzchni.

A. Otrzymywanie lateksu polipirolowego (Lateks IA).

W 50 ml wody potrójnie destylowanej rozpuszczono 0,4 g poliwinylopirolidonu (Aldrich, K30). Roztwór umieszczono w kolbie trójszyjnej zaopatrzonej w mieszadło i przedmuchiwano azotem. Do kolby dodano 8,83 g FeCb x 6H2O rozpuszczonego w 50 ml wody potrójnie destylowanej. Do układu dodano 1 ml świeżo przedestylowanego pirolu. Reagenty mieszano przez 24 godziny w temperaturze pokojowej. Otrzymany lateks oddzielano przez wirowanie przy 9 000 G w czasie 30 min., a następnie zawieszano w czystej wodzie potrójnie destylowanej. Otrzymano zawiesinę zawierającą lateks polipirolowy o stężeniu 1,2%. Średnica cząstek lateksu wynosiła 0,07 pm.

B. Utworzenie warstwy poliakroleinowej na powierzchni lateksu polipirolowego (Lateks IB).

W kolbie trójszyjnej zaopatrzonej w mieszadło umieszczono 50 ml zawiesiny zawierającej

0,6 g lateksu polipirolowego i 0,022 g K2SO4. Mieszaninę przedmuchiwano azotem. Do układu dodano 0,1 ml świeżo przedestylowanej akroleiny. Polimeryzację prowadzono w temperaturze 65°C w czasie 30 godzin. Otrzymany lateks oczyszczano przez czterokrotne odwirowanie (5 000 G, 30 min.) z zawiesiny w wodzie. W obrazach mikroskopu elektronowego obserwowano jeden rodzaj cząstek lateksu o średnicy nie różniącej się w istotny sposób od średnicy pierwotnego lateksu polipirolowego. Stężenie grup aldehydowych na powierzchni cząstek modyfikowanego lateksu oznaczano wykorzystując charakterystyczną reakcję z udziałem 2,4-dinitrofenylo4

171 637 hydrazyny (związek barwny) (S. Słomkowski, T. Basińska, ACS Symp. Ser., 492, 328 (1992)). Wynosiło ono 1.6 x 10'⁵ mol/m2

Przykiad Π. Kompozytowy lateks polipirol-poliakroleina otrzymano tak jak opisano w przykładzie I z tym, że do syntezy użyto dwa razy większą ilość akrolemy (Lateks I1B).

immobilizacja albuminy ludzkiej (HSA) (Sigma) i gamma globulin ludzkich (xG) (Sigma) na powierzchni lateksów polipirol-poliakroleina. Immobilizację prowadzono w buforze fosforanowym (pH = 7.4) w uprzednio opisany sposób (S. Słomkowski, T. Basińska, ACS Symp. Ser. 492, 328 (1992)). Ilość immobilizowanego białka oznaczano spektrofotometrycznie mierząc, przy 280 nm absorpcję roztworu białka przed i po inkubacji ze znaną ilością lateksu.

W tabeli podano maksymalne stężenia powierzchniowe r_mak HSA i tG immobilizowanych na lateksach Lateks IA, IB i ΠΒ. Immobilizację prowadzono przy stężeniu lateksów 3,1 x 10'³ g/ml. Maksimum immobilizacji uzyskiwano dla stężeń białek wyższych niż 200 Ug/rnl.

Przykład IEi-V. Kompozytowe lateksy polipirol-poli(akrylan hydroksyetylu), polipirol-poli(metakrylan hydroksyetylu), polipirol-poli(metakrylan hydroksyetylu)-polialliloamina otrzymano tak jak opisano w przykładzie I.

Tabela

	rmakiHSA)	TmOcCtG)
mg białWl g lateksu	mg białka/1 g lateksu
Lateks IA	< 0,5	4
Lateks IB	11	31
Lateks ΠΒ	10	30

Departament Wydawnictw UP RP Nakład 90 egz. Cena 2,00 zł

Claims (1)

1. Zastrzeżenie patentowe

   Sposób wytwarzania kompozytowych lateksów polipirolowych, znamienny tym, że powierzchnię lateksu polipirolowego pokrywa się polimerem zawierającym grupy funkcyjne zdolne do kowalencyjnej immobilizacji białek i innych związków, zwłaszcza pierwszorzędowe grupy aminowe, prowadząc polimeryzację rodnikową w wodzie monomerów winylowych, wybranych z grupy obejmującej akroleinę, monomery akrylowe i/lub alliloaminowe rozpuszczalne w wodzie, inicjowaną rozpuszczalnymi w wodzie inicjatorami lub promieniowaniem jonizującym, przy stężeniach monomerów niższych niż 0,5% (w/v), w obecności lateksu polipirolowego o stężeniach w zakresie od 1 do 2% (w/v).