PL172116B1 - Preparat antygenowy H.pyroli PL PL PL - Google Patents

Abstract

1. Preparat antygenowy H. pyroli, znamienny tym , ze zawiera pochodzace z H. pyroli skladniki o wielkosci 238,5 - 291,5 kDa okreslone jako natywna PAGE i 306 - 374 kPa okreslone jako natywna PAGE, przy czym jest zasadniczo wolny od pochodzacego z H. pyroli skladnika o wielkosci 440 kDa okreslone jako natywna PAGE. P L 1 7 2 1 1 6 B 1 PL PL PL

Description

Wynalazek dotyczy preparatu pozwalającego na szybkie wykrywanie in vitro infekcji Helicobacter pyroli w komórkach ssaków.

Infekcje przewodu pokarmowego ssaków, a szczególnie człowieka stymulują odpowiedź immunologiczną w wydzielinach śluzówki, takich jak ślina, poprzez aktywację systemu immunologicznego śluzówki. Taka odpowiedź często początkowo towarzyszy odpowiedzi immunologicznej w surowicy, chociaż jest ogólnie scharakteryzowana przez obecność przeciwciał IgA. Jednakże, odpowiedź immunologiczna w wydzielinach, włączając ślinę, gwałtownie zanika wraz z zanikiem w organizmie antygenu (na przykład, bakterii lub wirusów). Tak więc, obecność przeciwciał w wydzielinach śluzówki odzwierciedla obecne, to znaczy trwające infekcje. Na przykład, w przypadku infekcji bakteryjnych, przeciwciała w wydzielinach śluzówki, nazywane tu i dalej przeciwciałami wydzielniczymi, odzwierciedlają obecny stan zasiedlenia mikroorganizmami, na przykład, przewodu pokarmowego, i dlatego są użyteczne do monitorowania trwających infekcji. Z drugiej strony, przeciwciała surowicy, obecne są przez pewien czas po wyeliminowaniu mikroorganizmu z ciała. Dodatni wynik testu opartego na przeciwciałach surowicy, odzwierciedla obecne i przeszłe narażenie na antygen, co jest mniej użyteczne dla klinicystów. Z drugiej strony, dodatni wynik testu opartego na przeciwciałach wydzielniczych, odzwierciedla obecną lub trwającą infekcję przez mikroorganizm. Wynalazek obecny powstał w wyniku badań infekcji Helicobacter pyroli (znanej także jako Campylobacter pyroli) przewodu pokarmowego ssaków. Postawienie diagnozy o infekcji H. pyroli jest możliwe za pomocą mikroskopu, hodowli bakterii, wykrycia ureazy w biopsji śluzówki przewodu pokarmowego, testu na rozkład mocznika lub wykrycia obecności specyficznych przeciwciał w surowicy przy użyciu testu ELISA. Można przewidzieć, że infekcja H. pyroli, która jest infekcją śluzówki przewodu pokarmowego, zwiększy odpowiedź humoralną przeciwciał IgA w wydzielinach przewodu pokarmowego. Jednakże, w czasie prac poprzedzających obecny wynalazek, odkryto, specyficzne do H. pyroli przeciwciała występujące w wydzielinach śluzówki należą do klasy IgG, a nie do IgA, jak można się było spodziewać. Wykrywano, bardzo mało lub w ogóle nie wykrywano przeciwciał IgA. Tak więc, AU-A-9067676 jest nakierowany na wykrywanie w wydzielinach śluzówki przeciwciał IgG przeciw specyficznym antygenom H pyroli i w ten sposób zapewnia środek do monitorowania obecnych, to znaczy trwających, infekcji bakteryjnych w organizmach ssaków. Odpowiednia publikacja naukowa to Witt i wsp., Frontiers in Mucosal Immunology 1 693-696 (1991).

Obecność przeciwciał IgG w ślinie pacjentów zainfekowanych Campylobacter pyroli wzbudziła pewne zainteresowanie na dorocznym zjeździe Amerykańskiego Towarzystwa Gastroenterologicznego. Po wykryciu przez Czinn i wsp., obecności takich przeciwciał (publikacja po zjeździe w 1989 roku) Larsen i wsp., stwierdzili w publikacji po zjeździe

17.116 w maju 1991 roku, że poziom IgG w ślinie jest praktycznym, nieinwazyjnym markerem odpowiedzi terapeutycznej w czasie trwania leczenia antybiotykami. W publikacji po zjeździe w kwietniu 1992 roku Landes i wsp., potwierdził wcześniejsze obserwacje i stwierdził, że mierzenie poziomu IgG przeciw Helicobacter pyroli w ślinie jest prostym, nieinwazyjnym testem do wykrywania infekcji H. pyroli u pacjentów, szczególnie w populacjach szeroko rozprzestrzenionych, lub u dzieci, gdzie inne testy są niepraktyczne.

Z powyższego jasno wynika, że istnieje duże zainteresowanie i zapotrzebowanie kliniczne na oparty na pomiarze poziomu ślinowych IgG test do wykrywania H. pyroli.. Jasne jest także, że taki test musi być wiarygodny, a także wygodny. Znane są sposoby inwazyjne (na przykład, US-A-4882271, Schaber i wsp., J. Clin. Microbiol. 27(2) 327-330 (1989), Loffeld i wsp., The Lancet, 27 maja 1989,1182-1185 i Evans i wsp., Gastroenterology 96 1θθ4-1008 (1989) i wykorzystane (na przykład, zestaw CLOtest , który jest dostępny od Delta West Ltd., Perth, Australia Zachodnia i który wykrywa obecność ureazy w próbkach biopsji). Test nieinwazyjny musi mieć niezawodność porównywalną z testami inwazyjnymi, żeby zostać zaakceptowanym i użytecznym.

Preparat antygenowy H. pyroli według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera pochodzące z H. pyroli składniki o wielkości 238,5-291,5 kDa określone jako natywna PAGE i 306-374 kDa określone jako natywna PAGE, przy czym jest zasadniczo wolny od pochodzącego z H. pyroli składnika o wielkości 440 kDa określonego jako natywna PAGE.

Korzystnie preparat według wynalazku dodatkowo zawiera pochodzące z H. pyroli antygeny o ciężarze cząsteczkowym wynoszącym 144 - 176 kDa jako natywna PAGE i/lub 63 - 77 kDA jako natywna PAGE.

Dzięki preparatowi według wynalazku można przeprowadzić wydajny test in vitro do wykrywania infekcji H. pyroli przez monitorowanie obecności przeciwciał IgG w wydzielinach śluzówki.

Stwierdzono, że jeśli składnik o wielkości około 440 kDa jest obecny, u niektórych pacjentów można otrzymać fałszywy wynik pozytywny. Natomiast, jeżeli brak jest antygenu o wielkości około 265 kDa można otrzymać fałszywy wynik negatywny. Ponadto, jeżeli brak jest antygenu H. pyroli o wielkości około 340 kDa, u niektórych pacjentów można otrzymać fałszywy wynik negatywny, dlatego obecność antygenu o wielkości około 340 kDa jest wysoce pożądana.

Antygen jest obecny jeżeli można go wykryć metodą Western blotting. Jest więc nieobecny jeżeli nie można go wykryć tą metodą. Czułość metody western blotting rzędu 20 μ g/ml jest powszechnie akceptowana.

Masa cząsteczkowa składników antygenowych użytecznych w preparacie według wynalazku jest z konieczności przybliżona, z powodu ograniczeń obecnie stosowanych sposobów określania masy cząsteczkowej. Specyficznie określone masy cząsteczkowe otrzymano zwykłym zestawem do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE) sprzedawanym przez firmę Pharmacia pod znakiem handlowym PHASTGEL , przy użyciu gradientu 8-25 PHASTGEL. Zestaw ten daje liniową zależność pomiędzy odległością migracji białka w żelu a logarytmem jego masy cząsteczkowej, dla białek globuralnych o masie cząsteczkowej z zakresu od 50000 do 750000. W swoim zestawie do kalibracji elektroforezy Pharmecia dostarcza zestaw markerów o wysokiej masie cząsteczkowej, ten zestaw markerów był użyty do kalibracji wspomnianych w tym wynalazku żelów. Biegli w sztuce wiedzą, że w innych rękach lub w tych samych rękach przy innej okazji można otrzymać nieco inne wyniki, i że przybliżone masy cząsteczkowe wyszczególnione w niniejszym opisie powinny być czytane jako ±5% lub nawet +10%. Z tego powodu antygen około 265 kDa czasami jest oznaczany jako antygen 255-275 kDa.

Wyrażenie antygen używane jest w swoim szerszym znaczeniu i obejmuje całe komórki H. pyroli lub homogenne, prawie homogenne lub heterogenne ektrakty H. pyroli., wszystkie zdolne do wiązania się ze specyficznym przeciwciałem w wydzielinie śluzówki, pod warunkiem, że zawsze obecny jest pochodzący z H. pyroli antygen około 265 kDa

172 116 (i korzystnie około 340 kDa), i że pochodzący z H. pyroli antygen około 440 kDa jest całkowicie nieobecny. Rozważane składniki antygenowe obejmują białka, polisacharydy lub lipidy lub ich każdą kombinację. Korzystnie, antygenem jest białko, lipopolisacharyd lub ekstrakt komórkowy H. pyroli, otrzymany, na przykład, przez sonifikację, rozbicie nadciśnieniem, ekstrakcję detergentami lub frakcjonowanie.

Jedną z najbardziej efektywnych metod stwierdzenia, że pożądane antygeny są obecne po usunięciu wielu nieodpowiednich składników jest chromatografia surowego ekstraktu (na przykład, sonifikatu) komórek H. pyroli. Na przykład, szczególnie wydajna przy zastosowaniu do surowego sonifikatu komórek, który został poddany chromatografii jonowymiennej jest szybka, ciekła chromatografia białka (FLPC), taka jak chromatografia wykluczania przy użyciu kolumn SUPEROSE™ 6. Inne metody dostępne dla biegłych w sztuce też są dobre.

Jedną z najbardziej wydajnych metod gwarantujących, że niepożądany antygen około 440 kDa jest nieobecny, jest liofilizacja ekstraktu komórek H. pyroli, szczególnie po oczyszczaniu chromatograficznym, takim jak, FPLC. Liofilizację ekstraktu można prowadzić w każdym odpowiednim do tego celu aparacie. Konkretne wyposażenie i użyte warunki zależą od skali preparacji. Korzystnie jest gdy, proces liofilizacji prowadzi się do całkowitego zakończenia, w zakresie możliwości stwarzanych przez użyte wyposażenie.

Wynalazek obejmuje użycie naturalnie występujących form antygenu i form syntetycznych (na przykład, zrekombinowanych) i ich immunologicznie aktywnych pochodnych, analogów i pokrewnych. Dlatego jest jasne, że wydajny preparat antygenowy może być selektywnie uzyskany z preparatu komórek H. pyroli lub zbudowany z pojedynczych składników lub mieszaniny powyższych.

Przeciwciała wykrywa się w wydzielinie śluzówki. Przez wydzielinę śluzówki rozumie się w^tdzi^^linę komórek nabłonka wydzielniczego śluzówki (to jest błonę śluzówki), takich jak, te które wyścielają kanaliki, jamki i przewody, które komunikują się z powietrzem zewnętrznym, a szczególnie nosa, gardła, dróg oddechowych, oczu, przewodów płciowych i moczowych i układu trawiennego. W korzystnym przykładzie wykonania wynalazku, wydzieliną śluzówki jest wydzielina z nosa, plwocina, a szczególnie ślina.

Ślinę i inne wydzieliny śluzówki można testować nierozcieńczone lub po rozcieńczeniu odpowiednim rozcieńczalnikiem (takim jak, woda destylowana). Wraz ze zwiększeniem czułości, rozcieńczanie może być korzystne (szczególnie, gdy używa się urządzeń zbierających). ,

Preparat antygenowy jest dla wygody i preferencyjnie związany ze stałym nośnikiem. Odpowiednie stałe nośniki obejmują błony nitrocelulozowe, szkło lub polimery. Najbardziej powszechnie używane do tego celu polimery to celuloza, poliakrylamid, nylon, polistyren, chlorek poliwinylu lub polipropylen. Stały nośnik może występować w formie pasków, rurek, perełek, krążków lub mikropłytek, lub każdej innej powierzchni odpowiedniej do prowadzenia testu immunologicznego.

Składnik antygenowy H. pyroli użyteczny w tym wynalazku może być kowalencyjnie lub niekowalencyjnie (pasywnie) związany ze stałą powierzchnią. Odpowiednie procesy wiązania są dobrze znane biegłym w sztuce i ogólnie obejmują wiązanie krzyżowe, wiązanie kowalencyjne lub fizyczną adsorbcję antygenu na stałym nośniku.

Diagnozę o infekcji stawia się przez wykrycie tworzenia kompleksu pomiędzy przeciwciałem IgG z próbki śluzu i antygenu H. pyroli. Potrzebna jest więc pewna forma środka wykrywającego w celu określenia obecności (lub, jeśli to konieczne, określenia ilości) kompleksu przeciwciało-antygen.

Środkiem wykrywającym może być drugie przeciwciało połączone z cząsteczką reportera, przeciwciało które jest specyficzne przynajmniej do części klasy specyficznego przeciwciała przeciw H. pyroli znajdującego się w wydzielinie, jak wyjaśniono powyżej, tym przeciwciałem jest IgG.

Cząsteczka reportera jest cząsteczką lub grupą cząsteczek, które przez swoją naturę chemiczną, mają identyfikowalną analitycznie charakterystykę lub zapewniają identyfikowalny analitycznie sygnał, który pozwala na wykrycie związanego z antygenem przeciwciała. Wykrywanie może być ilościowe lub jakościowe. Najbardziej powszechnie używane w testach tego typu cząsteczki reportera to enzymy, fluorofory lub cząsteczki zawierające izotopy promieniotwórcze (to znaczy radioizotopy). W przypadku enzymatycznych testów immunologicznych, enzym jest sprzężony z drugim przeciwciałem, ogólnie za pomocą aldehydu glutarowego lub najdodanu. Jednakże, łatwo można rozpoznać, że istnieje wiele różnych technik sprzęgania, które mogą być łatwo dostępne dla biegłych w sztuce. Powszechnie używane enzymy obejmują, między innymi, peroksydazę korzenia chrzanu, oksydazę glukozy, β-galaktozydazę i fosfatazę alkaliczną. Substraty, których można użyć ze specyficznymi enzymami, ogólnie wybiera się pod kątem wytwarzania, po hydrolizie przez odpowiedni enzym, wykrywalnej zmiany koloru. Substraty mogą być rozpuszczalne lub nierozpuszczalne, w zależności od wybranego zastosowania. Na przykład, 5-bromo-4-chloro-3-indolilofosforan/błękit nitrotetrazolowy jest odpowiedni do użycia z koniugatami fosfatazy alkalicznej, dla koniugatów peroksydazy przeważnie używa się kwasu 1,2-fenylenodiamino-5-aminosalicylowego, 3,3,5,5-tetrametylobenzydyny, tolidyny lub dwuanizydyny. Możliwe jest także zastosowanie substratów fluorogennych, dających substraty fluorescencyjne, zamiast wspomnianych powyżej substratów chromogennych. Przykładem substratów fluorogennych są fluoresceina i rodamina. Po wzbudzeniu przez naświetlenie światłem o określonej długości fali przeciwciało znakowane fluorochromem adsorbuje energię świetlną, wywołując stan wzbudzenia cząsteczki, po czym następuje emisja światła o charakterystycznym kolorze, który można przeważnie wykryć wizualnie pod mikroskopem świetlnym. Techniki immunofluorescencji i EIA są dobrze znane w sztuce i są szczególnie korzystne. Jednakże inne cząsteczki reportera, takie jak, radioizotopy, cząsteczki chemiluminescencyjne i bioluminescencyjne i/lub barwniki i inne substancje chromogenne także mogą być użyte.

Wybór określonego przeciwciała sprzężonego z cząsteczką reportera jest w największym stopniu uzależniony od zamierzonego użycia i użytkownika. Ponadto, chociaż preparat jest odpowiedni dla wszystkich ssaków wrażliwych na infekcje H. pyroli jest najlepszy i najbardziej użyteczny do monitorowania infekcji H. pyroli u ludzi.

Sposób wykrywania trwających infekcji H, pyroli, u ludzi i obejmuje:

(a) doprowadzenie do kontaktu wydzielmy śluzówki człowieka z preparatem antygenowym H. pyroli immobilizowanym na stałym nośniku przez czas i w warunkach odpowiednich dla przeciwciała IgG z wydzieliny śluzówki, specyficznego do antygenu w preparacie antygenowym, do wytworzenia z nim kompleksu, przy czym preparat antygenowy zawiera składniki pochodzące z H. pyroli o wielkości około 265 kDa i około 340 kDa i jest zupełnie wolny od pochodzącego z H. pyroli składnika o wielkości około 440 kDa;

(b) doprowadzenie do kontaktu tego kompleksu z efektywną ilością drugiego przeciwciała znakowanego cząsteczką reportera i specyficznego do przeciwciała IgG specyficznego do H. pyroli; i (c) wykrycie wiązania drugiego przeciwciała ze wspomnianym przeciwciałem IgG dzięki cząsteczce reportera.

Tak więc, lekarz praktykujący, klinicysta, pielęgniarka lub nawet pacjent może użyć paska błony nitrocelulozowej lub innego odpowiedniego stałego podłoża, niosącego immobilizowane antygeny H. pyroli, takie jak, liofilizowane frakcjonowane metodą FPLC rozpuszczalne sonifikaty. Następnie doprowadza się do kontaktu paska z wydzieliną śluzówki przez czas i w warunkach odpowiednich żeby ewentualnie przeciwciała klasy IgG specyficzne do H. pyroli występujące w ślinie związały się immobilizowanymi antygenami. Zamiast śliny, źródłem wydzieliny śluzówki może być wydzielina nosa lub plwocina.

Następnie po ekspozycji na wydzielinę śluzówki doprowadza się do kontaktu paska testowego z drugim przeciwciałem znakowanym cząsteczką reportera przez czas i w warunkach odpowiednich żeby drugie przeciwciało związało się z pierwszym przeciwciałem. Korzystnie cząsteczką reportera jest enzym, taki jak, fosfataza alkaliczna.

172 116

Następnie pasek testowy przemywa się i doprowadza się do kontaktu substratu dla cząsteczki reportera (w przypadku, gdy cząsteczką reportera jest fosfataza alkaliczna 5-bromo-4-chloro-3-indolilofosforanu/błękitu nitrotetrazolowego) z paskiem testowym. Substrat reaguje z cząsteczką reportera i daje w ten sposób wykrywalną zmianę. Na przykład, fosfataza alkaliczna hydrolizuje rozpad 5-bromo-4-chloro-3-mdolilofosforanu do purpurowego produktu. Cała ta procedura może zajść w gabinecie przyjęć lekarza praktykującego lub w biurze. Kiedy wymaga się bardziej ilościowego enzymatycznego testu immunosorpcyjnego (ELISA), tak jak w laboratoriach klinicznych, można użyć mikropłytki niosącej w studzienkach immobilizowane antygeny H. pyroli. W tym przypadku, próbki wydzieliny śluzówki, na przykład, śliny, dodaje się do studzienki i pozwala żeby ewentualnie przeciwciała IgG specyficzne do H. pyroli związały się immobilizowanym antygenem. Nadmiar wydzieliny odmywa się i dodaje drugiego przeciwciała specyficznego do IgG sprzężonego z cząsteczką reportera w celu umożliwienia powstania kompleksu antygen-przeciwciało-przeciwciało sprzężone. Ten kompleks wykrywa się przez dodanie substratu dla cząsteczki reportera, tak jak opisano powyżej, w celu umożliwienia, na przykład, powstania sygnału wizualnego, który można następnie ilościowo określić spektrofotometrycznie lub innymi sposobami.

Preparat można wykonać alternatywnie lub dodatkowo w postaci immunoblotu, który także może być ilościowy (na przykład, przez pomiar intensywności koloru plamki i/lub odległości na jaką migruje przez pasek chromatograficzny).

Preparat, szczególnie w formie paska nitrocelulozy ma dużą przewagę nad dostępnymi obecnie w handlu testami dla H. pyroli. Użycie wydzieliny śluzówki, a szczególnie do wykrywania przeciwciał przeciw H. pyroli umożliwia diagnozowanie trwających lub obecnych infekcji i w ten sposób pozwala praktykującemu lekarzowi na:

(a) powiązanie objawów jelitowych z H. pyroli, co umożliwia podjęcie decyzji pod kątem dalszych badań (włączając procedury inwazyjne) i/lub leczenia (na przykład, użycia specyficznych związków przeciw H. pyroli). Można się spodziewać, że to ostatnie ma szczególnie znaczenie w odniesieniu do związanej z H. pyroli niewrzodowej niestrawności, zapalenia żołądka, owrzodzeniu dwunastnicy, owrzodzeniu żołądka i podobnych, a także w innych warunkach.

(b) Mając po raz pierwszy wygodny nieinwazyjny test w pokoju lekarskim, klinice lub szpitalu można badać pacjentów z wykrytym wrzodem trawiennym w celu wczesnego wykrycia nawrotów. Dodatni wynik pozwala na wczesną diagnozę i zapobieganie lub wczesne leczenie nawrotów wrzodu trawiennego. Wynik ujemny ma użyteczne znaczenie dla analizy podejścia diagnostycznego do niestrawności.

Ponadto, test przeprowadzony przy użyciu preparatu według wynalazku dostarcza prostej odpowiedzi tak/nie, nie wymagającej, na przykład, pobieranie krwi. Może być odczytany w ciągu minut i wykonany bez żadnych specjalnych przygotowań przez klinicystę. Znaczną przewagą obecnego wynalazku jest użycie wydzieliny śluzówki (na przykład, śliny) do wykrywania przeciwciał specyficznych do H. pyroli.

Preparat według wynalazku może być użyty w zestawie testowym do wykrywania H.pyroli w wydzielinach śluzówki ssaków, zawierającym:

(a) stały nośnik zawierający immobilizowany na sobie preparat antygenowy

H. pyroli., według wynalazku;

(b) środek wykrywający, który po użyciu wykrywa czy IgG we wspomnianej wydzielinie śluzówki wiąże się z jednym lub więcej składnikami preparatu antygenowego.

Środkiem wykrywającym może być przeciwciało sprzężone z cząsteczką reportera, która jest zdolna do wytworzenia lub dania przyczyny do powstania wykrywalnego sygnału, przeciwciało powinno być specyficzne do przeciwciała IgG badanego ssaka. W korzystnym przykładzie wykonania cząsteczką reportera jest enzym zdolny do katalizowania reakcji, w której produkt (produkty) jest lub są wykrywalnie różne od składnika

172 116 reakcji (składników reakcji). W takim przypadku, Substrat dla enzymu, który może, na przykład, mieć różne od produktu enzymu własności kalorymetryczne, jest przeważnie także obecny w zestawie.

Preparat według wynalazku może bvć użyty w zestawie do wykrywania przeciwciał

Σ' O J J J J J J Σ

IgG przeciw H. pyroli w wydzielinach śluzówki ssaków, takich jak, człowiek, który to zestaw testowy ma formę przedziałów i zawiera:

(a) pierwszy przedział przystosowany do zawierania stałego nośnika mającego immobilizowany na sobie preparat antygenowy H. pyroli, według wynalazku;

(b) drugi przedział zawierający przeciwciało sprzężone z cząsteczką reportera, zdolną do wytworzenia sygnału, pzeciwciało powinno być specyficzne do przeciwciała IgG, i (c) i jeśli cząsteczką reportera jest enzym, trzeci przedział zawierający substrat dla wspomnianego enzymu.

Zestaw może także zawierać dodatkowe przedziały, takie jak przedział do pobierania odpowiedniego materiału śluzowego i/lub do jednego lub więcej rozcieńczeń i/lub bufory'. Zestaw do sprzedaży może być także zapakowany w odpowiedniej formie.

Taki preparat antygenowy można otrzymać przez liofilizację ekstraktu komórek H. pyroii w celu usunięcia antygenu o wielkości około 440 kDa.

Następujące przykłady ilustrują wynalazek ale nie ograniczają jego zakresu.

Przykład 1.

W tym przykładzie wytwarza się surowy sonifikat H. pyroli, poddaje go frakcjonowaniu metodą FPLC i liofilizacji. Analiza metodą Western blotting wykazała, że białka o wieekości ollttyłł 265 k!Dći i 340 kDa ssą ccynnikiem oc^d^(^'wici^>^iiaίl^^τm za specyficzność immunologiczną testu wykonanego sposobem według wynalazku. Białka te dają tylko prawdziwe wyniki dodatnie, w odróżnieniu od potencjalnych zanieczyszczeń białkiem o 440 kDa. Białko to usuwa się przez liofiilimcję, na którą okazało się ono wrażliwe.

Otrzymanie antygenu Helicobacter pyroli

Odwirowany sonifikat, włączając chromatografię anionowymienną

i) Hodowle H. pyroli zbiera się z płytek z agarem czekoladowym do PBS. Bakterie rosną w dwóch osobnych hodowlach, szczep dziki oznaczony 'Traub i szczep NCTC 11637.

ii) Bakterie przemywa się trzy razy PBS wirując przez 5 minut przy 10000 x g.

iii) Przemyte bakterie zawiesza się w 2 ml PBS i oznacza się ilość bakterii przez odczyt na spektrofotometrze przy długości fali 405 nm.

iv) Zawiesinę poddaje się 5 cyklom sonifikacji (jeden cykl tworzy 30 sekund sonifikacji przy 6 μ i 00 sekndd prererwy.

v) Sonifikowane mikroorganizmy odwirowuje się przez 10 minut przy 10000 x g.

vi) Zbiera się supematant i filtruje przez filtr o wielkości porów 0,45 μm, a następnie 0,22 μ m w celu usunięcia wszystkich pozostałości komórkowych.

vii) Po przefiltrowaniu wykonuje się oznaczenie białka.

Uwaga:

Jeśli bezpośrednia obróbka sonifikatu nie jest możliwa, w tym punkcie sposobu według wynalazku, można go zamrozić do temperatury -70^OC, az do momentu, gdy nadarzy się możliwość kontynuowania metody.

viii) Kolumna anionowymienna Mono Q™ może nieść 20-50 mg białka na 500 μΐ injekcję (tak więc, sonifikat może mieć do 40-100 mg białka na ml).

ix) W tym punkcie sonifikat przeważnie wymaga zatężenia w celu zmniejszenia liczby iniekcji koniecznych do obróbki całego sonifikatu i do zwiększenia stężenia białka do dopuszczalnego poziomu. Zatężanie prowadzi się przy użyciu probówek do zatężenia CENTRISART™, które wiruje przy 2500 obrotów na minutę przez 20 minut w temperaturze 4°C. Sonifikat przeważnie zatęża się do uzyskania 2 do 3 injekcji po 500 μΐ.

x) Po zatężeniu preparatu nanosi się go na kolumnę MONO Q w 500 μΐ iniekcjach. Dla każdej injekcji prowadzi się odczyt i nagrywa wszystkie parametry.

xi) W czasie przepuszczania przez MONO Q frakcje sprawdza się pod kątem wystąpienia piku ureazowego.

xii) Wartości otrzymane za pomocą testu ureazowego nanosi się na profil białkowy uzyskany metodą FPLC (patrz poniżej).

Następnie zbiera się pożądane frakcje i prowadzi oszacowanie białek. Stężenie białka potrzebne jest do określenia liczby obrotów koniecznych do zatężenia porcji do około 1 ml. Preparat zatęża się przy użyciu probówek do zatężenia CENTRISART.

FPLC frakcji antygenowych

Następnie sonifikat oczyszcza się metodaszybkiej, ciekłej chromatografii białka na kolumnie wykluczania SUPEROSE 6.

i) ii)

m) iv) ^{v) vi)}

Kolumnę równoważy się PBS pH 7,6 - 7,7, zawierającym 0,02% (wag./obj.) azydku sodowego.

Na kolumnę nanosi się 200 μΐ sonifikatu i zbiera frakcje po 0,5 ml. Frakcje zbiera się, poddaje badaniu testem ureazowym w celu znalezienia piku ureazowego. Wartości nanosi się na odczyt uzyskany metodą FPLC. Pożądane frakcje zbiera się.

Pobiera się małe próbki w celu przeprowadzenia analizy metodą naturalnej PAGE w celu sprawdzenia zgodności wiązania. Frakcje, które nie zawierały piku ureazowego, ale leżały blisko piku odpowiadają grupie mniejszych białek o ciężarze cząsteczkowym pomiędzy 440 kDa i 67 kDa.

Pozostałość przechowuje się w temperaturze -20°C i następnie zlewa z innymi, podobnymi preparatami w celu utworzenia porcji.

Liofilizacja

Antygen z powyższej porcji liofilizuje się w liofilizatorze FSE składającym się z:

(a) pompy TRIVAC™, model D4A, firmy Leybold (USA);

(b) silnika na prąd zmienny 240 V firmy General Electric (USA);

(c) komory próżniowej VIRTIS™ (Virtis Co. Inc., New York, USA); i (d) jednostki chłodzącej włączonej w obudowę lifilizatora.

ml roztworu zawierającego antygen, zamrożone pod kątem, w celu zwiększenia powierzchni, w 50 ml naczyniu o średnicy 5 cm umieszcza się w komorze próżniowej i uruchamia urządzenie. Temperaturę w działającym urządzeniu ustawia się na -55°C. Działające urządzenie utrzymuje obniżone ciśnienie na poziomie 80 - 100 mTorr (około 0,001 atmosfery), zakres wartości zależy od początkowej objętości zamrażanego płynu i jego powierzchni, a wiec, objętości pary w komorze. Próbkę lioffilizije siię do całkowiiego wysuszenia, co zajmuje 16 - 18 godzin.

PAGE w natywnym gradiencie przy użyciu PHASTSYSTEM firmy Pharmacia

Antygeny z powyższych frakcji, przed i po liofilizacji, poddaje się natywnej PAGE przy użyciu liniowego gradientu żelu akrylamidowego i wizualizuje się profile białkowe metodą szybkiego barwienia srebrem, jak następuje:

i) Paski buforu były paskami natywnego buforu PHASTGEL™ do rozdzielania białek w ich naturalnym stanie.

ii) Żelem był gradient 8-25 PHASTGEL™. Zestaw ten daje liniową zależność pomiędzy odległością migracji białka w żelu a logarytmem jego masy cząsteczkowej, dla białek globuralnych o masie cząsteczkowej z zakresu od 50 kDa do 750 kDa.

iii) Użyte markery były zestawem do kalibracji elektroforezy firmy Pharmacia do oznaczeń o wysokiej masie cząsteczkowej. 1 pojemnik (Numer katalogowy 17-0445-01) liofilizowanego markera rozpuszcza się w 100 μl wody destylowanej. Do barwienia srebrem żelu zrekonstytuowany marker rozcieńcza się 1/10. Elektroforezie poddaje się 1 μΐ markera w dwóch powtórzeniach.

iv) Elektroforezie poddaje się w dwóch powtórzeniach próbki antygenu, każda po 1 ul oczyszczonego metodą FPLC na kolumnie SUPEROSE™ 6 ekstraktu.

v) Warunki rozdziału: próbki poddawano elektroforezieprzy użyciu optymalizowanej metody natywnej PAGE z PHASTSYSTEM Separation Technnique File numer 120. Czas trwania elektroforezy wynosił 120 votogodzin.

vi) Warunki rozwiania: żel barwi się srebrem według metody z Tablicy 3 z PHASTSYSTEM Development Technique File numer 210. (Metoda barwienia srebrem optymalizowana natywnej PAGE).

vii) Masę cząsteczkową określono przy użyciu markerów o wysokiej masie cząsteczkowej, które poddawano elektroforezie razem z antygenami na żelu. Krzywe standardowe określono rysując zależność logarytmu masy cząsteczkowej od wartości Rf.

Porównanie antygenów przed i po liofilizowaniu

Za pomocą powyższej metodyki natywnej PAGE otrzymano następujące wyniki. Wartości podano jako średnie minus odchylenie standardowe, (n) oznacza liczbę oznaczeń, które można było wykonać na żelu.

	Oczyszczony	Liofilizowany
Antygen 1	436±20,6 (4)	nie oznaczano (4)
Antygen 2	333,6± 14,1 (4)	334,0± 18,5 (4)
Antygen 3	248,0± 18,1 (4)	262,0±0 (2)
Antygen 4	162,7±23,0 (3)	162,0 (1)
Antygen 5	70,0±0 (3)	70,0 (1)

Dalsza charakterystyka antygenów

i) Względne masy cząsteczkowe można oznaczyć na podstawie standardów zawierających tyroglobulinę, ferrytynę, katalazę, dehydrogenazę laktozową i albuminę.

ii) Metodę Western blotting można zastosować do wykrycia odpowiednich prążków białkowych wykorzystując dodatni odczyn na H. pyroli.

iii) Frakcjonowanie metodą FPLC usuwa prążki o niższej masie cząsteczkowej, które reagując dają odczyn ujemny.

iv) Liofilizowanie preparatu antygenowego wydaje się zmniejszać obecność jednostki o dużej masie cząsteczkowej (około 440 kDa), która reagując daje fałszywy odczyn dodatni. Brak prążka 440 kDa jest ważny przy odróżnianiu odczynu dodatniego, fałszywego dodatniego i ujemnego.

Wynikiem tej metody oczyszczania jest zidentyfikowanie białka o masie cząsteczkowej z zakresu 255 - 275 kDa, ale ogólnie około 265 kDa i białka, którego masa cząsteczkowa wynosi około 340 kDa, które reagując dają odczyn dodatni, ale nie ujemny.

Przykład 2

Enzymatyczny test immunosorbcyjny (ELISA)

1. Opłaszczanie płytek ELISA antygenem

i) Używa się polistyrenowych płytek ELISA (Polysorb, Nunc. Dania) ii) Liofilizowany preparat antygenowy z przykładu 1 rozcieńcza się optymalnie (najwyższe rozcieńczenie dające maksymalną czułość dla przeciwciał ze śliny dodatniej bez zwiększania reaktywności przeciwciał ze śliny ujemnej) buforem do opłaszczania (patrz 2 (iii) poniżej).

iii) 100 μΐ rozcieńczonego antygenu dodaje się do studzienek płytki ELISA oznaczonych antygen i 100 μΐ buforu do opłaszczania (bez antygenu) dodaje się do studzienek oznaczonych bufor.

iv) Płytki inkubuje się przez noc w temperaturze 4°C

v) Inkubowane płytki opróżnia się i dodaje 100 μΐ 5% (wag./obj.) roztworu suchy puder mleczny/bufor do opłaszczania (patrz 2 (iii) poniżej) na 30 minut i natychmiast opróżnia z zawartości przez odwrócenie.

2. Bufory

1) Roztwór soli buforowany fosforanem (PBS): 0,14 M NaCl, 0,003 M NasHPO.j, 0,001 N NaH2PO4-2H2O w 1 litrze wody dejonizowanej, pH doprowadzone do 7,2.

ii) Bufor substratowy: 10,1 g kwasu cytrynowego, 14,2 g ortofosforanu dwusodowego (Na2HPO4), 150 μl H2O2 (30% wag./obj.) w 1 litrze wody dejonizowanej, pH doprowadzone do 5,0.

iii) Bufor do opłaszczania: 2,42 g TRIS (tris(hydroksynetylo)aminometan), 58,44 g NaCl w 1 litrze wody dejonizowanej, pH doprowadzone do 7,5.

3. Traktowanie płytek po opłaszczaniu antygenem

W celu przechowywania opłaszczonych antygenem płytek przez długi czas (6 miesięcy), po opłaszczeniu i zablokowaniu płytki suszy się i przechowuje w temperaturze 4°C w obecności środka pochłaniającego wilgoć. Taki sposób postępowania jest konieczny dla długiego zakonserwowania opłaszczonych antygenem płytek.

4. Test ELISA '

a) Metoda z wykorzystaniem peroksydazy korzenia chrzanu

i) 100 μ l śliny rozcieńczonej 1/2 raza w 0,05% (wag./obj.) roztworu suchy puder mleczny/PBST (PBSTM) lub 100 μΐ śimy rozcieńczonej 1/2 raza w PBSTM dodaje się do studzienek antygenowych i do studzienek buforowych płytki ELISA.

ii) PhyJk inki^l^i^je jieę do 90 minut m temperatmrze pokojowejj iii) Ptaki p^pinymy się 5 razy przez pałanie PBST.

iv) Do studzienek antygenowych i buforowych dodaje się 100 μΐ IgG przeciw człowiekowi sprzężonych z peroksydazą chrzanu optymalnie rozcieńczonych (najwyższe rozcieńczenie dające maksymalną czułość dla przeciwciał ze śliny dodatniej bez zwiększania reaktywności przeciwciał ze śliny ujemnej) w PBSTM.

v) Płytki inkubujb ^eę do 90 minut m n^^peramn^e pukojpwejj vi) Ptaki przememy ^żę 5 razy pram oałanłe PBST.

vii) Do studzienek antygenowych i buforowych dodaje się 100 μl substratu dla pyrokszdazz korzenia chrzanu Produkt T-2885, Sigma, USA) w buforze substratowym.

viii) Płytki inkubuje się do 30 minut w temperaturze pokojowej.

ix) Do studzienek antygenowych i buforowych dodaje się 100 μΐ 1 M H2SO4.

x) Dla każdej próbki surowicy lub śliny, absorbancję (A) studzienek buforowych odejmuje się od A studzienek antygenowych a otrzymaną A przelicza się na jednostki ELISA używane w krzywej standardowej (otrzymanej przez dwukrotne rozcieńczenia standardowego przeciwciała z dodatniej surowicy).

172 116 xi) Pomiar 100 próbek śliny od pacjentów u których stwierdzono przez biopsję, że są zainfekowani (lub nie zainfekowani) jest używany do określenia liczby jednostek ELISA odpowiadających infekcji.

Przykład 3

Test immunobloting .[.Przygotowanie antygenu Helicobacter pyroli

Sposób otrzymywania antygenu H. pyroli dla immunoblotingu jest identyczny jak w przykładzie 1.

2. Opłaszczanie błony antygenem

i) Używa się błon nitrocelulozowych. Można użyć także błon nylonowych.

ii) Po wysuszeniu blottingu, błonę namacza się na 5 minut w optymalnym rozcieńczonym antygenu (najwyższe rozcieńczenie dające maksymalną czułość dla przeciwciał z próbek dodatnich bez zwiększania reaktywności przeciwciał z nr jui ο νΛ vny · iii) Następnie błonę inkubuje się przez 30 minut w 5% (wag./obj.) roztworze suchy puder mleczny/TBS.

iv) Błonę przemywa się dwa razy przez 5 minut 0,05% (wag. obj.) roztworu monolaurynian polioksyetylenosorbitan/TBS (TBST). W celu przechowywania błon przez długi czas (18 miesięcy), błony suszy się i przechowuje w temperaturze 4°C w obecności środka pochłaniającego wilgoć.

v) Błonę pokrywa się nicrozcieńczoną testowaną śliną w butelce testowej lub pod językiem.

vi) Błonę przemywa się przez 30 sekund pod wodą bieżącą.

vii) Błonę pokrywa się roztworem sprzężonego z fosfatazą alkaliczną przeciwciała IgG przeciw człowiekowi rozcieńczonego optymalnie (dla umożliwienia rozróżnienia pomiędzy przeciwciałem ze śliny pozytywnej i negatywnej) w PBSTM przez czas do 5 minut.

viii) Błonę przemywa się przez 30 sekund pod wodą bieżącą.

ix) Błonę pokrywa się na 5 minut roztworem substratu (0,3 mg błękitu nitrotetrazolowego, 0,15 mg 5-bromo-4-chloro-3-indolilofosforanu w 1 ml 0,1 M NaHCOs, 1,0 mM MgCl₂, pH 9,8).

x) Próbki z przeciwciałami pozytywnymi powodują w rejonie antygenowym błony zmianę koloru na fioletowy, natomiast próbki z przeciwciałami negatywnymi nie powodują zmian w rejonie antygenowym błony.

Przykłe dl 4

Zbapano pacjentówskierowanych na Oddział Gastroenterologiczny, Royal North Shore Hokpital, NSW w pelę zbadania objawów gutnych dróg żołądkowυ-telltowach. We wszystkich możawych przepadkegh przeprowadzono hodowle mikrobtologiczng, nadania mikrosnopowz Η. ζ·ο^ώ11,1)5ϊζ hłeazcwe, siopsip t^ctoiggiczng i WzsELISA.

Koralasjn ^wrzeh^twc^ja^c ^mąptych w taopśćą dlw H.pyroU

W nakłhnkjącnj mbgh poLapano zcw ąsek pormędzy łosio 1ί^^ηνη·ι badaniem biopsji żołądka i wonikami tegau dla zimy oraz egeodw sel^- Η. pytroHi

Okazało się, ec tnst jest b^^deiec' conty o ipe^ym-nn w wdkryw:iniu infel^^i

H. pyroli niś biopłja n jasp hzwksnbhmn akeeptαwznb eakozłoSn ^^Οηρ! ówi hykrweanie infekcji H. kSo/t. Wymki ηthedsSawloae w tabeh pokazują, że test ślinowy jest równie dobry jak kłot kurowjccyve.Jeżęli -u eacjentów nte wosSęnhje stae zcąalny lub chroniczny stan ζ3)31β^ wsz^tkie! cheimn dostapga troty, włączsjąc ereacowy, hodowlę i Cagiιnie histologiczny są równśe do5rm. Jedzaiżh 4 pacsu.ntów zo jSanem gapelnym częściej stwierdzozo infekcje H. meo/e tgstanu'ELISA dla surowicy i śliny niż innymi sposobami.

Przyczyną tego, może być fakt, że biopsja jest raczej losowym sposobem pobierania próbek i może omijać obszary na których występuje inwazja H. pyroli. Jak widać, wyniki testu ELISA dla śliny dobrze korelują z wynikami testu ELISA dla surowicy.

Biegli w sztuce są świadomi, że opisany tu wynalazek podlega różnym zmianom i modyfikacjom innym niż te specyficznie opisane. Jest zrozumiałe, że wynalazek obejmuje też wszystkie te zmiany i modyfikacje. Wynalazek obejmuje także wszystkie etapy, własności, kompozycje i związki, do których wynalazek odnosi się lub wskazuje w tym opisie pojedynczo lub zbiorowo i każdą i wszystkie kombinacje każdych dwóch lub więcej wspomnianych etapów lub własności. Porównanie pomiędzy testami ELISA, biopsją i badaniem histologicznym żołądka

Claims (2)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Preparat antygenowy H. pyroli, znamienny tym, że zawiera pochodzące z H. pyroli składniki o wielkości 238,5 - 291,5 kDa określone jako natywna PAGE i 306 - 374 kDa określone jako natywna PAGE, przy czym jest zasadniczo wolny od pochodzącego z H. pyroli składnika o wielkości 440 kDa określone jako natywna PAGE.
2. 2. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że dodatkowo zawiera pochodzące z H. pyroli antygeny o ciężarze cząsteczkowym wynoszącym 144 - 176 kDa jako natywna PAGE i/lub 63 - 77 kDA jako natywna PagE.