PL172853B1

PL172853B1 - Niezjadliwa szczepionka przeciw wsciekliznieoraz sposób wytwarzania niezjadliwej szczepionki przeciw wsciekliznie PL

Info

Publication number: PL172853B1
Application number: PL93299739A
Authority: PL
Inventors: Jacqueline Benejean; Anne Flamand; Marie-Christine Tuffereau; Patrice Coulon; Florence Lafay
Original assignee: Virbac
Priority date: 1992-07-20
Filing date: 1993-07-20
Publication date: 1997-12-31
Also published as: ATE175877T1; DE69323130T2; BG97964A; CZ283400B6; PL299739A1; HUT69961A; SK76193A3; SK280104B6; MA22938A1; FR2693655B1; FI933210A0; FI933210L; MX9304349A; CZ140293A3; SI9300392A; EP0583998B1; RO112582B1; DE69323130D1; EP0583998A1; FI933210A7

Abstract

1. Niezjadliwa szczepionka przeciw wsciekliznie, zna- m ienna tym, ze stanowi mezjadliwy mutant szczepu SAD wirusa wscieklizny, którego proteina posiada w pozycji 333 naturalny aminokwas o kodonie rózniacym sie od kodonów argininy co najmniej dwoma nukleotydami. 5. Sposób wytwarz ania niezjadliwej szczepionki przeciw wsciekliznie, znamienny tym, ze wyselekcjonowuje sie ze szcze- pu SAD wirusa wscieklizny mutantów, które nie ulegaja neutra- lizacji przez przciwcialo monoklonalne neutralizujace omawiany szczep SAD lecz nie neutralizujace szczepu TAG1, wyodrebnia sie, przez sekwencjonowanie rejonu 333 glikoproteiny mutantów wyselekcjonowanych w poprzedniej operacji, mutanta zawie- rajacego w pozycji 333 lizyne, nastepnie wytwarza sie przeciw- cialo monoklonalne, neutralizujace równoczesnie omawiany szczep SAD oraz mutant otrzymany w poprzedniej operacji, lecz me neutralizujace szczepu TAG1, i dokonuje sie drugiej selekcji wsród mutantów otrzymanych w pierwszej operacji za pomoca przeciwciala monoklonalnego wytworzonego w trzeciej operacji. FIG. 3 PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest nowa szczepionka przeciw wściekliźnie oraz sposób jej wytwarzania.

Wirus wścieklizny jest rebdowirusem składającym się z pięciu protein, z których tylko proteina zewnętrzna, glikoproteina, wywołuje syntezę neutralizujących przeciwciał u zwierząt szczepionych. Wstrzyknięcie oczyszczonej glikoproteiny chroni zwierzę przed zakażeniem.

Najczęściej stosowane szczepy wirusa wścieklizny, zwłaszcza szczep CVS i szczep ERA, pochodzące od szczepów SAD, takich jak szczepy SAD Berne I · SAD B19, są opisane w publikacji Rabies Viruses przez H. F. Clarka i T. J. Wiktora - Strains of Human Viruses, wyd. Majer i Plotkin Karger, Bazylea, 1972, str. 177-182. Sekwencję aminokwasową glikoproteiny szczepu CVS opisali Yelverton i in. w publikacji Rabies virus glykoprotein analogs: biosynthesis in Escherichia Coli, Science 219, 614-620.

Glikoproteina ta zawiera dwa główne miejsca rozpoznające związane z neutralizacją wirusa (miejsce II i III). Miejsce III w pozycji 330-340 zawiera argininę 333 określającą zjadliwość tego szczepu.

Sekwencja aminokwasowa glikoproteiny szczepu SAD Berne nie została całkowicie ustalona. Jednakże można było określić, że miejsce antygenowe III glikoproteiny szczepu SAD Berne jest takie samo jak u glikoproteiny szczepu CVS.

Stosowane obecnie szczepionki przeciw wściekliźnie są bądź szczepionkami wytworzonymi z wirusów nieaktywnych, bądź szczepionkami składającymi się ze szczepów

172 853 jadowitych, których zjadliwość została osłabiona, bądź też wirusami rekombinowanymi (na przykład szczepionka).

Deaktywację wirusów można prowadzić różnymi sposobami, zwłaszcza za pomocą procesów chemicznych takich jak działanie formaldehydem lub p-propiolaktonem.

Główna niedogodność takiego sposobu wytwarzania szczepionek polega na manipulowaniu szczepami jadowitymi, co wymaga bardzo rygorystycznych warunków srosowania i stanowi niebezpieczeństwo zakażenia personelu fabrycznego.

Ponadto szczepionki nieaktywne podawane drogą doustną nie mają działania ochronnego.

Osłabianie zjadliwości szczepów jadowitych jest techniką dobrze znaną: na przykład można tego dokonać przez sukcesywne przejścia szczepów zjadliwych nad żywicielem różniącym się od gatunku nosiciela (na przykład królikiem lub myszą) lub przez hodowlę komórek. W ten sposób otrzymuje się szczepy nieprzystosowane do oryginalnego żywiciela, a więc mniej dla niego chorobotwórcze przy pełnym zachowaniu ich działania szczepiącego.

Szczepy SAD, takie jak szczepy SAD B10 i SAD Berne, ogólnie dostępne, są szczepami osłabionymi przebadanymi już w Europie przy szczepieniu lisów. Szczepy te mogą być zmieszane z przynętą dla podawania drogą doustną. Jednakże okazały się one chorobotwórczymi dla innych gatunków zwierząt i dla człowieka. Istnieje więc potencjalne niebezpieczeństwo zakażenia, co znacznie zmniejsza korzyści ze stosowania tych szczepów do szczepienia doustnego.

W praktyce, na przykład podawanie drogą doustną szczepu SAD Berne grupie 23 dzikich gryzoni, wybranych spośród Apodemus Flavicolus i sylvaticus, Arvicola terrestris, Clethrionomys clareous, Minotus agresti spowodowało śmierć z powodu wścieklizny dwóch zwierząt.

Badania na myszach również wykazały, że szczep SAD Berne jest chorobotwórczy dla tego gatunku zarówno drogą śródmózgową jak i śródmięśniową, jak to pokazują krzywe na załączonych rysunkach fig. 1a i fig. 1b, oznaczających odpowiednio:

- fig. 1a przedstawia: krzywą śmiertelności dorosłych myszy w zależności od podanych dawek (w jednostkach łysinkowych wirusa - PFU) drogą śródmózgową.

- fig. 1b przedstawia: krzywą śmiertelności dorosłych myszy w zależności od podanych dawek (w jednostkach łysinkowych wirusa - PFU) drogą śródmięśniową.

Przy podaniu drogą doustną odnotowano u myszy śmiertelność 10% przy dawce 10⁵’⁵ PFU.

Szczep SAD Berne jako taki, stosowany na wsiach do szczepienia lisów, stanowi więc niebezpieczeństwo dla dzikiej fauny i człowieka. Podobnie jest ze szczepem SAD B19.

W celu usunięcia tej niedogodności zaproponowano już niezjadliwą szczepionkę przeciw wściekliźnie. Szczepionka ta, opisana w europejskim zgłoszeniu patentowym nr EP 350398, jest niezjadliwym mutantem szczepu SAD wirusa wścieklizny charakteryzującym się tym, że na miejscu argininy 333 glikoproteiny zawiera aminokwas inny niż lizyna, na przykład glicynę, izoleucynę lub serynę.

Mutant ten pochodzi ze zmiany pojedynczego nukleotydu w kodonie argininy 333.

Niestety mutant ten może, przez zwykłą odwróconą mutację, dać ponownie szczep rodzicielski.

Szczepionka taka, używana do podawania drogą doustną, nie jest w pełni bezpieczna dla innych gatunków zwierząt.

Niniejszy wynalazek dotyczy skutecznej szczepionki pozwalającej na usunięcie powyższych niedogodności.

Szczepionka według wynalazku składa się z niezjadliwego mutanta szczepu SAD wirusa wścieklizny, który charakteryzuje się tym, że posiada na miejscu argininy 333 z glikoproteiny naturalny aminokwas o kodonie różniącym się od kodonów kodujących dla argininy dwoma nukleotydami.

172 853

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania określonej powyżej szczepionki.

Sposób według wynalazku polega na tym- że wvselekc.ionowuie sie ze szczepu □AD wirusa wścieklizny mutantów- które nie ulegają neutralizacji przez przeciwciało monoklonalne neutralizujące omawiany szczep SAD lecz nie neutralizujące szczepu TAG1 określonego poniżej- wyodrębnia sie- przez sekwencjonowanie rejonu 333 glikoproteiny mutantów wyselekcjonowanych w poprzedniej operacji- mutanta zawierającego w pozycji 333 lizynę- następnie wytwarza się przeciwciało monoklonalneneutralizujące równocześnie omawiany szczep SAD oraz mutant otrzymany w poprzedniej operacji- lecz nie neutralizujące szczepu TAG1- i dokonuje się drugiej selekcji wśród mutantów otrzymanych w pierwszej operacji za pomocą przeciwciała monoklonalnego wytworzonego w trzeciej operacji.

Przeciwciała monoklonalne stosowane do selekcjonowania mutantów w sposobie według wynalazku otrzymuje się przez fuzję komórek szpiczaka i komórek produkujących niewadliwe przeciwciała metodą krzyżowania opisaną przez Kohlera i Milsteina w Nature- tom 256- 495-497 (1975)- dobrze znaną specjalistom w tej dziedzinie.

W metodzie tej można łączyć komórki pochodzące od różnych gatunków- jednakże korzystniej jest stosować komórki pochodzące od tego samego gatunku zwierząt..

Na przykład- korzystnie stosuje się z jednej strony komórki szpiczaka mysiegoa z drugiej strony komórki śledziony mysiej immunizowane uprzednio szczepem, wirusa wścieklizny zgodnie z procedurą opisaną poniżej.

Ogólnie biorąc- proces krzyżowania- opisany w odniesieniu do myszy- obejmuje następujące etapy:

1) immunizację myszy daną ilością wirusa inaktywowanego za pomocą β-propiolaktonu2) pobranie śledziony myszy immunizowanych i odzielenie limfocytów śledziony;

3) fuzję tak otrzymanych limfocytów śledziony z komórkami szpiczaka mysiego w obecności promotora fuzji;

4) hodowlę otrzymanych komórek hybrydowych w wybranym środowisku- w którym me rozwijają się komórki szpiczaka nie połączone oraz w obecności odpowiednich czynników;

5) selekcję komórek produkujących żądane przeciwciało i klonowanie tych komórek.

Procedura immunizacji obejmuje wstrzyknięcie myszom Balb-C 100 ,^g wirusa CV5 inaktywowanego za pomocą β-propiolaktonu- drogą dootrzewnową- z pełnym adiuwantem Freunda oraz wywoływacza drogą dożylną na 4 dni przed fuzją po 1 miesięcznym okresie spoczynku.

Limfocyty śledziony myszy immunizowanych odzyskuje się po pobraniu śledziony w postępowaniu klasycznym.

Komórki szpiczaka mysiego stosowane do otrzymywania przeciwciał monoklonalnych neutralizujących są komórkami szpiczaka myszy Balb-C pochodzącego z linii SP2O. Komórki te zostały wybrane ze względu na ich wrażliwość na aminopterynę i hodowane w odpowiednim środowisku- takim jak środowisko- .podstawowe Eagle'a zmodyfikowane przez Dulbecco (Dulbecco Modified Eagle medium) zwane niżej środowiskiem DMEM- do którego dodano 15% surowicy kurzej.

Fuzję komórek szpiczaka z limfocytami śledziony prowadzono przez zmieszanie 5x10⁷ komórek śledziony myszy immunizowanych- w obecności promotora fuzji- na przykład takiego jak glikol polietylenowy.

Po inkubowaniu w temperaturze 37°C komórki przemyto w środowisku DMEM i sporządzono ich zawiesinę- po czym hodowano w selektywnym środowisku nadającym się wyłącznie do rozwoju komórek hybrydowych. Środowisko takie zawiera hipoksantynęaminopterynę i tymidynę.

172 853

Następnie selekcjonuje się nadsącze hodowli, po 7 do 20 dniach od fuzji, poddając je kontaktowi z zawiesiną wirusa CVS i zatrzymując przeciwciała, które neutralizują wspomnianą wyżej zawiesinę.

Przez przeciwciała neutralizujące wirus rozumie się przeciwciała, które w obecności zawiesiny tego wirusa hamują jego zjadliwość.

Zdolność neutralizującą przeciwciał monoklonalnych otrzymanych powyżej określa się metodą klasyczną, dobrze znaną specjaliście. Metoda ta polega na użyciu 100 μ 1 zawiesiny wirusa zawierającej 1000 PFU wirusa i 100 μl nadsączu hodowli krzyżowej, na zakażeniu hodowli komórek tą mieszaniną i na policzeniu po 4 dniach inkubacji zanikania łysinek pod agarem według postępowania opisanego przez Bussereau i in., J. Virol. Meth., 4, 277-282 (1982). Przciwciało jest neutralizujące gdy hamuje wszelkie tworzenie lysinek pod agarem w warunkach opisanych powyżej.

Wśród tych przeciwciał zatrzymuje się następnie te, które nie neutra^liz.j^ąją niezjadliwego mutanta TAG1 pochodzącego za szczepu CVS, zdeponowanego w Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (C. N. C. M.) Instytutu Pasteura we Francji dn 1 ~x_2e m nr i τ

Ullia IZ, KWICLIUd. iyoj puu 111

Otrzymane przeciwciała monoklonalne, neutralizujące szczep CVS lecz nie neutralizujące niezjadiiwego mutanta TAGI, pozwalają na wyselekcjonowanie niezjadliwych mutantów z każdego szczepu wirusa wścieklizny, który ulega neutralizacji pod wpływem tych przeciwciał.

Tak otrzymane przeciwciała monoklonalne są przeciwciałami neutralizującymi również szczepy SAD wirusa wścieklizny. Nadają się więc do prowadzenia pierwszej selekcji zgodnie ze sposobem z wynalazku.

Sekwencjonowanie rejonu 333 glikoproteiny mutantów wyselekcjonowanych w etapie 1) prowadzi się metodą klasyczną, dobrze znaną specjaliście z tej dziedziny [Sanger i in., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467 (1977)].

Sekwencjonowanie to pozwala na wyodrębnienie mutanta posiadającego w pozycji 333 glikoproteiny lizynę; mutant ten nazywany jest poniżej mutantem SK.

Kodon (AAA) tego aminokwasu (lizyny) różni się od koaonu argininy w pozycji 333 szczepu SAD pojedynczym nukleotydem, przy czym kodon argininy w pozycji 333 szczepu SAD jest AGA.

Następnie przystępuje się do wytworzenia przeciwciała monoklonalnego neutralizującego równocześnie szczep SAD oraz mutant otrzymany powyżej.

Takie przeciwciało monoklonalne otrzymuje się zatrzymując, wśród przeciwciał monoklonalnych neutralizujących szczep SAD i nie neutralizujących TAG I, to przeciwciało które również neutralizuje mutant lizyny lub mutant SK otrzymany powyżej. Otrzymane przeciwciało monoklonalne pozwala następnie przystąpić do drugiej selekcji (operacja czwarta) zgodnie ze sposobem według wynalazku.

Zdolność chorobotwórczą mutantów otrzymanych z tej drugiej selekcji testuje się następnie przez wstrzyknięcie śródmózgowe dorosłym myszom 10⁵ PFU. Mutanty, które w tej dawce i tą drogą nie zabijają, uważa się za niezjadliwe.

Mutanty stosowane w szczepionce według wynalazku są niezjadliwymi podwójnymi mutantami szczepu SAD, zwłaszcza takiego jak szczep SAD Berne, otrzymanymi z dwóch kolejnych selekcji za pomocą przeciwciał monoklonalnych określonych powyżej.

Mutanty stosowane w szczepionce według wynalazku mogą ponadto zawierać inne mutacje, na przykład mutację nadającą odporność na przeciwciało monoklonalne swoiste miejsca antygenowego Π, co pozwala na rozpoznanie ewentualnego rewertanta zjadliwości szczepów SAD stosowanych do doustnej szczepionki dla lisów.

Mutanty stosowane w szczepionce według wynalazku mogą być namnażane na komórkach nerki nowonarodzonych świnek morskich BHK 21, w obecności środowiska GEM (środowisko podstawowe minimum-modification Glasgow, firmy Flow) i 2% surowicy wołu w 33°C i w atmosferze wilgotnej z 5% CO2.

172 853

Mutanty te charakteryzuje się zwykłymi metodami, na przykład przez oznaczenie dawki śmiertelnej 50 (LD50) dla młodych myszek, za pomocą immunofluorescencji lub policzenia miejsc zanikowych pod agarem. Można je przechowywać w temDeraturze -70°C. * ^J

Analiza sekwencji nukleotydów glikoproteiny tych mutantów wykazała, że kodon aminokwasu w 333 różni się co najmniej dwoma nukleotydami od wszystkich możliwych kodonów argininy. Spośród mutantów spełniających ten warunek szczególnie preferuje się mutant posiadający w pozycji 333 kwas glutaminowy, gdyż namnaża się on dobrze w hodowli komórek, jest mniej chorobotwórczy dla nowonarodzonych myszek i ma dobre działanie ochronne.

Podwójny mutant zawierający kwas glutaminowy, którego kodon jest GAA na miejscu argininy w 333, otrzymany powyższym sposobem ze szczepu SAD Berne i nazywany poniżej SAG2, został zdeponowany w Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (C. N. C. M.) Instytutu Pasteura we Francji dnia 9 lipca 1992 pod nr I-1238. Mutant ten zawiera inną mutację, a mianowicie odporność na przeciwciało monoklonalne swoiste miejsca antygenowego II, co służy do dodatkowego znakowania szczepu.

Wynalazek zostanie opisany poniżej bardziej szczegółowo w odniesieniu do mutanta SAG2, jednakże bez ograniczania zakresu do tylko tego mutanta.

Przykład I. Testy stabilności genetycznej szczepu podczas przejść przez mózgi młodych myszek

10³ PFU SAG2 wstrzyknięto 6 czterodniowym myszkom. Gdy zwierzęta zachorowały (dzień 6-ty), uśmiercono je. Sporządzono sześć oddzielnych rozdrobnień; każde rozdrobnienie oznaczono, po czym 30 μΐ 1./10 wstrzyknięto 3 dorosymn myszom (kontrola chorobotwórczości) i młodej myszce (następne przejście). W ten sposób 6 młodych myszek pozwoliło na wykonanie 6 niezależnych serii 3 przejść.

Oznaczenie mózgów w PFU/ml podano w poniższej tabeli.

Tabela

Serie	— A	— B	C	-, D	E	F
1 przejście	>5x10⁷	1,5x107	107	10⁶	10⁶	10⁶
2 przejście	>5x10⁷	2,5x107	>5x10⁷	>5x107	>5x10⁷	>5x107
3 przejście	>5x107	>5x107	>5x107	>5x10⁷	>5x107	>5x1(6

Wszystkie dorosłe myszy, które otrzymały iniekcję (czyli 54 sztuki) po 1-szym, 2-gim lub 3-cim przejściu przeżyły wykazując brak rewersji.

Przykład II. Działanie ochronne SAG 2

Mutant SAG 2 wstrzyknięto drogą śródmózgową myszom i określono działanie ochronne tego mutanta przez próbę śródmięśniową 100 LD50 szczepu CVS.

Otrzymane wyniki przedstawiono na fig. 2 rysunku, który jest wykresem podającym na osi rzędnych działanie ochronne (%) w funkcji ilości wstrzykniętego mutanta wyrażonej w PFU/mysz (log). Ten sam test powtórzono z mutantem SK posiadającym w 333 lizynę.

Stwierdzono, że działanie ochronne SK i SAG2 wynosiło 100% począwszy od 10⁴ PFU/mysz.

Przykład III. Chorobotwórczość SAG2 drogą śródmózgową

Myszom wstrzyknięto mutant SAG2 w dawkach od 10'^θΊ do 1(6 PUL//mysz l nie stwierdzono śmiertelności w okresie 28 dni.

Równolegle przeprowadzono takie samo doświadczenie z wirusem SAD Berne lub mutantem SK.

172 853

Rezultaty przedstawiono na fig. 3 rysunku, który jest wykresem podającym % śmiertelności (na osi rzędnych) w funkcji wstrzykniętego mutanta na mysz (na osi odciętych).

Stwierdza się, że mutant SAG2 nie powoduje żadnej śmiertelności, podczas gdy mutant SK ma słabe resztkowe działanie chorobotwórcze.

Przykład IV. Chorobotwórczość SAG2 drogą śródmięśniową

Powtórzono powyższy test lecz drogą śródmięśniową. Otrzymane rezultaty przedstawiono na fig. 4 rysunku podającym % śmiertelności (na osi rzędnych) w funkcji zastosowanej dawki w PFU/mysz (na osi odciętych).

Jak widać, SAG2 i mutant SK nie powodują żadnej śmiertelności.

Mutanty według wynalazku można stosować jako żywą szczepionkę i podawać ją wszelkimi drogami stosowanymi zazwyczaj dla szczepionek, a zwłaszcza drogą śródmięśniową lub doustną. Mutanty korzystnie rozcieńcza się obojętnym nośnikiem farmaceutycznie dopuszczalnym, takim jak surowica fizjologiczna.

172 853

FIG. 2

PFU / Mysz (log)

172 853

Śmiertelność (%) Śmiertelność (%)

-0,5 0.5 1.5 2.5 3.5 ‘5 5.5 6.5

PFU/Mysz (log),drogą śródmózgową

J-1-1-1-Ϊ-’-r-'-1-1-1-1-1

1 2 3 4 5 6 7

P Fl$at4ys?. (ląg); 4() 0( g g, _t jś r ó d m i ę ś n i o w ą

172 853

PFU/Mysz (log)

PFU/Mysz (tog)

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 2,00 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Niezjadliwa szczepionka przeciw wściekliźnie, znamienna tym, że stanowi niezjadliwy mutant szczepu SAD wirusa wścieklizny, którego proteina posiada w pozycji 333 naturalny aminokwas o kodonie różniącym się od kodonów argininy co najmniej dwoma nukleotydami.
2. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że aminokwas w pozycji 333 jest kwasem glutaminowym.
3. Szczepionka według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że mutantem jest mutant szczepu SAD Berne.
4. Szczepionka według zastrz. 3, znamienna tym, że mutant jest mutantem zdeponowanym w Collection Nationale de Culture des Micro-organismes (C. N. C. M.) Instytutu Pasteura we Francji dnia 9 lipca 1992 r. pod numerem I-1238.
5. Sposób wytwarzania niezjadliwej szczepionki przeciw wściekliźnie, znamienny tym, że wyselekcjonowuje się ze szczepu SAD wirusa wścieklizny mutantów, które nie ulegają neutralizacji przez przciwciało monoklonalne neutralizujące omawiany szczep SAD lecz nie neutralizujące szczepu TAG1, wyodrębnia się, przez sekwencjonowanie rejonu 333 glikoproteiny mutantów wyselekcjonowanych w poprzedniej operacji, mutanta zawierającego w pozycji 333 lizynę, następnie wytwarza się przeciwciało monoklonalne, neutralizujące równocześnie omawiany szczep SAD oraz mutant otrzymany w poprzedniej operacji, lecz nie neutralizujące szczepu TAG1, i dokonuje się drugiej selekcji wśród mutantów otrzymanych w pierwszej operacji za pomocą przeciwciała monoldonalnego wytworzonego w trzeciej operacji.