PL173128B1 - Sposób wytwarzania nowych pochodnych chlorofilu i bakteriochlorofilu - Google Patents

Sposób wytwarzania nowych pochodnych chlorofilu i bakteriochlorofilu

Info

Publication number
PL173128B1
PL173128B1 PL93319910A PL31991093A PL173128B1 PL 173128 B1 PL173128 B1 PL 173128B1 PL 93319910 A PL93319910 A PL 93319910A PL 31991093 A PL31991093 A PL 31991093A PL 173128 B1 PL173128 B1 PL 173128B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
ome
formula
ser
derivatives
chla
Prior art date
Application number
PL93319910A
Other languages
English (en)
Inventor
Avigdor Scherz
Yoram Salomon
Leszek Fiedor
Original Assignee
Yeda Res & Dev
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yeda Res & Dev filed Critical Yeda Res & Dev
Publication of PL173128B1 publication Critical patent/PL173128B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • A61K49/0036—Porphyrins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0057—Photodynamic therapy with a photosensitizer, i.e. agent able to produce reactive oxygen species upon exposure to light or radiation, e.g. UV or visible light; photocleavage of nucleic acids with an agent
    • A61K41/0071—PDT with porphyrins having exactly 20 ring atoms, i.e. based on the non-expanded tetrapyrrolic ring system, e.g. bacteriochlorin, chlorin-e6, or phthalocyanines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0052—Small organic molecules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0056—Peptides, proteins, polyamino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/665—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
    • C07K14/68—Melanocyte-stimulating hormone [MSH]
    • C07K14/685—Alpha-melanotropin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/182—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Radiation-Therapy Devices (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

1. Sposób wytwarzania nowych pochodnych chlorofilu i bakteriochlorofilu o wzorze X-COOR, w którym X-CO- oznacza reszte C17 propionylowa chlorofilu (Chl) lub bakterio- chlorofilu (Bchl), a R oznacza reszte aminokwasowa, peptydowa lub bialkowa albo ich pochodne, na drodze enzymatycznej transestryfikacji, znam ienny tym , ze enzymatycznej transestryfikacji poddaje sie fitylowy ester Chl lub Bchl o wzorze X-COOfityl z aminokwa- sem, peptydem lub bialkiem zawierajacymi grupe hydroksylowa lub z ich pochodnymi o wzorze R-OH, w którym R oznacza reszte aminokwasowa, peptydowa lub bialkowa albo ich pochodne, w obecnosci enzymu chlorofilazy, po czym uzyskany produkt wyodrebnia sie z mieszaniny reakcyjnej. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych pochodnych chlorofilu i bakteriofilu o wzorze X-COOR, w którym X-CO- oznacza resztę C17 propionylową chlorofilu (Chl) lub bakteriochlorofilu (Bchl), a R oznacza resztę aminokwasową, peptydową lub białkową albo ich pochodne, na drodze enzymatycznej transestryfikacji.
Znane jest zastosowanie fotosensybilizatorów w leczeniu raka. W tej metodzie, znanej jako terapia fotodynamiczna (PDT - photodynamic therapy), podane uprzednio chromofory w procesie fotouczulania wytwarzają in situ atomowy (singletowy) tlen, rodniki tlenu i nadtlenki, niszczące złośliwe komórki (Dougherty, 1987). W metodzie tej stosowane są nietoksyczne lekarstwa w połączeniu z bezpiecznym napromieniowaniem fotouczulającym. Metoda ta jest potencjalnie bardziej selektywna, chociaż nie mniej destrukcyjna, niż powszechnie stosowana chemioterapia i radioterapia, przez co należy spodziewać się polepszenia jakości życia leczonych pacjentów.
Fotosensybilizatory używane w metodzie PDT muszą mieć wysoką wydajność kwantową wytwarzania atomowego tlenu oraz wysokie powinowactwo i selektywność w stosunku do tkanki złośliwej. Względnie wysoką wydajność kwantową tworzenia wzbudzonego stanu trypletowego mają porfiryny. Różnica pomiędzy energiami tego stanu i podstawowego stanu singletowego sprawia, że są one dobrymi donorami energii, wzbudzającymi tlen ze stanu podstawowego (trypletowego) do stanu singletowego. Od pewnego czasu wiadomo, że hematoporfiryna (HP) (Fig. 1) i jej pochodne (HPD) mają tendencję do odkładania się w tkankach nowotworowych. Z tego powodu HP i mieszaniny HPD stały się preferowanymi związkami w metodzie PDT.
Dostępna w handlu mieszanina pochodnych hematoporfiryny (HPD), stosowana jako środek do PDT, nazywa się Photofrin II (Quarda Logic Technologies, Inc., Vancouver, BC, Kanada) i w dużej części zawiera oligomery HP połączone eterowo. Oligomery te mają wysoki współczynnik absorpcji światła dla długości fali około 400 nm (tak zwane pasmo Soreta), ale znacznie mniejszy w paśmie widzialnym 500-630nm (tak zwane pasmo Q). Niestety, ze względu na duże tłumienie przez tkanki zwierzęce światła widzialnego i UV, wydajność kwantowa fotouczulania in situ jest bardzo niska. Dlatego dla skutecznego leczenia nowotworów wymagane jest intensywne naświetlanie i duże ilości HPD. Wraz z wzrostem ilości podawanych HPD zwiększa się możliwość ich akumulacji w normalnej tkance, a zatem i ryzyko jej uszkodzenia. Dodatkową wadą jest powolne wydalanie HPD z ludzkiego ciała. Pacjenci leczeni HPD cierpią tygodniami na fototoksyczność skóry.
Wady te spowodowały poszukiwanie nowych środków leczniczych, absorbujących światło poniżej 650 nm i cechujących się zwiększonym odkładaniem się w tkankach nowotworowych (McRobert i wsp., 1989).
W celu zwiększenia specyficzności i stopnia odkładania się w tkankach nowotworowych, testowano pochodne porfiryny zawierające różne grupy funkcyjne przyłączone do reszty pirolowej. Przesunięcie absorpcji związków HPD w kierunku czerwieni osiągnięto przez zmianę układu elektronów π w porfirynie.
W następstwie tego zwiększyło się zainteresowanie wykorzystaniem pochodnych Chl i Bchl jako środków do PDT (Kreimer-Birnbaum, 1989; Spike i Bommer, 1991). Chi i Bchl są odpowiednio pochodnymi dwu- i czterowodoroporfiryny, zawierającymi 4 pirylowe i jeden izocykliczny pierścienie połączone ze sobą i z atomem Mg, jak przedstawiono to w fig. 2 dla chlorofilu a (Chla) i w fig. 3 dla bakteriochlorofilu a (Bchla), gdzie M oznacza Mg, natomiast R jest rodnikiem fitylowym lub geranylogeranylowym w Bchla i fitylowym w Chla. Cząsteczka Bchla różni się od Chla dwoma dodatkowo zredukowanymi węglami β (boczne węgle pierścienia pirolowego). Różnorodność cząsteczek Chla i Bchla wynika z rozmaitości podstawników w pierścieniu makrocyklicznym i w grupie alkoholowej, która estryfikuje resztę kwasu 17-propionowego. W występującym w naturze Bchla reszta alkoholowa jest fitylem lub geranylogenarylem, podczas gdy na przykład w Bchlb jest geranylogenarylem. Kwasy wywodzące się z chlorofilu i bakteriochlorofilu są nazywane odpowiednio chlorofilidem (Chlide) i bakteriochlorofilidem (Bchlide). Wolne kwasy wywodzące się z Chla i Bchla są nazywane odpowiednio Chlidea i Bchlidea. Związki wywodzące się z Chl i Bchl pozbawione centralnego atomu metalu nazywane są odpowiednio feofityną (Pheo) i bakteriofeofityną (Bpheo). Feofityny wywodzące
173 128 się z Chla i Bchla nazywane są odpowiednio Pheoa i Bpheoa. Wolne kwasy wywodzące się z feofityny i bakteriofeofityny nazywane są odpowiednio feoforbidem i bakteriofeoforbidem.
Cząsteczki Chl i Bchl gromadzą energię słoneczną i inicjują przeniesienie elektronów w fotosyntezie biologicznej. Ich najniższe przejście energetyczne (tak zwane przejście Qv) postaci monomerycznej występuje przy 670-800 nm i może być przesunięte do 1000 nm w postaciach aglomerowanych. Przejścia te mają skrajnie wysokie współczynniki ekstynkcji. Prawdopodobieństwo wewnątrzsystemowego przejścia ze wzbudzonego stanu singletowego cząsteczek Chl i Bchl do ich najniższego stanu trypletowego jest dosyć wysokie (30-50%) i zapewnia wysoką wydajność wzbudzonych cząsteczek tlenu. Rzeczywiście, fotosensybilizacja tlenu cząsteczkami Chl i Bchl manifestuje się udziałem w ważnych degradacyjnych procesach w fotosyntezujących bakteriach i roślinach i z tego względu wszystkie fotosyntezujące organizmy mają rozmaite mechanizmy obronne przeciw atomowemu tlenowi i rodnikom tlenowym. Ponieważ Chi i Bchl są związkami zwykle konsumowanymi przez zwierzęta, ich rozkład in vivo jest bardzo szybki w porównaniu do HP i HPD (Llewellyn i wsp., 1990). Jest to ważna zaleta, zmniejszająca zależność pacjenta od długiego naświetlania.
Wciąż są jednak problemy związane ze stosowaniem ekstraktów Chl i Bchl do PDT. Po pierwsze, ze względu na silną hydrofobowość są one z trudem dostarczane do nowotworu. Po drugie, są one bardzo nietrwałe w normalnych warunkach podawania, to jest w obecności tlenu, temperaturze pokojowej i przy normalnym oświetleniu. Po trzecie, me ma możliwości skierowania ich wybiórczo do tkanki złośliwej. Ze względu na te ograniczenia, potencjalne użycie tych fotosyntetycznych pigmentów jako sensybilizatorów w PDT jest obecnie trudne do zrealizowania. Bardzo pożądane byłoby zsyntezowanie pochodnych Chl i Bchl, które pozwoliłyby pokonać te trudności i mogły być efektywnie używane w PDT. Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania takich nowych pochodnych chlorofilu i bakteriofilu.
Konkretnym przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania nowych pochodnych chlorofilu i bakteriofilu o wzorze X-COOR, w którym X-CO- oznacza resztę C17 propionylową chlorofilu (Chl) lub bakteriochlorofilu (Bchl), a R oznacza resztę aminokwasową, peptydową lub białkową albo ich pochodne, na drodze enzymatycznej transestryfikacji pokazanej w fig. 4 z enzymem chlorofilazą (Chlase), ekstrahowaną acetonem z roślinnych chloroplastów i przechowywaną w postaci proszku acetonowego. Estryfikację przeprowadza się przez utrzymywanie przez 1 godzinę w temperaturze 37°C mieszaniny acetonowego proszku chlorofilazy i pierwszorzędowego alkoholu R-OH (np. ester metylowy L-seryny) w roztworze buforowym zawierającym detergent, a następnie dodanie do uzyskanej zawiesiny pochodnej Bchl lub Chl, na przykład Bchla lub Chla, i dalsze utrzymywanie temperatury 37°C. Po usunięciu stałego proszku acetonowego, otrzymany ester ekstrahuje się z mieszaniny reakcyjnej i następnie oczyszcza.
Sposób według wynalazku polega na przereagowaniu, w obecności enzymu chlorofilazy, fitilowego estru Chl lub Bchl o wzorze X-COOfityl z aminokwasem posiadającym grupę OH, peptydem, białkiem lub ich pochodnymi o wzorze R-OH, a następnie na wyodrębnieniu z mieszaniny reakcyjnej uzyskanego estru X-COOR.
Kilka estrów otrzymano sposobem według wynalazku stosując serynę i jej pochodne, takie jak chlorowodorek estru metylowego L-seryny, ester metylowy N-trytylo-L-seryny i ester metylowy karbobenzoksyserylo-L-seryny. Pochodne te mogą być wykorzystywane bezpośrednio lub mogą służyć do połączenia innych cząsteczek z makrocyklem Chl lub Bchl.
Jeśli chce się otrzymać ester z peptydem lub białkiem nie mającym reszty aminokwasowej z grupą hydroksylową, to makrocykl Chl lub Bchl może być najpierw związany z seryną lub innym aminokwasem lub ich pochodną mającymi grupę hydroksylową, przez transestryfikację naturalnych związków lub estryfikację odpowiednich wolnych kwasów (Chlide lub Bchlide), a następnie peptyd lub białko łączone jest z makrocyklem poprzez tę resztę aminokwasową.
Związki o wzorze X-COSR mogą być uzyskane przez transestryfikację enzymatyczną pochodnych Chl lub Bchl z chlorofilazą i związkiem R-SH, np. cysteiną lub jej pochodną lub zawierającymi cysteinę peptydem lub białkiem.
W reakcji pochodnej Chlide lub Bchlide z peptydami lub białkiem zawierającymi aminokwas z rodnikami hydroksylowym, merkaptanowym i/lub aminowym może nie być pewne czy
173 128 przyłączenie nastąpi poprzez tlen, siarkę czy grupę NH, lecz wynalazek obejmuje wszystkie te połączenia, niezależnie od ich struktury.
Aby pozyskać podstawione metalem pochodne Chl i Bchl, Mg jest zastępowany przed przyłączeniem pigmentu do aminokwasu lub komórkowo specyficznego ligandu. Zamianę centralnego atomu Mg w Chl i jego pochodnych na Cu, Ni, Zn, V, Co i inne dwuwartościowe metale prowadzi się standardowymi metodami np. poddając feofitynę działaniu soli pożądanego metalu, np. octanu cynku lub octanu miedzi, w bezwodnym etanolu i w temperaturze otoczenia (Hambright, 1975; Hynninen, 1991). W przypadku Bchl i jego pochodnych, centralny atom Mg może być zastąpiony przez Zn lub Cu w podobnym procesie, w którym działa się octanem Zn lub Cu w lodowatym kwasie octowym, w atmosferze argonu i w podwyższonej temperaturze (Fiedor i wsp., 1993).
Nowe estry mają taką samą absorpcję optyczną i charakterystykę fotofizyczną jak odpowiednie związki Chl i Bchl. Dlatego należy się spodziewać, że umieszczone w leczonej tkance nowe estry Chl i Bchl będą skutecznymi środkami fotodynamicznymi.
Przyłączanie białek do cząsteczek Chl i Bchl, np. hormonów, czynników wzrostu lub ich pochodnych i przeciwciał oraz odżywek komórkowych, np. tyrozyny, ma na celu zwiększenie ich zatrzymywania w nowotworze i leczonych miejscach. Zwiększenie przesunięcia widma do czerwieni zezwala na głębszą penetrację nowotworu, bez osłabienia systemu naturalnego. Zastąpienie Mg innymi metalami ma na celu optymalizację wewnętrznej i metabolicznej stabilności Chl lub Bchl oraz międzysystemowego przejścia do wzbudzonego stanu trypletowego, a także otwiera możliwość nowych metod diagnostycznych.
Przeciwciała specyficzne w stosunku do nowotworu kierują Chl i Bchl do tkanki nowotworowej lub leczonego miejsca, podczas gdy hormony i odżywki komórkowe mogą być także pobierane przez tkanki normalne. Jakkolwiek komórki wybrane jako cele dla hormonów i odżywek komórkowych, takie jak melanocyty, w normalnych warunkach są rozrzucone wśród innych komórek, to po przemianie w komórki złośliwe, gromadzą się w postaci guza. W rezultacie, należy spodziewać się, że stężenie fotosensybilizatora w tkance złośliwej dramatycznie wzrośnie, w porównaniu do jego stężenia w tkance normalnej, w której komórki są bardziej rozproszone. Zapewnia to wzmocnienie efektu PDT w tkance nowotworowej. Efekt ten umożliwia stosowanie dawek światła niższych niż próg uszkadzania normalnej tkanki, co zmniejsza wymagania na przestrzennie ścisłe zdefiniowanie wiązki promieniowania. Dodatkowo, posiadając bardzo silne właściwości fluorescencyjne Chl i Bchl mogą być wykorzystywane do fluorescencyjnego ukazywania miejsc nowotworowych.
Nowotwory czerniakowe nadają się do leczenia nowymi fotosensybilizatorami Chl i Bchl według wynalazku z kilku powodów. We wczesnym stadium choroby złośliwy czerniak i inne nowotwory skóry są bardzo podatne na PDT. Stosowana dotychczas terapia fotodynamiczna z wykorzystaniem światła zielonego, jak również tradycyjna chemioterapia i radioterapia nie są jak dotąd skuteczne w leczeniu czerniaka. Istnieje jednak kilka specyficznych ligandów kierujących fotosensybilizatory do nowotworu. Zastosowanie wzbudzających się pod wpływem fal długich nowych pochodnych Chl i Bchl powinno przezwyciężyć wady tradycyjnych fotosensybilizatorów, wywoływane absorpcją melaniny.
Nowotwór czerniak rozwija się z rakowego przeobrażenia melanocytów (włącznie z mutacjami wywoływanymi promieniowaniem UV). Normalne melanocyty stanowią mały procent komórek zdrowej skóry ludzkiej i znajdują się w podstawowej warstewce tkanek pomiędzy naskórkiem i skórą właściwą, gdzie każde z nich jest otoczone przez 30 - 40 keratynocytów i jedną komórkę Langerhansa. Czerniak jest szczególnie trudnym przypadkiem dla metody PDT, ponieważ komórki nowotworowe mogą zawierać nierozpuszczalne czarne eumelaniny (poli5,6indolochinony), mające szerokie pasmo absorpcji w pobliżu 540 nm i w związku z tym konkurujące z każdym fotouczulaczem o promieniowanie o długości fali krótszej niż 650 nm. Na dodatek cząsteczki melaniny mogą likwidować powstałe rodniki tlenu i w ten sposób przeciwdziałać niszczeniu komórek. W rezultacie tego, leczenie czerniaka metodą PDT z zastosowaniem zwykłych HPD nie jest zbyt obiecujące. Posiadając maksymalną absorpcję optyczną powyżej 650 nm, wzbudzone Chl i Bchl i ich syntetyczne pochodne nie powinny być przesłaniane melaniną. Dodatkowo, komórki czerniaka (to znaczy przekształcone melanocyty)
173 128 zużywają znaczne ilości tyrozyny podczas syntezy melaniny, mają duże powinowactwo do melantropin (przysadkowe hormony stymulujące α-, β-, γ- melanocyty (MSH)) i kilku znanych przeciwciał. Dlatego mogą być dobrym celem dla tyrozynowych, melanokortynowych lub przeciwciałowych połączeń Chl i Bchl, pod warunkiem, że wytworzenie połączeń nie wpływa silnie na rozpoznawanie ligandów przez receptory komórkowe. Ponieważ stężenie melanocytów powiększa się prawie 40-krotnie w czerniaku w porównaniu z normalnymi komórkami skóry, można spodziewać się, że efekt fotodynamiczny drastycznie się zwiększy.
Pochodne Chl i Bchl według wynalazku mogą być wykorzystywane w fotodynamicznej terapii kilku typów raka, zwłaszcza raka mózgu, jajnika, piersi, skóry, płuc, przełyku, pęcherza i innych nowotworów wrażliwych na hormony.
Związki według wynalazku mogą być wykorzystane do leczenia złośliwego czerniaka. Efekt fotodynamiczny tych związków może być monitorowany w komórkach czerniaka w nowotworze i w sztucznych kulturach. Przykładami pochodnych mających zastosowanie do tego celu są połączenia Chl lub Bchl z α-melanotropiną, związane z pigmentem albo przez resztę serynową, tyrozynową lub lizynową, albo przez końcową grupę aminową.
Związki według wynalazku podaje się pacjentowi standardowymi metodami stosowanymi w PDT. Ilość i sposób podawania związku ustala się w zależności od rodzaju nowotworu, zaawansowania choroby, wieku i stanu zdrowia pacjenta. Dawki te są jednak znacznie niższe od obecnie stosowanej dawki Photofrinu II, około 20-40 mg HPD/kg wagi ciała. Korzystnymi metodami podawania wodnych roztworów aktywnego związku wraz z farmaceutycznie dopuszczalnymi nośnikami i dodatkami są dożylne zastrzyki i zastrzyki wykonywane bezpośrednio do nowotworu oraz miejscowe leczenie za pomocą odpowiednio do tego przygotowanych preparatów.
W metodzie fotodynamicznej terapii, związki według wynalazku podaje się pacjentowi cierpiącemu na raka, po czym naświetla się chore miejsce silnym źródłem światła o długości fali 670-780 nm.
Nowe pochodne Chl i Bchl mogą być stosowane do fotodestrukcji łagodnych lub złośliwych komórek lub tkanek przez ukierunkowaną na chore miejsce terapię fotodynamiczną (SPD). Pochodne Chl i Bchl przenoszą cząsteczki Chl i Bchl do komórek zbitych ze sobą w tkance nowotworowej po ich degeneracyjnej transformacji (np. melanocyty w czerniaku), ale dobrze od siebie oddzielonych w tkankach normalnych. W rezultacie efekt fotodynamiczny fotosensybilizatora w nowotworze może być o kilka rzędów większy niż w normalnej tkance. Dzięki temu niszczący próg naświetlania dla nowotworu obniża się do poziomu bezpiecznego dla zdrowej tkanki. Jest to szczególnie ważne w przypadku nowotworów, przy których niemożliwe jest stosowanie konwencjonalnych operacji chirurgicznych.
Terapia fotodynamiczna stosując proces bifotoniczny (Leupold i Freyer, 1992) pozwala na rozszerzenie zakresu uczulenia do bliskiej podczerwieni. Wysoki udział wewnętrznych połączeń w pochodnych Chi i Bchl i ich maksimum absorpcji przesunięte do fal długich czyni je użytecznymi w tej odmianie PDT.
Nowe pochodne Chl i Bchl są również bardzo użyteczne przy fotodestrukcji normalnych lub złośliwych komórek zwierzęcych, jak również drobnoustrojów w ich kulturach, z wykorzystaniem lub bez wykorzystania SPD. Pochodne te umożliwiają selektywną fotodestrukcję pewnych typów komórek w kulturach lub czynnikach zakaźnych. Pochodne te wykorzystywane są również do kierowania porfiryny do wybranych komórek przez związanie połączeń Chl i Bchl i seryny ze specyficznymi polipeptydami, takimi jak hormony lub inne ligandy receptorowe, ze specyficznymi przeciwciałami komórek i tkanek, np. lektynami. Można je także stosować do fluorescencyjnego znaczenia cząsteczek dla celów analitycznych w laboratoriach, diagnostyce i przemyśle. Ze względu na wysokie współczynniki ekstynkcji, mogą one zastąpić kilka obecnie używanych znaczników fluorescencyjnych, takich jak izorodanek fluoresceiny lub fikoerytryna.
Dla celów diagnostycznych nowe pochodne Chl i Bchl według wynalazku mogą być znakowane atomami promieniotwórczymi standardowymi metodami, np. atomami 67Ga, 114n, 2°hn, 2OIT1 i 9 mTc. Promieniotwórczy środek diagnostyczny jest podawany pacjentowi najlepiej w zastrzyku dożylnym. Po kilku godzinach lokalizację położenia nowotworu można dokonać standardowymi metodami.
173 128
Nowe pochodne Chl i Bchl mają maksymalną absorpcję optyczną przy takich długościach fal, przy których znacznie zmniejsza się absorpcja wykazywana przez tkanki ludzkie lub zwierzęce (660-830 nm dla postaci monomerycznych i do 1000 nm dla dimerów i większych agregatów). Razem ze zmniejszeniem rozpraszania zezwala to na większą głębokość penetracji lub użytkowanie słabszych i tańszych źródeł światła. Ich współczynniki absorpcji w świetle widzialnym i w bliskiej podczerwieni są około 10 razy większe w porównaniu z porfirynami, stosowanymi obecnie w PDT. Zastąpienie centralnego atomu Mg innymi metalami zwiększa wydajność wytwarzania atomowego tlenu. Nowe pochodne wykazują większą selektywność w rozpoznawaniu docelowych komórek, co zmniejsza wielkość stosowanych dawek. Niektóre doniesienia wskazują na dużą szybkość wydalania tych pochodnych z organizmu (Spikes i Bommer, 1991).
Zwykle naświetlanie prowadzone jest światłem laserowym, z takich źródeł jak laser argonowy, nastawiony na emisję fal długości 628 nm lub pulsacyjny laser złoty, emitujący fale o długości 628 nm. Wysoki koszt tego sprzętu ogranicza stosowanie PDT do większych centrów medycznych. Zastosowanie fotosensybilizatorów według wynalazku, absorbujących w podczerwieni i w bliskiej podczerwieni, umożliwia stosowanie środków bardziej konwencjonalnych i tańszych, takich jak ksenonowe lampy błyskowe, lampy halogenowe, lasery diodowe lub bezpośrednie naświetlanie słoneczne.
Figura 1 przedstawia wzór strukturalny hematoporfiryny, HP: R]i R2 oznacza -CHOH-CH3.
Figura 2 przedstawia wzór strukturalny Chla (M oznacza Mg, R oznacza fityl), Chlidea (M oznacza Mg, R oznacza H) i Pheoa (M oznacza 2H, R oznacza fityl).
Figura 3 przedstawia wzór strukturalny Bchla (M oznacza Mg, R oznacza fityl), Bchlidea (M oznacza Mg, R oznacza H) i Bpheoa (M oznacza 2H, R oznacza fityl).
Figura 4 przedstawia schemat enzymatycznej transestryfikacji Chla z estrem metylowym L-seryny (L-Ser-OMe) w obecności chlorofilazy (Chlase).
Figura 5 przedstawia widmo absorpcji optycznej (a) Chla, (b) Chla-L-Ser-OMe, (c)Bchla, i (d) Bchla-L-Ser-OMe, w 100% acetonie.
Figura 6 przedstawia widmo absorpcji optycznej (a)Pheoa-L-Ser-OMe (b)Zn-Pheoa-LSer-OMe i (d)Cu-Pheoa-L-Ser-OMe, w 100% etanolu.
Figura 7 przedstawia transformację Fouriera widma podczerwieni (FTIR) stałych (a)Chla, (b)Chlidea i (c)Chla-L-Ser-OMe.
Figura 8 przedstawia widmo FTIR stałych (a)Bchla, (b)Bchlidea i (c)Bchla-L-Ser-OMe.
Figura 9 przedstawia zależność adsorpcji Chlidea (trójkąty), Chla-L-Ser-OMe (kółka) i HPD (kwadraty) na kulturze komórek czerniaka M2R od stężenia pigmentu w pożywce.
Figura l0 przedstawia zależność adsorpcji Bchla-L-Ser-OMe (kółka) i Bchlidea (trójkąty) na kulturze komórek czerniaka M2R w funkcji stężenia pigmentu w pożywce.
Figura 11 A-C przedstawia wpływ PDT na przyłączanie (¾] tymidyny do (A) komórek czerniaka M2R u myszy, (B) ludzkich fibroblastów FS-11 napletka i (C) ludzkich komórek raka piersi T47D, po podziałaniu Chla-L-Ser-OMe, z następczym naświetlaniem (jasne słupki) i bez naświetlania (ciemne słupki).
Figura 12 przedstawia wpływ PDT na proliferację efektywności klonowania komórek czerniaka M2R, po podziałaniu Chla-L-Ser-OMe, z następczym naświetlaniem (jasne słupki) i bez naświetlania (ciemne słupki).
Figura 13 przedstawia zdjęcie mikroskopowe pokazujące kontrast fazowy (lewa strona) i fluorescencję (prawa strona) monomolekularnej warstwy komórek M2R inkubowanych z 4 x 10‘°M Chla-L-Ser-OMe przez 1 godzinę i naświetlanych 10 minut światłem laserowym 670 nm (5mW). Po 3 godzinach komórki poddano działaniu Propidium Iodide (PID) i zbadano fluorescencję PID. Na powierzchni krążka naświetlonego promieniem lasera (A) widoczne są uszkodzone komórki i regiony, z których komórki zostały usunięte. Komórki utrzymywane w ciemności wokół (B) naświetlonej strefy mają normalną morfologię (lewa strona). Na zdjęciu mikroskopowym fluorescencji tej samej monowarstwy (po prawej) wszystkie pozostałe uszkodzone komórki w obszarze (A) zostały oznakowane przez PID, podczas gdy komórki w obszarze (B) są nieoznakowane i dlatego można je uważać za nieuszkodzone.
Figura 14 przedstawia zdjęcie mikroskopowe pokazujące kontrast fazowy i fluorescencję monomolekularnej warstwy komórek M2R, poddanych działaniu takiemu samemu jak w fig. 13.
Widoczna jest granica naświetlonego obszaru, w którym można dostrzec znaczone przez PID jądra (Nu) w uszkodzonych komórkach, sąsiadujących z kontrolnymi nienaświetlonymi komórkami (C), mającymi normalną morfologię i nieoznakowane jądra.
Figura 15 przedstawia zdjęcie mikroskopowe pokazujące kontrast fazowy monomolekularnej warstwy komórek M2R, naświetlonej przez 10 minut bez dodatku sensybilizatora. Nie widać żadnych zmian kształtu komórek. Żadne komórki nie były zaznaczone przez PID.
Figura 16 przedstawia przekrój skóry leczonej fotodynamicznie myszy (A: pow. x 30; B: pow. x 70). Myszy zaaplikowano Chla-L-Ser-OMe (20 mg/kg) i po 24 godzinach naświetlano ją przez 4 godziny. Po następnych 24 godzinach mysz zabito. Skórę myszy poddano sekcji, po czym natychmiast utrwalono ją w odczynniku utrwalającym Bouina. Parafinowe fragmenty naświetlonej tkanki skórnej zabarwiono zmodyfikowanym trójchromem (hematoksylina/eozyna/light green, kwas fosforomolibdenowy). Jednakowe położenie naświetlonego obszaru było utrzymywane przez cały czas eksperymentu. Przekrój był wykonany przez środek obszaru martwicy (NC). Zdrowa skóra, która nie została naświetlona, widoczna jest z obu stron obszaru martwicy (A). Martwica penetruje skórę oraz naskórek i sięga do podskórnej warstwy tłuszczu, z charakterystycznymi kropelkami tłuszczu. Widoczne jest także przenikanie leukocytów (LU) tuż pod obszarem martwicy.
Figura 17 A-C przedstawia obraz rezonansu magnetycznego (MRI) czerniaka M2R (T), wszczepionego myszy CD 1, leczonej Bchla-L-Ser-OMe, przed (A), dwa tygodnie po pierwszym leczeniu (B) i dwa tygodnie po drugim (C). Na zdjęciu (B) widoczne są pewne nawroty, nie ma ich już na zdjęciu (C).
Figura 18 przedstawia rozkład Chla-L-Ser-OMe w poszczególnych organach myszy CD1, 12 godzin po podaniu Chla-L-Ser-OMe.
Figura 19 przedstawia powstawanie cAMP w kulturze czerniaka MR2 u myszy, wywoływane przez Chla-a-MSH (zaczernione kółka) i przez analog alfa-MSH (puste kółka). Stężenie Chla-a-MSH jest określone przez najniższy możliwy współczynnik absorpcji Chl.
Wynalazek zostanie zilustrowany przykładami, nie ograniczającymi jego zakresu.
Przykład I. Otrzymywanie chlorofilu a
Chlorofil a wyodrębniono ze Spirullina Galtieri w następujący sposób: liofilizowane komórki (2-3 g) zmielono na proszek, ekstrahowano trzykrotnie acetonem (10 ml) i ekstrakt przefiltrowano, odrzucając fazę ciekłą. Brązowo-zieloną pozostałość ponownie ekstrahowano przez roztarcie z metanolem. Po odsączeniu odrzucono blado szarą pozostałość, a z ekstraktu odparowano pod próżnią rozpuszczalnik. Zieloną pozostałość ponownie rozpuszczono w acetonie i przepuszczono w temperaturze 5°C przez kolumnę chromatograficzną (średnica 1,5 cm, długość 6 cm) wypełnioną dwuetyloaminoetylenosefarozą (Pharmacia Fine Chemicals, DEAEsepharose CL-6B). W celu usunięcia żółtych substancji (kartenoidów) kolumnę przemyto acetonem, po czym wymyto ją mieszaniną metanolu i acetonu (w stosunku objętościowym 1:3), uzyskując ciemnoniebieski roztwór Chla. Całkowity czas rozdzielania chromatograficznego wynosił 10-12 minut. Czystość Chla sprawdzano za pomocą TLC i spektrofotometrii na pozostałość karotenoidów i innych zanieczyszczeń, takich jak feofityny lub chloryny, i jeśli to było konieczne roztwór ponownie przepuszczano przez kolumnę chromatograficzną. Następnie odparowano metanol i aceton, a stały Chla suszono starannie pod próżnią i przechowywano w ciemności w -20°C. W celu zminimalizowania rozkładu, wszystkie operacje przeprowadzano w przyciemnionym świetle lub w zupełnej ciemności i w jak najkrótszym czasie. Stosowano rozpuszczalniki czyste do analizy, bez ich dalszego oczyszczania.
Przykład II. Otrzymywanie chlorofilazy
Acetonowy proszek chlorofilazy (Chlase) otrzymywano z liści drzewa Melia azedarach L. China. Świeże liście (50 g) utarto w mieszalniku z 350 ml zimnego acetonu (-20°C). Ujednorodnioną mieszaninę przesączono przez gazę i przesącz pozostawiono na noc w temperaturze 5°C, w celu sedymentacji chloroplastów. Aceton usunięto przez odsączenie, a pozostały proszek przemyto kilkakrotnie 95% acetonem i na końcu 100% acetonem, uzyskując acetonowy proszek
173 128 chlorofilazy, który suszono pod próżnią. Może on być przechowywany w -20°C przez co najmniej kilka miesięcy.
Przykład III. Otrzymywanie pochodnych seryny
Następujące pochodne seryny użyto do reakcji transestryfikacji Chla/Bchla:
a) chlorowodorek estru metylowego L-seryny (L-Ser-OMe-HCl), zakupiony w Sigma Chemical Co.;
b) ester metylowy karbobenzoksyseryloseryny (Z-Ser2-OMe): Syntezę tej nowej pochodnej przeprowadzono stosując metodę opisaną przez Nicolaidesa i wsp., 1968, J. Med. Chem. 11,: 74-79. Do zimnego (5°C) roztworu 6,45 g (0,027 mola) karbobenzoksyseryny (Z-Ser) w 50 ml DMF dodano 3,9 g (0,028 mola) p-nitrofenolu i 5,8 g (0,028 mola) DCC. Mieszaninę trzymano w 5°C przez 5 godzin i przesączono. Do przesączu dodano przefiltrowany roztwór przygotowany z 4,2 g chlorowodorku estru metylowego seryny i 2,7 g (0,027 mola) Et3N w 50 ml DMF. Mieszaninę reakcyjną pozostawiono w 25°C na 18 godzin, po czym odparowano ją do małej objętości. Do pozostałości dodano 100 ml EtOAc i uzyskany roztwór przemyty wodą, 5% roztworem Na2CO 3 i rozcieńczonym HCl wysuszono i odparowano do około 30 ml. Następnie dodano eter naftowy, oddzielono uzyskany osad i poddano go rekrystalizacji w EtOAc-MeOHEt2O, uzyskując Z-Ser2-OMe o temperaturze topnienia 190-192°C;
c) karbobenzoksyseryna (Z-Ser): Syntezę tej pochodnej, wykorzystywanej w powyższej syntezie (b), przeprowadzano stosując metodę opisaną przez Moore'a i wsp., 1954, JACS 76: 2884-2887. Do zimnego (5°C) roztworu NaOH (212 ml, 2N) dodano 44,3 g (0,42 mola) L-seryny, uzyskując roztwór o pH = 9,8. W 10-15 minutowych odstępach dodawano porcjami (4-5 g) chloromrówczan benzylu, utrzymując pH = 9,8 za pomocą IN roztworu NaOH. Dodawanie chloromrówczanu benzylu kontynuowano do momentu dodania 80 g (0,46 mola) tego odczynnika, po czym utrzymywano pH = 10 przez 0,5 godziny w 10°C. Zasadowy roztwór ekstrahowano początkowo 150 ml, później 100 ml eteru dwuetylowego, a następnie do wodnego roztworu dodano 1L EtOAc. Dodaniem 30-35 ml stężonego HCl zakwaszono roztwór do pH 3 i wodną warstwę ekstrahowano najpierw 250 ml, a później 150 ml EtOAc. Roztwór EtOAc wysuszono nad MgS0ą i zagęszczono pod próżnią do wytrącenia Z-Ser. W wyniku rekrystalizacji z EtOAc uzyskano czysty produkt o temperaturze topnienia 117-119°C, z całkowitą wydajnością 79 g (78%);
d) ester metylowy N-trytylo-L-seryny (Tri-Ser-OMe): Syntezę tej pochodnej przeprowadzono stosując metodę opisaną przez Guttmanna, 1962, Helv. Chem. 45:2622. Do zimnego (0°C) roztworu 15,5 g (0,1 mola) L-Ser-OMe w 150 ml chloroformu dodano 31 ml (0,22 mola) Et3N i 26,7 g (0,11 mola) trójfenylometanu. Roztwór przetrzymywano w 0°C przez 3 godziny, następnie przemywano go wodą i suszono nad MgSOą. Rozpuszczalnik odparowano pod próżnią i po rekrystalizacji stałej pozostałości w mieszaninie benzenu z eterem naftowym (1:1) uzyskiwano 28 g (77%) czystego produktu;
Przykład IV. Otrzymywanie 3-0-( 1 -O metylo)-L-serylochloroiiIidu (Chla-L-Ser-OMe) przez enzymatyczną transestryfikację Chla estrem metylowym L-seryny
4.1 Otrzymywanie Chla-L-Ser-OMe
Wytworzono zawiesinę 200 mg acetonowego proszku chlorofilazy z przykładu II w 6 ml 0,5M buforu fosforanu sodowego o pH 7,6, zawierającego 0,7% TX-100 (Triton X-100, Sigma Chem. Co.), 400 mg chlorowodorku estru metylowego L-seryny (Sigma) i 70 mg kwasu askorbinowego (Merck). Zawiesinę homogenizowano przez 5 minut i następnie mieszano 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po dodaniu 5 mg stałego Chla wytworzoną mieszaninę dalej homogenizowano przez 5 minut i nasycano Ar. Pojemnik z tą mieszaniną szczelnie zamykano i inkubowano mieszając przez 7 godzin w całkowitych ciemnościach w 36°C. Zaawansowanie reakcji kontrolowano metodą TLC na żelu krzemionkowym (Merck), stosując jako wymywacz albo mieszaninę n-heksanu i acetonu (1:1), albo 1-butanol. Zaobserwowano trzy pasma odpowiadające Chla, Chlidea i Chla-L-Ser-OMe.
4.2 Oczyszczanie Chla-L-Ser-OMe
Mieszaninę reakcyjną dodano do 20 ml wody zawierającej 2 g NaCl i 100 mg askorbinianu sodowego (Sigma) i przefiltrowano ją pod niewielką próżnią. Niebieskozielony osad przemyto acetonem i ponownie przesączono. Przesącze połączono, nasycono NaCl i wstrząsano z eterem dwuetylowym w rozdzielaczu. Warstwę eterową oddzielono, następnie trzymano ją nad stałym
173 128
NaCl przez około 10 godzin, odparowano w strumieniu suchego azotu i niebieskozieloną pozostałość pigmentu suszono pod próżnią. Osad ten rozpuszczono w acetonie i przepuszczono przez kolumnę CM-Sepharose CL-6B w 5°C, zrównoważoną acetonem. Kolumnę przemywano acetonem do ukazania się brązowego pasma feofityn i oddzielenia go od Chla-L-Ser-OMe, który pozostał w postaci niebieskozielonego pasma na szczycie kolumny. Do wymycia feoforbidów stosowano mieszaninę 5% i 8% metanolu i acetonu. Następnie 25% mieszaniną metanolu i acetonu wymyto Chlidea, a później Chla-L-Ser-OMe. Tę ostatnią, niebieskozieloną frakcję zebrano, sprawdzono jej czystość metodą TLC na żelu krzemionkowym, stosując do frakcjonowania 1 -butanol, a następnie przepuszczano N2 do odparowania rozpuszczalnika, suszono pozostałość pod próżnią i zamykano ją szczelnie w atmosferze Ar. Produkt przechowywano w ciemności w -20 C. Wydajność 75%.
4.3 Struktura Chla-L-Ser-OMe
Absorpcja optyczna i widma FTIR Chla, Chlidea i Chla-L-Ser-OMe są pokazane odpowiednio w fig. 6 i 8. W metodzie TLC każdy związek znajdujący się w mieszaninie reakcyjnej pojawia się jako oddzielna plamka na żelu krzemionkowym. W porównaniu do wyjściowego Chlidea (przesunięcia chemiczne są wymienione w tabeli 1), widmo rH-NMR Chla-L-Ser-OMe (IV) w CD 3OD ma nowe sygnały przy 3,57 ppm, odpowiadające grupie metylowej w serynie, i przy 5,31-5,37, wskazujące na pojawienie się wiązania estrowego. Wszystkie związki pokazują całkowity model makrocyklu, ale połączeniom Chla-L-Ser-OMe (IV) i Chlidea brakuje pasm fitylowych.
Widma FTiR Chla (a) i Chla-L-Ser-OMe (c) (mające pasmo estrowe przy 1728 cm'1) są podobne, ale wyraźnie różnią się od widma Chlidea (b), jak pokazano to w fig. 7.
Przykład V. Enzymatyczna transestryfikacja Chla z Z-Ser2-OMe i Tri-Ser-OMe
Transestryfikację Chla z serynowymi pochodnymi Z-Ser2-OMe i Tri-Ser-OMe (związki (b) i (d) z przykładu III) przeprowadzono tak jak w przykładzie IV. TLC pokazuje 35% wydajność pochodnych Chla-seryny i żadnych produktów hydrolizy.
Przykład VI. Otrzymywanie 3-0-( 1 -0-metylo)-L-serylobakteriochlorolΊiidu a (BchlaL-Ser-OMe) przez enzymatyczną transestryfikację Bchla estrem metylowym L-seryny
Transestryfikację Bchla z estrem metylowym L-seryny przeprowadzono tak jak opisano w przykładzie IV, otrzymując Bchla-L-Ser-OMe z wydajnością 35%. Czystość związku sprawdzono metodą TLC. Absorpcja optyczna i widma FTiR Bchla i Bchla-L-Ser-OMe pokazano odpowiednio w fig. 5 i 8 (przesunięcia chemiczne są wymienione w tabeli 1 (związek VII)).
Tabela 1
1H przesunięcia chemiczne Chlidea, Bchlidea 1 ich pochodnych (jedynie sygnały silnego pola) w CD3OD, w ppm
Proton Chlidea Bchlidea IV V VIII IX I II III
C-10 9,16s 8,60s 9,6s 9,65s 8,80s 8,80s - -
C-5 9,48s 8,25s 9,5s 9,33s 8,42s 8,45s - - -
C-20 8,34s 8,18s 8,55s 8,45s 8,25s 8,34s - -
wiązanie - - 5,33 5,10m 5,33 - - - -
estrowe* m m
reszta - - - 7,35m 7,35 6,7- 7,35 6,7-
aminokwasu m 7,0q m 7,0q
C-13 6,46s 6,15s 6,40s 6,70s 6,80s 8,80s - - -
* wiązanie estrowe pomiędzy karboksylowi) grupą Bchlidea i Z-Ser2-OMe
I Z-Sei'2-OMe - Ester metylowy kaibobenzoksys^e^iĄlks^t^rymy
II L-seryna - Ester metylowy L-seryny
III N-tBOC-Tyr-OMe - Ester metylowy ^Oer^butoksykaIbx)nyιlotyΎO/Λnly
IV 3-0-( 1-0-meryloTL-eerylochlorofilid a
V 3-0-( - -0-merylo-N-kabObeenzkkry-L-eerylo--L-eerylochlolΌfllίd a
VIII 3-0-( 1 -0-metylo-N-karbobenzoksy^Τ.^5^^ι^1 o)-L-serylobakteriochlorofilid a
IX 7l0-(1-0-metylo-Nltert-butoksykarbonylo)-L-tyrozylobakterlochlorofilida
173 128
Przykład VII. Podstawienie centralnego Mg w Chl i Bchl przez Zn i Cu
Wprowadzenie Zn lub Cu do Chlidea-L-Ser-OMe zachodzi łatwo w temperaturze pokojowej, w umiarkowanych warunkach reakcji.
3-0-(1-0-metylo)-L-serylofeoforbid a (Pheo-L-Ser-OMe - związek X) otrzymano przez usunięcie metalu z Chla-L-Ser-OMe w reakcji z lodowatym kwasem octowym. Niewielką ilość Chla-L-Ser-OMe rozpuszczono w kilku kroplach kwasu octowego i po 10-15 sekundach odparowano kwas przepuszczając N 2. Brązowawa^ozostałość Pheo-Ser-OMe rozpuszczono w 2 ml 0,1 M roztworu octanu Zn (lub octanu Cu+) w etanolu i przetrzymywano 20 minut w ciemności, w atmosferze Ar i w pokojowej temperaturze, cały czas mieszając. Zmianom koordynacyjnego stanu makrocyklu towarzyszyły zmiany widma absorpcji w zakresie widzialnym i dlatego stopień zaawansowania reakcji mógł być śledzony spektroskopowo. Widmo absorpcji produktów w zakresie widzialnym pokazane jest w fig. 6. W tych warunkach reakcja podstawiania metalu przebiegała prawie ilościowo, dając czyste pochodne Chla-L-Ser-OMe z Zn i Cu.
Przykład VIII. Adsorpcja Chlidea, Bchlidea i Chla oraz związków Bchla-seryna na kulturze komórek czerniaka
a) próba in vitro.
Sprawdzanie powinowatości pochodnych Chl i Bchl w stosunku do komórek czerniaka przeprowadzano w następujący sposób: komórki czerniaka myszy M2R (Gerst i wsp., 1986) hodowano jako warstwy monomolekularne (do 100% zlewania się) w DMEM/F12 zawierającej 10% osocza końskiego w temperaturze 37°C, w wilgotnej atmosferze z 8% zawartością Co2. Po 48 godzinach komórki poddano przez 3 godziny działaniu różnych stężeń (1-100 μM) Chlidea, Bchlidea, związków Chla i Bchla z seryną oraz HPD (Photofnn II). W celu określenia stopnia adsorpcji pochodnych Chl i Bchl na komórkach, pożywkę kultury zassano, komórki trzykrotnie przemyto solanką buforowaną fosforanami (PBS) i pigmenty ekstrahowano acetonem. Stężenie pochodnych Chl i Bchl w roztworze określono przez porównanie ich absorpcji optycznej i fluorescencji z acetonowym roztworem o znanym stężeniu pigmentów.
Liczba cząsteczek Chlidea i Chla-L-Ser-OMe i odpowiednich pochodnych Bchla adsorbowanych na komórkach M2R po następującej potem 3 godzinnej inkubacji w obecności osocza końskiego zilustrowana jest w fig. 9 i 10. Jak widać, Chlidea i Bchlidea adsorbują się lepiej na komórkach M2R czerniaka niż Photofrin II (HPD). Bchlidea i Bchla-L-Ser-OMe są adsorbowane w takim samym stopniu na komórkach czerniaka, ale 5 razy mniej niż Photofrin II. Liczba adsorbowanych komórek zależy liniowo od ich początkowego stężenia w kulturze i adsorpcja pigmentu osiąga maksimum w czasie pierwszej godziny inkubacji (tabela 2). W nieobecności osocza Chla-L-Ser-OMe adsorbowana była około 15 razy lepiej niż Chla (nie pokazane).
Tabela 2 Adsorpcja komórkowa
Zależność od czasu dla Chla-L-Ser-OMe (2,7 x 10SM)
Czas, godziny Liczba cząsteczek Chla-L-Ser-OMe/komórkę
1,0 2.7 x 1)
1,5 1,3 x 108
2,0 1,3 x 1(}8
b) próba in vivo.
Chl lub Bchl rozpuszczony w 10% etanolu/PBS są wstrzykiwane dootrzewnie (i.p.). Jako grupy kontrolne wykorzystuje się myszy, które nie dostały zastrzyku, albo którym wstrzyknięto jedynie vehiculum. Fragmenty tkanki lub organów wewnętrznych (np. śledziony, wątroby, mózgu, etc) poddawane są sekcji, homogenizowane w acetonie i następnie odwirowywane. Stężenie pigmentów w sklarowanej cieczy określa się metodą spektroskopii fluorescencyjnej.
173 128
Przykład IX. Toksyczność pochodnych Chl i Bchl w stosunku do komórek czerniaka w kulturze
Efekt fotodynamiczny związków Chlidea i Chla-L-Ser-OMe na kulturę komórek czerniaka sprawdzony został następująco: Na komórki czerniaka M2R w postaci warstw monomolekularnych (do 100% zlewania) podziałano przez 30 minut pigmentami Chla, Chlidea i Chla-L-SerOMe. Następnie kultury naświetlano od góry przez 10 minut 5mW laserem diodowym GaAs przy 670 nm (źródło światła A), 150W lampą ksenonowa przy 5000 gEinsteinów/cm 2 (źródło B) lub 90W lampą halogenową przy 1500 gEinsteinów/cm2 (źródło C). Grupy kontrolne zawierały komórki niepoddane żadnej obróbce, komórki potraktowane pigmentami ale nienaświetlone oraz komórki nie potraktowane pigmentami ale naświetlone. Trzy godziny po naświetlaniu badano metodą mikroskopii z kontrastem fazowym zmiany w morfologii komórek wywołane naświetlaniem.
Cytologiczną aktywność różnych pochodnych Chl i Bchl wyznaczano oceniając ilość martwych komórek w monomolekularnym obszarze potraktowanym fotodynamicznie, drogą ich barwienia i mierzenia czerwonej fluorescencji po potraktowaniu Propidium Iodide ([jodek 2.7-dwuamino-9-fenvlo-10-(dwuetyloaminopropylo)fenatridinu - metodajddoowa] ) (PD)) , który jest wydzielany z komórek nienaruszonych/żywych i selektywnie gromadzony w jądrach komórek uszkodzonych. Badania fluorescencji jąder w barwionej kulturze dokonywano metodą mikroskopii fluorescencyjnej (Yeh, 1981). Wyniki przedstawione są w fig. 13 i 14. Jednakże, opierając się na mikroskopowych badaniach kultur komórkowych nie poddanych obróbce, metoda ta nie jest najodpowiedniejsza dla systematycznego, ilościowego śledzenia i oceny cytologicznej aktywności leków PDT, stosowanych do dużej liczby kultur komórkowych.
Alternatywnie, toksyczność fotodynamiczną oznaczano przez przyłączanie pH] tymidyny. W tym przypadku zmiany szybkości przyłączania [3H]tymidyny po procesie PDT dokonywano następująco: kultury komórek (4-5x 11) komórek przy 40-50% zlaniu, hodowanych w 10% osoczu płodu wołowego) pobudzono 1 g Ci/ml tymidyny [metylo JH] przez 2 godziny w 37°C. Następnie kultury dwukrotnie przemyto zimną solanką zbuforowaną fosforanami (PBS), podziałano na nie lodowato zimnym 7,5% kwasem trójchlorooctowym (TCA) przez 30 minut w 4°C i przemyto 2 razy etanolem. Następnie kultury rozpuszczano w 0,3 ml 1 M NaOH w 37°C przez 15 minut. 100 gl próbki zobojętniono 100 gl 1N HCl i 4 ml 0,1 M imidazolu i zliczono w 20:8 (obj/obj) scyntylatorze ksylenowym / mieszaninie Lumax. W doświadczeniu przedstawionym w fig. 11 A na komórki M2R działano coraz większymi stężeniami Chla-L-Ser-OMe i następnie naświetlano źródłem światła B. Jak można zauważyć, fotodynamiczne uszkodzenia wyrażają się w zależnym od dawki zmniejszeniu zdolności komórek do przyłączania [5H] tymidyny po upływie 24 godzin. Efekt jest całkowicie zależny od oświetlenia i nie występował w nie naświetlanej grupie kontrolnej i w grupie naświetlanej, a nie potraktowanej pigmentami. Podobne wyniki uzyskano z fibroblastami FS11 napletka ludzkiego (fig. 11B) i z ludzkimi komórkami raka piersi T47D (fig. 11C), przy użyciu źródła światła B. Rezultaty podano jako średnią +/odchylenie standardowe z trzech oznaczeń.
Efekt PDT określano również próbą klonogeniczną: 24 godziny po podziałaniu roztworami Chla-L-Ser-OMe o różnych stężeniach i po naświetlaniu przeprowadzanym w sposób opisany powyżej (fig. 11A), na komórki podziałano trypsyną i liczbę zdolnych do życia komórek określano przez wykluczenie zabarwionych na niebiesko. Przeprowadzono odpowiednie rozcieńczenie i 250 komórkami zaszczepiono każde wgłębienie płytki Costara z 6 wgłębieniami. Po 11-12 dniach wyssano pożywkę, kolonie drobnoustrojów utrwalono i zabarwiono fioletem krystalicznym w metanolu, po czym policzono liczbę kolonii (ponad 40 komórek na kolonię) pod mikroskopem sekcyjnym. Jak widać na wykresach fig. 12 leczenie fotodynamiczne zmniejszyło liczbę żywych komórek w stopniu zależnym od dawki Chla-L-Ser-OMe, czego nie obserwowano w ciemności lub w próbkach kontrolnych naświetlanych, ale nie poddawanych działaniu Chla-L-Ser-OMe. Porównanie wyników przedstawionych w fig. 11A i 12 wskazuje na dobrą korelację między tymi dwoma metodami. Rezultaty podano jako średnią +/- odchylenie standardowe z trzech oznaczeń.
Innymi metodami stosowanymi do oceny komórkowej cytolizy są: 1) oznaczanie cytolitycznej aktywności po wprowadzeniu [ 'H| adeniny do komórek, 2) oznaczanie cytolitycznej
173 128 aktywności po wprowadzeniu 51Cr i 3) wykrywanie obszarów martwych za pomocą techniki mikro-wideo. Podczas gdy stosowanie PID oparte jest na pochłanianiu barwnika fluorescencyjnego tylko przez uszkodzone komórki, metody 1 i 2 polegają na pochłanianiu radioaktywnego wskaźnika na etapie wstępnej inkubacji i uwalnianiu radioaktywności wywoływanym lekarstwem w drugim etapie. Te ostatnie dwie metody nadają się do wielokrotnych prób wymaganych dla szczegółowej oceny dziesiątek i setek próbek.
W figurze 13 pokazano dwa obszary na monomolekularnej warstwie komórek czerniaka inkubowanych przez 30 minut 4x10°M Chla-L-Ser-OMe. Obszar A (fig. 13, lewa strona) był naświetlony (źródło światła A), podczas gdy obszar B utrzymywano w ciemności. Naświetlone komórki wyglądają na wyraźnie skurczone, zmniejszył się ich kontakt z podłożem płytki, a ich błona komórkowa jest fragmentaryczna i nieregularna. Mikroskopia fluorescencyjna PID tych samych kultur (fig. 13, po prawej) pokazuje, że uszkodzenia komórek ograniczają się do obszaru potraktowanego fotodynamicznie i że jest korelacja 1:1 pomiędzy zmianami morfologicznymi i śmiercią komórek, ponieważ jądra żywych komórek nie wykazują żadnej fluorescencji pochodzącej od PID (porównaj obszary A i B w fig. 13, po lewej i prawej stronie). Większe powiększenie zewnętrznego brzegu naświetlonej strefy pokazuje potraktowane PID i naświetlone komórki z fluoryzującym jądrem oraz sąsiadujące nienaświetlone kontrolne komórki o normalnej morfologii i niezabarwionym jądrze (fig. 14). Nie wykryto żadnych uszkodzeń kontrolnych komórek, nie leczonych, ale naświetlanych (fig. 15). Podobne zmiany morfologii zaobserwowano po 10 minutowym naświetlaniu komórek czerniaka, inkubowanych 4x10’°M Chlidea (nie pokazane).
Przykład X. Leczenie myszy związkami Chl i Bchl
a) wszczepienie guza
Komórki są zwykle hodowane jako monowarstwy. Komórki zdrapuje się bagietką z gumką i wytwarza się ich zawiesinę w solance. 1x10° komórek/0,1 ml wstrzykuje się podskórnie w bok lub brzuch samca białej myszy C57B1 lub CD1. Po około 3-5 tygodniach guz staje się widoczny. Guzy te mogą osiągnąć masę około 10 g, 7-8 tygodni po wszczepieniu. Podobną procedurę używa się w przypadku implantowania białym myszom czerniaka myszy M2R lub czerniaka ludzkiego (czerniak FO/1, MRI/H/221, HS695T lub SK/MEL/28);
b) wstrzykiwanie i naświetlanie
Wstrzykiwano myszom 20 mg/kg pochodnych Chl i Bchl w 10% roztworze etanolu w PBS. Po 5 godzinach naświetlano guz przez 1 godzinę. Myszom kontrolnym wstrzykiwano roztwór etanolu w PBS i naświetlano je przez 1 godzinę lub wstrzykiwano pochodną Chl lub Bchl i trzymano w ciemności;
c) 24 godziny po naświetlaniu myszy zabijano przez skręcenie karku i guzy poddawano standardowej histologicznej sekcji;
d) toksyczność związków serynowych Chla-L-Ser-OMe i Bchla-L-Ser-OMe u myszy C57B1 w normalnych warunkach hodowlanych bez naświetlania określono przez wstrzykiwanie związku rozpuszczonego w 10%o etanolu w PBS. Myszom kontrolnym wstrzykiwano jedynie vehiculum. Stwierdzono, że wstrzykiwanie do 40 mg/kg wagi ciała nie ma zauważalnego wpływu na zachowanie i stan zdrowia myszy w czasie do 14 dni. Ta dawka lekarstwa była jednak o wiele wyższa od maksymalnej, stosowanej przy leczeniu;
e) przetestowano skórną toksyczność cytologiczną u myszy potraktowanych Chla-L-SerOMe, powodowaną zogniskowanym naświetlaniem (5 mW Ga/As laser diodowy 670 nm). Związki Chl/Bchl (20 mg/kg) w 10% etanolu w PBS wstrzyknięto (i.v.) białym myszom i 24 godziny później naświetlano przez 4 godziny. Myszom kontrolnym (i) wstrzyknięto roztwór etanolu w PBS i trzymano w ciemności, (ii) naświetlano bez wstrzykiwania przez 4 godziny (źródło światła A). 24 godziny po naświetlaniu myszy zabijano przez skręcenie karku. Guzy poddano standardowej sekcji histologicznej. Stwierdzono (fig. 14), że naświetlanie skóry zwierząt doświadczalnych wywołały zmiany miejsc naświetlonych, w postaci martwicy tkanki (NC) przez skórę, naskórek i podskórną warstwę tłuszczu (SF). Na wyraźną odpowiedź immunologiczną wskazuje przenikanie leukocytów (LU) w region znajdujący się bezpośrednio pod obszarem martwicy. Nienaświetlona skóra sąsiadująca z obszarem naświetlonym wygląda normalnie. Żadnych oznak podrażnienia skóry nie obserwowano w grupie kontrolnej (nie pokazane);
173 128
f) fotodynamiczne leczenie czerniaka MR2 za pomocą Bchla-L-Ser-OMe;
50-150 μg Bchla-L-Ser-OMe w 0,05 ml mieszanki etanolu z solanką 1:1 wstrzyknięto białej myszy CD 1 pod narkozą (Nembuta,, 6,0 mg/kg) w okolice wszczepionego wcześniej guza o średnicy 5-6 mm. Zastrzyk wykonano przez wbicie igły 10-15 mm od guza i dostarczenie lekarstwa do nowotworu od wewnątrz, bez naruszania zewnętrznej części guza. Następnie naświetlano przez 60 minut miejsce nowotworu uśpionej myszy lampą halogenową z intensywnością 19000 gEinstenów/cm2. Średnica naświetlonego miejsca wynosiła 9 mm, pokrywając wyłącznie obszar nowotworu. Obserwację zmian struktury i rozmiarów nowotworu wykonywano przez kilka tygodni, przy wykorzystaniu obrazu uzyskiwanego za pomocą rezonansu magnetycznego (MRl). Różnice kształtu guza nowotworowego przed i po leczeniu przedstawiono w fig. 17. Nowotwór wszczepiony w klatkę piersiową w pobliżu łopatki jest wyraźnie widoczny przed leczeniem jako jasna struktura (T) z wysokim sygnałem MRI. Po 84 godzinach nowotwór praktycznie zanikł. Dwa tygodnie później pojawił się mały nawrót (fig. 17B). W wyniku drugiego leczenia (naświetlanie Bchl-L-Ser-OMe) po 3 tygodniach nie pojawił się żaden nawrót (fig. 17C);
g) oszacowano czas pozostawania Chla-L-Ser-OMe w różnych tkankach, organach i guzach leczonej białej i czarnej myszy. Chla-L-Ser-OMe w etanolu w PBS wstrzyknięto (i.p.) samcom myszy C57B1 oraz samcom i samicom myszy CD1 (20 mg/kg, przeciętnie 5-10 myszy). Próbki tkanek (tłuszcz, muskuły, skóra, krew), nienaruszone organy (śledziona, wątroba, mózg, płuca, serce, etc.) i guz usunięto, zhomogenizowano w acetonie i odwirowano. Stężenie pigmentu w cieczy oznaczono metodą spektroskopii fluorescencyjnej. Zawartość Chla-L-Ser-OMe w guzie i w różnych tkankach i organach po 12 godzinach pokazano w fig. 18.
173 128
173 128
Fig. 2
a) Struture of Chllorophyll a and the IUPAC numbering system
Wzór strukturalny chlorofilu i system numeracji według IUPAC
Fig. 3
Bchla Bchlidea Bpheoa
M = Mg Mg 2H
R = Phytyl H Phytyl
b) Structure of Bacteriochiorophylł a .Wzór strukturalny bakteripfilu a
173 128
/Ν ω
ω
X ο
Ν
03 X
S 2
Ο I «Μ
ο X X
ο -ϋ- ο
>» ό»
Ł.
X
173 128
Itanoueters ihnotssters
173 128 (a)
A b
o 0.4 r b a n c
5.2· (b)
A , b 1.05 o p b a s c a
400.....455’
Λ l'\
5v0
555
A, Hanoaeters ένΟ
-.-r—
500
ιτγτ:i1 ί i ·τ .. 111. <. r,. i. i'. 11 -i.,, 11.,,,, n
350 4θό 450 δ0θ 550
Haiioaeters
Γ.ΤΤ'ί '- I Ί 111 .1 . U Ί I |?i r. l.\ fr Ujl
600 650 700
0,6( (c)
A b 5 0 «1 b a a c yJ
0,4-3/ r\ 'ίί1. i).i :r.'i . 11.'11·. ι ί ,, ,·|.. iT^-J.T.Trr; «»τ··ιτ! -τ, Ί1·.ι, ί·.τ.~<; ., ι
400 ίίο 500 550 ÓOO 650 700
X MaMnete?5
ΤΓ7Τ*Τ7ΤΤ
Fig- 6
173 128
Fig. /
173 128
Fig. £
173 128
Fig.
Fig. 40
173 128 £<< rj cc 3 O ε °>,cc χ O 43 u ωΞ •H 'j-* £ ~z. N ~ O r-\
Pd —
N > Ł. -A αίΤ t3
O. 8000 o
“J of contro!
Ξ OARK Ul LiGHT >,B) (A)
Z
O >>·τ £ < •h n* >,QC Λ O -P u φΞ i-ł
S ω
CO —? N _ n >: p x εχ ρCHL-SER (1 0 -6M) x
r>
ε 400Ω.
9) 4 śsKŚias^, % o/ contro!
D dark ίϋ LlGhT <B) (B)
Z o
•S X a O
S % 5 CC £ o -p oj z cu — ♦cd £ LU co 2Z N — υ Q ccT _ Pd V >> £ n >: Ł. X
CO f—
HO
1 2.5
CHL-SER(x10 δ M) £ 1000
?. of ccntrol
0.5
OARK
LIGHT (B) fc)
CHL-SER(xl0 “ 0 1Ί)
Fig. 4Ą
173 128
Wpływ PDT na proliferację komórek czerniaka. Wydajność klonowania
THE EFFECT OF PDT ON PROLIFERAT1CN OF M2R MELANOMA CELLS CLONłNO EFF1C1ENCY
Liczba klonów
NUMBER OF CLONES
0.5 1 25
CHL-SER
Fig. U
173 128
Fig.. 13
Fig. W
Fig. 4 5
173 128
Fig.
173 128 fi
Fig. 4?
to
Organ - Organy
1. serce, 2. wątroba, 3. płuca,
4. śledziona, 5. nerki, 6. mózg,
7. skóra, 8. jądra, Fig‘
9. krew, 10. mięśnie, 11. tłuszcz,
12. nowotwór.
173 128
173 128
OOgH CO2Η
Haemaioporphyrin \Hp)
R1 = R2=CH{OH)CH3
Fig. 1
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz
Cena 4,00 zł

Claims (11)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sposób wytwarzania nowych pochodnych chlorofilu i bakteriochlorofilu o wzorze X-COOR, w którym X-CO- oznacza resztę C17 propionylową chlorofilu (Chi) lub bakteriochlorofilu (Bchl), a R oznacza resztę aminokwasową, peptydową lub białkową albo ich pochodne, na drodze enzymatycznej transestryfikacji, znamienny tym, że enzymatycznej transestryfikacji poddaje się fitylowy ester Chi lub Bchl o wzorze X-COOfityl z aminokwasem, peptydem lub białkiem zawierającymi grupę hydroksylową lub z ich pochodnymi o wzorze R-Oh, w którym R oznacza resztę aminokwasową, peptydową lub białkową albo ich pochodne, w obecności enzymu chlorofilazy, po czym uzyskany produkt wyodrębnia się z mieszaniny reakcyjnej.
  2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że początkowo inkubuje się chlorofilazę ze związkiem R-OH, a następnie mieszaninę reakcyjną dalej inkubuje się z estrem o wzorze X-COOfityl, po czym ekstrahuje się z mieszaniny reakcyjnej ester o wzorze X-COOR.
  3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że związkiem o wzorze R-OH jest aminokwas lub jego pochodna.
  4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że związkiem o wzorze R-OH jest ester aminokwasu.
  5. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że związkiem o wzorze R-OH jest ester L-serynometylowy (L-Ser-OMe).
  6. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że związkiem o wzorze R-OH jest ester N-trytylo-L-serynometylowy (Tri-Ser-OMe).
  7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że związkiem o wzorze R-OH jest ester peptydu.
  8. 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że związkiem o wzorze R-OH jest ester karbobenzoksyseryloserynometylowy (Z-Ser2-OMe).
  9. 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że wytwarzaną pochodną jest 3-0-(1-0-metylo)-L-serylochIorofilid a (Chla-L-Ser-OMe), przy czym początkowo inkubuje się acetonowy proszek chlorofilazy z chlorowodorkiem estru metylowego L-seryny w roztworze buforowym zawierającym detergent, następnie dodaje się ester fitylowy chlorofilu (Chla) i dalej prowadzi się inkubację mieszaniny reakcyjnej, po czym po usunięciu osadu stałego proszku acetonowego ekstrahuje się produkt Chla-L-Ser-OMe i oczyszcza się go chromatograficznie.
  10. 10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wytwarzaną pochodną jest 3-0-( 1 -0-metylo)-L-serylobakteriochlorofilid a (Bchla-L-Ser-OMe), przy czym początkowo inkubuje się acetonowy proszek chlorofilazy z chlorowodorkiem estru metylowego L-seryny w roztworze buforowym zawierającym detergent, następnie dodaje się ester fitylowy bakteriochlorofilu (Bchla) i dalej prowadzi się inkubację mieszaniny reakcyjnej, po czym po usunięciu osadu stałego proszku acetonowego ekstrahuje się produkt Bchla-L-Ser-OMe i oczyszcza się go chromatograficznie.
  11. 11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wytworzony związek o wzorze X-COOR, poddaje się dalszej reakcji z peptydem zawierającym grupę OH lub SH, albo z jego pochodną wybraną spośród estrów i pochodnych, w których atom N jest chroniony grupami karbobenzoksy, trytylową i tert-butoksykarbonylową, przy czym jeśli A jest wiązaniem kowalencyjnym, to Y oznacza O lub S, albo z białkiem, będącym specyficznym ligandem komórek, w wyniku czego otrzymuje się związek o wzorze X-COOR-R', w którym R' oznacza resztę wspomnianego peptydu lub białka.
    * * *
    173 128
PL93319910A 1992-07-26 1993-07-26 Sposób wytwarzania nowych pochodnych chlorofilu i bakteriochlorofilu PL173128B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IL102645A IL102645A (en) 1992-07-26 1992-07-26 Chlorophyll and bacteriochlorophyll derivatives, their preparation and pharmaceutical compositions comprising them

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PL173128B1 true PL173128B1 (pl) 1998-01-30

Family

ID=11063865

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL93299803A PL173150B1 (pl) 1992-07-26 1993-07-26 Nowe pochodne chlorofilu i bakteriofilu oraz sposób otrzymywania tych pochodnych
PL93319910A PL173128B1 (pl) 1992-07-26 1993-07-26 Sposób wytwarzania nowych pochodnych chlorofilu i bakteriochlorofilu

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL93299803A PL173150B1 (pl) 1992-07-26 1993-07-26 Nowe pochodne chlorofilu i bakteriofilu oraz sposób otrzymywania tych pochodnych

Country Status (16)

Country Link
US (3) US5726169A (pl)
EP (1) EP0584552B1 (pl)
JP (1) JP3612343B2 (pl)
CN (1) CN1040212C (pl)
AT (1) ATE196850T1 (pl)
AU (1) AU674315B2 (pl)
CA (1) CA2101227C (pl)
DE (1) DE69329538T2 (pl)
DK (1) DK0584552T3 (pl)
ES (1) ES2153367T3 (pl)
GR (1) GR3035195T3 (pl)
HU (1) HU221186B1 (pl)
IL (1) IL102645A (pl)
PL (2) PL173150B1 (pl)
PT (1) PT584552E (pl)
ZA (1) ZA935310B (pl)

Families Citing this family (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6147195A (en) * 1993-07-26 2000-11-14 Yeda Research And Development Co., Ltd. Chlorophyll and bacteriochlorophyll derivatives, their preparation and pharmaceutical compositions comprising them
IL116126A0 (en) 1995-11-24 1996-01-31 Yeda Res & Dev Process for the preparation of bacteriochlorophyllis some novel compounds of this type and pharmaceutical compositions comprising them
GB9625895D0 (en) * 1996-12-13 1997-01-29 Riley Patrick A Novel compound useful as therapeutic agents and assay reagents
CN1074771C (zh) * 1996-12-30 2001-11-14 中国科学院长春应用化学研究所 聚合物载体茂金属催化剂的制备
WO1998030102A1 (en) * 1997-01-09 1998-07-16 Emory University Non-iron metalloporphyrins and methods of use
DE19731741A1 (de) * 1997-07-23 1999-01-28 Deutsches Krebsforsch Konjugat zur Unterscheidung von krankhaftem und gesundem Gewebe
US6652836B2 (en) 1998-10-15 2003-11-25 Fluoroprobe, Inc. Method for viewing tumor tissue located within a body cavity
US6299860B1 (en) 1998-10-15 2001-10-09 Fluoro Probe, Inc. Method for viewing diseased tissue located within a body cavity
US6284223B1 (en) * 1998-10-15 2001-09-04 Fluoroprobe, Inc. Method for viewing tumor tissue located within a body cavity
EP1137411B1 (en) 1998-12-09 2006-12-06 YEDA RESEARCH AND DEVELOPMENT Co. LTD. Palladium-substituted bacteriochlorophyll derivatives and use thereof
IL133253A0 (en) * 1999-12-01 2001-04-30 Yeda Res & Dev Chlorophyll and bacteriochlorophyll esters, their preparation and pharmaceutical compositions comprising them
US7045117B2 (en) * 1999-12-01 2006-05-16 Yeda Research And Development Co. Ltd. Method for tumor diagnosis comprising administering of palladium-substituted bacteriochlorophyll derivatives
US20020049247A1 (en) * 2000-01-12 2002-04-25 Chen James C. Novel treatment for eye disease
US7235685B2 (en) * 2001-07-03 2007-06-26 Mallinckrodt, Inc. Aromatic sulfenates for type I phototherapy
US20020169107A1 (en) * 2001-01-19 2002-11-14 Mallinckrodt Inc. Novel aromatic azides for type I phototherapy
US7183319B2 (en) * 2000-07-26 2007-02-27 Patrick Anthony Riley Phenylethylamine derivatives and their use in the treatment of melanoma
EP1318807A4 (en) * 2000-08-11 2008-02-20 Ceramoptec Gmbh LIGHT-SENSITIVE OINTMENT
AU2006200164B2 (en) * 2001-04-09 2007-03-08 Oncofluor, Inc. Method for viewing tumor tissue located within a body cavity
IL148921A0 (en) * 2002-03-26 2002-09-12 Peptor Ltd Photo active backbone cyclized somatostatin analogs for optical imaging and photodynamic therapy
AU2003230164B2 (en) 2002-05-08 2008-05-01 Yeda Research And Development Co. Ltd. Sensitized online BOLD-MRI imaging method
IL152900A0 (en) * 2002-11-17 2003-06-24 Yeda Res & Dev Water-soluble bacteriochlorophyll derivatives and their pharmaceutical uses
GB0323358D0 (en) * 2003-10-06 2003-11-05 Green Grass Design Ltd Novel compounds and processes
DK1753457T3 (en) * 2004-06-07 2016-12-05 Yeda Res & Dev Cationic bakterieklorofylderivater and uses
US7947827B2 (en) * 2006-06-30 2011-05-24 State Of Oregon Acting By And Through The State Board Of Higher Education On Behalf Of Oregon State University Pharmaceutical formulation comprising a metaloporphyrin and method for its purification and use
RU2450018C2 (ru) * 2006-08-23 2012-05-10 Йеда Рисерч Энд Диверлопмент Ко. Лтд Конъюгаты rgd-пептидов и фотосенсибилизаторов порфирина или (бактерио)хлорофилла и их применение
US9957293B2 (en) 2006-08-23 2018-05-01 Yeda Research And Development Company Ltd. Conjugates of RGD peptides and porphyrin or (bacterio)chlorophyll photosynthesizers and their uses
US8463365B2 (en) 2007-09-19 2013-06-11 Oncofluor, Inc. Method for imaging and treating organs and tissues
RU2347563C1 (ru) * 2007-11-21 2009-02-27 Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского" Способ селективного разрушения меланомы
FR2924021B1 (fr) * 2007-11-27 2010-08-13 Du Vernet Michele Eymard Composition pour le traitement de la peau par therapie photodynamique
EP2244787A1 (en) * 2008-01-28 2010-11-03 Yeda Research And Development Company Ltd. Endoscopic imaging photodynamic therapy system and methods of use
CA2716509A1 (en) * 2008-02-22 2009-08-27 Clinuvel Pharmaceuticals Limited Method for treatment of photosensitivity and phototoxicity
CA2717060C (en) 2008-02-27 2016-11-01 Avigdor Scherz Rgd-(bacterio)chlorophyll conjugates for photodynamic therapy and imaging of necrotic tumors
IN2014CN02153A (pl) 2011-08-23 2015-05-29 Yeda Res & Dev
EP2934303B1 (en) 2012-12-19 2019-09-04 The Research Foundation for the State University of New York Compositions and method for light triggered release of materials from nanovesicles
BR112015030233A2 (pt) * 2013-06-05 2017-07-25 Hafezi Farhad método de aplicação de uma composição e composição farmacêutica com um regime de administração da mesma
RU2536109C1 (ru) * 2013-07-25 2014-12-20 федеральное государственное бюджетное учреждение "Межотраслевой научно-технический комплекс "Микрохирургия глаза" имени академика С.Н. Федорова" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ комбинированной обработки склерального ложа после эндорезекции внутриглазного новообразования
RU2536116C1 (ru) * 2013-07-25 2014-12-20 федеральное государственное бюджетное учреждение "Межотраслевой научно-технический комплекс "Микрохирургия глаза" имени академика С.Н. Федорова" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ фотодинамической обработки склерального ложа после эндорезекции внутриглазного новообразования
SG10201506686WA (en) * 2015-08-24 2017-03-30 Agency Science Tech & Res Conjugates
CN111171030B (zh) * 2018-11-12 2022-11-22 浙江海正药业股份有限公司 细菌叶绿素衍生物及其制备方法
CN115093422B (zh) * 2022-06-15 2023-06-20 西北工业大学 一种基于代谢标记策略的新型光敏剂及其制备方法和应用
CN116585530B (zh) * 2023-05-05 2024-02-02 暨南大学 一种高效产氧的叶绿体复合水凝胶及其制备方法与应用
CN120005963B (zh) * 2025-02-28 2025-11-07 青岛农业大学 一种快速计数牛奶中菌落总数的方法及染色试剂组合

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5156840A (en) * 1982-03-09 1992-10-20 Cytogen Corporation Amine-containing porphyrin derivatives
US4977177A (en) * 1985-04-30 1990-12-11 Nippon Petrochemicals Company, Ltd. Tetrapyrrole polyaminomonocarboxylic acid therapeutic agents
HU204856B (en) * 1987-08-12 1992-02-28 Orszagos Mueszaki Fejlesztesi Process for releasing cell mixtures and tissues from undesired populations and for producing monoclonal antibody - hematoporphyrin conjugates
US4876190A (en) * 1987-10-21 1989-10-24 Becton Dickinson & Company Peridinin-chlorophyll complex as fluorescent label
DE68928607T2 (de) * 1988-07-14 1998-07-23 Toyohakka Kogyo K K Porphyrinderivate
US5002962A (en) * 1988-07-20 1991-03-26 Health Research, Inc. Photosensitizing agents
US5567687A (en) * 1989-03-06 1996-10-22 University Of Texas Texaphyrins and uses thereof
US5171741A (en) * 1989-04-21 1992-12-15 Health Research, Inc. Bacteriochlorophyll-a derivatives useful in photodynamic therapy
US5238940A (en) * 1990-03-22 1993-08-24 Quadra Logic Technologies Inc. Compositions for photodynamic therapy
DE4121876A1 (de) * 1991-07-02 1993-01-14 Scheer Hugo Modifizierte bakteriochlorophylle, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
US5330741A (en) * 1992-02-24 1994-07-19 The Regents Of The University Of California Long-wavelength water soluble chlorin photosensitizers useful for photodynamic therapy and diagnosis of tumors

Also Published As

Publication number Publication date
CA2101227C (en) 2002-11-12
ATE196850T1 (de) 2000-10-15
DE69329538T2 (de) 2001-06-07
PL299803A1 (en) 1994-02-07
GR3035195T3 (en) 2001-04-30
US5955585A (en) 1999-09-21
US5726169A (en) 1998-03-10
HUT64949A (en) 1994-03-28
EP0584552A3 (en) 1994-08-17
DK0584552T3 (da) 2001-02-05
AU4214893A (en) 1994-01-27
EP0584552B1 (en) 2000-10-11
CA2101227A1 (en) 1994-01-27
DE69329538D1 (de) 2000-11-16
EP0584552A2 (en) 1994-03-02
US5650292A (en) 1997-07-22
IL102645A0 (en) 1993-01-14
JP3612343B2 (ja) 2005-01-19
AU674315B2 (en) 1996-12-19
CN1040212C (zh) 1998-10-14
HU221186B1 (en) 2002-08-28
PT584552E (pt) 2001-04-30
CN1088210A (zh) 1994-06-22
JPH0733772A (ja) 1995-02-03
ZA935310B (en) 1994-02-11
ES2153367T3 (es) 2001-03-01
PL173150B1 (pl) 1998-01-30
IL102645A (en) 1998-02-22
HU9302149D0 (en) 1993-10-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL173128B1 (pl) Sposób wytwarzania nowych pochodnych chlorofilu i bakteriochlorofilu
JP5555659B2 (ja) 水溶性陰イオン性バクテリオクロロフィル誘導体及びそれらの使用
EP1246826B1 (en) Chlorophyll and bacteriochlorophyll esters, their preparation and pharmaceutical compositions comprising them
Fingar et al. The effects of photodynamic therapy using differently substituted zinc phthalocyanines on vessel constriction, vessel leakage and tumor response
HK1040638B (en) Palladium-substituted bacteriochlorophyll derivatives and use thereof
US6740637B1 (en) Chlorophyll and bacteriochlorophyll derivatives, their preparation and pharmaceutical compositions comprising them
RU2183635C2 (ru) Сульфозамещенные фталоцианины как фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии
Zuk et al. PHARMACOKINETIC AND TISSUE DISTRIBUTION STUDIES OF THE PHOTOSENSITIZER bis (DI‐ISOBUTYLOCTADECYLSILOXY) SILICON 2, 3‐NAPHTHALOCYANINE (isoBOSINC) IN NORMAL AND TUMOR‐BEARING RATS
Zhao et al. In vitro and in vivo evaluation of a chlorin-based photosensitizer KAE® for cancer treatment
CA2172607C (en) Phorbine derivatives and their use in the diagnosis and therapy of cancer
EP1628958B1 (en) Amphiphilic trisulfonated porphyrazines for photodynamic applications in medicine
Cook et al. Highly substituted phthalocyanine derivatives as potential photosensitizers for photodynamic therapy of tumors
HK1081858B (en) Water-soluble anionic bacteriochlorophyll derivatives and their uses

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20080726