PL173321B1

PL173321B1 - Środek biologicznie aktywny i sposób wytwarzania środka biologicznie aktywnego

Info

Publication number: PL173321B1
Application number: PL93308535A
Authority: PL
Inventors: Aleksander N. Nikołajenko; Dymitrij B. Szoroch; Aleksander A. Szewczenko
Original assignee: Nikolaenko Alexsandr Nikolaevi
Priority date: 1992-07-21
Filing date: 1993-07-20
Publication date: 1998-02-27
Also published as: PL308535A1; MD839F1; BG99446A; HU9500410D0; ATE214283T1; BG61680B1; AU4767693A; EP0673652A4; EP0673652A1; DE69331704D1; CA2149146A1; HUT73378A; EP0673652B1; MD839G2; DE69331704T2

Abstract

1. Srodek biologicznie aktywny na bazie rozpuszczalnych w wodzie zwiazków organicznych, bedacych produktami hydrolizy skladników rozdrobnionej tkanki zwierzecej, znamienny tym, ze w sklad produktów hydrolizy wchodza termostabilne przy Tn= 120°C, maloczasteczkowe komponenty morfoplazmy i glikoka liksu komórek o wzglednej masie czasteczkowej = 10 000, zmodyfikowane podczas procesów embriogene zy, i/lub proliferacji, i/lub zróznicowania komórek, i/lub patologii, poprzedzajacej, i/lub towarzyszacej regeneracji, i/lub reperacji tkanki 8. Sposób wytwarzania srodka biologicznie aktywnego, zawierajacego produkty hydrolizy skladników rozdrobnionej tkanki zwierzecej, w sklad których wchodza termostabilne przy Tn<120°C maloczasteczkowe komponenty morfoplazmy i glikokaliksu komórek o wzglednej masie czasteczkowej = 10 000, w którym dokonuje sie rozdrabniania przeplukanego surowca z tkanki zwierzecej, hydrolizy otrzymanych skladników z nastepnym wydzieleniem produktów hydrolizy, ich filtracja i wydzieleniem produktu koncowego w postaci klarownej cieczy, znamienny tym, ze jako surowiec wykorzystuje sie tkanke zwierzeca, zmodyfikowana podczas procesów embnogenezy i/lub proliferacji, i/lub zróznicowania komórek, i/lub patologii, poprzedzaja- cej, i/lub towarzyszacej regeneracji, i/lub reperacji tkanki, przy czym tkanki rozdrabnia sie az do uszkodzenia komórek, ekstrahuje sie ich zawartosc droga dodatkowego przeplukiwania z filtracja, i/lub odwirowaniem z przyspieszeniem 300-15 000 g w ciagu 10-20 min, po czym przemyte tkanki poddaje sie homogenizacji w roztworze fizjologicznym, i/lub buforowym, homogenizat oczyszcza sie z nienaruszonych elementów tkanki przez filtracje, i/lub odwirowanie z przyspieszeniem 150-250 g w ciagu 10-15 min, ciecz nadosadowa poddaje sie hydrolizie, po której hydrolizat odwirowuje sie, z wydzieleniem klarownej cieczy zawierajacej skladniki z komponentami morfoplazmy i glikokaliksu komórek. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest środek biologicznie aktywny na bazie rozpuszczalnych w wodzie związków organicznych, będących produktami hydrolizy składników rozdrobnionej tkanki zwierzęcej.

173 321

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania środka biologicznie aktywnego, posiadającego właściwość immunomodulującą, w którym dokonuje się rozdrabniania przepłukanego surowca z tkanki zwierzęcej, hydrolizy otrzymanych składników z następnym wydzielaniem produktów hydrolizy, ich filtracją i wydzielaniem produktu końcowego w postaci klarownej cieczy.

Wynalazek dotyczy przemysłu chemicznego i farmaceutycznego, a mianowicie dziedziny otrzymywania środków bilogicznie aktywnych, posiadających oddziaływanie immunomodulujące, dla wykorzystania w medycynie i weterynarii celem normalizacji stanu fizjologicznego organizmu człowieka i zwierząt, szczególnie, celem podwyższenia uodporniania i produkcjności zwierząt gospodarskich.

Środek biologicznie aktywny według wynalazku należy do substancji pochodzenia zwierzęcego i zawiera związki organiczne.

Różnego rodzaju zaburzenia patologiczne w organizmie człowieka i zwierząt powodują odchylenie od normy parametrów stanu fizjologicznego. W podobnych wypadkach lecznicze oddziaływanie na organizm, w tym oddziaływanie profilaktyczne, polega na stabilizacji, czyli na podtrzymywaniu w normie wskazanych parametrów lub (w wypadku ich odchylenia od normy) w takim oddziaływaniu na organizm, przy którym wspomniane parametry są normalizowane.

Grupa wynalazków dotyczy środka biologicznie aktywnego, oraz sposobu jego otrzymywania.

Normalizacja stanu fizjologicznego organizmu człowieka i zwierząt może być dokonywana w dwóch kierunkach: po pierwsze, drogą bezpośredniego oddziaływania na patologię i, po drugie, drogą pośredniego oddziaływania na systemy, organy i tkanki organizmu, odpowiadające za podtrzymywanie w normie parametrów homeostazy.

Wprowadzenie preparatów hormonalnych, mediatorów, czynników wzrostu, terapia chemiczna oraz podobne środki zapewniają bezpośrednie oddziaływanie na komórki drogą recepcji. Na przykład, podczas leczenia cukrzycy stosuje się insulinę, która uzupełnia funkcjonalną wadę trzustki. W wypadku zaburzenia funkcjonalnej aktywności systemu nerwowego używa się neuromediatorów, sprzyjających normalizacji granicznej czułości neuronów i, odpowiednio, polepszeniu przekazywania bodźców nerwowych. W przypadkach zaburzenia funkcjonalnej aktywności systemu odpornościowego organizmu wykorzystuje się immunomediatory, korelacjonujące odpowiedź systemu odpornościowego itd;

Podczas oddziaływania na organizm, leczenie chorób dokonuje się dzięki zmobilizowaniu zasobów wewnętrznych organizmu. Na przykład, podczas przebiegu procesów związanych z regeneracją organów i tkanek, z ich rehabilitacją i restytucją ich funkcji, jak również w przypadkach procesów zapalnych i zakaźnych, pobudzana jest działalność systemu odpornościowego organizmu. Dzięki temu następuje polepszenie zdolności odpornościowej i w wyniku tego, polepszenie ogólnego stanu organizmu.

Z opisu patentowego FR-A-2413912 znany jest środek biologicznie aktywny na podstawie tkanki zarodkowej, posiadający właściwość immunomodulującą, przywracający stan fizjologiczny organizmu i regulujący przemianę komórek. Wspomniany środek biologicznie aktywny (dalej - ŚBA) jest wyprodukowany ze składników rozdrobnionej i zhomogenizowanej tkanki zwierzęcej, wydzielonej z zarodków, zmieszanej z surowicą fizjologiczną.

Wskutek obecności czynnika immunomodulującego, środek ten posiada stosunkowo wysoką właściwość immunomodulującą, dzięki czemu jego wykorzystanie zapewnia normalizację stanu fizjologicznego organizmu, w tym leczenie, oraz podwyższenie produkcyjności zwierząt w porównaniu z grupą kontrolną o 5-15%.

Skuteczność działania znanego ŚBA jednakże jest niedostateczną w wyniku tego, że obok czynników immunomodulujących zawiera on immunodepresatory, przeszkadzające wystąpieniu pełnego efektu immunomodulującego. W istocie właściwość immunomodulującą tego środka jest działaniem sumarycznym, który jest wynikiem jednoczesnej obecności czynników immunostymulujących i depresatorów. W ten sposób faktycznie aktywność specyficzna znanego ŚBA, zależąc od stosunku stężenia czynników immunomodulujących i depresatorów, jest porównawczo nieduża wskutek znacznego stężenia depresatorów w jego składzie.

173 321

Drugą wadą wspomnianego ŚBA jest podwyższona zawartość związków wielkocząsteczkowych będących immunogenami, co powoduje pojawienie się ubocznych reakcji immunologicznych (alergia, hiperwrażliwość opóźnionego typu itd.).

W znacznym stopniu wady wspomnianego wyżej ŚBA zależą od sposobu jego wytwarzania, w którym proces technologiczny kończy się operacją rozdrabniania i homogenizacji surowca z tkanki pochodzenia zwierzęcego, co nieuchronnie powoduje obecność wjego składzie znacznej ilości depresatorów i związków wielkocząsteczkowych.

Z opisu patentowego EP-A-0249563 znany jest również ŚBA, posiadający właściwość immunomodulującą, dla normalizacji stanu fizjologicznego organizmu, wytwarzany ze składników rozdrobnionej i zhomogenizowanej tkanki, wydzielony w postaci ekstraktu tkanek zarodkowych narządów zwierząt.

Sposób jego otrzymywania polega na rozdrabnianiu i homogenizacji surowca z tkanki zwierzęcej, następnego usunięcia związków nierozpuszczalnych i wykorzystania ekstrahowanych rozpuszczonych substancji jako produktu końcowego (EP-A-0249563).

Aktywność specyficzna środków, otrzymanych za pomocą opisanej wyżej metody, która jest określana wynikowym stosunkiem efektów immunostymulacji i immunoinhibicji, również nie jest dostateczną. Jest to tłumaczone tym, że sposób otrzymywania znanego ŚBA w postaci ekstraktu przewiduje wykorzystanie tylko białek rozpuszczalnych, a białka strukturalne są usuwane, co istotnie obniża zawartość czynników immunostymulujących.

Oprócz tego, znany ŚBA również zawiera w swoim składzie związki wielkocząstkowe, które powodują uboczne reakcje immunologiczne organizmu.

Z opisu patentowego SU-A-1442064 znany jest również ŚBA na podstawie składników rozdrobnionej i homogenizowanej tkanki pochodzenia zwierzęcego, otrzymany w postaci ekstraktu termostabilnych komponentów tkanki narządów immunokompetencyjnych (grasica, śledziona, węzły chłonne) lub tkanek hormonowytwarzających (łożysko) dla normalizacji stanu fizjologicznego organizmu, w tej liczbie dla podwyższenia uodporniania i produkcyjności zwierząt gospodarczych.

Znany ŚBA jest przeznaczony dla regulacji odpornościowego T-systemu i praktycznie nie powoduje ubocznych reakcji immunologicznych przy jego wykorzystaniu (alergia, hiperwrażliwość opóźnionego typu itd.). W porównaniu z już rozpatrzonymi ŚBA, jego aktywność specyficzna jest wyższa kosztem większej zawartości czynników immunostymulujących.

Jednak wykorzystanie tego środka celem normalizacji stanu fizjologicznego organizmu jest ograniczone w związku z jego naturą mediatomą i/lub hormonalną, która nie dopuszcza do przedawkowania z powodu zagrożenia zaburzenia. parametrów homeostazy organizmu.

Bardziej bezpieczny w zastosowaniu jest ŚBA dla normalizacji stanu fizjologicznego organizmu, otrzymany w postaci ekstraktu termostabilnych komponentów rozdrobnionej tkanki pochodzenia zwierzęcego, w której aktywność mediatorna lub hormonowytwarzająca nie jest na tyle istotną (SU-A-139404). Wspomniany ŚBA posiada analogiczne zalety, jak i wskazane wyżej ŚBA, jednak nie wykazuje aktywności mediatornej i/lub hormonalnej, chociaż przy tym nieco traci na swojej aktywności immunomodulującej. Podobne właściwości znanego ŚBA są związane ze sposobem jego otrzymania, polegającym na rozdrabnianiu tkanki pochodzenia zwierzęcego, jej dwukrotnej obróbce cieplnej oraz fasowaniu w warunkach aseptycznych (Su-A-139404).

Inny ŚBA, posiadający właściwość immunomodulującą, dla normalizacji stanu fizjologicznego organizmu, w tej liczbie dla wygojenia urażonych miejsc ciała, wyprodukowany z rozpuszczalnych w wodzie produktów hydrolizy składników rozdrobnionego surowca z tkanki zwierzęcej, zwłaszcza wziętej od zwierząt niedorozwiniętych, znany jest z opisu patentowego US-A-4455302. Przy tym w jego skład wchodzą substancje mineralne, rozpuszczalne związki organiczne, takie jak polipeptydy, aminokwasy i substancje mineralne, otrzymane w wyniku hydrolizy tkanki.

Wspomniany środek posiada wysoką skuteczność pod względem normalizacji parametrów stanu fizjologicznego organizmu. Jest to uwarunkowane tym, że znany ŚBA jest charakteryzowany przez wysoki stosunek efektów immunostymulacji i immunoinhibicji, w związku z większą zawartością czynników immunostymulujących.

173 321

Jednakże skuteczność opisanego wyżej ŚBA jest mimo wszystko niedostateczna, co jest związane z zawartością w jego składzie stosunkowo dużej ilości substancji balastowych i immunodepresatorów. Oprócz tego, znany ŚBA może spowodować uboczne efekty, które występują przy jego wykorzystaniu (alergia i inne). Wadą znanego ŚBA jest i to, że skład otrzymywanego produktu docelowego nie jest stabilny i waha się od partii do partii, wskutek czego jest utrudniona jego standaryzacja.

Właściwości znanego ŚBA, przede wszystkim jego aktywność immunomodulująca, są bezpośrednio związane ze sposobem jego otrzymywania.

W znanym sposobie otrzymywania ŚBA, posiadającego właściwość immunomodulującą, dla normalizacji stanu fizjologicznego jest dokonywana hydroliza składników przepłukanego rozdrobnionego surowca z tkanki zwierzęcej z następnym odwirowywaniem, filtrowaniem produktów hydrolizy i wydzielaniem końcowego produktu w postaci proszku lub żelu. Przy tym hydroliza jest dokonywana w roztworze rozcieńczonego słabego kwasu organicznego przy pH równym 3,6-6,5 i o temperaturze około 68°C, a w postaci surowca są wykorzystywane nóżki drobiu niedorozwiniętego nie starszego niż 9 tygodni. (US-A-4455302).

Stosowany surowiec, jak również brak przed hydrolizą operacji, które są przeznaczone do jego homogenizacji i oczyszczania z nienaruszonych elementów tkanki z wydzielaniem klarownej cieczy, zawierającej składniki z komponentami morfoplazmy oraz glikokaliksu komórek, nie dają możliwości otrzymywania końcowego produktu z wysokim (powyżej 30%) stężeniem wspomnianych komponentów, jak również obniżenia zawartości w nim immunodepresatorów, związków obojętnych i balastowych.

Wskazane wyżej wady są usunięte w środku biologicznie aktywnym, posiadającym właściwość immunomodulującą oraz w sposobie wytwarzania środka biologicznie aktywnego według wynalazku.

Celem wynalazku jest stworzenie środka biologicznie aktywnego, posiadającego właściwość immunomodulującą oraz opracowanie sposobu jego otrzymywania, zapewniającego wysoką biologiczną aktywność bez przejawów toksyczności oraz różnych efektów ubocznych, jak również możliwość otrzymywania produktu końcowego, posiadającego przewidziany skład i zadane właściwości.

Cel ten realizuje środek biologicznie aktywny, posiadający właściwość immunomodulującą, na bazie rozpuszczalnych w wodzie związków organicznych, będących produktami hydrolizy składników rozdrobnionej tkanki pochodzenia zwierzęcego, który zawiera w składzie produktów hydrolizy termostabilne, małocząsteczkowe komponenty morfoplazmy i glikokaliksu komórek, zmodyfikowane podczas procesów embriogenezy i/lub proliferacji, i/lub zróżnicowania komórek, i/lub patologii, poprzedzającej i/lub towarzyszącej regeneracji i/lub reperacji tkanki.

Należy uwzględnić, że termin morfoplazma jest stosowany tutaj w szerokim znaczeniu i obejmuje strukturowaną część cytoplazmy komórek, reprezentowaną przez organelle, membrany komórkowe, cytoszkielet i podobne struktury komórkowe (Hcyo KaiaBa. Bno \ie\iópahh. -M- Bbicuiai uiKOJia. -1985.- c. 13, 15), a termin glikokaliks jest stosowany dla określenia warstwy, zawierającej węglowodany, przylegającej do strony zewnętrznej plazmatycznej membrany komórki (E. AnGepTc, /5· /U- JlbKrnc, MoneKyjiapHaa 6ηο;ιοιί κπετκΗ.

-Mup. -1886. -5. 9)5).

Cel ten zrealizowano również przez zastosowanie zmodyfikowanych komponentów morfoplazmy i glikokaliksu komórek ŚBa według wynalazku, zawierających komponenty termostabilne w temperaturze Tn<120°C. Przy tym zawartość względna termostabilnych komponentów wśród zmodyfikowanych składników stanowi 30-100% masy.

W skład zmodyfikowanych komponentów morfoplazmy i glikokaliksu komórek zgłaszanego ŚBA wchodzą małocząsteczkowe komponenty o względnej masie cząsteczkowej <10 000. Przy tym zawartość względna małocząsteczkowych komponentów wśród zmodyfikowanych komponentów morfoplazmy i glikokaliksu komórek stanowi 30-100% masy.

Cel ten zrealizowano również przez to, że w skład środka według wynalazku wchodzą produkty hydrolizy ze zmodyfikowanymi komponentami morfoplazmy i glikokaliksu komórek, składające się ze związków organicznych w następującym stosunku w % wagowych:

173 321

Polipeptydy - do 26,0;

Peptydy - 10,0- 22,5;

Aminokwasy - 32,0-60,1;

Węglowodany -10,5-28,7;

Lipidy, nukleotydy oraz inne związki organiczne - 2,0-11,0;

Przy tym środek według wynalazku zawiera węglowodany, składające się z następujących związków organicznych w stosunku wyrażonym w % wagowych:

- związki wielkocząsteczkowe o względnej masie cząsteczkowej > 10 000 - do 2,0;

- związki małocząsteczkowe o względnej masie cząsteczkowej 800-10 000 - 2,5-11,5;

- monomery wolne o względnej masie cząsteczkowej <800 - 6,0-17,0;

W ŚBA według wynalazku stosunek wagowy węglowodanów i peptydów w składzie związków organicznych o względnej masie cząsteczkowej 800-10 000 mieści się w granicach G=0,25-0,60.

Cel wynalazku uzyskuje się w w ten sposób, że środek według wynalazku zawiera produkty hydrolizy ze zmodyfikowanymi komponentami morfoplazmy i glikokaliksu komórek, składające się ze związków organicznych w następujących stosunku w % wagowych:

Polipeptydy - 16,3-24,7;

Peptydy -11,9-17,1;

Aminokwasy - 32,0-48,2;

Węglowodany - 14,6-20,8;

Lipidy, nukleotydy oraz inne związki organiczne - 5,1-9,3;

Oprócz tego, środek według innego wykonania wynalazku zawiera produkty hydrolizy ze zmodyfikowanymi komponentami morfoplazmy i glikokaliksu komórek, składające się ze związków organicznych w następującym stosunku w % wagowych:

Polipeptydy - 5,5-12,7;

Peptydy -13,6-21,0;

Aminokwasy - 37,1-52,9;

Węglowodany - 16,1-25,1;

Lipidy, nukleotydy oraz inne związki organiczne - 5,3-11,0;

Środek według wynalazku w jeszcze innym wykonaniu zawiera produkty hydrolizy ze zmodyfikowanymi komponentami morfoplazmy i glikokaliksu komórek, składające się ze związków organicznych w następującym stosunku w % wagowych:

Polipeptydy - mniej niż 0,3;

Peptydy -14,9-22,5;

Aminokwasy - 43,5-60,1;

Węglowodany - 15,5-28,7;

Lipidy, nukleotydy oraz inne związki organiczne - 5,0-9,2;

Cel wynalazku osiągnięto również przez to, że w sposobie otrzymania ŚBA, posiadającego właściwość immunomodulującą, w którym jest dokonywane rozdrabnianie przepłukanego surowca z tkanki zwierzęcej, hydroliza otrzymanych składników z następnym wydzielaniem produktów hydrolizy, ich filtracją i wydzielaniem klarownej cieczy w postaci produktu docelowego, jako surowiec jest wykorzystywana tkanka zwierzęca, zmodyfikowana podczas procesów embriogenezy i/lub proliferacji, i/lub różnicowania komórek, i/lub patologii, poprzedzającej i/lub towarzyszącej regeneracji i/lub reperacji tkanki, i przed hydrolizą dokonuje się homogeni8

173 321 zacji i oczyszczania z nienaruszonych elementów tkanki z wydzielaniem klarownej cieczy, zawierającej składniki z komponentami morfoplazmy i glikokaliksu komórek.

Jako surowiec jest wykorzystywana tkanka, wybierana z szeregu: tkanka embrionalna, spermatogonia i spermatocyty męskich gruczołów płciowych, tkanka łożyskowa, tkanka nabłonkowa jelit, komórki szpiku kostnego, różnicujące się tymocyty grasicy, regenerująca się tkanka skórna, tkanka regenerującej się wątroby, tkanka regenerujących się kończyn płazów, tkanka zmieniona patalogicznie, pobrana przed stadium regeneracji.

Przy tym oczyszczanie z nienaruszonych elementów tkanki po homogenizacji w roztworze fizjologicznym i/lub buforowym jest dokonywane drogą filtracji i/lub odwirowywania z przyspieszeniem 150-250 g w ciągu 10-15 min.

Oprócz tego, rozdrobnienie surowca z tkanki zwierzęcej jest dokonywane przed homogenizacją i jest prowadzone do uszkodzenia komórek z następnym ekstrahowaniem ich zawartości drogą dodatkowego przepłukiwania z filtracją i/lub odwirowywaniem z przyspieszeniem 300-15 000 g w ciągu 10-20 min z wydzielaniem rozdrobnionej ekstrahowanej tkanki.

Cel wynalazku osiągany jest i przez to, że w składzie składników poddawanych hydrolizie, zawartość komponentów morfoplazmy i glikokaliksu komórek stanowi 30-60% ogólnej masy związków organicznych.

Hydroliza jest przeprowadzana w temperaturze Tr=4-45°C. Przy tym hydroliza może być dokonana w obecności środka antyseptycznego.

Cel wynalazku jest osiągany jeszcze i w ten sposób, że produkty hydrolizy składników poddaje się obróbce cieplnej w temperaturze Tn=60-120°C do osiągnięcia pełnej denaturacji związków termolabilnych i filtruje i/lub odwirowywuje się je z przyspieszeniem ponad 1 500 g w ciągu 20-40 min z wydzielaniem produktu końcowego w postaci klarownej cieczy, zawierającej komponenty termostabilne.

Oprócz tego, produkty hydrolizy składników poddaje się frakcjonowaniu drogą dializy poprzez błonę półprzepuszczalną i/lub ultrafiltracji, i/lub żelfiltracji z wydzielaniem jako produktu końcowego frakcji, zawierającej małocząsteczkowe komponenty morfoplazmy i glikokaliksu komórek z względną masą cząsteczkową <10 000.

Normalizacja stanu fizjologicznego człowieka i zwierząt za pomocą ŚBA według wynalazkujest dokonywana drogą stymulacji systemu odpornościowego, przeważnie przez aktywację systemu retikuloendotelialnego, T-, B- systemów, neutrofilów, i/lub populacji killerów naturalnych. ,

Ustalono, że skuteczność praktyczna ŚBA według wynalazku, otrzymanego za pomocą sposobu według wynalazku, polega na jego wysokiej aktywności biologicznej, i przede wszystkim, na podwyższonym efekcie immunomodulującym.

Aktywizując system odpornościowy, a przede wszystkim komórki rzędu makrofagalnogranulocytamego, ŚBA według wynalazku zapewnia:

1) oddziaływanie nie na konkretną patologię, lecz na polepszenie ogólnego statusu stanu fizjologicznego organizmu, mobilizując zasoby wewnętrzne, skierowane na normalizację wszystkich parametrów homeostazy, w tym i na daną patologię. W odróżnieniu od wielu innych środków leczniczych, ŚBA według wynalazku, normalizując zmienione parametry, nie pogarsza pozostałych parametrów homeostazy organizmu i nie powoduje zjawisk ubocznych;

2) kompleksowe oddziaływanie, które zezwala na poszerzenie zakresu zastosowania ŚBA na cały szereg schorzeń, których kontrola zależy od systemu odpornościowego organizmu;

3) taki stopień skuteczności oddziaływania, skierowanego na normalizowanie parametrów homeostazy, koreluje ze stopniem ich odchylenia od normy. W przypadku braku odchyleń lub normalizacji parametrów w trakcie leczenia, aktywność stymulowanych przez ŚBA komórek systemu odpornościowego normalizuje się już po upływie kilku dób po jego wprowadzeniu bez jakichkolwiek skutków dla organizmu i w ten sposób efekt oddziaływania SB A jest przerywany. Przy tym jest realizowana zasada sprzężenia zwrotnego: im mniejsze jest odchylenie, tym mniejszy jest efekt oddziaływania i odwrotnie.

Wskazane wyniki są osiągnięte dzięki specjalnym właściwościom ŚBA według wynalazku, których nie ma u analogów, wystąpienie których jest wywołane obecnością w składzie ŚBA produktów hydrolizy, zawierających komponenty morfoplazmy i glikokaliksu, zmodyfikowane

173 321 podczas procesów embriogenezy i/lub proliferacji i/lub różnicowania, i/lub patologii, poprzedzającej i/lub towarzyszącej regeneracji i/lub reperacji tkanki.

Ustalono, że podwyższona zawartość zmodyfikowanych komponentów morfoplazmy i glikokaliksu komórek jest wynikiem wykorzystania tkanek zwierzęcych, pobranych w stadium przebiegu w nich wskazanych wyżej procesów embriogenezy i/lub poliferacji, i/lub różnicowania, i/lub procesów patologicznych, poprzedzających i/lub towarzyszących regeneracji i/lub reperacji tkanki.

Do takich tkanek należą:

- różnicujące się tymocyty grasicy;

- tkanka embrionalna, tkanka łożyskowa;

- spermatogonia i spermatocyty męskich gruczołów płciowych, komórki szpiku kostnego, tkanka nabłonkowa jelit;

- tkanka regenerujących się kończyn płazów, regenerująca się wątroba po częściowej hepatektomii lub porażeniu substancjami trującymi, na przykład, czterochlokiem węgla (CClą), regenerująca się tkanka skórna, jak również tkanka z istniejącą w niej patologią, na przykład, przy gangrenie, po porażeniu chemicznym lub cieplnym.

Ustalono również, że charakterystyczną właściwością wymienionych wyżej rodzajów tkanek jest obecność w nich zmodyfikowanych komponentów morfoplazmy i glikokaliksu komórek, zezwalających na odseperowanie ich od intaktowych lub przebywających w stanie spoczynku komórek tkanki dorosłych osobników. Podobna właściwość zmodyfikowanych komponentów morfoplazmy i glikokaliksu komórek wspomnianych tkanek zezwala na ich wykorzystanie w ŚbA według wynalazku, przy wprowadzeniu którego do organizmu zwierząt lub człowieka osiąga się stymulowanie ukierunkowanej reakcji odwzajemniającej organizmu na patologię. Zasadniczą rolę w tym procesie spełnia system odpornościowy organizmu.

Materialnymi nośnikami informacji w procesach wymienionych wyżej i/lub odchyleniach od normy we wskazanych tkankach są specyficzne komponenty, które wchodzą do struktury morfoplazmy i glikokaliksu komórek, poddawanej zmodyfikowaniu przy zmianie statusu fizjologicznego komórek.

Dokonanie przed hydrolizą procesu wymywania rozdrobnionej tkanki od komponentów ekstraktu tkanki i krwi w połączeniu z homogenizacją, po której dokonuje się oczyszczania z nienaruszonych elementów tkanki, sprzyja wysokiemu stężeniu komponentów morfoplazmy i glikokaliksu komórek (30-60%), jak również znaczne obniżenie zawartości immunodepresatorów, związków obojętnych (pod względem aktywności specyficznej) i związków balastowych, stanowiących pozostałość masy w produkcie końcowym. Służy to wzmocnieniu skierowanej odpowiedzi immunologicznej organizmu.

Odwzajemniająca reakcja organizmu jest istotnie wzmacniana przy wprowadzeniu środka według wynalazku, który zawiera w swoim składzie komponenty morfoplazmy i glikokaliksu komórek w postaci komponentów termostabilnych (stabilnych przy temperaturze nagrzewania Tn<120°C), w postaci komponentów małocząsteczkowych o względnej masie cząsteczkowej <10 θ0θ kDa.

Środek biologicznie aktywny według wynalazku, posiadający właściwość immunomodulującą, dla normalizacji stanu fizjologicznego organizmu otrzymuje się w następujący sposób.

Jako surowiec jest używana tkanka zwierzęca, zmodyfikowana podczas embriogenezy i/lub proliferacji, i/lub różnicowania, i/lub patologii poprzedzającej i/lub towarzyszącej regeneracji i/lub reperacji tkanki. Wspomnianą tkankę zwierzęcą przepłukuje się i rozdrabnia, po czym ją homogenizuje w roztworze fizjologicznym i/lub buforowym do całkowitego zniszczenia komórek, a mieszankę zhomogenizowaną oczyszcza się z nienaruszonych elementów tkanki drogą filtracji i/lub odwirowywania z wydzielaniem składników, zawierających komponenty morfoplazmy i glikokaliksu komórek i poddaje hydrolizie. Produkty hydrolizy po odwirowywaniu i/lub filtracji wykorzystuje się w postaci produktu końcowego dla normalizacji stanu fizjologicznego organizmu, w szczególności, przy zastosowaniu zewnętrznym (inhalacji, aplikowaniu, wprowadzeniu przez jamę nosową, w składzie maści itd.).

IJ 341

Skuteczność produktu końcowego zależy od zawartości w nim zmodyfikowanych komponentów morfoplazmy i glikokaliksu komórek. Zwiększenie ich zawartości jest osiągane drogą wyboru surowca z podwyższoną intensywnością procesów modyfikacji w tkankach oraz wyboru optymalnych warunków zrealizowania sposobu jego obróbki.

Wybór surowca jest uwarunkowany tym, że komponenty morfoplazmy i glikokaliksu komórek dostatecznie specyficznie reagują na zmiany stanu fizjologicznego komórek zmianą swojej organizacji strukturalnej, a podobne zmiany doprowadzają do zmiany immunogeniczności tkanki, i powodują tym odpowiednie reakcje systemu odpornościowego organizmu. Ustalono, że immunogeniczność zmodyfikowanej struktury jest uzyskiwana w stadium przebiegu wskazanych wyżej procesów (embriogeneza itp.).

Jako tkankę zwierzęcą wykorzystuje się w szczególności:

-zróżnicowane tymocyty grasicy (proces zróżnicowania komórek);

- spermatogonia i spermatocyty męskich gruczołów płciowych, komórki szpiku kostnego, tkankę nabłonkową jelit (procesy proliferacji i zróżnicowania komórek);

- tkankę embrionalną, tkankę łożyskową (procesy proliferacji, zróżnicowania, embriogenezy);

- tkanki regenerujących się kończyn płazów, regenerującej się wątroby szczurów po częściowej hepatektomii lub po porażeniu czterochlorkiem węgla (CClą), regenerującą tkankę skórną, jak również tkankę z istniejącą w niej patologią, na przykład, przy gangrenie, po urazie chemicznym lub cieplnym (kombinacja w różnym połączeniu wspomnianych wyżej procesów).

Ustalono, że cechą charakterystyczną dla wymienionych wyżej różnych rodzajów tkanek, są zmiany w nich struktury komponentów morfoplazmy i glikokaliksu komórek tkanki, pozwalające na ich odseperowanie od intaktowych lub znajdujących się w stanie spoczynku tkanek dorosłych osobników.

Pożądanym jest wykorzystanie tkanki zwierzęcej, pobranej w stadium inkrementu procesu modyfikacji. Wspomniane stadium jest określane empirycznie na podstawie zmiany immunogeniczności. Na przykład, w przypadku wykorzystania tkanki embrionalnej ten okres stanowi pierwszą połowę embriogenezy. Regenerującą się wątrobę szczurów wykorzystuje się po upływie 4-12 godzin po częściowej hepatektomii, a w wypadku wykorzystania regenerujących się kończyn płazów - w stadium powstania blastemy.

Powiększenie względnej zawartości komponentów morfoplazmy i glikokaliksu komórek jest osiągane przez usunięcie nienaruszonych elementów tkanki, reprezentowanych z reguły przez tkankę łączną.

Oczyszczanie z nienaruszonych elementów tkanki dokonuje się podczas procesu odwirowywania z przyspieszeniem w zakresie 150-250 g w ciągu 10-15 min. co jest tłumaczone tym, że przy większym przyspieszeniu i dłuższym czasie trwania procesu odbywa się osadzanie elementów morfoplazmy i glikokaliksu komórek, a w przypadku przyspieszenia poniżej 150 g oczyszczanie jest mało skuteczne.

Oczyszczanie z nienaruszonych elementów dokonuje się również przez filtrowanie na filtrze makroporowatym, na przykład, przez kilka warstw gazy, przez tkaninę bawełnianą (krośniak) albo przez siatki kapronowe.

Celem wzmocnienia właściwości immunomodulujących produktu końcowego, przed homogenizacją tkanka jest rozdrabniana aż do zniszczenia komórek z następnym ekstrahowaniem ich zawartości drogą dodatkowego przepłukiwania w roztworze fizjologicznym i/lub w roztworze kwasu organicznego drogą filtrowania i/lub odwirowywania przy przyspieszeniu 300-15 000 g w ciągu 10-20 min. i wydzielenia ekstrahowanej rozdrobnionej tkanki, którą poddaje się homogenizacji.

Przy tym, z jednej strony osiąga się usunięcie znacznej części immunodepresatorów, obecnych w składzie surowicy krwi i ekstraktu tkanki, a z drugiej strony - zwiększenie względnej zawartości komponentów morfoplazmy i glikokaliksu komórek, co jest istotnym dla tkanek z małą ich zawartością.

Dodatkowe przepłukiwanie wykorzystywanej rozdrobnionej tkanki zwierzęcej przed homogenizacją drogą odwirowywania z przyspieszeniem 300-15 000 g w ciągu 10-20 min. pozwala na najbardziej skuteczne oddzielanie ekstrahowanej tkanki od ekstraktu w warunkach

173 321 przemysłowych. Analogiczny efekt jest osiągalny przez filtrowanie przy pomocy filtru makroporowatego, na przykład przez kilka warstw gazy, przez tkaninę bawełnianą (krośniak) lub przez siatki kapronowe.

Zawartość względna komponentów morfoplazmy i glikokaliksu komórek w składnikach tkanki, wydzielonych celem przeprowadzenia hydrolizy, określa się na podstawie zawartości białka i węglowodanów w strukturach komórkowych, wolnych od nienaruszonych elementów tkanki.

Skuteczność produktu końcowego w znaczym stopniu wzrasta przy wykorzystaniu komponentów morfoplazmy i glikokaliksu komórek w postaci komponentów małocząsteczkowych. Pozwala to z jednej strony na uniknięcie niepożądanych zjawisk ubocznych, a z drugiej strony -na otrzymanie preparatu o szerokim zakresie działania bez ograniczeń ze względu na specyficzność gatunków zwierząt i odpowiedniego do wymagań medycyny. W tym celu składniki tkanki, zawierające zmodyfikowane komponenty morfoplazmy i glikokaliksu komórek poddawano hydrolizie, powodującej rozszczepienie wielkocząsteczkowych strukturalnych formacji morfoplazmy i glikokaliksu komórek na produkty, zawierające komponenty z mniejszą masą cząsteczkową. Skuteczność produktów hydrolizy jest uzależniona od specyficzności hydrolizy, która w znaczym stopniu zależy od charakterystyk temperaturowo-czasowych.

Ustalono, że właściwość immunomodulującą środka według wynalazku, w szczególności podwyższenie aktywności makrofagów eksudatu otrzewnowego szczurów in vitro jest maksymalna w przypadku dokonania hydrolizy w zakresie temperatur roboczych Tr=4-45°C.

Odchylenia od tego zakresu są niepożądane, ponieważ:

- przy Tr <4°C znacznie wzrasta czas rrwania procesu hydroiizy, co powoduje efektywności ekonomicznej;

- przy Tr>45°C następuje obniżenie aktywności fermentów, wywołujących hydrolizę surowca i są przyspieszane procesy rozpadu aktywnych komponentów. W wyniku jest obniżana jegojakość.

Czas trwania hydrolizy jest ustalany po osiągnięciu maksymalnego poziomu efektu immunomodulującego zgłaszanego środka, w szczególności według aktywacji makrofagów eksudatu otrzewnowego zgodnie z testem NBT.

Długotrwała hydroliza jest dokonywana w obecności środka antyseptycznego.

Podwyższenie względnej zawartości (względnego stężenia) komponentów małocząsteczkowych w produktach hydrolizy w stosunku do zawartości wielkocząsteczkowych związków termolabilnych jest dokonywane drogą obróbki cieplnej hydrolizatu do całkowitej denaturacji związków termolabilnych, które potem są usuwane w postaci osadu za pomocą odwirowywania z przyspieszeniem nie mniej niż 1 500 g w ciągu 20-40 min i/lub filtracją. Klarowna ciecz znad osadu, zawierająca komponenty termostabilne morfoplazmy i glikokaliksu komórek, jest wykorzystywana jako produkt końcowy.

Obróbkę cieplną produktów hydrolizy przeprowadza się w zakresie temeperatur Tn=60+120°C, ponieważ przekroczenie granic wskazanego zakresu powoduje zmniejszenie aktywności specyficznej środka.

Na przykład, w temperaturze Tn<60°C nie wszystkie białka poddają się denaturacji, wskutek czego zawartość związków termolabilnych w produkcie końcowym jest podwyższona. Kosztem tego aktywność specyficzna środka obniża się. Przy temperaturze Th>120°C odbywa się skokowe zwiększenie szybkości zmian strukturalnych w komponentach peptydowych i węglowodanowych produktu końcowego, co również powoduje obniżenie jego jakości.

Po obróbce cieplnej wydzielanie termostabilnych komponentów jest dokonywane odwirowywaniem z przyspieszeniem nie mniejszym niż 1 500 g w ciągu 20-40 min, z tego powodu, że w wypadku zmniejszenia tej wielkości istotnie obniża się stopień usunięcia denaturowanych związków termolabilnych, a jego przeprowadzenie w czasie 20-40 min jest najbardziej optymalne.

Koagulowane denaturowane związki termolabilne można oddzielić od cieczy znad osadu drogą filtrowania przez sączek z bibuły.

Produkt końcowy, zawierający termostabilne komponenty morfoplazmy i glikokaliksu komórek, posiada dużą aktywność specyficzną i pozwala na rozwiązanie bardziej szerokiego

173 321 kręgu zadań. Ten produkt może być zastosowany i jako środek do wstrzykiwania, używany zarówno w weterynarii, jak i w medycynie.

Dalsze podwyższenie stopnia aktywności specyficznej ŚBA jest osiągane wydzielaniem komponentów małocząsteczkowych o względnej masie cząsteczkowej <10 000 z produktów hydrolizy drogą dializy przez błonę półprzepuszczalną i/lub ultrafiltracji, i/lub żelfiltracji, co pozwala na całkowite usunięcie związków wielkocząsteczkowych, zdolnych do wywołania efektów ubocznych.

Osiągnięty w ten sposób stopień skuteczności pozwala na szerokie zastosowanie otrzymanego produktu końcowego w medycynie.

Niżej są przytoczone przykłady konktretnego wykonania i wykorzystania wynalazku, jak również są przedstawione wykorzystane metody określania składu i właściwości środków biologicznie aktywnych.

Przykład 1.W celu otrzymania ŚBA według wynalazku została wykorzystana tkanka embriologiczna, pobrana w stadium pierwszej połowy ciąży krów. Z embrionów po zdezynfekowaniu w słabym roztworze nadmanganianu potasowego (KMnOą) wycięto tkankę mięśniową i skórną, wątrobę, śledzionę, trzustkę, nerki, płuca, i serce, które poddano grubemu rozdrobnieniu za pomocą maszynki do mielenia mięsa.

Potem 10 kg mielonego mięsa zmieszano z 30 kg roztworu fizjologicznego i homogenizowano przy pomocy homogenizatora z blenderami nożowymi do otrzymania jednolitej masy. Oczyszczanie mieszanki z nienaruszonych elementów tkanki dokonywano przez dekantacje, a otrzymaną ciecz nadosadową ze składnikami tkanki, zawierającymi komponenty morfoplazmy i glikokaliksu komórek, poddawano autolizie przy Tn=45°C w ciągu 48 godzin.

Otrzymany hydrolizat filtrowano za pomocą filtru papierowego, a przesącz, zawierający komponenty morfoplazmy i glikokaliksu komórek wykorzystano jako produkt końcowy, którego skład oraz wywoływana przez niego aktywność specyficzna są przedstawione w tabeli 1 i tabeli 2.

Produkt końcowy, zawierający ŚBA w ilości 1,0% masy, a pozostałe - wypełniacz, zmieszano z 9 objętościami miąższu ogórkowo-gruszkowego i wykorzystano jako preparat leczniczy w postaci maseczki do twarzy w celach kosmetycznych. Przy długotrwałym przechowywaniu do żelu dodawano środek antyseptyczny (nipaginę i nipazol w stosunku części masowych 5:1) w stężeniu końcowym 0,1 % masy. Żel nakładano na twarz na 2-3 godziny. Efekt leczniczy następował po 4-10 zabiegach i był oceniany według stanu cery.

Przykład 2. Tkankę embrionalną, otrzymaną analogicznie jak w przykładziel, poddawano rozdrabnianiu. Potem 10 kg mielonego mięsa zmieszano z 30 kg roztworu fizjologicznego oraz homogenizowano do otrzymaniajednolitej masy. Celem usunięcia nienaruszonych elementów tkanki, w tym elementów tkanki łączącej, homogenizowaną -masę odwirowywano z przyspieszeniem 250 g w ciągu 10 min. Po odwirowywaniu osad usuwano, a ciecz filtrowano przez tkaninę bawełnianą (krośniak) celem usunięcia flotowanego tłuszczu. Do przesączu oczyszczonego w ten sposób homogenatu, zawierającego 30% masy komponentów morfoplazmy i glikokaliksu komórek, dodawano środek antyseptyczny (chinozol) do końcowego stężenia 0,08% masy. Po zmieszaniu homogenat poddawano hydrolizie w temperaturze Tr=4°C w ciągu 6 tygodni.

Otrzymany hydrolizat odwirowywano z przyspieszeniem 15 000 g w ciągu 20 min i wydzielano klarowną ciecz z komponentami morfoplazmy i glikokaliksu komórek jako produkt końcowy, którego skład i wywoływana przez niego aktywność specyficzna są przedstawione w tabeli 1 i 2.

Produkt końcowy, zawierający ŚBA w ilości 1,0% masy, a pozostałe - wypełniacz, wykorzystywano jako preparat leczniczy polepszenia stanu osłabionych młodych zwierząt futerkowych, jak również kurcząt drobiu, sposobem inhalacji w specjalnej komorze, gdzie zwierzęta przeewwały w ciągu 15-20 min. W komorze preparat rozpylano w aerozolu z obliczenia 0,5 ml na 1 tu w ciągu 1 min. Zabieg ponawiano co 7 dni. Kontrolę skuteczności działania dokonywano według zmniejszenia pomoru młodych zwierząt, który zmniejszył się o 30-40%.

Przykład 3. Tkankę embrionalną, otrzymaną analogicznie, jak w przykładzie 1, poddawano rozdrabnianiu. Otrzymane w ten sposób mielone mięso zalewano podwójną objęto173 321 ścią roztworu fizjologicznego i mieszano. Mieszankę odwirowywano z przyspieszeniem 1 500 g w ciągu 20 min. Osad wyjmowano, ponownie mieszano w podwójnej objętości roztworu fizjologicznego i odwirowywano w tych samych warunkach. Operację przemywania mięsa dokonywano 3 razy. Potem 10 kg przemytego mielonego mięsa zmieszano z 30 kg centymolowego fosforanowego buforowego roztworu solnego (0,01 M PBS) o pH 7,2, zawierającego centymolowy dwu- podstawiony fosforan sodu i piętnastocentymolowy roztwór chlorku sodowego (0,01 M NażHPOą i 0,15 M NaCl) i poddawano homogenizacji na młynie koloidalnym do otrzymania jednolitej masy. Nienaruszone elementy tkanki usuwano w postaci osadu po odwirowywaniu z przyspieszeniem 150 g w ciągu 15 min. Ciecz nad osadem po usunięciu flotowanego tłuszczu drogą filtracji przez tkaninę bawełnianą (krośniak) obrabiano środkiem antyseptycznym z końcowym stężeniem 0,08% masy. Po zmieszaniu homogenat, zawierający 60% masy komponentów morfoplazmy i glikokaliksu komórek, poddawano hydrolizie w temperaturze Tr=4°C w ciągu 6 tygodni.

Otrzymany hydrolizat odwirowywano z przyspieszeniem 1 500 g w ciągu 40 min z wydzielaniem klarownej cieczy, zawierającej komponenty morfoplazmy i glikokaliksu komórek w postaci produktu końcowego, którego skład oraz wywoływana przez niego specyficzna aktywność są podane w tabeli 1 i w tabeli 2.

Produkt końcowy, zawierający ŚBA w ilości 1,0% masy, a pozostałe - wypełniacz, wykorzystywano jako preparat leczniczy dla leczenia cieląt, chorych na paragrypę, w postaci zastrzyków, dokonywanych domięśniowo w dawce 0,05 ml/kg masy ciała co trzeci dzień. Efekt leczniczy występował po 1-5 zastrzykach i był kontrolowany według temperatury ciała i obecności wirusów we krwi.

Przykład 4. Mięso grubo rozdrobnione za pomocą maszynki do mielenia, otrzymane analogicznie jak w przykładzie 1, zalewano podwójną objętością 3% kwasu octowego i wymieszano. Mieszankę filtrowano przez tkaninę bawełnianą w próżni przy pomocy nuczy filtracyjnej. Osad wyjmowano i znów mieszano w podwójnej objętości roztworu fizjologicznego i odwirowywano z przyspieszeniem 300 g w ciągu 20 min. 10 kg przemytego mielonego mięsa mieszano z 30 kg centymolowego fosforanowego buforowego roztworu solnego (0,01 M PBS) o pH 7,2, zawierającego centymolarny dwupodstawiony fosforan sodu i piętnastocentymolowy roztwór chlorku sodowego (0,01 M NA2HPO4 i 0,15 NaCl) poddawano homogenizacji na młynie koloidalnym do otrzymaniajednolitej masy. Celem usunięcia nienaruszonych elementów tkanki zhomogenizowaną masę filtrowano przez tkaninę bawełnianą (krośniak). Do otrzymanego przesączu dodawano środek antyseptyczny o stężeniu końcowym 0,08% masy. Po wymieszaniu homogenat, zawierający 50% masy komponentów morfoplazmy i glikokaliksu komórek, poddawano hydrolizie w temperaturze Tr=20°C w ciągu 8 dni. Kolejne operacje przeprowadzano w ten sam sposób, jak i w przykładzie 3.

Zawartość związków organicznych w produkcie końcowym oraz wskaźniki jego specyficznej aktywności, określone eksperymentalnie, są podane w tabeli 1 i tabeli 2.

Produkt końcowy, zawierający ŚBA w ilości 1,0% masy, a pozostałe - wypełniacz, był wykorzystany jako preparat leczniczy w postaci maści do leczenia dermatozy, przygotowywanej drogą mieszania lanoliny, wazeliny oraz produktu końcowego ŚBA stosunku 1:3:1 części masowych. Maść wcierano do skóry codziennie. Efekt leczniczy występował po 4-12 dniach i był oceniany według stanu skóry.

173 321

Tabela 1

Efekty immunomodulujące i

Wskaźnik ilościowy efektów ŚBA zgodnie z przykładami □

regeneracyjne środków biologicznie aktywnych (ŚBA)	Nr 1	Nr2	Nr 3	Nr 4	Nr 7	Nr 8	Nr 9	Nr 11	Nr 12	Nr 13
Podwyższenie aktywności makrofagów otrzewnowego eksudatu szczurów, %, w porównaniu z kontrolą	aktywności fermentacyjnej (test NBT)	52,3	54,2	71,0	58,3	102,6	73,0	87,6	158,2	127,0	151,1
aktywności fagocytowej wobec E. Coli	37,3	39,1	54,5	43,8	73,9	54,7	64,1	124,7	116,1	122,4
Podwyższenie aktywności neutrofilów krwi, %, \| w porównaniu z kontrolą	aktywności fermentacyjnej (test NBT)	66,7	71,2	85,0	75,4	109,2	81,6	95,4	179,5	138,3	167,6
aktywności fagocytowej wobec E. Coli	44,5	49,8	59,8	52,2	78,9	61,9	60,2	134,3	112,9	125,4
Stymulacja reakcji blast transformacji w \| porównaniu z kontrolą, %	T-limfocytów	40,2	44,8	51,3	46,2	79,7	59,3	69,2	149,3	120,3	141,3
B-limfocytów	48,7	50,2	61,0	55,2	93,3	71,9	83,4	189,6	146,8	176,2
Zwiększenie miareczkowego surowicznego czynnika (MSC) %, w porównaniu z kontrolą	156,3	167,4	249,8	210,4	364,3	273,1	307,4	706,0	543,4	650,8
Stymulacja naturalnej aktywności ! killerowej splenocytów szczurów, %, w porównaniu z kontrolą	65,7	66,1	78,5	72,3	120,6	90,0	105,0	211,0	178,4	194,4
Wzmocnienie zdolności reperacyjnych hepatocytów szczurów w odnawianiu aktywności po wprowadzeniu CCl4 w porównaniu z kontrolą	Na, K-ATF-azy	20,1	24,3	29,1	26,7	34,6	28,2	30,8	64,8	50,4	60,2
aminotransferazy krwi	18,7	22,1	32,3	27,4	53,6	38,8	45,2	82,0	59,2	75,6
stężenia K+ w hepatocytach	10,3	13,8	19,8	16,8	27,0	22,2	24,6	52,5	43,9	50,4

173 321

Tabela 2

Związki organiczne	Zawartość związków organicznych w % masy w zgodnie z przykładami	ŚBA otrzymanego
Nr 1	Nr 2	Nr 3	Nr 4	Nr 7	Nr 8	Nr 9	Nr 11	Nr 12	Nr 13
mniej
Polipeptydy	26,0	16,3	21,8	20,5	11,0	5,5	12,7	0,2	0,3	0,3
Peptydy	10,0	11,6	20,0	11,9	21,0	13,6	18,6	19,1	14,9	22,5
Aminokwasy	51,3	48,2	32,0	44,3	37,1	52,9	47,3	43,5	60,1	49,8
								mniej
Węglowodany w składzie:
-związków wielkocząsteczkowych z
względną masą cząsteczkową >10000	2,0	0,3	1,1	0,6	0,6	0,2	0,4	0,2	0,2	0,2
-związków małocząsteczkowych z
względną masą cząsteczkową
800-10000	2,5	3,3	10,3	5,0	11,0	4,0	7,4	11,5	4,9	11,0
- wolnych monomerów lub związków
z względną masą cząsteczkową <800	6,0	11,0	9,4	12,6	13,5	12,8	8,3	17,0	10,4	11,2
R AZEM:	10,5	14,6	20,8	18,2	25,1	17,0	16,1	28,7	15,5	22,4
Lipidy, nukleotydy oraz inne związki organiczne	2,0	9,3	5,4	5,1	5,8	11,0	5,3	8,5	9,2	5,0
RAZEM:	100,0	100,0	100,0	100,0	100,0	100,0	100,0	100,0	100,0	100,0
Stosunek zawartości węglowodanów i peptydów, G	0,25	0,28	0,52	0,42	0,52	0,30	0,40	0,60	0,33	0,50

G - współczynnik, charakteryzujący względną zawartość węglowodanów w związkach z względną masą cząsteczkową 800-10000 w stosunku do peptydów.

Przykład 5. Względna zawartość komponentów morfoplazmy i glikokaliksu komórek w stosunku (w % wagowych) do komponentów tkanki łączącej i ekstraktu tkanki, wydzielonych dla przeprowadzenia hydrolizy, ustalano według zawartości białka i węglowodanów w strukturach komórkowych, wolnych od nienaruszonych elementów tkanki.

W tym celu oczyszczony w ten sam sposób, jak i w przykładach 1-4, z nienaruszonych elementów tkanki homogenat poddawano ultraodwirowywaniu z przyspieszeniem 100 000 g w ciągu 60 min.

Stosunek ilości białka w całym osadzie i w całej klarownej cieczy wskazuje na stosunek ilości białka komponentów morfoplazmy i glikokaliksu do białka ekstraktu.

Określenie zawartości białka w osadzie i klarownej cieczy nad osadem dokonywano po ultraodwirowywaniu homogenatu. Po usunięciu klarownej cieczy nad osadem do 0,1 ml osadu dodawano 4,9 ml roztworu fizjologicznego i po doprowadzeniu do stanu zawiesiny pobierano 0,1 ml celem ustalenia ilości białka sposobem fotometrycznym, według intensywności zabarwienia roztworu zgodnie z metodą SDS-Louri (U.K.Laemmli. - 20 Nature, -1970,v.227, -5259, p.680-685).

Celem określenia ilości białka w klarownej cieczy, do 0,1 ml cieczy dodawano 0,9 ml roztworu fizjologicznego i po wymieszaniu pobierano 0,1 ml celem określenia ilości białka według SDS-Louri.

Skład komponentów tkanki łącznej określano za pomocą analizy aminokwasowej według obecności hydroksyproliny i hydroksylizyny. W odróżnieniu od znanych środków, w ŚBA według wynalazku nie stwierdzono obecności wspomnianych aminokwasów.

Skład komponentów glikokaliksu komórek określano według ilości węglowodanów w homogenacie, wchodzących w skład związków z względną masą cząsteczkową powyżej 800, według reakcji antronowej po usunięciu z homogenatu granulek glikogenowych (S.Seifter,

S.Dayton, C.Hovic.-Arch. Biochemistryand Biophysical, - 1950, -25, -1, p. 1191-200).

173 321

W tym celu 20 ml homogenatu tkanki wprowadzano do probówek warstwami do ultraodwirowywania o pojemności 30 ml razem z 5 ml sacharozy o gęstości d=1,40 i poddawano ultraodwirowywaniu ’z przyspieszeniem 100 000 g w ciągu 60 min. Glikogen, który osiadał na spodzie probówki, usuwano, a elementy morfoplazmy i glikokaliksu komórek pobierano w interfazie i po odmywaniu z sacharozy, drogą odwirowywania w roztworze fizjologicznym, wykorzystywano dla analizy.

Przy określeniu ilości węglowadanów w badanych próbkach uwzględniano ogólną zawartość węglowodanów po hydrolizie oraz zawartość wolnych węglowodanów w postaci monomerów. Na podstawie otrzymanej różnicy tej wielkości, przy dokonaniu pomiarów określano ilość wolnych węglowodanów w składzie związków różnego rodzaju.

Celem dokonania ogólnej hydrolizy pobierano 1,0 ml badanej próbki i mieszano z 1 ml czteronormalnego roztworu kwasu solnego (4,0 N HCl). Hydrolizę przeprowadzano w temperaturze 105°C w ciągu 2 godzin, po czym hydrolizat odparowywano w eksykatorze z suchą sodą kaustyczną (NaOH) w próżni. Wysuszoną próbkę rozpuszczano w 1,0 ml wody destylowanej i wykorzystywano dla analizy.

Określenie ilości wolnych węglowodanów bezpośrednio w ŚBA lub po hydrolizie kwasowej dokonywano w sposób następujący: 1 ml próbki mieszano z 1 ml wody destylowanej, po czym, przy stałym wymieszaniu w temperaturze -5°C dodawano 4 ml 0,2% odczynnika antronowego, przygotowanego na podstawie 95% kwasu siarkowego (H2SO4). Otrzymaną mieszankę gotowano w temperaturze 95°C w ciągu 10 min., i po chłodzeniu określano gęstość optyczną przy długości fali 620 nm. Jako wzorzec wykorzystywano glikozę o stężeniu 20 mkg/ml.

W analizie białkowej ŚBA, otrzymanego w przykładach 1 i 2, zawartość komponentów morfoplazmy i glikokaliksu komórek stanowi 37,6±7,4%, a dla ŚBA w przykładach 3 i 4 51,8±8,2%.

W tym przykładzie i w przykładach poniższych oraz w przytoczonych tabelach podano przeciętne wartości określonych eksperymentalnie wielkości z granicznymi odchyleniami od średniej, obliczonymi z uwzględnieniem testu Studenta.

Przykład 6. Klarowną ciecz hydrolizatu, otrzymaną w przykładzie 3, poddawano obróbce cieplnej w temperaturach nagrzewania (obróbki cieplnej): Tni=55°C, Tn2=60°C, Tn3=95°C, Tn4=120°C, Tn5=135°C.

Ogrzewanie przeprowadzano do całkowitej denaturacji związków termolabilnych, zawartych w produktach hydrolizy, potem odwirowywano z przyspieszeniem powyżej 1 500 g w ciągu 30 min z wydzielaniem klarownej cieczy, zawierającej termostabilne komponenty morfoplazmy i glikokaliksu komórek w postaci produktu końcowego. Otrzymany produkt końcowy w każdym wypadku posiadał własny efekt (właściwość) immunomodulujący, podany w tabeli 3, w której przedstawiono rozdzielenie wartości aktywności specyficznej zgłaszanego ŚBA w zależności od wybranego zakresu temperatury ogrzewania hydrolizatu i poza granicami wskazanego zakresu. Przy tym za optymalną uważana jest temperatura nagrzewania T_n=95°C, przy której otrzymywany produkt końcowy zapewnia maksymalne wzmocnienie aktywności fermentacyjnej i fagocytowej, które odpowiednio wynosiły 72,8% i 64,3%. Przy Tn=55°C podwyższenie wartości aktywności specyficznej w porównaniu z kontrolą wynosi przeciętnie 61,1% - według testu NBT i 52,3% - według fagocytozy. W Tn>120°C odbywa się skokowy wzrost szybkości zmian strukturalnych peptydów i związków zawierających węglowodany, co powoduje zmiany strukturalne komponentów produktu końcowego, i co odbija się na obniżeniu wartości aktywności specyficznej ŚBA. Na przykład, przy Th=135°C podwyższenie aktywności specyficznej zgłaszanego ŚBA w porównaniu z kontrolną stanowi przeciętnie 57,3% - wg testu NBT i 43,0% wg fagocytozy. Maksymalna wartość aktywności specyficznej ŚBA w porównaniu z kontrolną jest uzyskiwana w zakresie temperatur T_n=60-120°C, w którym podwyższenie aktywności makrofagów eksudatu otrzewnowego szczurów (in vitro) wynosi przeciętnie 72,8% - według wzmocnienia aktywności fermentacyjnej (test NBT), a według wzmocnienia aktywności fagocytowej (wobec E.Coli) - 64,3%.

Przykład 7. Klarowną ciecz hydrolizatu, otrzymaną w przykładzie 3, poddawano obróbce cieplnej gotowaniem w temperaturze nagrzewania T_n=95°C do całkowitej denaturacji związków termolabilnych i po chłodzeniu odwirowywano z przyspieszeniem 1500 g w ciągu

173 321 min. Osad w postaci związków denaturowanych usuwano, a jako produkt końcowy wykorzystywano klarowną ciecz, która zawierała komponenty termostabilne w ilości 60% masy pod względem peptydów, w stosunku do produktów hydrolizy rozpuszczalnych w wodzie związków przed obróbką cieplną.

Zawartość związków organicznych w produktach hydrolizy oraz wskaźniki aktywności specyficznej otrzymanego środka, ustalone eksperymentalnie, są podane w tabeli 1 i 2.

Produkt końcowy, zawierający ŚBA w ilości 0,5% masy, a pozostałe - wypełniacz, wykorzystywano jako preparat leczniczy dla leczenia zapalenia gruczołów sutkowych krów w postaci zastrzyków, dokonywanych domięśniowo w dawce 0,05 ml/kg masy ciała co trzeci dzień. Efekt leczniczy występował po 1-4 zastrzykach i był kontrolowany według stanu wymienia oraz według ilości wydzielin ropnych z sutek.

Przykład 8. Klarowną ciecz hydrolizatu, otrzymaną w przykładzie 2, poddawano obróbce cieplnej w Tr=95°C do całkowitej denaturacji związków termolabilnych i po chłodzeniu odwirowywano z przyspieszeniem 50 000 g w ciągu 20 min. Osad usuwano, a w postaci produktu końcowego wykorzystywano klarowną ciecz znad osadu, zawierającą komponenty termostabilne w ilości 30% masy pod względem peptydów w stosunku do produktów hydrolizy rozpuszczalnych w wodzie związków przed obróbką cieplną. Zawartość związków organicznych w produktach hydrolizy oraz wskaźniki specyficznej aktywności otrzymanego środka, określone eksperymentalnie, są podane w tabeli 1 i tabeli 2. ,

Otrzymany produkt końcowy, zawierający ŚBA w ilości 0,5% masy, a pozostałe wypełniacz, wykorzystano jako preparat leczniczy dla zapobiegania zachorowalności cieląt na paragrypę w postaci zastrzyków, które dokonywano domięśniowo w dawce 0,05 ml/kg masy ciała dwa razy z przerwą pomiędzy zabiegami 14 dni. Skuteczność zastosowania preparatu była rejestrowana pod względem ilości zachorowań zwierząt w ciągu miesiąca, która w grupie doświadczalnej nie przekroczyła 10%, a w grupie kontrolnej liczba ta osiągała 22-28%.

Przykład 9. Hydrolizat, otrzymany w przykładzie 4, poddawano obróbce cieplnej w temperaturze Tn=95°C do całkowitej denaturacji związków termolabilnych i po chłodzeniu filtrowano przez bibułę filtracyjną na nuczy. Przesącz, zawierający komponenty termostabilne w ilości 45% pod względem peptydów w stosunku do produktów hydrolizy przed obróbką cieplną związków rozpuszczalnych w wodzie, wykorzystywano w postaci produktu końcowego.

Zawartość związków organicznych w produktach hydrolizy i wskaźniki aktywności specyficznej otrzymanego środka, określone eksperymentalnie, są podane w tabeli 1 i 2.

Produkt końcowy suszono liofilowo i wykorzystywano podjęzykowo jako preparat leczniczy celem leczenia zapalenia gruczołów sutkowych kobiet. Zabieg dokonywano codziennie. Efekt leczniczy występował po 1-4 dniach i był kontrolowany według stanu piersi według obecności stwardnień, wydzielin ropnych oraz analizy krwi.

Przykład 10. Ciecz hydrolizatu, otrzymanego w przykładzie 3, poddawano frakcjonowaniu na urządzeniu ultrafiltracyjnym typu A m i c o n z wykorzystaniem ultrafiltrów przepuszczających związki z względną masą cząsteczkową mniejszą lub dorównującą: 50 000, 10 000, 5 000, 1000, 800, 500.

Biologiczną aktywność otrzymanych frakcji, zawierających związki z względną masą cząsteczkową: 1)M1>50 000

173 321

Tabela 3

Temperatura nagrzewania (obróbki cieplnej) °C	Aktywizacja makrofagów otrzewnowego eksudatu szczurów (in vitro) w wyniku oddziaływania zgłaszanego ŚBA, otrzymanego przy różnej obróbce cieplnej, %, w porównaniu z kontrolą
Wzmocnienie aktywności fermentacyjnej (test NBT)	Wzmocnienie aktywności fagocytowej wobec E Coli
55	61,1 ±2,2	52,:3 ± 2,8
60	66^,1 ± 3,8	55,1 ±2,1
95	72,8±4,8	64,3± 5,6
120	64,3±5,1	58,3±4,2
135	55,3± 5,3	43,0 ± 3,4

Różnice z kontrolą są wiarygodne przy P<0,05.

Tabela 4

Numer porządkowy frakcji	Względna masa cząsteczkowa frakcji, M	Aktywacja makrofagów otrzewnowego eksudatu szczurów, przy oddziaływaniu małocząsteczkowych frakcji zgłaszanego ŚBA, %, w porównaniu z kontrolą
1	M1 >50000	52,1±4,8
2	10000<M250000	93,8±7,6
3	M3<10000	148,4±17,4
4	M4<5000	H0,7±15,l
5	M5<1000	120,5±11,7
6	M6<800	8^,3± 137
7	M7<500	53,4±7,2

Różnice z kontrolą są wiarygodne przy P<0,05

2) 10 000<M2 <50 000; 3) M3<10 000; 4) Mą<5 000;

5) M5<1 000; 6) M6<800 i 7) M7<500, - analizowano pod względem zdolności do aktywizacji makrofagów eksudatu otrzewnowego szczurów według testu NBT. Wyniki przeprowadzonych badań są zebrane w tabeli 4.

Analiza danych tabeli 4 pozwala wyciągnąć następujące wnioski:

1) rozdzielenie aktywności specyficznej według frakcji ma wyrażone maksimum, które przypada na zakres względnych mas cząsteczkowych od 800 do 10 000;

2) obniżenie aktywności specyficznej przy względnej masie cząsteczkowej M>10 000 jest związane ze wzmocnieniem wpływu czynników hamujących w produkcie końcowym i z obniżeniem stężenia substancji aktywnej;

3) obniżenie aktywności specyficznej przy względnej masie cząsteczkowej M<800 jest związane z obniżeniem stężenia substancji aktywnej, reperezentowanej związkami oligomerowymi z M>800.

Przykład 11. Ciecz hydrolizatu, otrzymaną w przykładzie 3, poddawano ultrafiltracji za pomocą aparatu filtracyjnego AP-2,0, wypełnionego włóknami wiskozowymi ΒΠ\Μ5-ΠΑ (TY 6-12-151-87). Otrzymany ultraprzesącz, zawierający małocząsteczkowe komponenty morfoplazmy i glikokaliksu komórek z M < 10 000, wykorzystywano jako produkt końcowy, w którym komponenty małocząsteczkowe z M < 10 000 stanowiły 60% masy pod względem peptydów, w stosunku do produktów hydrolizy związków rozpuszczalnych w wodzie przed ultrafiltracją.

Zawartość związków organicznych w produktach hydrolizy oraz wskaźniki aktywności specyficznej otrzymanego środka, określone eksperymentalnie, są podane w tabeli 1 i 2.

173 321

Produkt końcowy, zawierający ŚBA w ilości 0,1% masy, a pozostałe - wypełniacz, wykorzystywano jako preparat leczniczy dla leczenia eksperymentalnego hepatytu szczurów w postaci zastrzyków, które robiono domięśniowo przy dawkowaniu 0,05 ml/kg masy ciała co drugi dzień (charakter i wyniki leczenia są opisane bardziej dokładnie w przykładach 34 i 35).

Przykład 12. Ciecz hydrolizatu, otrzymaną w przykładzie 2, poddawano dializie w ciągu 16-24 godzin przez błonę z folii wiskozowej przeciwko roztworowi fizjologicznemu, kg którego zawierał 0,8 g środka antyseptycznego. Otrzymany dializat wykorzystywano jako produkt końcowy, który zawierał komponenty małocząsteczkowe z M<10 000 w ilości 30% masy pod względem peptydów, w stosunku do produktów hydrolizy związków rozpuszczalnych w wodzie przed dializą. Zawartość związków organicznych w produktach hydrolizy oraz wskaźniki aktywności specyficznej otrzymanego ŚBA, określone eksperymentalnie, są wskazane w tabeli 1 i 2.

Produkt końcowy, zawierający ŚBA w ilości 0,1% masy, a pozostałe - wypełniacz, wykorzystywano jako preparat leczniczy w postaci zastrzyków dla cieląt celem normalizacji parametrów homeostazy. Wstrzykiwanie preparatu cielętom z odchyleniami od normy robiono domięśniowo w dawce 0,05 ml/kg masy ciała co 1+2 miesiące. Kontrolę efektu dokonywano drogą comiesięcznego ważenia zwierząt, wyniki którego świadczą o podwyższeniu o 45-70% średniodobowego przyrostu ciężaru w porównaniu z kontrolną grupą zwierząt, nie poddawanych obróbce wspomnianym preparatem.

Przykład 13. Klarowną ciecz hydrolizatu, otrzymaną w przykładzie 7, poddawano żelfiltracji w sefadeksie typu G-25 w kolumnie o średnicy d=26 mm i o długości h=600 mm, zrównoważonej decymolowym (0,01 M) fosforanowym roztworem buforowym pH 7,2, zawierającym piętnastocentymolowy chlorek sodowy (0,15 M NaCl). Frakcjonowanie klarownej cieczy hydrolizatu według mas cząsteczkowych dokonywano drogą eluowania kolumny tym samym roztworem buforowym i obraz chromatograficzny eluatu kontrolowano spektrometrycznie przy długości fali 280 nm. Frakcję małocząsteczkowych komponentów hydrolizatu, zawierającą komponenty morfoplazmy i glikokaliksu komórek, eluowano jako produkt końcowy. Zawartość związków organicznych w produktach hydrolizy oraz wskaźniki aktywności specyficznej otrzymanego środka, określone eksperymentalnie, są podane w tabeli 1 i 2.

Produkt końcowy, zawierający ŚBA w ilości 0,1% masy, a pozostałe - wypełniacz, wykorzystywano jako preparat leczniczy dla leczenia cieląt chorych na pneumonię oskrzelową lub ostre schorzenia oddechowe w postaci zastrzyków, robionych domięśniowo w dawce 0,05 mg/kg masy ciała, co trzeci dzień. Efekt leczniczy, który występował po 1-4 zastrzykach, kontrolowano według temperatury ciała.

Przykład 14. Zależność skuteczności zgłaszanego ŚBA od zawartości w nim zmodyfikowanych komponentów morfoplazmy i glikokaliksu komórek określano wykorzystaniem surowca na podstawie tkanek zwierzęcych, w których odbywały się procesy embriogenezy i/lub proliferacji, i/lub zróżnicowania komórek, i/lub patologii, poprzedzającej i/lub towarzyszącej regeneracji lub reperacji tkanki. Otrzymywane tkanki obrabiano w ten sposób, jak i w przykładzie 7. Właściwości otrzymywanego produktu końcowego, z wykorzystaniem tkanki każdego ze wskazanych rodzajów zmodyfikowanych struktur, a mianowicie morfoplazmy i glikokaliksu komórek, są zebrane w tabeli 5.

Analiza tabeli 5 wskazuje na to, że obecność efektu immunomodulującego ŚBA według wynalazku i istotne wzmocnienie tego efektu są uzależnione od wykorzystywanego surowca, z którego otrzymywano produkty hydrolizy, zawierające zmodyfikowane komponenty morfoplazmy i glikokaliksu komórek.

Na przykład, jako surowiec tkanki zwierzęcej, pobranej w stadium proliferacji i zróżnicowania komórek, wykorzystano spermatogonia i spermatocyty męskich gruczołów płciowych szczurów, komórki szpiku kostnego, tkankę nabłonkową jelit szczurów^ a jako surowiec z procesami embriogenezy wykorzystano tkankę embrionalną szczurów. Jako surowiec z procesami briogenezy wykorzystano tkankę embrionalną szczurów. Jako surowiec z procesami patologii, poprzedzającej regenerację, wykorzystano tkankę wątrobową po częściowej hepatek tomii, a jako surowiec z patologią - towarzyszącą regeneracji - tkankę regenerujących się

173 321 kończyn aksolotlu, tkankę wątrobową szczurów po podskórnym wprowadzeniu czterochlorku węgla (CCl4).

Jednocześnie z otrzymanymi danymi eksperymentalnymi, celem porównania, w tabeli 5 są również przedstawione dane, dotyczące efektu immunomodulującego, otrzymanego w wyniku wykorzystania jako surowca tkanki mięśniowej i wątrobowej tkanki intaktnej dorosłych osobników szczurów-samców.

Tabela 5

Rodzaje wykorzystywanych tkanek zwierzęcych	Aktywacja makrofagów otrzewnowego eksudatu szczurów (in vitro) w wyniku oddziaływania zgłaszanego ŚBA-TS otrzymanego z różnych tkanek, %, w porównaniu z kontrolą
Wzmocnienie aktywności fermentacyjnej (test NBT)	Wzmocnienie aktywności fagocytowej wobec E.Coli
Hepatocyty intaktnej wątroby	32,2±5,4	3O,8± 2,7
Mięśniowa intaktna tkanka dorosłych zwierząt	43,6±6,8	35,2±2,6
Spermatogonia i spermatocyty męskich gruczołów płciowych	63,8 ± 3,5	55,4±3,2
Tkanka nabłonkowa jelit	68,2 ± 6,3	61,3±5,2
Hepatocyty wątroby po wprowadzeniu CClą	72,1±4,2	64,4±4,3
Komórki szpiku kostnego	74,2± 61	67,5±4,1
Tkanka regenerujących kończyn	82,5	70,2
aksolotlu*	87,3	77,4
Embrionalna tkanka mięśniowa	83,7±5,2	73,6±4,8
Hepatocyty regenerującej wątroby szczurów po hepatektomii	94,8 ± 5,7	78,8±5,6

* Tkanka, dla której podane w tabeli wielkości wskaźników otrzymano przy konkretnym wykonaniu eksperymentu

Różnice z kontrolą są wiarygodne przy P<0,05

Analiza danych tabeli 5 wskazuje na to, że immunomodulujący efekt ŚBA według wynalazku przy wykorzystaniu tkanek, pobranych w stadium przebiegu w nich procesu embriogenezy, proliferacji i patologii, która poprzedzała i/lub towarzyszyła regeneracji i/lub reperacji, jest znacznie wyższy, niż ten, który posiadają znane środki, wykorzystujące surowiec z tkanki zwierzęcej, w której nie odbywały się wskazane wyżej procesy.

Oprócz tego, można również dojść do wniosku, że z tkanek, w których są obserwowane wskazane wyżej procesy, największy efekt immunomodulujący mają regenerująca się tkanka wątrobowa, tkanka embrionalna i regenerująca się tkanka kończyn płazów.

Przykład 15. Jako surowiec wykorzystywano regenerującą się wątrobę szczurów 4 12 godzin po dokonaniu hepatektomii, wykonanej zgodnie ze znaną metodą (G. M. Higgins, R. M. Anderson Experimental pathology of the liver. -Atch. Patology, -1931- N 12-p. 186).

Tkankę wątrobową drobno krajano i mieszano z trzykrotną objętością roztworu fizjologicznego, po czym odwirowywano z przyspieszeniem 15 000 g w ciągu 10 min, a otrzymany osad

173 321 mieszano z trzykrotną objętością roztworu fizjologicznego i odwirowywano w tych samych warunkach. Operacje przemywania rozdrobnionej tkanki wątrobowej powtarzano 3 razy i potem dalsze stadium otrzymania produktu końcowego wykonywano w ten sam sposób, jak i w przykładach 3, 7 i 11.

Aktywność specyficzną otrzymanych produktów końcowych określano eksperymentalnie według aktywacji zdolności reperacyjnych hepatocytów wątroby szczurów po porażeniu czterochlorkiem węgla (CClą), przy którym aktywność Na, K-ATFazy była odnawiana, odpowiednio, o 32,7±3,1%; o 43,6±3,9% i o 85,4±7,8% w porównaniu z grupą zwierząt, którym środek według wynalazku nie był wstrzykiwany.

Aktywność aminotransferaz we krwi odnawiała się, odpowiednio, o 37,4±2,8%; 47,2±3,4% i 98,3±1,7%, a stężenie potasu w hepatocytach wątroby - o 22,6±1,8%; 28,9±2,5% i o 59,1 ±4,7%. _x

Produkt końcowy, zawierający ŚBA w ilości 0,1% masy, a pozostałe - wypełniacz, wykorzystywano jako preparat leczniczy dla leczenia cieląt, chorych na zapalenie wątroby w postaci zastrzyków, które robiono domięśniowo w dawce 0,05 mg/kg masy ciała co trzeci dzień. Efekt leczniczy występował po dokonaniu 7-14 zastrzyków i był kontrolowany według aktywności aminotransferaz, stężeniu we krwi azotu i bilirubiny.

Przykład 16. Jako surowiec wykorzystywano makuchę gruczołów płciowych byków, otrzymaną po wydzielaniu z nich lidazy drogą ekstrahowania 3%-wym kwasem octowym homogenatu tkanki.

Otrzymaną makuchę gruczołów płciowych, która jest odpadem poprodukcyjnym lidazy, ponownie homogenizowano w potrójnej objętości roztworu fizjologicznego z zastosowaniem homogenizatorów nożowych i odwirowywano z przyspieszeniem 250 g w ciągu 15 min celem usunięcia nienaruszonych elementów tkanki. Za pomocą decynormalnego roztworu wodnego sody żrącej (0,1N NaOH) doprowadzono kwasowość środowiska do wartości pH 7,4 i dodawano środek antyseptyczny w ilości 0,8 g/l do homogenatu, zawierającego składniki z komponentami morfoplazmy i glikokaliksu komórek, zmodyfikowanych podczas procesów proliferacji i zróżnicowania komórek, który po wymieszaniu poddawano hydrolizie i dalszej obróbce w ten sam sposób, jak i w przykładach 3, 7 i 11.

Aktywność specyficzną otrzymanych produktów końcowych określano eksperymentalnie według aktywacji makrografów otrzewnowego eksudatu i neutrofilów krwi szczurów. Przy wykorzystywaniu produktu końcowego, otrzymanego w ten sam sposób, jak i w przykładzie 11, aktywność fermentacyjna makrografów została powiększona o 108,3±13,2%, a aktywność fagocytowa wobec E. Coli - o 92,2±10,2%. Dla neutrofilów krwi podobne wskaźniki powiększyły się odpowiednio o 99,2±14,1% i o 72,4±8,3%.

Produkt końcowy, zawierający ŚBA w ilości 0,1% masy, a pozostałe - wypełniacz, mieszano z 50 objętościami wody i wykorzystywano jako środek do pojenia, celem normalizacji parametrów homeostazy kur. Pojenie preparatem kur z odchyleniami wspomnianych wyżej parametrów od normy dokonywano w dawce 5 ml/kg masy ciała co 2 - 6 tygodni. Efekt oceniano przez obliczenie nośności, ulegającej podwyższeniu o 15+30% w porównaniu z grupą kontrolną drobiu, nie poddawanego obróbce preparatem.

Przykład 17. Jako surowiec wykorzystywano tkankę łożyskową krów, którą obrabiano w ten sam sposób, jak i’ w przykładach 3, 7 i 11, z otrzymaniem produktów końcowych, aktywność specyficzną których określano eksperymentalnie według aktywacji makrografów eksudatu otrzewnowego i neutrofilów krwi szczurów w porównaniu z grupą kontrolną. Przy wykorzystywaniu produktu końcowego, otrzymanego w ten sam sposób, jak i w przykładzie 11, aktywność fermentacyjna makrografów powiększała się o 150,6±17,4%, aktywność fagocytowa makrofagów powiększała się o 109,3±12,7%. Dla neutrofilów krwi odpowiednie wskaźniki zwiększały się, odpowiednio, o 137,6+16,8% i o 95,7+11,3%.

Produkt końcowy, zawierający ŚBA w ilości 0,5% masy, a pozostałe - wypełniacz, wykorzystywano w postaci preparatu leczniczego dla leczenia krów, chorych na zapalenie błonki śluzowej ciała macicy, w postaci zastrzyków, robionych domięśniowo w dawce 0,05 ml/kg masy ciała co trzeci dzień. Efekt leczniczy występował po 6-10 zastrzykach i był kontrolowany na podstawie wskaźników reakcji zapalenia, badań histologicznych i wydzielin ropnych.

173 321

Przykład 18. Celem przygotowania ŚBA według wynalazku jako surowiec wykorzystano makuchę grasicy, otrzymaną po wydzielaniu z homogenatu nierozpuszczalnych komponentów tkanki, które są odpadami poprodukcyjnymi thymozyny.

Makuchę grasicy obrabiano w ten sam sposób, jak i w przykładach 3,7 i 11, z otrzymaniem produktów końcowych, specyficzną aktywność których określano eksperymantalnie według stymulacji reakcji blasttransformacji T-limfocytów, która powiększała się o 165,6+13,7% w porównaniu z grupą kontrolną przy wykorzystaniu produktu końcowego, otrzymanego w ten sam sposób, jak i w przykładzie 11.

Produkt końcowy, zawierający ŚBA w ilości 0,5% masy, a pozostałe - wypełniacz, wykorzystywano drogą wprowadzenia przez jamę nosową w postaci preparatu leczniczego celem profilaktyki chorób zakaźnych człowieka. Do każdego nozdrza wprowadzano po dwie krople preparatu z następnym masażem dla rozprowadzenia po błonie śluzowej. Zabieg przeprowadzano 2 razy dziennie. Kontrolę efektu dokonywano na podstawie ogólnego stanu organizmu i temperatury ciała.

Przykład 19. Analizę aminokwasową składu ŚBA, otrzymanego w ten sam sposób, jak i w przykładach 1-8, przeprowadzano w trzech kierunkach, przy tym określano:

- Ogólny skład aminokwasowy;

- Skład aminokwasowy peptydów i wolnych aminokwasów przy nieobecności nierozpuszczalnego w kwasach białka;

- Skład wolnych aminokwasów

1) Ogólna analiza aminokwasowa ŚBA, otrzymanego w ten sam sposób, jak i w przykładach 1-8, przeprowadzano drogą hydrolizy środka w 6-ciu normalnym kwasie solnym (6 N HCl) w temperaturze 110^oC w ciągu 24 godzin w próżni. Po skończeniu hydrolizy próbki odparowywano w próżni nad suchą sodą żrącą (NaOH). Suchą pozostałość rozcieńczano w buforowym dwudecynormalnym (0,2 N) roztworze cytrynianu sodu o pH 2,2 i powlekano nią kolumny wymieniaczy jonów analizatorów aminokwasów.

2) Celem usunięcia białka nierozpuszczalnego w kwasach, do 0,5 ml próbki dodawano 0,5 ml 3%-go kwasu sulfosalicylowego, pozostawiano na 1 godzinę, w ciągu której otrzymaną w ten sposób mieszaninę periodycznie mieszano. Zdenaturowane białka usuwano drogą odwirowywania z przyspieszeniem 8 000 g w ciągu 15-20 min. Otrzymaną klarowną ciecz poddawano ogólnej analizie aminokwasowej.

3) Zawartość wolnych aminokwasów w ŚBA, otrzymanym w ten sam sposób, jak i w przykładach 1-18, określano po zrównoważeniu próbek dwudecynormalnym (0,2 N) buforowym roztworem cytrynianu sodu o pH 2,2 i po filtracji poprzez odpopielony sączek z bibuły, próbkami powlekano kolumny wymieniaczy jonów analizatorów aminokwasów.

Wymywanie aminokwasów z kolumien przeprowadzano przy zastosowaniu buforowych roztworów cytrynianu sodu o pH 3,25; pH 4,25 i pH 5,28. Frakcjonowane aminokwasy obrabiano odczynnikiem ninhydrynowym i określano gęstość optyczną za pomocą fotometru przepływowego przy długości fali 440 i 570 nm.

Przykład 20. Zawartość ogólnych lipidów w ŚBA, otrzymanym w ten sam sposób jak i w przykładach 1-18, określano w sposób następujący. 0,5 ml ŚBA mieszano z 1,5 ml stężonego kwasu siarkowego (H2 SO4) i gotowano w temperaturze 95°C w ciągu 15 min. Po ostygnięciu do 1,0 ml hydrolizatu dodawano 1,5 ml odczynnika fosfowanilinowego produkcji firmy Chemapol (Czecho-Słowacja) zgodnie ze znaną metodą określenia ogólnych lipidów według specyficznego zabarwienia (J. M. Knight, S. Anderson, J. M. Rawie, -Clinical Chemistry-1972, -18- p. 199). Gęstość optyczną tworu określano przy długości fali 530 nm.

Przykład 21. Analizę składu nukleotydowego ŚBA, otrzymanego w ten sam sposób jak i w przykładach 1-18, dokonywano w sposób następujący. Rozpuszczalne w kwasach nukleotydy purynowe i pirymidynowe ekstrahowano z 1,5-5,5 ml próbki 5%-wym schłodzonym kwasem nadchlorowym (HClO4). Próbki po 20 min chłodnego ekstrahowania odwirowywano z przyspieszeniem 2 500 g w ciągu 10 min, osad trzykrotnie przepłukiwano 5%-wym kwasem nadchlorowym (HClO4), klarowne ciecze znad osadów połączono i wykorzystywano celem wydzielania nukleotydów rozpuszczalnych w kwasach. Frakcję, rozpuszczalną w kwasach, hydrolizowano jednomolowym kwasem nadchlorowym (1 M HCLO 4) w temperaturze 100°C

173 321 w ciągu 1 godziny do pirymidynowych monofosforanów i zasad purynowych. Roztwory neutralizowano, stosując potas żrący (KOH) i produkty Hydrolizy rozdzielano przy pomocy wymieniacza kationowego typu DAUEKS 50x4, wykorzystując wymywanie stopniowe: stosując destylat (H2O) - dla kwasu moczowego i urydinmonofosforanu (UMP); dwudecymolowy kwas nadchlorowy (0,2 M HClOą) - dla ksantyny i cytozynmonofosforanu (CMF); czterodecymolowy kwas nadchlorowy (0,4 M HClOą) - dla Hipoksatyny; jednomolowy kwas nadchlorowy (1,0 M HClOą) - dla guaniny; dwumolowy kwas nadchlorowy (2,0 M HClOą) dla adeniny.

Nukleotydy identyfikowano według ruchliwości chromatograficznej na wymieniaczu kationowym w porównaniu ze standardami, jak również według widm absorpcyjnych w zakresie 200-300 nm. Ilość nukleotydów określano, wykorzystując wielkości współczynników ekstyncji molamej.

Przykład 22. Aktywność immunomodulująca (właściwości) ŚBA, otrzymanego w ten sam sposób, jak, i w przykładach 1-18, określano według aktywacji makrofagów eksudatu otrzewnowego szczurów linii Wister w eksperymentach in vitro, według wzmacniania się aktywności fermentacyjnej przy odnowieniu nitro-błękitnego tetrazolium w diformazan (test NBT) i według wzmacniania się aktywności fagocytowej wobec E.Coli.

Do jamy brzusznej zdekapitowanych zwierząt za pomocą igły ze strzykawką wprowadzano 20 ml bezbarwnego roztworu Henksa, zawierającego 20 jed/ml geparyny. Po 2-3 min masażu brzucha robiono nacięcie i tą samą strzykawką z jamy brzusznej odsysano wprowadzoną ciecz, którą po filtracji przez kapronowy, odwirowano z przyśpieszeniem 150-200 g w ciągu 15 min. Otrzymany osad przeprowadzano w stan zawiesiny w połowie objętości świeżej porcji roztworu Henksa i ponownie odwirowano w tych samych warunkach. Przepłukiwania wydzielonych komórek dokonywano 3-4 razy, po czym stężenie komórek w zawiesinie doprowadzano do 80 x 10” komórek/ml. Zawartość makrofagów w eksudacie tkankowym wszystkich komórek stanowiła 25-35%.

Określenie aktywności fermentacyjnej makrofagów eksudatu otrzewnowego szczurów przeprowadzano z wykorzystaniem spektrofotometrii według redukcji nitro-błękitnego tetrazolium w diformazan. Osad komórek eksudatu otrzewnowego szczurów rozcieńczano roztworem Hanksa do stężenia 80 x 10° komórek/ml. Do 50 ml zawiesiny komórkowej dodawano 50 ml próbki o pH-. 7,4 i o stężeniu peptynów 1,0 mg/ml. Mieszaninę pozostawiano do inkubacji w temperaturze 37°C na łaźni wodnej przy stałym wstrząsywaniu w ciągu 30 min, po czym dodawano 50 ml nasyconego w temperaturze 20°C roztworu nitro-błękitnego tetrazolium firmy Reanal (Węgry) i kontynuowano inkubację jeszcze w ciągu 30 min. Potem dodawano 3 ml acetonu i odwirowywano z przyśpieszeniem 2 000 g w ciągu 20 min. Acetonowy wyciąg nadosadowy poddawano fotometrii przy długości fali 515 nm.

Celem porównania aktywności fermentacyjnej wykorzystywano kontrolnie próbkę ze środkiem antyseptycznym na bazie roztworu fizjologicznego.

Aktywność fagocytową komórek eksudatu otrzewnowego szczurów określano według icH zdolności do absorbacji E. Coli.

Do 50 ml zawiesiny komórkowej dodawano 50 ml próbki o pH 7,4 i stężeniu peptydów 0,05 mg/ml. Mieszankę pozostawiano do inkubacji w temperaturze 37°C na łaźni wodnej przy stałym wstrząsywaniu w ciągu 30 min. Po skończeniu inkubacji mieszankę przeprowadzano w stan zawiesiny w 10 ml bezbarwnego roztworu Henksa w temperaturze 4°C i odwirowywano z przyspieszeniem 150-200 g w ciągu 15 min. Osad komórek eksudatu otrzewnowego szczurów rozcieńczono bezbarwnym roztworem Henksa do stężenia 2,5 x 10° komórek/ml. Otrzymaną w ten sposób zawiesiną w ilości 0,2 ml powlekano szkło o wymiarach 18x 18 mm i poddawano inkubacji w temperaturze 37°C w ciągu 30 min w atmosferze z 5% dwutlenku węgla (CO2) celem przymocowania makrofagów do szkła.

Po inkubacji, celem usunięcia nieprzymocowanycH komórek, szkło 3 razy opłukiwano w szklankach ze środowiskiem Henksa. Do pozostałych na szkle komórek dodawano 0,2 ml zawiesiny E. Coli ze stężeniem 20 x 10 ° komórek/ml i poddawano inkubacji w tych samych warunkach w ciągu 45 min. Później szkło znów trzy razy opłukiwano, utrwalano metanolem i farbowano według Romanowskiego-Gimzy.

'24

173 321

Indeks fagocytozy (IF) określano według wzoru: IF = (0 + 2,5n + 6t + 9p + 1 OR)/ilość komórek gdzie:

(1)

- ilość komórek nie fagocytujących E. Coli; n - ilość komórek, absorbujących 1-4 komórki; t - ilość komórek, absorbujących 5-7 komórek; p - ilość komórek, absorbujących 8-9 komórek;

R - ilość komórek, absorbujących 10 i więcej komórek E. Coli.

Identyfikacja makrofagów była dokonywana według zabarwienia niespecyficznej esterazy. Przykład 23. Aktywność immunomodulującą ŚBA, otrzymanego w ten sam sposób jak i w przykładach 1-18, określano według aktywacji neutrofilów krwi szczurów linii W i s t a r w eksperymentach in vitro, według wzmacniania się aktywności fermentacyjnej przy odnawianiu nitro-błękitnego tetrazolium w diformazan (test NBT) i według wzmacniania aktywności fagocytowej wobec E. Coli.

Krew z arterii ogonowej szczurów od razu pobierano do probówki z bezbarwnym roztworem Henksa na heparynie i mieszano. Do otrzymanej mieszaniny dodawano 6% dekstran T-500 w stosunku 3:1 i probówki na jedną godzinę stawiano do lodówki. Po osadzaniu się erytrocytów nadosadową warstwę leukocytów pobierano pipetą i odwirowywano z przyspieszeniem 250 g w ciągu 15 min. Usunięcie erytrocytów z masy leukocytarnej było dokonywane przez hemolizację drogą przeprowadzenia do stanu zawiesiny osadu leukocytów w wodzie destylowanej, po czym dodawano roztwór Henksa i mieszankę odwirowywano. Osad leukocytów ponownie przeprowadzano w stan zawiesiny z zastosowaniem świeżego roztworu Henksa i odwirowywano w tych samych warunkach. Operację przepłukiwania leukocytów dokonywano 3 razy.

Określenie aktywności fermentacyjnej neutrofilów krwi przeprowadzano sposobem spektrofotometrycznym według redukcji nitro-błękitnego tetrazolium w diformazan.

Osad leukocytów krwi szczurów rozcieńczano bezbarwnym roztworem Henksa do stężenia 80 x 10° komórek/ml. Do 100 ml zawiesiny komórkowej dodawano 300 ml ŚBA, otrzymanego zgodnie z przykładami 1-26, pH którego doprowadzono do 7,4, i stężenie peptydów - do 1,0 mg/ml. Mieszankę pozostawiano do inkubacji w temperaturze 37°C na łaźni wodnej przy stałym wstrząsaniu w ciągu 30 min., po czym dodawano 400 ml roztworu nitro-błękitnego tetrazolium Reanal (Węgry) i dalsze operacje przeprowadzano w tej samej kolejności, jak i w przykładzie 22.

Aktywność fagocytową leukocytów krwi szczurów określano według ich zdolności do absorbacji E. Coli. ,

Do 50 ml zawiesiny dodawano 50 ml ŚBA o pH 7,4 i o stężeniu peptydów 0,05 mg/ml. Mieszankę poddawano inkubacji, a potem dodawano 10 ml bezbarwnego roztworu Henksa w temperaturze 4°C i odwirowywano z przyspieszeniem 150-200 g w ciągu 15 min. Osad leukocytów rozcieńczano w 0,3 ml roztworu Henksa i dodawano 0,05 zawiesiny E. Coli o stężeniu 500 x 10^b komórek/ml, a potem poddawano inkubacji 30 min w temperaturze 37°C. Po inkubacji pobierano rozmazy, w których po farbowaniu ilość fagocytujących komórek oraz indeks fagocytozy (IF) obliczano w ten sam sposób, jak to pokazano w przykładzie 22.

Przykład 24. Aktywność immunomodulującą ŚBa, otrzymanego w ten sam sposób jak i w przykładach 1-18, określano eksperymentalnie in vivo na myszach linii BALB/C. Zwierzętom robiono dwa zastrzyki podskórne z odstępem dwa dni w dawce po 0,5 ml/kg masy ciała przy stężeniu peptydów 1,0 mg/ml. Analizę właściwości immunomodulujących dokonywano po upływie dwóch dób po ostatnim zastrzyku. W każdym eksperymencie wykorzystywano nie mniej niż 10 zwierząt. Jako grupę kontrolną wykorzystano zwierzęta obrobione według wskazanego schematu 0,08% środkiem antyseptycznym, rozcieńczonym w roztworze fizjologicznym.

Celem określenia reakcji blasttransformacji limfocytów jako mitogen T-komórkowy wykorzystano fitogemagliutinin(FGA), a jako mitogen B-komórkowy - lipopolisacharyd E. Coli (LPS). Limfocyty, wydzielone ze śledziony myszy, poddawano inkubacji ze wspomnianymi

173 321 mitogenami w ciągu 72 godzin przy temperaturze 37°C w atmosferze z 5% dwutlenku węgla (CO2). Poziom - 55 - proliferacji komórek oceniano radiometrycznie według włączenia ^JH-tymidyny. W tym celu do kultur dodawano 'H-tymidynę (3,7 x 10⁴ Bq/próbkę) i poddawano inkubacji w ciągu 3 godzin. Potem próbki nakładano na filtry milliporowate (Synpor N 5, CSRS), trzykrotnie przepłukiwano przez środowisko 199, potem - przez 5% roztwór kwasu trój chlorooctowego (TCHO) i etanol. Filtry suszono, wkładano do flakonów z cieczą scyntylującą A'C-106 i określano promieniotwórczość próbek za pomocą licznika typu Mark-111.

Przykład 25. Skuteczność immunomodulującą ŚBA, otrzymanego w ten sam sposób jak i w przykładach 1-18, określano według stymulowania naturalnej aktywności killerowej splenocytów myszy w eksperymentach in vivo. Zwierzętom w ciągu dwu dni robiono dwa podskórne zastrzyki preparatu w dawce po 0,05 ml/kg masy ciała ze stężeniem w nich peptydów 1,0 mg/ml. Analizę właściwości immunomodulujących przeprowadzano w następną dobę po ostatnim zastrzyku. W każdym eksperymencie wykorzystywano nie mniej niż 10 zwierząt. Jako kontrolę wykorzystywano zwierzęta, obrobione według wskazanego schematu 0,08% środkiem antyseptycznym, rozcieńczonym w roztworze fizjologicznym.

Stan naturalnej aktywności killerowej splenocytów określano na komórkach limfomy myszy YAC-12, znaczonych przez izotop chromu ^Cr. Inkubacji dokonywano w ciągu 18 godzin przy stosunku komórek-celii komórek-efektorów 1:25 (1 x 105 : 2,5 _χ |0⁶ komórek). Specyficzne wyzwalanie izotopu chromu ³‘Cr, odpowiadające aktywności cytotoksycznej komórek efek- tornych, obliczano według wzoru:

Cr = (wyzwalanie podczas eksperymentu) - (samoczynne wyzwalanie się) (maksymalne wyzwalanie się) - (samoczynne wyzwalanie się) x 100 (2) gdzie maksymalne wyzwalanie oznacza promieniotwórczość, przy której wszystkie komórki już są lizyrowane. Jako kontrolę do określania wzmocnienia naturalnej aktywności killerowej przez ŚBA stosowano środek antyseptyczny, rozcieńczony w roztworze fizjologicznym.

Przykład 26. Skuteczność immunomodulującą ŚBA, otrzymanego w ten sam sposób, jak i w przykładach 1-18, określano według aktywności funkcjonalnej grasicy myszy w eksperymentach in vivo w warunkach, analogicznych przykładu 24.

Efekt oddziaływania oceniano według miana tymusowego czynnika surowiczego (TCS). Metoda jest zbudowana w oparciu o zdolność grasicy do odnawiania czułości spontanicznych komórek tworzących rozetę śledziony dorosłych myszy po thymektomii wobec surowicy antythymocytowej.

Surowicę krwi myszy wykorzystywanych w eksperymencie, przepuszczano przez ultrafiltr systemu CENTRIFILO CF-50A produkcji firmy A m i c o n. W reakcji wykorzystano po 0,1 ml surowicy seryjnie rozcieńczonej środowiskiem 199. Jako kontrolę wykorzystano środowisko 199.

Śledzionę pobierano u myszy po 10-14 dniach po thymektomii. Ze śledziony pobierano komórki drogą rozdzielania włókna tkanki za pomocą igieł preparacyjnych w środowisku 199. Po filtracji przez sito kapronowe były one dwukrotnie odmywane przez środowisko 199, drogą odwirowywania z przyspieszeniem 4 000 g. Osad ponownie przeprowadzano w stan zawiesiny w środowisku do stężenia4 χ 10⁷ komórek/ml i w ten sposób otrzymywano zawiesinę w objętości 0,1 ml, którą dodawano do probówek z surowicą i ze środowiskiem 199. Zawartość probówek mieszano pipetkowaniem i poddawano inkubacji w temperaturze 37° w ciągu 60 min.

Po inkubacji, do wszystkich probówek dodawano po 0,1 ml surowicy antythymocytowej i komplementu świnek morskich w rozcieńczeniu 1:10. Zawiesinę poddawano inkubacji w temperaturze 37°C jeszcze 30 min. Potem do mieszanki dodawano po 0,1 ml zawiesiny erytrocytów barana (12 x 10' komórek/ml), mieszano, odwirowywano z przyspieszeniem 250 g w ciągu 5 min i poddawano inkubacji w ciągu 60 min w temperaturze 4-8°C. Osad w probówkach ponownie przeprowadzano w stan zawiesiny w ciągu 5 min. Obliczenie rozetek

173 321 przeprowadzano w komorze Gorjaewa. Za rozetkę uważano limfocyt, który dołączył do siebie cztery i więcej erytrocytów. Zamiano TCS uważano ostatnie rozcięczenie surowicy, powodujące

50% redukcję liczby komórek tworzących rozetki (KTR), w stosunku do kontroli. Wyniki wyrażano w postaci logarytmu miana przy podstawie 2, to znaczy w postaci log A, gdzie A wartość wielkości miana.

Przykład 27. Skuteczność ŚBA, otrzymanego w ten sam sposób jak i w przykładach 1-18, która ujawnia się przez wzmacnianie zdolności reperacyjnych hepatocytów wątroby szczurów in vivo po podskórnym wprowadzeniu czterochlorku węgla (CCU), określano według odnowienia aktywności Na, K-ATFazy w sposób następujący.

Szczurom-samcom o wadze 230-250 g linii Wistar codziennie w ciągu 4 dni wstrzykiwano podskórnie czterochlorek węgla (CCl 4) zmieszany z olejem roślinnym w stosunku 1:1 w dawce 4,0 ml/kg masy ciała zwierzęcia. Po 4 godzinach po pierwszym wstrzykiwaniu czterochlorku węgla (CCI4) zwierzętom doświadczalnym robiono pierwszy z 4 wstrzykiwań podskórnych środka z przerwą w jeden dzień w dawce 0,05 ml/kg masy ciała zwierzęcia. Skuteczność środka rejestrowano w dniu następnym po ostatnim wstrzykiwaniu. Przy tym jako kontrolę porównawczą, wykorzystywano wątrobę zwierząt porażoną czterochlorkiem węgla (CCI4) w sposób analogiczny, ale bez zastosowania badanych ŚBA, jak również wątrobę zwierząt kontrolnych.

Celem określenia aktywności Na, K-ATFazy, wykorzystywano frakcje membran komórkowych hepatocytów. W tym celu 15 g chłodzonej wątroby trzech szczurów homogenizowano w 150 g jednomillimolowego buforowego roztworu boranowego (1mM Na2B 4O7) o pH=7,5 w obecności pięciodecymillimolowego roztworu chlorku wapniowego (0,5 mM CaCl2), korzystając z ręcznego szklanego homogenizatoru z tłuczkiem teflonowym. Mieszankę zhomogenizowaną odwirowywano z przyspieszeniem 150 g przy temperaturze 4°C w ciągu 10-12 min. Ciecz znad osadu ponownie odwirowywano z przyspieszeniem 100 000 g w ciągu 20 min, a otrzymany osad 3 razy odmywano w 130 ml buforu w tych samych warunkach odwirowywania. Po skończeniu odmywania osad ponownie przeprowadzano w stan zawiesiny w roztworze buforowym, doprowadzając stężenie białka do 3 mg/l, według metody SDS-Louri.

Wszystkie operacje, związane z otrzymywaniem membran, przeprowadzano w niskiej temperaturze.

Aktywność Na, K-ATFazy membrany plazmatycznej hepatocytów określano w środowisku standaryzowanym, o składzie: sześćdziesięciosześciomillimolowy chlorek sodowy (66 mM NaCl), trzydziestoczteromillimolowy chlorek potasowy (34 mM KCl), pięciomillimolowy chlorek magnezowy (5 mM MgCl2), dwudziestopięciomillimolowy (25 mM) Tris-HCl, do którego przed rozpoczęciem eksperymentu dodawano pięciomillimolowy kwas adenozynotrójfosforowy (5 mM ATP).

Do 1,8 ml wspomnianego wyżej środowiska standaryzowanego dodawano 0,2 ml zawiesiny frakcji membran o stężeniu białka 3,0 mg/l i poddawano inkubacji przy temperaturze 37°C w ciągu 45 min, po czym reakcję przerywano, dodając 0,6 ml 50% roztworu kwasu trójchlorooctowego (TCO). Mieszaninę odwirowywano z przyspieszeniem 300-500 g w ciągu 15 min. Do 1,0 ml otrzymanej cieczy dodawano 4 ml dwudecymolowego (0,2 M) buforowego roztworu octanowego o pH=4,0, 0,5 ml 1 % roztworu molibdenu amonowego w 1 % roztworze kwasu siarkowego (H2SO4), 0,5 ml kwasu askorbinowego w 0,16% roztworze siarczanu miedziowego pięciowodnego (CUSO4) i po wymieszaniu poddawano inkubacji w ciągu 10 min. w temperaturze 25°C. Gęstość optyczną określano spektrometrycznie przy długości fali 700 nm.

Aktywność Na, ATFazy obliczono według różnicy pomiędzy aktywnościami ATFazy ogólnej i Mg-ATFazy. Celem określenia aktywności Mg-ATFazy przeprowadzono analogiczne badania, jednak zamiast 0,6 ml trójchlorooctowego do mieszaniny dodawano 0,3 ml 0,05% roztworu strofantyny.

Ustalono, że w wypadku porażenia toksycznego wątroby czterochlorkiem węgla (CClą) aktywność Na, K-ATFazy obniża się w 3,5 razy, jednakże przy zastosowaniu ŚBA według wynalazku, jak w przykładzie 11, jej aktywność jest odnawiana w eksperymencie nie mniej niż o 50%, w porównaniu z normą.

Przykład 28. Skuteczność ŚBA, otrzymanego w ten sam sposób jak i w przykładach 1-18, która ujawnia się we wzmocnieniu zdolności reperacyjnych hepatocytów wątroby szczu173 321 rów (in vivo) po podskórnym wprowadzeniu czterochlorku węgla (CClą), określano według odnowienia aktywności we krwi aminotransferaz i stężenia potasu (K+) w hepatocytach wątroby szczurów w następujący sposób.

U zwierząt, obrobionych w ten sam sposób jak i w przykładzie 27, aktywność aminotransferaz we krwi kontrolowano według systemu testowego firmy Chemanol (Czecho-Słowacja), zgodnie z metodą fotometryczną na podstawie specyficznego zabarwienia (S. Reitman,

S. Frankel. - American Journal of Clinical Pathology, -1957-28-56).

Do 0,25 ml roztworu, zawierającego decymolowy roztwór (0,1 M) L-aspartatu, dwumillimolowy (0,002 M) 2-oksoglutoratu i decymolowy (0,1 M) buforowy roztwór fosforanowy o pH = 7,4, dodawano 0,05 ml surowicy krwi szczurów i poddawano inkubacji w temperaturze 37°C w ciągu 60 min. Po skończeniu inkubacji do roztworu dodawano 0,25 ml millimolowej (0,001 M) 2,4 - dwunitrofenylohydrazyny, rozpuszczonej w jednomolowym kwasie solnym (1 M HCl) i próbkę zostawiano na 20 min. w temperaturze pokojowej, po czym dodawano 2,5 ml czterodecymolowej (0,4 M) sody żrącej (NaOH), mieszano i po 10 minutach mierzono gęstość optyczną przy długości fali 520 nm, porównując z roztworem kontrolnym, w którym zamiast 0,05 ml surowicy krwi dodawano 0,05 ml roztworu fizjologicznego.

Porażenie toksyczne wątroby czterochlorkiem węgla (CClą), powoduje zniszczenie hepatocytów i odpowiednio, wyjściem aminotransferaz, w związku z czym, ich aktywność w surowicy krwi podwyższa się w 2 razy. Jednocześnie, zastosowanie ŚBa według wynalazku, jak w przykładzie 11, pozwala na odnowienie w eksperymencie podobnej aktywności, nie mniejszej niż 59%, w porównaniu z normą.

Stężenie potasu (K+) w hepatocytach wątroby szczurów doświadczalnych określano przy pomocy standaryzowanej metody fotometrii płomieniowej, według Brikkera, z zastosowaniem fotometru płomieniowego typu ΠΦΜ-1 (B.H. EpHKKep. OnpeueaieHHe co,nepxaHHH K, Ha mcto.mom nnaMeHHon φοτοΜ.τρΜΜ.- PaSopaTopHoe oa-io -1961-7-s(a. 3-6).

Ustalono, że przy porażeniu toksycznym wątroby czterochlorkiem węgla (CClą), aktywność Na, ATFazy obniża się 3,5 razy, czemu towarzyszy obniżenie stężenia K+ w hapatocytach wątroby szczurów o 40%. Jednocześnie zastosowanie ŚBA według wynalazku, otrzymanego w ten sam sposób, jak w przykładzie 11, pozwala na odnowienie stężenia K+ nie mniej, niż o 43%.

Zidentyfikowanie ŚBA według wynalazku wśród innych środków biologicznie aktywnych jest możliwe bezpośrednio - z analizy biochemicznej składu i w sposób po wielkości wykazywanego efektu immunomodulującego.

Zostało ustalone, że właśnie zawartość zmodyfikowanych komponentów morfoplazmy i glikokaliksu komórek ze zmodyfikowaną strukturą w ŚBA według wynalazku zapewnia istotne wzmocnienie reakcji odpornościowej organizmu w porównaniu z grupą kontrolną. Zezwala to na zidentyfikowanie zgłaszanego ŚBA według wymienionego niżej zespołu wskaźników:

a) Według podwyższenia aktywności makrofagów eksudatu otrzewnowego szczurów, a mianowicie według wzmacniania się aktywności fermentacyjnej makrofagów, kontrolowanej za pomocą testu NBT - nie mniej, niż o 54% (przy zastosowaniu w eksperymentach nitro-błękitnego tetrazolium - NBT produkcji węgierskiej firmy Reanal), oraz według wzmocnienia aktywności fagocytowej E. Coli - nie mniej, niż o 39%;

b) Według podwyższenia aktywacji neutrofilów krwi szczurów, a mianowicie według wzmocnienia aktywności fermentacyjnej, kontrolowanej według testu NBT - nie mniej, niż o 67% (przy zastosowaniu w eksperymentach nitro-błękitnego tetrazolium produkcji węgierskiej firmy Reanal) i według wzmocnienia aktywności fagocytarnej E. Coli - nie mniej, niż o 44%

c) Według wzmocnienia reakcji blasttransformacji T-limfocytów - nie mniej niż o 42% i B-limfocytów - nie mniej, niż o 50%;

d) Według wzmocnienia aktywności funkcjonalnej grasicy - zgodnie z zawartością we krwi szczurów thymicznego czynnika surowicznego (TCS) - nie mniej, niż o 167%;

e) Według zwiększenia naturalnej aktywności killerowej splenocytów szczurów - nie mniej, niż o 66%;

f) Według zwiększenia zdolności do stabilizacji membran plazmatycznych hepatocytów wątroby szczurów po wprowadzeniu czterochlorku węgla (CClą):

- wedhłu oonnwienia aatywnnści Na,K-AAFaay - nie mniejjniżo 24%;

173 321

- według odnowienia aktywności transferazy w krwi szczurów - nie mniej, niż o 22%;

- według odnowienia stosunku potasu (K) i sodu (Na) w hepatocytach wątroby szczurów - nie mniej, niż o 13,8%.

Przy tym jako bazę do porównania wykorzystano kontrolę w postaci wprowadzanego do organizmu środka antyseptycznego, rozpuszczonego w roztworze fizjologicznym.

Przytoczony wyżej system wskaźników efektów immunomodulujących i regeneracyjnych ŚBA według wynalazku, pozwala na jego zidentyfikowanie na podstawie wykazywanej aktywności biologicznej, a mianowicie - jako immunomodulatora.

Dla ŚBA według wynalazku jest obserwowana tendencja do wykazania efektu stymulacji funkcji obronnych systemu odpornościowego organizmu, skierowanych tak na wyeliminowanie patologii wewnętrznej (stymulacja aktywności killerów naturalnych), jak i na podwyższenie ogólnej odporności organizmu na choroby infekcyjne, która w znacznym stopniu przewyższa analogiczne wskaźniki powyżej rozpatrzonych znanych ŚBA.

Drogą eksperymentalną określono właściwości immunomodulujące różnego rodzaju środków biologicznie aktywnych odpowiednio do zespołu wskaźników, identyfikujących badane obiekty. Rezultaty eksperymentu są zebrane w tabeli 6, w której podano ilościowe wskaźniki efektów znanych ŚBA N1, N2, N3, otrzymanych według technologii, opisanej odpowiednio w EP-A-02499563, SU-A-139404 i US-A-4455302 i ŚBA według wynalazku, przedstawionego w postaci grup WS, TS i LM, a mianowicie - uogólnionych według rezultatów:

WS - przykładów 1-4 (komponenty morfoplazmy i glikokaliksu komórek);

TS - przykładów 7-9 (termostabilne komponenty morfoplazmy i glikokaliksu komórek);

LM - przykładów 11-13 (małocząsteczkowe komponenty morfoplazmy i glikokaliksu komórek M<10 000).

W postaci obiektu dla kontroli wykorzystano roztwór fizjologiczny chlorku sodowego, zawierający środek antyseptyczny. Otrzymane rezultaty są zebrane w tabeli 6 i w sposób porównawczy charakteryzują ŚBA według wynalazku i już znane ŚBA. Przytoczone rezultaty dotyczą charakterystyk ŚBA według wynalazku, otrzymanego w postaci mieszaniny struktury nie zidentyfikowanej oraz potrzebnych dla jego zidentyfikowania danych według efektu, który uwarunkowuje jego przeznaczenie.

Analiza danych tabeli 6 jednocześnie z możliwością zidentyfikowania środka według wynalazku pozwala również na ocenę konkretnego rezultatu, powodowanego przez ŚBA według wynalazku i polegającego na istotnym polepszeniu właściwości aktywności biologicznej kosztem obecności w nim produktów hydrolizy, zawierających zmodyfikowane komponenty morfoplazmy i glikokaliksu komórek ze zmodyfikowaną strukturą, wpływ których w znanych ŚBA nie był ujawniony.

Właściwości ŚBA według wynalazku są ściśle uzależnione od jego składu.

Jak na to wskazują rezultaty analizy biochemicznej (patrz tabela 7), ŚBA w zasadzie zawiera takie związki organiczne, jak polipeptydy, peptydy, aminokwasy, związane i wolne węglowodany, lipidy, nukleotydy i związki innego rodzaju. Dane tabeli 7 demonstrują rozdzielenie według masy związków organicznych w wchodzących w skład ŚBA przy zastosowaniu jako surowca wyjściowego tkanki embrionalnej bydła domowego. Oprócz tego, w tabeli 7 są podane rezultaty otrzymania różnych grup ŚBA według wynalazku (WS, TS i LM) po kolei, przy pomocy wszystkich zgłaszanych sposobów. Poza rezultatami zrealizowania sposobu, który zapewnia otrzymanie ŚBA-WS i przy zrealizowaniu któregojako surowiec jest stosowana tkanka zwierzęca, pobrana w stadium procesu modyfikacji komponentów morfoplazmy i glikokaliksu komórek ze wskazanymi wyżej procesami, tabela 7 również zawiera rezultaty zrealizowania sposobu otrzymania ŚBA według wynalazku w postaci termostabilnych komponentów ŚBA-ST i w postaci komponentów małocząsteczkowych ŚBA-LM.

173 321

T a b e 1 a- 6

Efekty immunomodulujące i regeneracyjne środków biologicznie aktywnych (ŚBA)	Wskaźnik ilościowy efektów
Znanych ŚBA	Zgłaszanego ŚBA
Nr 1	Nr 2	Nr 3	WS	TS	LM
Podwyższenie aktywności makrofagów otrzewnowego eksudatu szczurów, %, w porównaniu z kontrolą	aktywności fermentacyjnej (test NBT)	27,1 ±2,6	42,2 ±2,4	46,8 ±4,3	62,6 ±8,4	87,8 ±4,8	142,6 ±15,6
aktywności fagocytowej wobec E. Coli	15,6 ±2,1	21,4 ±4,2	33,4 ±4,3	46,8 ±7,7	64,3 ±9,6	120,4 ±4,3
Podwyższenie aktywności neutrofilów krwi, %, w porównaniu z kontrolą	aktywności fermentacyjnej (test NBT)	33,8 ±5,9	60,6 ±3,7	67,2 ±3,8	76,2 ±8,8	95,4 ±13,8	158,9 ±20,6
aktywności fagocytowej wobec E. Coli	25,4 ±1,6	34,6 ±3,7	44,2 ±5,7	52,3 ±7,5	70,4 ±8,5	123,6 ±10,7
Stymulacja reakcji blast transformacji w porównaniu z kontrolą, %	T-limfocytów	24,6 ±2,8	25,1 ±3,7	38,4 ±4,6	46,6 ±4,7	69,5 ±10,2	134,8 ±14,5
B-limfocytów	22,1 ±3,2	28,8 ±2,4	46,3 ±4,7	55,6 ±5,4	82,6 ±10,7	168,2 ±21,4
Zwiększenie miana thymicznego czynnika surowiczego (TCS) %, w porównaniu z kontrolą	52,4 ±4,2	56,7 ±6,2	117,8 ±9,1	208,6 ±41,2	318,7 ±45,6	624,7 ±81,3
Stymulacja naturalnej aktywności killerowej \| splenocytów szczurów, %, w porównaniu z kontrolą	65,6 ±4,8	17,6 ±4,2	53,8 ±5,4	72,3 ±6,2	105,3 ±15,3	194,7 ±16,3
j Wzmocnienie zdolności \| reperacyjnych hepatocytów szczurów w odnawianiu aktywności po wprowadzeniu CCU, %, w porównaniu z	Na, K-ATF-azy	0	13,2 ±3,1	22,6 ±3,4	26,7 ±2,4	31,4 ±3,2	57,6 ±7,2
aminotransferazy krwi	0	0	23,4 ±4,8	27,2 ±5,1	46,2 ±7,4	70,6 ±11,4
kontrolą	stężenia K⁺ w hepatocytach	0	5,2 ±1,2	14,2 ±3,1	16,8 ±3,0	24,6 ±2,4	48,2 ±4,3

Różnice z kontrolą są prawdopodobne przy P<0,05

173 321

Tabela 7

Związki organiczne	Zawartość związków organicznych w % masy, w ŚBA
W znanych	W zgłaszanym
N 1	N 2	N 3	WS	TS	LM
Polipeptydy	72,7	47,4	32,1	20,0	9,1	mniej
	±9,4	±8,7	±6,1	±3,5	±3,6	0,3
Peptydy	13,5	35,8	16,3	15,0	17,3	18,7
	±2,1	±7,4	±3,2	±5,0	±3,7	±3,8
Aminokwasy	4,7	3,7	31,7	40,1	45,0	51,8
	±1,7	±0,8	±6,2	±8,1	±7,9	±8,3
RAZEM:	90,9	86,9	80,1	75,1	71,4	70,5
	±6,0	±5,8	±5,1	±5,1	±51	±5,3
Węglowodany w składzie:
-związków wielkocząsteczkowych z	0,5	0,9	1,9	0,7	0,4	mniej
względną masą cząsteczkową M>10000	±0,2	±0,2	±0,8	±0,4	±0,2	0,2
-związków małocząsteczkowych z względną	mniej	2,7	3,0	6,8	7,5	8,2
masą cząsteczkową M= 800-10000	0,2	±1,1	±0,5	±3,5	±3,5	±3,3
-monomerów wolnych lub związków z	7,3	2,1	10,2	10,0	12,7	13,7
względną masą cząsteczkową M<800	±2,4	±0,6	±2,7	±2,4	±2,9	±3,5
RAZEM:	8,0	5,7	14,9	17,7	20,6	22,1
	±1,8	±1,6	±2,7	±3,1	±4,5	±6,6
Lipidy, nukleotydy oraz inne związki	1,1	7,4	5,0	7,2	8,0	7,1
organiczne	±0,3	±2,1	±2,1	±2,1	±2,7	±21
RAZEM:	100,0	100,0	10),0	100,0	100,0	100,0
Stosunek zawartości węglowodanów i * peptydów, G	mniej 0,01	0,08	0,18	0,45	0,43	0,44
Waga suchej pozostałości ŚBA, mg/ml	20,0	11,4	32,6	12,8	8,4	6,1
	±4,2	±3,7	±9,6	±3,6	±2,2	±1,8
Waga środka antyseptycznego, mg/ml	-	-	-	0,7	0,7	07
Stężenie ŚBA w kompozycji proszku,		-	-	94,8	92,3	89,7
w % masy				±11	±1,5	±2,2

* Wartości są obliczone według wartości średniostatystycznycH wielkości, które są podane w tabeli.

Różnice z kontrolą są wiarygodne przy P<0,05

Dane tabeli 7 zezwalają na przeprowadzenie analizy porównawczej rezultatów zrealizowania sposobu wytwarzania ŚBA według wynalazku i już znanych sposobów otrzymywania ŚBA, a mianowicie - analizy porównawczej ŚBA według wynalazku i znanego ŚBA, z uwzględnieniem tej okoliczności, że ze znanych ŚBA N3 (US-A-4455302), ŚBA N2 (SU-A-139404) i ŚBA N1 (EP-A-0249563) są najlepszymi pod względem własnych charakterystyk.

Analiza porównawcza aktywności specyficznej ŚBA według wynalazku i już znanych ŚBA wskazuje na to (tabele 6 i 7), że icH aktywność specyficzna zależy od zestawu składników, stosunek których ma istotny wpływ ma wielkość aktywności specyficznej.

173 321 z

Cechą charakterystyczną składu biochemicznego ŚBA według wynalazku jest obecność w nim komponentów, zawierających węglowodany, modyfikacja których w znacznym stopniu określa jego właściwości.

Przy tym zawartość węglowodanów w najbardziej aktywnych frakcjach (frakcje 3, 4 i 5, tabela 4) komponentów małocząsteczkowych z względną masą cząsteczkową M=800-10 000 (oligowęglowodany, glikopeptydy, glikoplipidy, nukleotydy) jest decydującą przy zidentyfikowaniu oraz scharakteryzowaniu ŚBA według wynalazku.

Na przykład, analiza porównawcza aktywności specyficznej i zestawu składników (tabele 6 i 7) wskazuje na to, że wyższa aktywność ŚBA według wynalazku, w porównaniu z analogami, koreluje się z wyższą zawartością węglowodanów w składzie komponentów z względną masą cząsteczkową M=800-10 000. Dla środka według wynalazku podobne znaczenia są odpowiednie do wielkości: 6,8±3,5%; 7,5±3,5% i 8,2±3,3% podczas gdy dla analogów - ŚBA N1, N2 i N3 podobne wielkości stanowią odpowiednio nie więcej 0,2%; 2,7±1,1% i 3,0±0,5%. W jeszcze większym stopniu podobna zależność koreluje z zawartością węglowodanów w stosunku do innych związków organicznych tej frakcji.

Pod tym względem bardzo istotnym wskaźnikiemjest stosunek zawartości węglowodanów i peptydów w komponentach z względną masą cząsteczkową M=800-10 000 (tabele 2 i 7), który oblicza się ze wzoru:

G = Cw/Cp (3) gdzie Cw i Cp - stężenia odpowiednio węglowodanów i peptydów w komponentach z względną masą cząsteczkową M=800-10 000.

Dla zgłaszanego ŚBA wielkość tego wskaźnika leży w granicach G_Zg = 0,25-0,60, podczas gdy znanych ŚBA wielkość tego wskaźnika nie przewyższa znaczenia G_Zn <0,25.

W ten sposób, wielkość wskaźnika G w sposób uogólniony charakteryzuje właściwość produktów hydrolizy i jest uzależnioną od surowca, zastosowanego w sposobie według wynalazku, od całokształtu operacji obróbki i warunków zrealizowania procesów hydrolizy i jest jednym z charakterystycznych wskaźników biochemicznego zidentyfikowania ŚBA według wynalazku. ,

Technologia otrzymywania ŚBA zapewnia odtwarzalność rezultatów, czyli pozwala na standaryzowane otrzymywanie ŚBA według wynalazku z zadanymi właściwościami, a mianowicie z zadaną utrwaloną aktywnością immunomodulującą, określającą efekt farmakologiczny, terapeutyczny i ogólnobiologiczny przy zastosowaniu wynalazku.

Otrzymane produkty końcowe w ogólnym i poszczególnych wypadkach zrealizowania sposobu otrzymywania ŚBA według wynalazku są równowartościowe pod względem charakteru swojego oddziaływania biologicznego, ale odróżniają się pod względem swojej aktywności specyficznej. Z tego powodu celowość zastosowania tego lub innego konkretnego ŚBA jest określana wymaganiami, stawianymi przez obiekt, dla którego jest on przeznaczony, inaczej wymaganiami weterynarii i/lub medycyny. W związku z tym w każdym konkretnym przypadku wykorzystania produktu końcowego wybór tego lub innego wariantu ŚBA jest określany stosunkiem pomiędzy wymaganiami stawianymi w odniesieniu do jego aktywności immunomodelującej i jego skuteczności w całości a ekonomicznością jego otrzymywania. Szczególnie, wysoka skuteczność środka, zawierającego komponenty małocząsteczkowe z względną masą cząsteczkową M < 10 000 ŚBA według wynalazku -LM w całości przejawiają się w podwyższeniu aktywności makrofagów, neutrofilów, limfocytów, killerów naturalnych, co zapewnia wzmacnianie procesów regeneracyjnych (tabela 6). Dla zwierząt hodowlanych podobne efekty idą w parze ze zwiększeniem dodatkowych przyrostów ciężaru przy intensywnym tuczeniu (patrz tabela 8). Przy leczeniu chorób oddechowych i infekcyjnych (paragrypa) podobna zaleta nie jest istotną i w tym przypadku pod względem ekonomicznym uważa się za celowe zastosowanie środka, zawierającego rozpuszczalne w wodzie komponenty morfoplazmy i glikokaliksu komórek ŚBA-WS. Przy leczeniu stanów zapalnych (zapalenie gruczołów sutkowych) korzystne jest zastosowanie środka zawierającego komponenty termostabilne ŚBA-ST.

173 JZl

Tabela 8

Efekt farmaceutyczny, terapeutyczny i ogólnobiologiczny (właściwość) przy zastosowaniu środków biologicznie aktywnych (ŚBA)	Charakterystyka ilościowa efektu
Znane ŚBA	Zgłaszany ŚBA
N 1	N 2	N 3	WS	ST	LM
Stany	Zapalenia	Ekspery-
zapalne	gruczołów sutkowych	ment	56±8	66±6*	70±5	76±3		83±4		88±5
	krów, %, wyzdrowienia	Kontrola	59±7	57±6	61±5	58±8		67±7		53±8
	Zapalenie płuc,	Ekspery-
	%>,	ment	55±8	64±7*	69±6	78±5		89±6		91±5
	wyzdrowienia	Kontrola	58±7	60±7	55±7	51±8		61±6		48±6
Choroby	Paragrypa i	Ekspery-
infekcyj-	ostre	ment	55±5*	65±7	70±6	82±6		90±7		93±5
ne	schorzenia oddechowe, %, wyzdrowienia	Kontrola	60±5	62±6	64±7	58±7		61±7		67±5
Zwiększenie dodatkowego przyrostu ciężaru cieląt, %,
w porównaniu z kontrolą		-12±*10	15±6	24±7	37±7		58±8		102±15
Ostra toksyczność, LD50,		ponad 25 (260)		ponad 25 (260)
ml/kg masy ciała

Różnice z kontrolą są wiarygodne przy P<0,05 * P>0,05

Przy zewnętrznym stosowaniu ŚBA w postaci maści, czopków, żeli, okładów, do wprowadzenia przez jamę nosową lub wypojania zwierząt zamiast ŚBA-LM, pod względem ekonomicznym, korzystne jest zastosowanie SBA, zawierającego komponenty termostabilne ŚB A-ST.

Przy tym celem uzyskania maksymalnego efektu wykorzystuje się środek według wynalazku do stymulacji funkcji odpornościowych organizmu, skierowanych tak na wyeliminowanie patologii wewnętrznej (stymulacja killerów naturalnych) jak i na podwyższenie ogólnej odporności organizmu wobec chorób infekcyjnych, które w znacznym stopniu przewyższa analogiczne wskaźniki wspomnianych wyżej znanych ŚBA.

Zastosowanie ŚBA według wynalazku przy chorobach infekcyjnych młodzieży bydła domowego (paragrypa, ostre schorzenia cieląt oraz inne) zapewniało wyzdrowienie zwierząt w 82-93% przypadków. Jednocześnie przy wykorzystaniu znanych środków w tych samych warunkach wyzdrowienie zwierząt było obserwowane nie więcej, niż w 70% przypadków, a przy spontanicznym wyleczeniu w grupie kontrolnej - w granicach 58-67% przypadków.

Wykorzystanie ŚBA według wynalazku w celach profilaktycznych powodowało obniżenie poziomu zachorowań zwierząt na grypę do 10%, podczas gdy przy zastosowaniu znanych środków poziom zachorowalności zwierząt stanowił 12-17%, a w grupie kontrolnej - 22-28%.

Wprowadzenie ŚBA według wynalazku do organizmu zwierzęcia, mającego odchylenia od normy parametrów homeostazy, przy intensywnym tuczeniu powodowało zwiększenie dodatkowego przyrostu ciężaru przeciętnie o 37-100% w porównaniu z przyrostem ciężaru zwierząt z grupy kontrolnej, która nie była obrabiana ŚBA według wynalazku. Jednocześnie przy wykorzystaniu znanych ŚB A-analogów (N1, N2 i 3) w tych samych warankach dodatkowy

173 321 przyrost ciężaru w porównaniu z przyrostem ciężaru zwierząt z grupy kontrolnej, stanowił przeciętnie 12-24%.

Normalizacja parametrów homeostazy sprzyja również zwiększeniu:

- udojów mleka bydła domowego;

- nieśności drobiu;

- jakości futra zwierząt futerkowych;

- utrzymywania się przy życiu młodzieży;

- miodobrania pszczół itp.

ŚBA według wynalazku nie jest toksyczny i nie powoduje efektów ubocznych (alergii itp.)

Dane porównawcze dotyczące efektu farmaceutycznego, terapeutycznego i ogólnobiologicznego, związane z wykorzystaniem na zwierzętach ŚBA według wynalazku, są podane w tabeli 8. Analiza danych wspomnianej tabeli wskazuje na to, że aktywność biologiczna ŚBA według wynalazku znacznie przewyższa wielkość aktywności biologicznej jego analogów.

Tak więc, ŚBA według wynalazku ma szeroki zakres zastosowania w weterynarii i medycynie i może być wykorzystany do normalizacji stanu fizjologicznego organizmu podczas leczenia schorzeń, kontrola których odbywa się w ramach systemu odpornościowego organizmu.

ŚBA według wynalazku stymuluje system odpornościowy organizmu drogą aktywacji systemu, retikuloendotelialnego, T- i B- systemów, neutrofilów i/lub populacji killerów naturalnych organizmu, co powoduje podwyższenie aktywności makrofagów eksudatu otrzewnowego oraz neutrofilów krwi in vitro, podwyższenie stymulacji reakcji blasttransformacji limfocytów in vivo, podwyższenie stymulacji funkcjonalnej aktywności grasicy, podwyższenie stymulacji naturalnej aktywności killerowej splenocytów in vivo, jak również wzmocnienie zdolności reperacyjnych hepatocytów wątroby po wprowadzeniu substancji trujących lub częściowej hepatektomii itp.

Dla osiągnięcia tego celu ŚBA według wynalazku jest wprowadzany do organizmu w następujący sposób:

- zastrzyki domięśniowe w dawce 0,005-0,5 ml/kg masy ciała z przerwami pomiędzy wstrzykiwanymi 1-7 dni;

- inhalacje w dawce 0,012-0,12 ml/kg masy ciała z przerwami pomiędzy inhalacjami 4-48 godzin;

- podjęzykowo w dawce 0,012-1,0 ml/kg masy ciała z przerwą pomiędzy zabiegami 4-48 godzin;

- wykarmianie w dawce 0,02-1,0 ml/kg masy ciała z przerwami pomiędzy wykarmieniami 1-10 dni;

- doustnie w pigułkach w dawce 0,02-1,0 ml/kg masy ciała z przerwą 1-10 dni;

- drogą wprowadzenia przez jamę nosową w dawce dobowej 0,001-0,05 ml/kg masy ciała z przerwą pomiędzy wkropleniami 2-24 godziny;

- aplikowania na powierzchnie śluzową lub urażoną w postaci okładów, czopków, przysypek, maści oraz żeli;

- oraz ich kombinacji, - do normalizacji parametrów homeostazy.

Dane, potwierdzające skuteczność podawania ŚBA-ST według wynalazku sposobami powyżej wyliczonymi zebrane są w tabelach 9-12. W tabelach tych podano rezultaty działania ŚBA przy:

- wstrzykiwaniach domięśniowych z przerwą 3 dni (tabela 9);

Tabela 9

Skuteczność przy wstrzykiwaniach domięśniowych
Dawka, ml/kg masy ciała	mniej 0,005 (0,001)	0,005	0,05	0,5	ponad 0,5 (1,0)
Przyrosty ciężaru %, w porównaniu z grupą kontrolną zwierząt	32 + 2	47±2	55±5	61±5	42+:3

Różnice z kontrolą są wiarygodne przy P<0,05

173 321

Tabela 10

Skuteczność przy inhalacjach
Dawka, ml/kg masy ciała	0,001	0,012	0,05	0,12	0,6
Przyrosty ciężaru %, w porównaniu z grupą kontrolną zwierząt	10±2	22±2	25±3	30±4	20±2

Różnice z kontrolą są wiarygodne przy P<0,05

Tabela 11

Skuteczność przy pojeniu
Dawka, ml/kg masy ciała	0,001	0,01	0,05	0,5	2,0
Przyrosty ciężaru %, w porównaniu z grupą kontrolną zwierząt	10±4	32±3	35±3	42±3	30 ± 4

Różnice z kontrolą są wiarygodne przy P<0,05 Tabela 12

Skuteczność przy wprowadzeniu przez jamę nosową
Dawka, ml/kg masy ciała	0,0005	0,001	0,005	0,05	5,0
Przyrosty ciężaru %, w porównaniu z grupą kontrolną zwierząt	3±1	12±2	17±3	20±4	8±2

Różnice z kontrolą są wiarygodne przy P<0,05

- przy inhalacjach z przerwą 24 godziny (tabela 10);

- pojeniu z przerwą 7 dni (tabela 11);

- przy wprowadzeniu przez jamę nosową z przerwą 12 godzin.

Wprowadzenie do organizmu ŚBA według wynalazku pozwala na stymulację:

- leczenia chorób infekcyjnych (paragrypa, ostre schorzenia oddechowe);

- leczenia chorób zapalnych (zapalenia gruczołów sutkowych, zapalenie płuc, zapalenie błonki śluzowej ścianki macicy);

- podwyższenia odporności zwierząt na procesy zapalne i infekcyjne;

- polepszenia stanu ogólnobiologicznego organizmu;

- zwiększenia przyrostu ciężaru zwierząt;

- aktywności funkcjonalnej tkanki wątrobowej przy hepatycie;

- regeneracji wątroby po częściowej hepatektomii;

- wygojenia się wrzodów, ran, skóry przy urazach i zranieniach;

- odnawiania formuły krwi po jej stratach.

Brak efektów ubocznych podczas wykorzystania ŚBA oraz dane, dotyczące oddziaływania farmakologicznego, terapeutycznego i ogólnobiologicznego na organizm zwierząt ustaliły możliwość aprobaty klinicznej ŚBA.

Podczas badania grupy pacjentów ustalono pozytywny wpływ na stan fizjologiczny organizmu, jak również praktycznie całkowite podobieństwo z wynikami eksperymentalnych badań przedklinicznych, przeprowadzanych na zwierzętach.

Sposób otrzymania zgłaszanego środka biologicznego aktywnego może być zrealizowany tak w warunkach przemysłowych, jak i w warunkach laboratoryjnych.

Departament Wydawnictw UP RP Nakład 90 egz.

Cena 6,00 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Środek biologicznie aktywny na bazie rozpuszczalnych w wodzie związków organicznych, będących produktami hydrolizy składników rozdrobnionej tkanki zwierzęcej, znamienny tym, że w skład produktów hydrolizy wchodzą termostabilne przy T_n<120°C, małocząsteczkowe komponenty morfoplazmy i glikokaliksu komórek o względnej masie cząsteczkowej <10 000, zmodyfikowane podczas procesów embriogenezy, i/lub proliferacji, i/lub zróżnicowania komórek, i/lub patologii, poprzedzającej, i/lub towarzyszącej regeneracji, i/lub reperacji tkanki, przy czym ich ilość nie jest mniejsza niż 30% wagowych.
2. Środek według zastrz. 1, znamienny tym, że w skład produktów hydrolizy ze zmodyfikowanymi komponentami morfoplazmy i glikokaliksu komórek wchodzą następujące związki organiczne w stosunku wyrażonym w % wagowych:

Polipeptydy - do 26,0;

Peptydy 110,0 - 22,5;

Aminokwasy - 32,0 - 60,1;

Węglowodany ^0,5- 28,7;

Lipidy, nukleotydy oraz inne związki organiczne - 2,0 - 11,0.
3. Środek według zastrz. 2, znamienny tym, że węglowodany zawierają następujące związki organiczne w stosunku wyrażonym w % wagowych:

- związki wielkocząsteczkowe o względnej masie cząsteczkowej >10 000 - do 2%;

- związki małocząsteczkowe o względnej masie cząsteczkowej 800-10 000 - 2,5 -11,5%;

- monomery wolne o względnej masie cząsteczkowej <800 - 6,0 - 17,0%.

4. Środek według zastrz. 2, znamienny tym, że w skład produktów hydrolizy ze zmodyfikowanymi komponentami morfoplazmy i glikokaliksu komórek wchodzą następujące związki

organiczne w stosunku wyrażonym w % wagowych: Polipeptydy - 16,3 -24,7; Peptydy -11,9-17,1; Aminokwasy - 32,0 - 48,2; Węglowodany - 14,6 - 20,8; Lipidy, nukleotydy oraz inne związki organiczne - 5,1-(,33. 5. Środek według zastrz. 2, znamienny tym, że w skład produktów hydrolizy ze zmodyfi-

kowanymi komponentami morfoplazmy i glikokaliksu komórek wchodzą następujące związki organiczne w stosunku wyrażonym w % wagowych:

Polipeptydy - 5,5-12,7; Peptydy - 13,6-21,0; Aminokwasy -37,1 -52,9; Węglowodany - 16,1-25,1; Lipidy, nukleotydy oraz inne związki organiczne - 5,3-11,0. 6. Środek według zastrz. 2, znamienny tym, że w skład produktów hydrolizy ze zmodyfi- kowanymi komponentami morfoplazmy i glikokaliksu komórek wchodzą następujące związki organiczne w stosunku wyrażonym w % wagowych: Polipeptydy poniżej 0,25; Peptydy - 14,9 - 22,5; Aminokwasy -43,5 -60,1; Węglowodany - 15,5-28,7;

173 321

Lipidy, nukleotydy oraz inne związki organiczne - 5,0 - 9,2.

7. Środek według zastrz. 1, albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, znamienny tym, że stosunek wagowy węglowodanów do peptydów w składzie produktów hydrolizy o względnej masie cząsteczkowej 800-10 000 mieści się w granicach G=0,25-0,6.
8. Sposób wytwarzania środka biologicznie aktywnego, zawierającego produkty hydrolizy składników rozdrobnionej tkanki zwierzęcej, w skład których wchodzą termostabilne przy Tn<120°C małocząsteczkowe komponenty morfoplazmy i glikokaliksu komórek o względnej masie cząsteczkowej <10 000, w którym dokonuje się rozdrobniania przepłukanego surowca z tkanki zwierzęcej, hydrolizy otrzymanych składników z następnym wydzieleniem produktów hydrolizy, ich filtracją i wydzieleniem produktu końcowego w postaci klarownej cieczy, znamienny tym, że jako surowiec wykorzystuje się tkankę zwierzęcą, zmodyfikowaną podczas procesów embriogenezy i/lub proliferacji, i/lub zróżnicowania komórek, i/lub patologii, poprzedzającej, i/lub towarzyszącej regeneracji, i/lub reperacji tkanki, przy czym tkanki rozdrabnia się aż do uszkodzenia komórek, ekstrahuje się ich zawartość drogą dodatkowego przepłukiwania z filtracją, i/lub odwirowaniem z przyspieszeniem 300-15 000 g w ciągu 10-20 min, po czym przemyte tkanki poddaje się homogenizacji w roztworze fizjologicznym, i/lub buforowym, homogenizat oczyszcza się z nienaruszonych elementów tkanki przez filtrację, i/lub odwirowanie z przyspieszeniem 150-250 g w ciągu 10-15 min, ciecz nadosadową poddaje się hydrolizie, po której hydrolizat odwirowuje się, z wydzieleniem klarownej cieczy zawierającej składniki z komponentami morfoplazmy i glikokaliksu komórek.
9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że w postaci surowca wykorzystuje się tkankę, wybieraną z szeregu: tkanka embrionalna, tkanka różnicujących się tymocytów grasicy, spermatogonia i spermatocyty męskich gruczołów płciowych, tkanka łożyskowa, tkanka nabłonkowa jelit, regenerująca się tkanka skórna, tkanka regenerującej się wątroby, tkanka regenerujących się kończyn płazów, tkanka zmieniona patologicznie, pobrana przed stadium regeneracji oraz ich dowolna kombinacja.
10. Sposób według zastrz. 8, albo 9, znamienny tym, że komponenty poddawane hydrolizie zawierają komponenty morfoplazmy i glikokaliksu komórek w ilości 30-60% ogólnej masy związków organicznych.
11. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że hydroliza jest przeprowadzana w temperaturze Tr=4-45°C.
12. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że hydroliza jest przeprowadzana w obecności środka antyseptycznego.
13. Sposób według zastrz. 8, albo 9, albo 11, albo 12, znamienny tym, że produkty hydrolizy składników są poddawane obróbce cieplnej w temperaturze Tn= 60-120°C do całkowitej denaturacji związków termolabilnych i filtracji i/lub odwirowywaniu z przyspieszeniem ponad 1 500 g w ciągu 20-40 min z wydzielaniem klarownej cieczy, zawierającej komponenty termostabilne w postaci produktu końcowego.
14. Sposób według zastrz. 8, albo 9, albo 11, albo 12, znamienny tym, że produkty hydrolizy składników są poddawane frakcjonowaniu drogą dializy poprzez błonę półprzepuszczalną, i/lub ultrafiltracji, i/lub żelfiltracji z wydzielaniem produktu końcowego w postaci frakcji składników małocząsteczkowych o względnej masie cząsteczkowej <10 000.
15. Sposób według zastrz. 8, albo 9, albo 11, albo 12, znamienny tym, że produkty hydrolizy składników są poddawane frakcjonowaniu drogą dializy poprzez błonę półprzepuszczalną, i/lub ultrafiltracji, i/lub żelfiltracji z wydzielaniem produktu końcowego w postaci frakcji składników małocząsteczkowych o względnej masie cząsteczkowej <10 000.