PL1761557T5 - Nowe produkty genowe z Bacillus licheniformis tworzące lub degradujące poliaminokwasy oraz oparte na nich sposoby produkcji biotechnologicznej - Google Patents

Description

17/P28699PL00 [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy dwóch nowych genów i ich produktów genowych z Bacillus licheniformis i wystarczająco podobnych genów i białek, które uczestniczą in vivo w tworzeniu, modyfikacji i/lub degradacji poliaminokwasów i mogą być do tego celu zastosowane, jak i opartych na nich ulepszonych sposobów produkcji biotechnologicznej przez mikroorganizmy, które cechują się inaktywacją bądź aktywacją tych genów.

[0002] Niniejszy wynalazek należy do obszaru biotechnologii, szczególnie wytwarzania cennych produktów przez fermentację mikroorganizmów, które zdolne są do tworzenia interesujących cennych produktów. Zalicza się do tego przykładowo wytwarzanie związków niskocząsteczkowych, przykładowo suplementów diety, lub farmaceutycznie istotnych związków lub białek, dla których wskutek ich różnorodności istnieje z kolei szeroki obszar przemysłowego zastosowania. W pierwszym przypadku właściwości metaboliczne odnośnych mikroorganizmów wykorzystuje się i/lub zmienia w celu wytwarzania cennych produktów; w drugim przypadku stosuje się komórki, które eksprymują geny interesujących białek. W obydwu przypadkach chodzi zatem przeważnie o organizmy modyfikowane metodami inżynierii genetycznej (GV0).

[0003] W odniesieniu do fermentacji mikroorganizmów istnieje bogaty stan techniki, szczególnie także w skali przemysłowej; rozciąga się on od optymalizacji odnośnych szczepów pod względem szybkości tworzenia i wykorzystania substancji odżywczych poprzez techniczne ukształtowanie fermentora aż do uzyskiwania cennych produktów z samych odnośnych komórek i/lub pożywki fermentacyjnej. Są tu skuteczne zarówno podejścia genetyczne i mikrobiologiczne, jak i podejścia od strony techniki sposobów oraz biochemiczne. Celem niniejszego wynalazku jest ulepszenie tego sposobu pod względem częstej właściwości stosowanych mikroorganizmów, oddziaływującej ujemnie na właściwy etap fermentacji, a mianowicie na poziomie właściwości genetycznych stosowanych szczepów.

[0004] Do celów przemysłowej produkcji biotechnologicznej odnośne mikroorganizmy hoduje się w fermentorach, które są kofigurowane odpowiednio do ich właściwości metabolicznych. Podczas hodowli metabolizują one dany substrat i tworzą zwykle, obok właściwego produktu, wiele innych substancji, które z reguły nie są obiektem zainteresowania i/lub które -jak to poniżej objaśniono - mogą prowadzić do trudności przy fermentacji lub obróbce.

[0005] Fermentacje są zwykle wysoce złożonymi procesami, w przypadku których trzeba ustawić i kontrolować wiele różnych parametrów. Tak więc bardzo często chodzi np. o procesy aerobowe, to znaczy zastosowane mikroorganizmy trzeba przez cały okres trwania fermentacji zaopatrywać wystarczająco w tlen (kontrola stopnia gazowania). Dalszymi przykładami takich parametrów są geometria reaktora, ciągle zmieniający się skład pożywki, wartość pH lub szybkość tworzenia CO2. Szczególnie ważnym parametrem, zarówno pod względem opłacalności, jak i prowadzenia sposobu per se, jest konieczny wkład energii przykładowo poprzez systemy mieszania, które zapewniają możliwie całkowite wymieszanie zawartości reaktora. Ponadto, obok rozprowadzenia substratu, zapewnia się także wystarczające zaopatrzenie organizmów w tlen.

[0006] Po zakończeniu sposobu fermentacji należy obok oddzielenia organizmów produkcyjnych zwykle dokonać oczyszczania i/lub zatężenia interesującego cennego produktu z tak zwanej brzeczki fermentacyjnej. Sposób obróbki może przykładowo obejmować różne etapy chromatografii i/lub filtracji. Zatem dla pomyślnego wyniku całego sposobu obróbki, obok zawartości cennych produktów, decydujące są także biofizyczne właściwości brzeczki fermentacyjnej, szczególnie jej lepkość bezpośrednio po zakończeniu fermentacji.

[0007] Na jej właściwości wpływają także aktywności metaboliczne wybranych mikroorganizmów, przy czym mogą także występować niepożądane efekty. Są to przykładowo wzrastająca często podczas fermentacji lepkość pożywki. Wpływa to niekorzystnie na mieszanie, a tym samym na transport materii i zaopatrzenie w tlen w obrębie reaktora. Dodatkowe trudności wynikają przeważnie przy obróbce następczej, ponieważ przykładowo zwiększona lepkość źle wpływa na efektywność sposobów filtracji.

[0008] Szczególnie na temat gatunków z rodzaju Bacillus wiadomo, że wytwarzają one śluz, który zasadniczo składa się z poli-gamma-glutaminianu (PGA) i/lub asparaginianu, to znaczy z takich poliaminokwasów, które są związane przez odnośne wiązania gamma-peptydowe. W pracach naukowych na temat Bacillus subtilis doszukuje się związku głównie między trzema genami ywsC, ywtA i ywtB bądź pochodzącymi z nich produktami genowymi a tworzeniem poli-gamma-glutaminianu; przy degradacji uczestniczy produkt genowy ywtD. Powszechnie stosowane oznaczenie genu " ywt" jest tu synonimem skrótów "cap" i "pgs”, które są znane dla określania tych samych funkcji. Przedstawiono to poniżej.

[0009] Publikacja "Physiological and biochemical characteristics of poly gamma-glutamate synthetase complex of Bacillus subtilis" (2001), M. Ashiuchi, i in., w Eur. J. Biochem., tom 2 68, str. 5321 - 5328, opisuje składający się z trzech podjednostek PgsB, PgsC i PgsA kompleks enzymu PgsBCA (kompleks syntetazy poli-gamma-glutaminianowej BCA) z B. subtilis. Stosowanie do tego, w przypadku tego kompleksu chodzi o nietypową ligazę amidową, która przekształca zarówno D- jak i L-enancjomer glutaminianu w odpowiedni polimer. Opisany w niej eksperyment z przerwaniem genu jest według tej publikacji uważany za dowód na to, że ten kompleks jest jedynym, który w przypadku B. subtilis katalizuje tę reakcj ę.

[0010] Y. Urushibata i in. w publikacji "Characterization of the Bacillus subtilis ywsC gene, involved in gamma-poliglutamic acid production" (2002), w: J. Bacteriol., tom 184, str. 337 - 343, dowodzą m.in. poprzez mutacje delecyje trzech genów ywsc, ywtA i ywtB, że trzy produkty genowe odpowiedzialne w B. subtilis za tworzenie PGA są kodowane przez te trzy geny. W tej kolejności i wraz z następującym po tym genem ywtC tworzą one w tym mikroorganizmie spójny operon.

[0011] τ. Suzuki i Y. Tahara w publikacji "Characterization of the Bacillus subtilis ywtD gene, whose product is involved in gamma-poliglutamic acid degradation" (2003), w: J. Bacteriol., tom 185, str. 2379 - 2382 dowodzą, że w genomie B. subtilis „w dół" od ywtC w osobnym operonie, jest położony dalszy gen, istotny dla metabolizmu PGA. Gen ten koduje DL-endopeptydazę, zdolną do hydrolizy PGA, a zatem może być określona jako gamma-DL-glutamylo-hydrolaza.

[0012] Aktualny przegląd tych enzymów przedstawia dodatkowo artykuł "Biochemistry and molecular genetics of poly-gamma-glutamate synthesis", M. Ashiuchi i H. Misono w: Appl. Microbiol. Biotechnol., tom 5_9, str. 9-14 z 2002 roku. Geny kodujące kompleks syntazy PGA, w B. anthracis, homologiczne z pgsB, pgsC i pgsA, są określane w nim jako capB, capC i capA. Gen położony „w dół" w B.anthracis jest zgodnie z tym artykułem określany jako dep (od "D-PGA-depolimeraza") iw B. subtilis - jako pgdS (od "PGA-depolimeraza").

[0013] W aktualnym stanie techniki te aktywności enzymu są już wykorzystywane w pozytywnej postaci, głównie do wytwarzania poli-gamma-glutaminianu jako surowca, przykładowo do zastosowania w kosmetyce, jednak dotychczas nie znano ich dokładnych sekwencji DNA bądź sekwencji aminokwasowych, szczególnie w B. licheniformis. Tak więc przykładowo w zgłoszeniu JP 08308590 A ujawniono wytwarzanie PGA przez fermentację samych szczepów produkujących, mianowicie z gatunków Bacillus, jak B. subtilis i B. licheniformis; dalej opisano w nim izolację tego produktu z pożywki do hodowli. B. subtilis var. chunkookjang stanowi według zgłoszenia WO 02/055671 Al szczególnie odpowiedni do tego celu mikroorganizm.

[0014] Zatem w przypadku pewnych fermentacji istnieje zainteresowanie GLA jako cennym produktem wytwarzanym w wyniku fermentacji.

[0015] W przypadku wszystkich innych fermentacji istnieje jednak zainteresowanie wytwarzaniem innych cennych produktów; przy tym tworzenie poliaminokwasów oznacza, z wyżej przytoczonych powodów, negatywny efekt towarzyszący. Typowym sposobem postępowania, by zapanować nad podwyższoną lepkością pożywki fermentacyjnej pochodzącą z ich tworzenia, jest zwiększenie prędkości obrotowej mieszadła. Ma to jednak wpływ na wkład energii. Ponadto, fermentowane mikroorganizmy są przez to narażone na wzrastające siły ścinające, co stanowi dla nich ważny czynnik stresogenny. Ostatecznie także przez to może nie udać się przezwyciężyć bardzo wysokich poziomów lepkości, przez co może być konieczne przedwczesne przerwanie fermentacji, chociaż w innym razie produkcję można by jeszcze kontynuować.

[0016] Tworzenie śluzu, jako negatywny efekt towarzyszący licznym sposobom fermentacji, może zatem z wielu powodów oddziaływać negatywnie na całościowy wynik fermentacji. Zwykłe metody kontynuacji fermentacji z powodzeniem pomimo wzrastającej lepkości pożywki odżywczej, można określić tylko jako niewystarczające, szczególnie dlatego, że w ogóle nie zwalczają one żadnych jej przyczyn.

[0017] Poj awiło się zatem priorytetowe zadanie, by powstrzymać niepożądane tworzenie śluzu w możliwie znacznym stopniu, szczególnie śluzu pochodzącego z poli-gamma-aminokwasów, takich jak poli-gamma-glutaminian, podczas fermentacji mikroorganizmów. Należałoby w szczególności znaleźć rozwiązanie zwalczające przyczynę. Dalszy aspekt tego problemu stanowi przygotowanie odnośnych genów do pozytywnego wykorzystania produktów genowych syntetyzujących GLA bądź dla ich degradacji i/lub modyfikacji.

[0018] Każdorazowo zasadniczo równowartościowe rozwiązanie częściowe tego zadania stanowi każde z następujących białek uczestniczących w tworzeniu bądź degradacji poliaminokwasów:

YwsC (CapB, PgsB), kodowane przez sekwencję nukleotydową ywsC, która względem sekwencji nukleotydowej podanej w SEK NR ID: 1 wykazuje co najmniej 94% identyczności;

YwsC' (jako skrócona odmiana YwsC), kodowane przez sekwencję nukleotydową ywsC', która względem sekwencji nukleotydowej podanej w SEK NR ID: 3 wykazuje co najmniej 94% identyczności.

[0019] Dalsze rozwiązania częściowe stanowią przynależne kwasy nukleinowe ywsC i ywsC' oraz oparte na tym zastosowanie przynależnych kwasów nukleinowych do obniżania pochodzącego z poliaminokwasów tworzenia się śluzu podczas fermentacji mikroorganizmu, jak i odpowiedni sposób fermentacji mikroorganizmów. W przypadku obniżania poziomu tworzenia się śluzu na poziomie genetycznym według wynalazku co najmniej jeden z genów ywsC lub ywsC' jest czynnościowo inaktywowany. Do tego dochodzi pozytywne wykorzystanie tych genów bądź pochodzących z nich produktów genowych do wytwarzania, modyfikacji lub degradacji poli-gamma-glutaminianu.

[0020] Wynalazek ten może być zasadniczo stosowany w przypadku wszelkich fermentowalnych mikroorganizmów, szczególnie tych z rodzaju Bacillus, i prowadzi do tego, że mikroorganizmom stosowanym do produkcji fermentacyjnej innych cennych produktów niż poliaminokwasy, szczególnie farmaceutycznie istotnych niskocząsteczkowych związków lub białek, uniemożliwia się, na poziomie genetycznym, tworzenie poliaminokwasów, szczególnie GLA. To z jednej strony działa korzystnie na lepkość pożywki hodowlanej i przez to na możliwość mieszania, wprowadzanie tlenu i nakład energii; z drugiej strony - obróbka interesującego produktu jest znacznie ułatwiona. Ponadto większość użytych surowców, jak np. źródła N, nie jest przekształcana w nieinteresujący produkt, tak że ogólnie należy się spodziewać wyższej wydajności fermentacj i.

[0021] Zgodnie z dalszym aspektem niniejszego wynalazku dostarczone są obecnie wymienione geny do pozytywnego zastosowania produktów genowych syntetyzujących GLA bądź do ich degradacji i/lub modyfikacji, dokładniej przez pochodne białka YwsC i/lub YwsC' wytwarzane biotechnologicznie i wprowadzane do odpowiednich komórek produkujących albo niezależnie jako katalizatory do odpowiednich mieszanin reakcyjnych.

[0022] Pi erwsze rozwiązanie częściowe stanowi białko YwsC (CapB, PgsB) uczestniczące w tworzeniu poliaminokwasów, kodowane przez sekwencję nukleotydową ywsC, która względem sekwencji nukleotydowej podanej w SEK NR ID: 1 wykazuje co najmniej 94% identyczności.

[0023] Ten szczególny enzym otrzymano przez analizę genomu B. licheniformis DSM 13 (patrz przykład 1) . Białko to jest dostarczane w sposób powtarzalny poprzez podane w niniejszym zgłoszeniu w SEK NR ID: 1 i 2 sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe (patrz przykład 1) .

[0024] W tym przypadku zgodnie z przytoczoną na wstępie bibliografią chodzi o podjednostkę kompleksu syntetazy poli-gamma-glutaminianowej. Jako najbardziej podobne do niego, znane w stanie techniki białko, określono homolog YwsC z B. subtilis, który w banku danych GenBank (National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) jest zapisany pod numerem dostępu AB046355.1 i na poziomie kwasu nukleinowego posiada homologię na poziomie 75,4% identyczności; na poziomie aminokwasów zgodność wynosi 86,1% identyczności (patrz przykład 2). Te znaczące zgodności nie dają się wywnioskować tylko z takiej samej funkcji biochemicznej, lecz także z tego, że w obrębie zastrzeganego obszaru jest wiele pokrewnych białek o tej samej funkcji, którą również uwzględnia się w zakresie ochrony niniejszego zgłoszenia.

[0025] Temu pierwszemu częściowemu rozwiązaniu należy przyporządkować następujące postaci wykonania:

Każde odpowiednie biało YwsC, kodowane przez sekwencję nukleotydową, która wykazuje względem sekwencji nukleotydowej podanej w SEK NR ID: 1 coraz bardziej korzystnie co najmniej 96%, 97%, 98%, 99% i szczególnie korzystnie 100% identyczności, zatem wraz z coraz większą zgodnością sekwencji należy wnioskować o wzrastającej zgodności w funkcji i wzajemnej zastępowalności na poziomie genetycznym; - Każde białko YwsC (CapB, PgsB) uczestniczące w tworzeniu poliaminokwasów, które ma sekwencję aminokwasową, która względem sekwencji aminokwasowej podanej w SEK NR ID: 2 wykazuje co najmniej 94% identyczności, coraz bardziej korzystnie co najmniej 95%, 96%, 97%, 98%, 99% i szczególnie korzystnie 100% identyczności. W związku z niniejszym zgłoszeniem wyrażenie w postaci "co najmniej X%" oznacza X%—100%, włączając wartości graniczne X i 100 oraz wszystkie wartości procentowe liczb całkowitych i niecałkowitych znajdujące się pomiędzy nimi.

[0026] Najbardziej korzystne jest każdorazowo konkretne białko otrzymane z B. licheniformis DSM13, ponieważ zostało ono konkretnie opisane w niniejszym zgłoszeniu i dostarczone w sposób w 100% powtarzalny.

[0027] Drugie częściowe rozwiązanie stanowi białko YwsC' (jako skrócona odmiana YwsC) uczestniczące w tworzeniu poliaminokwasów, które koduje sekwencja nukleotydowa ywsC', która względem sekwencji nukleotydowej podanej w SEK NR ID: 3 wykazuje co najmniej 94% identyczności.

[0028] Ten szczególny enzym otrzymano przez analizę genomu B. licheniformis DSM 13 (patrz przykład 1) . Białko to jest dostarczane w sposób powtarzalny poprzez podane w niniejszym zgłoszeniu w SEK NR ID: 3 i 4 sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe (patrz przykład 1) .

[0029] Jak dodatkowo objaśniono w przykładzie 1, wskutek podanego na figurze 6 porównania sekwencji między YwsC z B. licheniformis i B. subtilis nasuwa się wniosek, że pierwsze 16 aminokwasów YwsC z B. licheniformis nie jest ważne dla jego funkcji jako podjednostki C kompleksu syntetazy poli-gamma-glutaminianowej. Zatem niniejszy wynalazek jest realizowany także z zastosowaniem tej skróconej odmiany.

[0030] Należy przypuszczalnie wyjść z założenia, że w odnośnych organizmach każdorazowo nie występują in vivo obydwa te "geny", lecz każdorazowo tylko jeden z nich tak, że mógłby także występować tylko jeden odpowiedni produkt genowy YwsC lub YwsC'. Zatem pierwsze i drugie rozwiązanie częściowe stanowią poniekąd dwa aspekty tego samego przedmiotu. Rozdzielenie na dwa częściowe rozwiązania wydaje się jednak uzasadnione z powodu różnic na poziomie aminokwasów.

[0031] Jako najbardziej podobne do niego białko znane w stanie techniki określono znowu homolog YwsC z B. subtilis, który w banku danych GenBank odnotowano pod numerem dostępu AB046355.1 i który na poziomie kwasu nukleinowego posiada homologię na poziomie 78,5% identyczności; na poziomie aminokwasów zgodność wynosi 89,6% identyczności (patrz przykład 2).

[0032] Temu drugiemu częściowemu rozwiązaniu należy, odpowiednio do tego co już powiedziano powyżej, przyporządkować następujące postaci wykonania: - Każde odpowiednie białko YwsC', kodowane przez sekwencję nukleotydową, która względem sekwencji nukleotydowej podanej w SEK NR ID: 3 wykazuje coraz bardziej korzystnie co najmniej 96%, 97%, 98%, 99% i szczególnie korzystnie 100% identyczności; - Każde białko YwsC' (jako skrócona wersja YwsC) uczestniczące w tworzeniu poliaminokwasów, które ma sekwencję aminokwasową, która względem sekwencji aminokwasowej podanej w SEK NR ID: 4 wykazuje co najmniej 94% identyczności, coraz bardziej korzystnie co najmniej 95%, 96%, 97%, 98%, 99% i szczególnie korzystnie 100% identyczności.

[0033] Najbardziej korzystne jest każdorazowo konkretne białko otrzymane z B. licheniformis DSM13, ponieważ zostało ono konkretnie opisane w niniejszym zgłoszeniu i dostarczone w sposób w 100% powtarzalny.

[0034] Każdorazowo jest tu korzystne takie uprzednio opisane białko według wynalazku uczestniczące w tworzeniu lub degradacji poliaminokwasów, które naturalnie jest wytwarzane przez mikroorganizm, korzystnie bakterię, szczególnie korzystnie bakterię gram-dodatnią, spośród nich korzystnie bakterię z rodzaju Bacillus, spośród nich szczególnie korzystnie bakterię z gatunku B. licheniformis i spośród nich całkiem szczególnie korzystnie B. licheniformis DSM13.

[0035] Zatem, stosownie do zadania, istniało zainteresowanie tym, by ulepszyć fermentację mikroorganizmów, do czego często stosuje się bakterie i tu szczególnie gram-dodatnie, szczególnie takie, które jak Bacillus, są w stanie wydzielać utworzone cenne produkty i białka. Ponadto istnieje odnośnie tego bogaty zbiór doświadczeń technicznych. Ponadto, jak wspomniano, można było wykryć białka podane w liście sekwencji dla B. lichen!formis, konkretnie B. lichen!formis DSM13. Należy oczekiwać, że wraz z coraz większym stopniem pokrewieństwa odnośnych organizmów w parze idzie coraz większa miara zgodności sekwencji nukleotydowych i aminokwasowych, a zatem ich wymienność.

[0036] Stosownie do tego, co już powiedziano, zrealizowanym rozwiązaniom częściowym należy przyporządkować, jako dalsze wykonania niniejszego wynalazku, następujące, każdorazowo przynależne kwasy nukleinowe:

Dla produktu genowego uczestniczącego w tworzeniu poliaminokwasów - kodujący kwas nukleinowy ywsC (capB, pgsB) który ma sekwencję nukleotydową, która względem sekwencji nukleotydowej podanej w SEK NR ID: 1 wykazuje co najmniej 94% identyczności; - odpowiedni kwas nukleinowy ywsC mający sekwencję nukleotydową, która względem sekwencji nukleotydowej podanej w SEK NR ID: 1 wykazuje coraz bardziej korzystnie co najmniej 96%, 97%, 96%, 99% i szczególnie korzystnie 100% identyczności; dla produktu genowego uczestniczącego w tworzeniu poliaminokwasów, kodujący kwas nukleinowy ywsC' (jako skrócona odmiana YwsCJ który ma sekwencję nukleotydową, która względem sekwencji nukleotydowej podanej w SEK NR ID: 3 wykazuje co najmniej 94% identyczności; - odpowiedni kwas nukleinowy ywsC mający sekwencję nukleotydową, która względem sekwencji nukleotydowe j podanej w SEK NR ID: 3 wykazuje coraz bardziej korzystnie co najmniej 96%, 97%, 98%, 99% i szczególnie korzystnie 100% identyczności.

[0037] Niniejszym dostarczone kwasy nukleinowe można stosować według znanych per se metod biologii molekularnej do inaktywacji bądź zwiększenia aktywności przynależnych białek. W ten sposób inaktywacje są przykładowo możliwe przez odpowiednie wektory delecyjne (patrz niżej); wzmocnienie aktywności następuje korzystnie przez nadekspresję, która jest osiągalna przy pomocy wektora ekspresyjnego (patrz niżej). Zatem postawione zadanie realizuje się za pomocą tych kwasów nukleinowych przez inaktywację ywsC i/lub ywsC'.

[0038] Odpowiednie geny przypadające na każdorazowo podane obszary homologii można otrzymać z interesujących organizmów przykładowo przy pomocy sond, które dają się wytworzyć na podstawie sekwencji 1 lub 3. Te całkowite geny mogą także służyć jako wzór do wytwarzania starterów do PCR, dzięki którym mogą być pozyskane odnośne geny z odpowiednich preparatów całkowitego DNA; te z kolei dostarczają uprzednio opisane białka. Stopień powodzenia jest tu z reguły tym większy, im większy stopień pokrewieństwa odnośnego szczepu z tym, który posłużył do konstrukcji sondy lub startera do PCR, w niniejszym przypadku zatem względem B. licheniformis.

[0039] Każdorazowo korzystny jest taki kwas nukleinowy według wynalazku, który jest naturalnie zawarty w mikroorganizmie, korzystnie w bakterii, szczególnie korzystnie w bakterii gram-dodatniej, spośród nich korzystnie z rodzaju Bacillus, spośród nich szczególnie korzystnie z bakterii z gatunku B. lichen!formis i spośród nich całkiem szczególnie korzystnie z B. lichen!formis DSM13.

[0040] Zatem jak wywiedziono powyżej, istnieje szczególny interes w tym, aby wykorzystywać te geny do fermentacji tego rodzaju mikroorganizmów. Z drugiej strony, z niniejszym wynalazkiem jest także związana możliwość, by przez opisane tu geny i/lub białka przynajmniej częściowo regulować metabolizm poliaminokwasów, szczególnie kwasu gamma-glutaminowego, gdy te mają być zsyntetyzowane, modyfikowane i/lub rozkładane. Poziom skuteczności wzrasta za to na ogół, szczególnie w odpowiednich transgenicznych komórkach gospodarza tym bardziej, im bardziej odnośne geny odpowiadają genom naturalnych komórek.

[0041] Ponadto, alternatywne postaci wykonania genów i białek można łatwo wyodrębnić zasadniczo ze wszystkich naturalnych organizmów.

[0042] Dalszą postacie wykonania niniejszego wynalazku stanowią wszelkie kwasy nukleinowe, które kodują wyżej opisane białko według wynalazku.

[0043] Tak więc istnieją, szczególnie między odlegle pokrewnymi gatunkami, różnice odnośnie wykorzystania synonimicznych kodonów, kodujących dane aminokwasy, na co także jest nastawiony aparat biosyntezy białek, przykładowo przez dostępną liczbę pasujących załadowanych tRNA. Przeniesienie jednego z wymienionych genów do mniej pokrewnych gatunków można wtedy szczególnie skutecznie przykładowo użyć do mutacji delecyjnych lub do syntezy danego białka, gdy jest ono odpowiednio zoptymalizowane względem kodonów. Można przez to procentowo wprowadzić na poziomie DNA wzrastające różnice, nie wywierające jednak skutku na poziomie aminokwasów. Z tego powodu, również takie kwasy nukleinowe stanowią wykonania niniejszego wynalazku.

[0044] Dalszy przedmiot wynalazku stanowią wektory, które zawierają uprzednio określony obszar kwasu nukleinowego według wynalazku.

[0045] Zatem, aby posługiwać się istotnymi dla wynalazku kwasami nukleinowymi, i tym samym w szczególności przygotowywać produkcję białek według wynalazku, są one w odpowiedni sposób ligowane do wektorów. Takie wektory, jak i przynależne metody pracy są wyczerpująco opisane w stanie techniki. Wektory są w znacznej ilości i zakresie wersji dostępne w sposób komercyjny, zarówno do klonowania, jak i do ekspresji. Są to przykładowo wektory, które wywodzą się z plazmidów bakteryjnych, z bakteriofagów lub wirusów, lub przeważnie są to wektory syntetyczne. Ponadto rozróżnia się je według rodzaju komórek, w których są one w stanie wzrastać, przykładowo wektory dla bakterii gram-ujemnych, gram-dodatnich, dla drożdży lub dla wyższych eukariontów. Tworzą one odpowiednie punkty wyjścia przykładowo dla biologii molekularnej i badań biochemicznych, jak i dla ekspresji danego genu lub przynależnego białka. Szczególnie do wytwarzania konstruktów do delecji lub wzmacniania ekspresji są one - jak wynika z odnośnego stanu techniki - praktycznie nieodzowne.

[0046] Korzystne są tu takie wektory, które zawierają dwa lub więcej uprzednio określonych kwasów nukleinowych według wynalazku.

[0047] Zatem odnośne geny można z jednej strony równocześnie przechowywać lub poddawać ekspresji pod kontrolą tego samego promotora. Stosownie do innego zastosowania wektor, który równocześnie zawiera dwie lub więcej nienaruszonych kopii genów według wynalazku, może służyć do utrzymywania przy życiu (ucieczki, ang. rescue) mutanta delecyjnego, który równocześnie zawiera delecje wielu tych genów. Celowe usuwanie tego wektora skutkuje następnie równoczesnym wyłączeniem wielu tych genów.

[0048] W jednej postaci wykonania wektory według wynalazku to wektory do klonowania.

[0049] Zatem wektory do klonowania nadają się, obok przechowywania, amplifikacji biologicznej lub selekcji interesującego genu, do charakterystyki jego biologii molekularnej. Równocześnie stanowią one przenaszalne i zdolne do przechowywania postaci żądanych kwasów nukleinowych i są także punktami wyjścia do technik biologii molekularnej, które nie są związane z komórkami, jak przykładowo PCR lub sposoby mutagenezy in-vitro.

[0050] Korzystnie, wektory według wynalazku to wektory ekspresyj ne.

[0051] Zatem tego rodzaju wektory ekspresyjne są podstawą do tego, by realizować odpowiednie kwasy nukleinowe w biologicznych układach produkcji i tym samym produkować przynależne białka. Korzystnymi postaciami wykonania przedmiotu tego wynalazku są wektory ekspresyjne, które niosą elementy genetyczne niezbędne do ekspresji, przykładowo promotor naturalny zlokalizowany przez tym genem lub promotor z innego organizmu. Te elementy mogą być przykładowo umieszczone w postaci tak zwanej kasety ekspresyjnej. Alternatywnie poszczególne lub wszelkie elementy regulacyjne mogą być dostarczone także przez odpowiednią komórkę gospodarza. Szczególnie korzystnie wektory ekspresyjne są dobierane pod względem dalszych właściwości, jak przykładowo optymalnej liczby kopii do wybranego układu ekspresji, szczególnie komórki gospodarza (patrz niżej).

[0052] Możliwość tworzenia nienaruszonych produktów genowych na podstawie jednego wektora istniejącego jako replikon ma szczególne znaczenie dla wyżej opisanej ucieczki i wyłączenia pewnych genów. Odwrotnie, przygotowanie wektora ekspresyjnego stanowi najlepszą możliwość nasilenia wytwarzania białka według wynalazku, a zatem podwyższenia odnośnej aktywności.

[0053] Samodzielny przedmiot wynalazku tworzą komórki, które po modyfikacji metodą inżynierii genetycznej, zawierają jeden z uprzednio określonych kwasów nukleinowych według wynalazku.

[0054] Komórki te zawierają bowiem informację genetyczną na temat syntezy białka według wynalazku. Chodzi tu szczególnie o takie komórki, które według znanych per se sposobów zaopatrzono w kwasy nukleinowe według wynalazku, bądź takie, które wywodzą się z takich komórek. Do tego są w odpowiedni sposób wybierane takie komórki gospodarza, które dają się hodować stosunkowo prosto i/lub które dają dużą wydajność otrzymywania produktu.

[0055] Za sadniczo w przypadku krajów, w których ludzkie embrionalne komórki macierzyste nie mogą być objęte ochroną patentową, takie zgodne z wynalazkiem ludzkie embrionalne komórki macierzyste muszą być wykluczone z zakresu ochrony.

[0056] Komórki według wynalazku umożliwiają przykładowo amplifikację odpowiednich genów, ale także ich mutagenezę lub transkrypcję i translację oraz ostatecznie - produkcję biotechnologiczną odnośnych białek. Ta informacja genetyczna może występować albo pozachromosomowo jako odrębny element genetyczny, to znaczy zlokalizowany w plazmidach w przypadku bakterii albo może być zintegrowany z chromosomem. Wybór odpowiedniego układu zależy od sformułowania pytań, takich jak przykładowo rodzaj i czas trwania przechowywania genu, bądź organizmu lub rodzaju mutagenezy lub selekcji.

[0057] Do tego zaliczają się w szczególności te komórki, które zawierają jeden z genów ywsC i ywsC przez wektor in trans, a zatem mogą być one użyte do odpowiednich delecji (patrz niżej). Tym tłumaczy się korzystną postać wykonania, według której w takiej komórce wspomniany kwas nukleinowy jest częścią wektora, szczególnie wektora uprzednio opisanego.

[0058] Korzystne komórki gospodarza to bakterie.

[0059] Bakterie cechują się bowiem krótkimi czasami generacji i małymi wymaganiami co do warunków hodowli. Można przez to opracować sposoby opłacalne pod względem nakładu kosztów. Ponadto w przypadku bakterii dysponuje się rozległym bogactwem doświadczeń w technice fermentacyjnej. Do celów produkcji specjalnej mogą - z najróżniejszych, w pojedynczym przypadku eksperymentalnie wyznaczanych powodów, takich jak źródła pożywek, szybkość tworzenia produktu, zapotrzebowanie czasu itd. - być odpowiednie bakterie gram-ujemne lub gram-dodatnie.

[0060] W korzystnym wykonaniu chodzi o bakterię gram-ujemną, szczególnie z rodzajów Escherichia coli, Klebsiella, Pseudomonas lub Xanthomonas, szczególnie o szczepy E. coli K12, E. coli B lub Klebsiella planticola, i całkiem szczególnie o pochodne szczepu Escherichia coli BL21 (DE3) , E. coli RV308, E. coli DH5a, E. coli JM109, E coli XL-1 lub Klebsiella planticola (Rf).

[0061] Zatem w przypadku bakterii gram-ujemnych, jak przykładowo E. coli, do przestrzeni periplazmatycznej wydzielana jest duża ilość białek. Może to być korzystne dla zastosowań specjalnych. W zgłoszeniu WO 01/81597 Al ujawniono sposób, według którego osiąga się to, że również bakterie gram-ujemne wydzielają utworzone przez ekspresję białka. Bakterie gram-ujemne określone jako korzystne są z reguły łatwo dostępne, to znaczy dostępne komercyjnie lub poprzez publicznie dostępne zbiory szczepów i mogą być optymalizowane do szczególnych warunków wytwarzania wraz z wieloma innymi składnikami, jak przykładowo wektorami, które są także podobnie dostępne.

[0062] W alternatywnym, nie mniej korzystnym wykonaniu chodzi o bakterię gram-dodatnią, szczególnie z rodzajów

Bacillus, Staphylococcus lub Corynehacterium, całkiem szczególnie z gatunku Bacillus lentus, B. lichen!formis, B. amyloliguefaciens, B. suhtilis, B. globigii lub B. alcalophilus, Staphylococcus carnosus lub Corynebacterium glutamicum, i tu znowu całkiem szczególnie korzystnie o pochodną B. lichen!formis DSM 13.

[0063] Zatem bakterie gram-dodatnie wykazują względem bakterii gram-ujemnych zasadniczą różnicę, polegającą na natychmiastowym oddawaniu wydzielanych białek do pożywki otaczającej komórki, z której, gdy jest to pożądane, można bezpośrednio oczyszczać poddane ekspresji białka według wynalazku. Ponadto, są one spokrewnione lub identyczne z większością organizmów, z których pochodzą przemysłowo ważne enzymy i przeważnie same tworzą porównywalne enzymy, tak że dysponują podobnym wykorzystaniem kodonów i ich aparat syntezy białek jest odpowiednio naturalnie skonfigurowany. Całkiem szczególnie korzystne są pochodne B. lichen!formis DSM 13 dlatego, że - z jednej strony - w stanie techniki są one również szeroko rozpowszechnione jako szczepy do produkcji biotechnologicznej, a-z drugiej strony - wraz z niniejszym zgłoszeniem dostarczono dokładnie geny i białka według wynalazku z B. lichen!formis DSM 13, dlatego realizacja niniejszego wynalazku powinna być najprawdopodobniej skuteczna w takich szczepach.

[0064] Dalszą postać wykonania niniejszego wynalazku tworzą sposoby wytwarzania jednego lub więcej wyżej opisanych produktów genowych YwsC i YwsC'.

[0065] Należy do nich każdy sposób wytwarzania wyżej opisanego białka według wynalazku, przykładowo sposoby syntezy chemicznej. Natomiast korzystne są jednak wszelkie ustalone w stanie techniki, wyżej już poruszane w poszczególnych aspektach molekularnobiologiczne, mikrobiologiczne, bądź biotechnologiczne sposoby wytwarzania. Ich celem jest w pierwszym rzędzie otrzymanie białka według wynalazku w celu dostarczenia ich do odpowiednich zastosowań, przykładowo do syntezy, modyfikacji lub degradacji poli-gamma-glutaminianu.

[0066] Korzystnie chodzi przy tym o sposoby, które zachodzą przy zastosowaniu jednego z wyżej określonych kwasów nukleinowych według wynalazku, korzystnie przy zastosowaniu jednego uprzednio określonego wektora według wynalazku i szczególnie korzystnie przy zastosowaniu jednej uprzednio określonej komórki według wynalazku .

[0067] Bowiem wymienione kwasy nukleinowe, szczególnie kwasy nukleinowe podane w liście sekwencji w SEK NR ID: 1 bądź 3, dostarczają odpowiednio korzystną informację genetyczną w postaci wykorzystywalnej mikrobiologicznie, to znaczy do sposobów produkcji metodami inżynierii genetycznej. Coraz bardziej korzystne jest dostarczanie na wektorze, który może być szczególnie skutecznie wykorzystywanym przez komórkę gospodarza bądź przez same takie komórki. Odnośne sposoby produkcji są znane specjaliście per se.

[0068] Postaciami wykonania niniejszego wynalazku mogą być na podstawie przynależnych sekwencji kwasu nukleinowego także systemy ekspresyjne pozbawione komórek, w przypadku których biosyntezę białek prowadzi się in vitro. Wszystkie przytoczone już wyżej elementy można także łączyć z nowymi sposobami w celu wytwarzania białek według wynalazku. Dla każdego białka według wynalazku można przy tym przewidzieć wiele możliwości kombinacji etapów sposobu, tak że optymalne sposoby dla każdego konkretnego pojedynczego przypadku muszą być określone eksperymentalnie.

[0069] Ponadto, korzystne są takie tego rodzaju sposoby według wynalazku, w przypadku których sekwencja nukleotydowa w jednym lub korzystnie w wielu kodonach została dopasowana do wykorzystania kodonów szczepu gospodarza.

[0070] Zatem, stosownie do tego co powiedziano wyżej, przeniesienie jednego z wymienionych genów do mniej spokrewnionego gatunku można wtedy szczególnie skutecznie wykorzystać do syntezy danego białka, gdy jest on odpowiednio zoptymalizowany odnośnie wykorzystania kodonów.

[0071] Dalszym wykonaniem niniejszego wynalazku jest zastosowanie wyżej opisanego kwasu nukleinowego ywsC według wynalazku, wyżej opisanego kwasu nukleinowego ywsC' według wynalazku lub odpowiedniego kwasu nukleinowego, który koduje jedno z wyżej opisanych białek według wynalazku lub każdorazowo ich części, do czynnościowej inaktywacji każdorazowo przynależnego genu ywsC bądź ywsC' w mikroorganizmie.

[0072] Pod pojęciem czynnościowej inaktywacji należy w kontekście niniejszego zgłoszenia rozumieć każdy rodzaj modyfikacji lub mutacji, zgodnie z którym jest wstrzymana funkcja danego białka jako enzymu uczestniczącego w tworzeniu poliaminokwasów bądź jako podjednostki takiego enzymu. Zalicza się do tego takie wykonanie, w którym tworzy się praktycznie całkowite, lecz nieaktywne białko tak, że nieaktywne części takiego białka są w komórce, aż do możliwości, że przynależny gen nie ulega już translacji lub nawet całkowicie ulega delecji. Zatem szczególne "zastosowanie" takich czynników bądź genów w tej postaci wykonania polega na tym, że w odnośnej komórce właśnie nie dochodzą już one w naturalny sposób do działania. Zgodnie z wynalazkiem osiąga się to w ten sposób, że odnośny gen zostaje wyłączony na poziomie genetycznym.

[0073] W korzystnych wykonaniach chodzi przy tych zastosowaniach o takie, w przypadku których podczas fermentacji mikroorganizmu zachodzi czynnościowa inaktywacja bądź zwiększenie aktywności, korzystnie ze zmniejszeniem śluzu pochodzącego od poliaminokwasów do 50%, szczególnie korzystnie do mniej niż 20%, całkiem szczególnie korzystnie do mniej niż 5%, przy czym z kolei wszelkie leżące pomiędzy wartości procentowe liczb całkowitych i niecałkowitych należy rozumieć w odpowiednio korzystnym stopniowaniu.

[0074] Dla wyznaczenia tych wartości komórki nietraktowanego i traktowanego szczepu fermentuje się w poza tym identycznych warunkach i podczas fermentacji w odpowiedni sposób wyznacza się lepkość danej pożywki. Jako, że szczepy poza tym są identyczne, różnice lepkości należy wyjaśnić różnymi zawartościami poliaminokwasów. Zgodnie z wynalazkiem pożądane jest tu każde obniżenie lepkości. Wartości porównywalne procentowo są otrzymywane przez pobieranie próbek z obydwu fermentacji i wyznaczanie według metod znanych per se zawartości śluzu zawierającego poliaminokwasy. Coraz bardziej korzystne jest, gdy wartość wyznaczana w próbce według wynalazku przy przejściu do stacjonarnej fazy wzrostu wynosi mniej niż 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% i całkiem szczególnie mniej niż 1% odpowiedniej wartości fermentacji porównawczej.

[0075] Zatem, stosownie do zadania powinno się ulepszyć fermentację mikroorganizmów stosowanych do produkcji biotechnologicznej. Tak więc jest sensowne lub - w szczególności w przypadku gdy „dotkniętych" jest wiele genów - z reguły konieczne, by odnośne konstrukty molekularnobiologiczne realizować w skali laboratoryjnej i ewentualnie na komórkach gospodarza, które stanowią tylko etapy pośrednie, przykładowo konstrukcję wektora delecyjnego w E. coli. Zgodnie z wynalazkiem jest jednak pożądane, by inaktywacja genów ywsC lub ywsC' przede wszystkim przy fermentacji wykazywała oczekiwane działanie.

[0076] Według jednej z postaci wykonania zastosowania do czynnościowej inaktywacji jednego lub więcej genów ywsC lub ywsC' kwas nukleinowy kodujący nieaktywne białko poddaje się mutacji punktowej.

[0077] Tego rodzaju kwasy nukleinowe można wytwarzać znanymi per se sposobami mutagenezy punktowej. Są one przykładowo przedstawione w odnośnych podręcznikach, takich jak: Fritsch, Sambrook i Maniatis, "Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989. Ponadto dostępne są komercyjnie liczne zestawy do konstrukcji, przykładowo

QuickChange®-Kit z Stratagene, La Jolla, USA. Zasada działania tego zestawu polega na tym, że syntetyzuje się oligonukleotydy z pojedynczymi wymianami (starter niedopasowany, ang. Mismatch-primer) i hybrydyzuje się z genami w postaci jednoniciowej; następująca po tym polimeryzacja DNA daje wtedy w rezultacie odpowiednie mutanty punktowe. Można tu stosować właściwe dla danego gatunku sekwencje tych genów. Na podstawie wysokich homologii jest możliwe, i zgodnie z wynalazkiem szczególnie korzystne, przeprowadzenie tej reakcji na podstawie sekwencji dostarczonych w SEK NR ID: 1 i 3. Sekwencje te mogą także służyć do zaprojektowania odpowiednich starterów niedopasowanych dla pokrewnych gatunków, szczególnie na podstawie konserwatywnych obszarów identyfikowalnych przez przyrównanie na fig. 6 lub 7 bądź 1 lub 2.

[0078] Według jednej postaci wykonania tego zastosowania do czynnościowej inaktywacji stosuje się każdorazowo kwas nukleinowy z mutacją delecyjną lub insercyjną, korzystnie obejmującą sekwencje brzegowe obejmujące każdorazowo co najmniej 70—150 pozycji kwasu nukleinowego obszaru kodującego białko.

[0079] Także te sposoby są znane specjaliście per se. Zatem istnieje możliwość, aby zapobiec tworzeniu się jednego lub więcej czynników YwsC i YwsC' przez komórkę gospodarza poprzez to, że część danego genu wycina się na odpowiednim wektorze do transformacji przez endonukleazy restrykcyjne i wektor następnie transformuje się do gospodarza będącego przedmiotem zainteresowania, gdzie przez - aż dotąd wciąż możliwą -homologiczną rekombinację aktywny gen wymienia się na nieaktywną kopię. W postaci wykonania mutacji insercyjnej można tylko wstawić inny gen, przykładowo marker selekcyjny, przerywając nienaruszony gen lub w miejsce części genu. Tu zdarzenie mutacji jest fenotypowo weryfikowalne w sposób znany per se.

[0080] Aby umożliwić te każdorazowo konieczne zdarzenia rekombinacji między genem uszkodzonym wprowadzonym do komórki i przykładowo nienaruszoną kopią genu dostępną endogennie na chromosomie, potrzebna jest wedle obecnego stanu wiedzy zgodność każdorazowo w co najmniej 70—150 powiązanych pozycjach kwasu nukleinowego, każdorazowo w obydwu sekwencjach brzegowych względem części niepasującej, przy czym nie dochodzi to do części leżącej pomiędzy nimi. Odpowiednio do tego, korzystne są takie postaci wykonania, które obejmują tylko dwa otaczające obszary o co najmniej tych wielkościach.

[0081] Według jednej alternatywnej postaci wykonania tego zastosowania stosuje się kwasy nukleinowe z w sumie dwoma odcinkami kwasu nukleinowego, które każdorazowo obejmują co najmniej 70—150 pozycji kwasu nukleinowego i tym samym przynajmniej częściowo a korzystnie całkowicie, otaczają obszar kodujący białko. Otaczające obszary można przy tym określić wychodząc ze znanych sekwencji metodami znanymi per se, przykładowo przy pomocy starterów do PCR skierowanych na zewnątrz i preparatu genomowego DNA jako matrycy (zakotwiczona PCR). Zatem, aby jedynie umożliwić wymianę obydwu kopii genu przez rekombinację homologiczną, nie chodzi przy tym koniecznie niezbędnie o odcinki kodujące białko. Według niniejszego wynalazku można zaprojektować odnośnie tego potrzebne startery na podstawie SEK NR ID: 1 i 3 także dla innych gatunków bakterii gram- dodatnich i tu szczególnie dla tych z rodzaju Bacillus. Alternatywnie w stosunku do tego eksperymentalnego podejścia można pobierać tego rodzaju, co najmniej w części niekodujące obszary dla wielu z tych genów z pokrewnych gatunków, przykładowo z zapisów banku danych B. subtilis, przykładowo banku danych SubtiList

Instytutu Pasteura, Paris, Francja (http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/genome.cgi).

[0082] Niniejszy wynalazek realizuje się także w postaci mikroorganizmów modyfikowanych metodami inżynierii genetycznej, czego odpowiednio dotyczy to co powiedziano już wyżej.

[0083] Całkiem powszechne są mikroorganizmy, w przypadku których co najmniej jeden z genów ywsC lub ywsC jest czynnościowo inaktywowany.

[0084] Korzystne są mikroorganizmy, w przypadku których coraz bardziej korzystnie jeden z genów ywtA według SEK NR ID: 5 lub ywtB według SEK NR ID: 7 jest ponadto inaktywowany.

[0085] Tymi mikroorganizmami są korzystnie bakterie.

[0086] Zgodnie z dotychczasowymi wykonaniami korzystne są takie mikroorganizmy, w przypadku których chodzi o bakterie gram-ujemne, szczególnie te z rodzajów Escherichia coli, Klebsiella, Pseudomonas lub Xanthomonasr szczególnie o szczepy E. coli K12, E. coliB lub Klebsiella planticola, i całkiem szczególnie o pochodne szczepu Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV30 8, E. coli DH5a, E. coli JM109, E. coli XL-1 lub Klebsiella planticola (Rf).

[0087] Stosownie do dotychczasowych wykonań nie mniej korzystne są takie mikroorganizmy, w przypadku których chodzi o bakterie gram-dodatnie, szczególnie takie z rodzajów Bacillus, Staphylococcus lub Corynebacterium, całkiem szczególnie z gatunku Bacillus lentus, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. subtilis, B. globigiioder B. alcalophilus, Staphylococcus carnosus lub Corynebacterium glutamicum i tu całkiem szczególnie o B. licheniformis DSM 13.

[0088] Wedle zadania leżącego u podstaw niniejszego zgłoszenia intencją w pierwszym rzędzie było ulepszenie sposobów fermentacji przemysłowej. Zgodnie z tym wynalazek realizuje się w szczególności w odpowiednich, sposobach fermentacji według wynalazku.

[0089] Są to ogólnie sposoby fermentacji uprzednio opisanego mikroorganizmu według wynalazku.

[0090] Stosownie do tego co opisano powyżej korzystne są odpowiednio opisane powyżej sposoby. Obejmują one szczególnie wykonanie czynnościowego inaktywowania jednego lub więcej genów ywsC lub ywsC'. W tym celu szczególnie chętnie odwołuje się do wyżej opisanych kwasów nukleinowych według wynalazku, przede wszystkim tych podanych w SEK NR ID: 1 lub 3. Dotyczy to odpowiednio także gatunków wybranych jako odpowiednie do każdorazowej fermentacji. Stosownie do tego co powiedziano wyżej, coraz bardziej korzystne są takie, które wykazują we wzrastającej mierze pokrewieństwo w stosunku do B. licheniformis DSM13, ponieważ tym samym rosną szanse powodzenia przy użyciu podanych kwasów nukleinowych.

[0091] Spoś ród sposobów fermentacji według wynalazku korzystne są te do wytwarzania cennego produktu, szczególnie te do wytwarzania niskocząsteczkowego związku lub białka.

[0092] Jest to bowiem najważniejszy obszar zastosowań fermentacji na skalę przemysłową.

[0093] Korzystnie są sposoby, w których niskocząsteczkowym związkiem jest produkt naturalny, suplement diety lub farmaceutycznie istotny związek.

[0094] W ten sposób produkuje się przykładowo aminokwasy lub witaminy, które znajdują zastosowanie szczególnie jako suplementy diety. W przypadku farmaceutycznie istotnych związków może chodzić o prekursory lub produkty pośrednie leków lub nawet o nie same. We wszystkich tych przypadkach mówi się także o biotransformacji, do czego wykorzystuje się właściwości metaboliczne mikroorganizmów, aby całkiem lub przynajmniej w poszczególnych etapach zastąpić i tak pracochłonną syntezę chemiczną.

[0095] Nie mniej korzystnie są odpowiednie sposoby, w których wytwarzane jest białko, którym jest enzym, szczególnie taki z grupy α-amylaz, proteaz, celulaz, lipaz, oksydoreduktaz, peroksydaz, lakkaz, oksydaz i hemicelulaz.

[0096] Enzymy przemysłowe, wytwarzane w tego rodzaju sposobach, znajdują zastosowanie przykładowo w przemyśle środków spożywczych. Tak więc a-amylazy przykładowo służą do tego, aby uniemożliwiać czerstwienie chleba lub aby klarować soki owocowe. Proteazy stosuje się do rozkładu białek. Wszystkie te enzymy opisano do zastosowania w środkach piorących i czyszczących, przy czym szczególnie istotne miejsce zajmują proteazy subtylizynowe naturalnie wytwarzane przez bakterie gram-dodatnie. Szczególnie w przemyśle tekstylnym i skórzanym służą one do obróbki surowców naturalnych. Ponadto można wszystkie te enzymy zastosować w kontekście biotransformacji jako katalizatory reakcji chemicznych.

[0097] Wiele z tych enzymów pierwotnie pochodzi z gatunków Bacillus i dlatego szczególnie skutecznie są one produkowane w organizmach gram-dodatnich, szczególnie w tych z rodzaju Bacillus, w tym w wielu przypadkach podpadają także pochodne B. lichen!formis DSM13. Sposoby produkcji, oparte na tych systemach mikrobiologicznych, można w szczególności ulepszać przy pomocy niniejszego wynalazku, ponieważ sekwencje szczególnie podane w SEK NR ID: 1 i 3 pochodzą właśnie z tego organizmu.

[0098] Na koniec, czynniki dostarczone z niniejszym zgłoszeniem można także pozytywnie zastosować, to znaczy w sensie ich naturalnej funkcji, to znaczy w związku z celowym wytwarzaniem, modyfikacją lub degradacj ą poli-gamma-glutaminianu.

[0099] Jedną postać wykonania tworzą zatem mikrobiologiczne sposoby wytwarzania, modyfikacji lub degradacji poli-gamma-glutaminianu, w których stosuje się transgenicznie jeden z wyżej opisanych kwasów nukleinowych ywsC i/lub ywsC' według wynalazku lub odpowiedni kwas nukleinowy, który koduje wyżej opisane białko według wynalazku, korzystnie przy tworzeniu odpowiedniej wyżej opisanego białka według wynalazku.

[0100] Korzystne są tu sposoby, w których stosuje się mikroorganizm z rodzaju Bacillus, szczególnie B. subtilis lub B. licheniformis.

[0101] Zatem, jak przykładowo opisano w zgłoszeniach JP 08308590 A lub WO 02/055671 Al, jest możliwe, by mikrobiologicznie wytwarzać GLA, a mianowicie w B. subtilis i B. licheniformis. Dostarczone z niniejszym zgłoszeniem sekwencje DNA można przykładowo zastosować do tego, aby w odpowiednich komórkach podwyższać aktywności odpowiednich genów i tym samym zwiększać wydajność otrzymywania.

[0102] Alternatywą względem powyższego są obecnie także pozbawione komórek sposoby wytwarzania, modyfikacji lub degradacji poli-gamma-glutaminianu z udziałem wyżej opisanego, uczestniczącego w tworzeniu poliaminokwasów produktu genowego YwsC i/lub YwsC' według wynalazku, zwłaszcza przy zastosowaniu odpowiedniego wyżej opisanego kwasu nukleinowego według wynalazku.

[0103] Tak więc czynniki te mogą być doprowadzone do reakcji przykładowo w bioreaktorze. Konstrukcja takich bioreaktorów dla enzymów jest znane per se ze stanu techniki.

[0104] Poniższe przykłady dalej objaśniają niniejszy wynalazek.

Przykłady [0105] Wszystkie molekularnobiologiczne etapy pracy wynikają ze standardowych metod, tak jak je przykładowo podano w podręczniku Fritscha, Sambrooka i Maniatisa "Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989, lub w porównywalnych, odnośnych pracach. Enzymy, zestawy konstrukcyjne i aparaty zastosowano zgodnie z informacjami podanymi przez każdorazowego wytwórcę. Przykład 1

Identyfikacja genów ywsC, ywsC, ywtA, ywtB i ywtD z B. licheniformis DSM 13 [0106] Genomowy DNA otrzymano wedle standardowych metod z dostępnego dla każdego, odnośnego szczepu B. licheniformis DSM 13 z Niemieckiej Kolekcji Mikroorganizmów i Hodowli Komórkowych GmbH, Mascheroder Weg lb, 38124 Braunschweig (http://www.dsmz.de), następnie mechanicznie frakcjonowano i rozdzielono przez elektroforezę w 0,8% żelu agarozowym. W celu klonowania metodą strzelby genowej mniejszych fragmentów, wymywano fragmenty o wielkości 2—2,5 kb z żelu agarozowego, defosforylowano i ligowano jako fragmenty z tępymi końcami (blunt ended) w restrykcyjne miejsce cięcia Smal wektora pTZ19R-Cm. Chodzi przy tym o nadającą oporność na chloramfenikol pochodną plazmidu pTZ19R dostępnego z Fermentas (St. Leon-Rot). Tym sposobem otrzymano bibliotekę genów mniejszych fragmentów. Jako drugie klonowanie metodą strzelby genowej w układ wektora SuperCos-1 ("Cosmid Vector Kit") z Stratagene, La Jolla, USA, ligowano fragmenty genomowe otrzymane przez częściową restrykcję enzymem SauIIIal, przez co przez otrzymano bibliotekę genów przeważająco większych fragmentów.

[0107] Z bakterii E. coli DH5a (D.Hannahan (1983): "Studies on transformation on Escherichia coli"; J. Mol. Microbiol., tom 166, str. 557 - 580), możliwych do otrzymania dostępnych w wyniku transformacji odnośnymi bibliotekami genów, wyodrębniono i sekwencjonowano odnośne plazmidy rekombinacyjne. Zastosowano tu metodę terminacji z barwnikiem (ang. dye terminator chemistry), przeprowadzaną z użyciem przyrządów do automatycznego sekwencjonowania Mega-BACE 1000/4000 (Amersham Bioscence, Piscataway, USA) i ABI Prism 377 (Applied Biosystems, Foster City, USA).

[0108] W ten sposób otrzymano m.in. sekwencje SEK NR ID: 1, 3, 5, 7 i 9 podane w liście sekwencji niniejszego zgłoszenia, które w tej kolejności oznaczają geny ywsC, ywsC' (jako skróconą odmianę ywsC), ywtA, ywtB i ywtD. Wyprowadzone stąd sekwencje aminokwasowe są podane w odpowiedniej kolejności w SEK NR ID: 2, 4, 6, 8 bądź 10. Dla genu bądź białka ywsC (bądź YwsC) podano skróconą odmianę ywsC (bądź YwsC' ) , ponieważ pokazane na Figurze 6 porównanie sekwencji aminokwasowych dla homologicznego białka w B. subtilis pokazuje polipeptyd, który - przy poza tym dość wysokiej homologii i dlatego porównywalnej aktywności -na N-kohcu jest krótszy o 16 aminokwasów.

Powtwarzalność [0109] Te geny i produkty genowe można obecnie celowo na podstawie tych sekwencji sztucznie syntetyzować według metod znanych per se, bez potrzeby wykonywania przedstawionego sekwencjonowania. Dalszą alternatywą jest możliwość, by uzyskać przez PCR odnośne geny ze szczepu Bacillus, szczególnie możliwego do nabycia z DSMZ szczepu B. licheniformis DSM 13, przy czym do syntezy starterów można stosować każdorazowo podane w liście sekwencji sekwencje brzegowe. W przypadku zastosowania innych szczepów otrzymuje się każdorazowo homologiczne do tego geny, przy czym PCR powinno być tym skuteczniejsza, im większe jest pokrewieństwo pomiędzy wybranymi szczepami z B. licheniformis DSM 13, ponieważ wraz z tym powinna następować wzrastająca zgodność sekwencji także wewnątrz obszarów wiązania startera.

Przykład 2 Homologie sekwencji [0110] Po wyznaczeniu sekwencji DNA i sekwencji aminokwasowych według przykładu 1, każdorazowo wyznaczano najbardziej podobne homologi ujawnione dotąd przez badanie w bankach danych GenBank (National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA; http://www.ncbi.nim.nih. gov) i Subtilist z Institute Pasteur, Paris, Francja(http://genolist.Pasteur.fr/ Subtilist/genome.cgi).

[0111] Wy znaczone sekwencje DNA bądź sekwencje aminokwasowe przyrównano względem siebie jak przedstawiono na figurach 1—10; w tym celu zastosowano program komputerowy Vector NTI® Suite Version 7, który można nabyć z Informax Inc., Bethesda, USA. Zastosowano tutaj standardowe parametry tego programu, to znaczy dla porównania sekwencji DNA: Wielkość K-tupie: 2; Liczba najlepszych przekątnych: 4; Wielkość okna: 4; Kara za przerwę: 5;Kara za otwarcie przerwy: 15 iKara za wydłużenie przerwy: 6,66. Dla porównania sekwencji aminokwasowych zastosowano następujące standardowe parametry: Wielkość K-tuple: 1; Liczba najlepszych przekątnych: 5; Wielkość okna: 5; Kara za przerwę: 3; Kara za otwarcie przerwy: 10 i Kara za zamknięcie przerwy: 0,1. Wyniki tych porównań sekwencji zestawiono w następującej tabeli 1, przy czym jako numery dostępu podane są numery z banku danych NCBI.

Tabela 1: Geny bądź białka najbardziej podobne do genów i białek określonych w przykładzie 1.

[0112] Widać wyraźnie, że w przypadku znalezionych genów i wyprowadzonych z nich produktów genowych chodzi o nowe geny bądź białka wyraźnie różniące się względem dotychczas znanego stanu techniki.

Przykład 3

Czynnościowa inaktywacją jednego lub wielu genów ywsC, ywsC', ywtA i ywtB w B. licheniformis Zasada wytwarzania wektora delecyjnego [0113] Każdy z tych genów można przykładowo czynnościowo inaktywować za pomocą tak zwanego wektora delecyjnego. To postępowanie zostało opisane per se przykładowo przez J. Vehmaanpera i in. (1991) w publikacji "Genetic manipulation of Bacillus amyloliquef aciens"; J. Biotechnol., tom 1_9, str. 221 - 240 .

[0114] Odpowiednim do tego wektorem jest pE194, który scharakteryzowano w publikacji "Replication and incompatibility properties of plasmid pE194 in Bacillus subtilis" T.J. Gryczana i in. (1982), J. Bacteriol., tom 152, str. 722 - 735. Zaleta tego wektora delecyjnego polega na tym, że posiada on zależny od temperatury początek replikacji. W temperaturze 33°C pE194 może replikować w transformowanej komórce, tak że w tej temperaturze najpierw przeprowadza się wstępną selekcję pod kątem skutecznej transformacji. Następnie, komórki zawierające wektor inkubuje się w temperaturze 42°C. W tej temperaturze wektor delecyjny już nie replikuje i presja selekcyjna wywierana jest na integrację plazmidu przez uprzednio wybrany obszar homologiczny do chromosomu. Druga rekombinacja homologiczna przez drugi obszar homologiczny prowadzi następnie do wycięcia wektora wraz z nienaruszoną kopią genu z chromosomu i tym samym do delecji genu zlokalizowanego w chromosomie in vivo. Możliwa byłaby także - jako druga rekombinacja - reakcja odwrotna do integracji, to znaczy „wyrekombinowanie" wektora z chromosomu tak, aby gen chromosomowy pozostał nienaruszony. Delecję genu trzeba zatem udowodnić według metod znanych per se, przykładowo według metody Southerna po restrykcji chromosomowego DNA odpowiednimi enzymami lub za pomocą techniki PCR na podstawie wielkości amplifikowanego obszaru.

[0115] Wymagany jest zatem wybór dwóch obszarów homologicznych poddawanego delecji genu, które każdorazowo powinny obejmować co najmniej po 70 par zasad, przykładowo obszaru 5' i obszaru 3' wybranego genu. Klonuje się je do wektora w taki sposób, że otaczają one część kodującą nieaktywne białko lub następują bezpośrednio po sobie po opuszczeniu leżącego między nimi obszaru. Przez to otrzymuje się wektor delecyjny.

Delecja rozpatrywanych tu genów ywsC, ywsC', ywtA i ywtB

[0116] W celu konstrukcji wektora delecyjnego według wynalazku amplifikuje się za pomocą PCR obszary 5' i 3' jednego z tych czterech bądź trzech genów. W celu konstrukcji odpowiednich starterów do dyspozycji są podane w liście sekwencji sekwencje SEK NR ID: 1, 3, 5 i 7, które pochodzą z B. licheniformis, jednak wskutek oczekiwanych homologii powinny być także odpowiednie dla innych gatunków, szczególnie rodzaju Bacillus.

[0117] Obydwa amplifikowane obszary poddaje się pośredniemu klonowaniu w odpowiedni sposób bezpośrednio po sobie na jednym wektorze stosownym do tego celu prac, np. na wektorze pUCl8, który nadaje się do etapów klonowania w E. coli.

[0118] W następnym etapie następuje subklonowanie do wektora pE194 wybranego do delecji i jego transformacja do B. subtilis DB104, przykładowo metodą transformacji protoplastów według Changa & Cohena (1979; "High Frequency Transformation of Bacillus subtilis Protoplasts by Plasmid DNA"; Molec. Gen. Genet. (1979), tom 168, str. 111-115). Wszystkie etapy pracy trzeba przeprowadzić w temperaturze 33°C, aby zapewnić replikację wektora.

[0119] W następnym etapie transformuje się subklonowany wektor poddany pośredniemu klonowaniu również za pomocą metody transformacji protoplastów do żądanego szczepu gospodarza, tu B. licheniformis. Tak otrzymane transformanty, zidentyfikowane jako dodatnie typowymi metodami (selekcja przez marker oporności plazmidu; kontrola przez preparat plazmidu i PCR dla wstawki) hoduje się następnie w temperaturze 42°C pod presją selekcyjną przez dodanie erytromycyny na obecność plazmidu. W tej temperaturze wektor delecyjny nie może już replikować, i przeżywają tylko takie komórki, w przypadku których wektor uległ integracji do chromosomu, przy czym ta integracja z największym prawdopodobieństwem odbywa się w obszarach homologicznych lub identycznych. Przez hodowlę w temperaturze 33°C bez presji selekcyjnej za pomocą erytromycyny można wtedy następnie indukować wycięcie wektora delecyjnego, przy czym chromosomowo kodowany gen całkowicie usuwa się z chromosomu. Powodzenie delecji sprawdza się następnie metodą Southerna po restrykcji chromosomowego DNA odpowiednimi enzymami lub za pomocą techniki PCR.

[0120] Takie transformanty, w przypadku których odnośny gen ulega delecji, cechują się ponadto ograniczeniem lub nawet pełną niezdolnością do tworzenia GLA.

[0121] Opis figur

Figura 1: Przyrównanie genu ywsC (SEK NR ID: 1) z B. licheniformis DSM 13 (B.I. ywsC) z homologicznym genem ywsC z B. subtilis (B.s. ywsC).

Figura 2: Przyrównanie genu ywsC'(SEK NR ID: 3) z B. licheniformis DSM 13 (B.I. ywsC') z homologicznym genem ywsC z B. subtilis (B.s. ywsC).

Figura 6: Przyrównanie białka YwsC (SEK NR ID: 2) z B. licheniformis DSM 13 (B.s. YwsC) z homologicznym białkiem YwsC z B. subtilis (B.s. YwsC).

Figura 7: Przyrównanie białka YwsC' (SEK NR ID: 4) z B. lichenifonnis DSM 13 (B.s. YwsC') z homologicznym białkiem YwsC z B. subtilis (B.s. YwsC).

Usta sekwencfi P1221 10> H&amp;fsk«3 Karmasfs^&amp;gss«^shą&amp; ąal AkSan <12ώ> {iłujcie produkt? genowe z Ssc-iSUis ttc&amp;enifomis tworzące :ub dsgra&amp;ijącs poSarnkuikwssv oraz coarts na rach udostonsteoe spesofey produkcji t^ecAjws&amp;ecznej

<33C»HOS382PCT <1S0> »<32004038838,8 <151 »2004*05*26 <3e?* ίο

<178> Patent! s? wsns.ja3J <21Φ* 1 <bi> nm <21 > SacisiS S^h^sifóirras Om 13 <m>

<221 a gen <223> ye$C <aao>

<221>COS <222> {1 >: Ą1230} <223> *'400* 1 a tg aat g&amp;a fcfcfc aea tafc cag att «tea aga agg aga tgt aga eaa eea 4 i

Ket ftSRt Glu Phe Tiar Tyr <3in tle Pro Arg Arg Arg Cyś Arg Gin Thr ;t $ 10 1:5 atg tgg gta atf eta tta fee tgtgfcg atc gtt gtt ggg atc gge att 96

Met Ttp Val Met Lett l*eu Alą Cya Val Ile Val V5ał Sly Ile Sly 21® 20 25 li tat gaa aaa agg ege eas eąg eaa mat atc get §c«j ttg set gfce ega 144 tyr Gin Lya Arg Arg Mis sin sin A®ą II® Aap Ala Leu Pro Val Arg 35 40 es

gtg aac atc aac ggt eta ege gga sag t-ee aeg gtg aca aga eta aca IfS V*1 Asa Ile As« Gly Ile Arg Sly &amp;ye Ser Th* Val litr Arg tó« Thr S0 55 «0 ace ggg ata tta ate gaa gea gge tac aaa aca gta gga aa* aca aee 240 TM* my Ile Łetł Ile Siu Ala <31 y Ty* Ays Thr Val <5ly Łya Thr Thr €5 70 ?§ 8© gfg aca gae gea agg atg att tafc tgg gac aca ccg gaa gag aag ceg 280

Sly 1$» Asp Ala Arg Met Ile Tyr Tsrp Aap Thr prę 4ł« ela Lys Pro 85 9© 95 ate aaa aga aag ccg caa ggg ccg aat ate gga gag cag aag gag gtt 336

Ile Lys Arg Lys Pro Gin Gly Pro Asn lie Gly Glu Gin Lys Glu Val 100 105 110 atg aaa gaa aeg gtg gaa aga ggg gee aat geg att gtc agt gag tgc 384

Met Lys Glu Thr Val Glu Arg Gly Ala Asn Ala He Val Ser Glu Cys 115 120 125 atg gee gtt aat cct gat tac caa ate ate ttt cag gaa gaa ttg ett 432

Met Ala Val Asn Pro Asp Tyr Gin He lie Phe Gin Glu Glu Leu Leu 130 135 140 cag get aat ate ggc gtg ate gtg aac gtg ctg gag gat cac atg gat 480

Gin Ala Asn lie Gly Val lie Val Asn Val Leu Glu Asp His Met Asp 145 150 155 160 gtg atg gga ccg act ttg gat gaa ate gca gaa gca ttc aca gca ace 528

Val Met Gly Pro Thr Leu Asp Glu lie Ala Glu Ala Phe Thr Ala Thr 165 170 175 att cct tat aat gga cat ttg gtt att act gat agt gag tat acc gat 576 lie Pro Tyr Asn Gly His Leu Val lie Thr Asp Ser Glu Tyr Thr Asp 180 185 190 ttc ttt aag caa att gca aaa gaa agg aac aca aaa gtc ate gtc gca 624

Phe Phe Lys Gin lie Ala Lys Glu Arg Asn Thr Lys Val lie Val Ala 195 200 205 gac aat tet aaa ata aca gat gaa tac etc aga cag ttt gag tac atg 672

Asp Asn Ser Lys lie Thr Asp Glu Tyr Leu Arg Gin Phe Glu Tyr Met 210 215 220 gta ttc cct gat aat geg tet ett geg etc ggt gta get caa geg ttg 720

Val Phe Pro Asp Asn Ala Ser Leu Ala Leu Gly Val Ala Gin Ala Leu 225 230 235 240 ggc att gac gaa gaa acc gee ttt aaa ggc atg ctg aat geg ccg cct 768

Gly lie Asp Glu Glu Thr Ala Phe Lys Gly Met Leu Asn Ala Pro Pro 245 250 255 gat ccg gga gee atg aga att ctg ccg ctg atg aac gee aag aat cce 816

Asp Pro Gly Ala Met Arg lie Leu Pro Leu Met Asn Ala Lys Asn Pro 260 265 270 gga cat ttc gtc aac ggt ttt geg gee aat gac gca get tee act tta 864

Gly His Phe Val Asn Gly Phe Ala Ala Asn Asp Ala Ala Ser Thr Leu 275 280 285 aac att tgg aag cgt gta aaa gaa ata ggc tat cct aeg gat cag ccg 912

Asn lie Trp Lys Arg Val Lys Glu lie Gly Tyr Pro Thr Asp Gin Pro 290 295 300 ate gtc att atg aac tgc ege gee gac agg gta gac aga aca cag cag 960 lie Val He Met Asn Cys Arg Ala Asp Arg Val Asp Arg Thr Gin Gin 305 310 315 320 ttt geg gaa gat gtc ett cct tat att gaa gca agt gaa ett gtg ctg 1008

Phe Ala Glu Asp Val Leu Pro Tyr lie Glu Ala Ser Glu Leu Val Leu 325 330 335 att gga gaa aca aca gag ccg ate gtc aaa gca tat gaa gca ggc aaa 1056 lie Gly Glu Thr Thr Glu Pro lie Val Lys Ala Tyr Glu Ala Gly Lys 340 345 350 att cct geg gac aag ctg ttt gat ttt gag cac aaa tea aeg gaa gaa 1104

He Pro Ala Asp Lys Leu Phe Asp Phe Glu His Lys Ser Thr Glu Glu 355 360 365 ate atg ttc atg ctg aaa aac aag ett gag ggc ege gtt att tac gga 1152 lie Met Phe Met Leu Lys Asn Lys Leu Glu Gly Arg Val lie Tyr Gly 370 375 380 gtc gga aat ate cac gga gca geg gag cct etc att gaa aaa ata caa 1200

Val Gly Asn lie His Gly Ala Ala Glu Pro Leu lie Glu Lys lie Gin 385 390 395 400 gat tac aag att aag tag etc gtt age tag 1230

Asp Tyr Lys lie Lys Gin Leu Val Ser 405

<210> 2 <211 >409 <212> PRT <213> Bacillus licheniformis DSM 13 <400>2

Met Asn Glu Phe Thr Tyr Gin lie Pro Arg Arg Arg Cys Arg Gin Thr 15 10 15

Met Trp Val Met Leu Leu Ala Cys Val lie Val Val Gly lie Gly He 20 25 30

Tyr Glu Lys Arg Arg His Gin Gin Asn He Asp Ala Leu Pro Val Arg 35 40 45

Val Asn lie Asn Gly He Arg Gly Lys Ser Thr Val Thr Arg Leu Thr 50 55 60

Thr Gly He Leu lie Glu Ala Gly Tyr Lys Thr Val Gly Lys Thr Thr 65 70 75 80

Gly Thr Asp Ala Arg Met lie Tyr Trp Asp Thr Pro Glu Glu Lys Pro 85 90 95 lie Lys Arg Lys Pro Gin Gly Pro Asn lie Gly Glu Gin Lys Glu Val 100 105 110

Met Lys Glu Thr Val Glu Arg Gly Ala Asn Ala He Val Ser Glu Cys 115 120 125

Met Ala Val Asn Pro Asp Tyr Gin lie He Phe Gin Glu Glu Leu Leu 130 135 140

Gin Ala Asn lie Gly Val He Val Asn Val Leu Glu Asp His Met Asp 145 150 155 160

Val Met Gly Pro Thr Leu Asp Glu lie Ala Glu Ala Phe Thr Ala Thr 165 170 175 lie Pro Tyr Asn Gly His Leu Val He Thr Asp Ser Glu Tyr Thr Asp 180 185 190

Phe Phe Lys Gin He Ala Lys Glu Arg Asn Thr Lys Val lie Val Ala 195 200 205

Asp Asn Ser Lys He Thr Asp Glu Tyr Leu Arg Gin Phe Glu Tyr Met 210 215 220

Val Phe Pro Asp Asn Ala Ser Leu Ala Leu Gly Val Ala Gin Ala Leu 225 230 235 240

Gly lie Asp Glu Glu Thr Ala Phe Lys Gly Met Leu Asn Ala Pro Pro 245 250 255

Asp Pro Gly Ala Met Arg lie Leu Pro Leu Met Asn Ala Lys Asn Pro 260 265 270

Gly His Phe Val Asn Gly Phe Ala Ala Asn Asp Ala Ala Ser Thr Leu 275 280 285

Asn He Trp Lys Arg Val Lys Glu He Gly Tyr Pro Thr Asp Gin Pro 290 295 300 lie Val He Met Asn Cys Arg Ala Asp Arg Val Asp Arg Thr Gin Gin 305 310 315 320

Phe Ala Glu Asp Val Leu Pro Tyr lie Glu Ala Ser Glu Leu Val Leu 325 330 335

He Gly Glu Thr Thr Glu Pro lie Val Lys Ala Tyr Glu Ala Gly Lys 340 345 350

He Pro Ala Asp Lys Leu Phe Asp Phe Glu His Lys Ser Thr Glu Glu 355 3S9

Ile ptee Met. Leu Lys Asn Lys Leet <31» Giy &amp;p§ Val 11« Tyr Gly 370 375 3S0

VaX Oly Aar* He His Gly Ala Ala Giu Pt» Lgu tie $1¾ Ly&amp; Ils ©lit 385 390 395 409

Asp Tjfx Łye 11« Lys <31n Leu val sear

4 OS «210 3

<211*1182 <212* DMA <213> BadSiss HdsealteRls DSM 13 <220 <221»(J#ft 4222s» (1) .411821 <223» fmC·' 4229¾ <221» CDS <222» (1141132) <22.3» <4 00» 3 atg tgg gta atg eta tta gcc tgt gtg ate gtt gtt ggg ate ggc att 48

Met Trp Val Met Leu Leu Ala Cys Val lie Val Val Gly lie Gly He IS 10 15 tat gaa aaa agg ege cac cag caa aat ate gat geg ctg cct gtc ega 96

Tyr Glu Lys Arg Arg His Gin Gin Asn He Asp Ala Leu Pro Val Arg 20 25 30 gtg aac ate aac ggt ata ege gga aag tec aeg gtg aca aga tta aca 144

Val Asn Ile Asn Gly He Arg Gly Lys Ser Thr Val Thr Arg Leu Thr 35 40 45 aca ggg ata tta ate gaa gca ggc tac aaa aca gta gga aaa aca acc 192

Thr Gly lie Leu He Glu Ala Gly Tyr Lys Thr Val Gly Lys Thr Thr 50 55 60 ggg aca gac gca agg atg att tat tgg gac aca ccg gaa gag aag ccg 240

Gly Thr Asp Ala Arg Met He Tyr Trp Asp Thr Pro Glu Glu Lys Pro 65 70 75 80 ate aaa aga aag ccg caa ggg ccg aat ate gga gag cag aag gag gtt 288 lie Lys Arg Lys Pro Gin Gly Pro Asn lie Gly Glu Gin Lys Glu Val 85 90 95 atg aaa gaa aeg gtg gaa aga ggg gcc aat geg att gtc agt gag tgc 336

Met Lys Glu Thr Val Glu Arg Gly Ala Asn Ala He Val Ser Glu Cys 100 105 110 atg gcc gtt aat cct gat tac caa ate ate ttt cag gaa gaa ttg ett 384

Met Ala Val Asn Pro Asp Tyr Gin lie lie Phe Gin Glu Glu Leu Leu 115 120 125 cag get aat ate ggc gtg ate gtg aac gtg ctg gag gat cac atg gat 432

Gin Ala Asn lie Gly Val lie Val Asn Val Leu Glu Asp His Met Asp 130 135 140 gtg atg gga ccg act ttg gat gaa ate gca gaa gca ttc aca gca ace 480

Val Met Gly Pro Thr Leu Asp Glu lie Ala Glu Ala Phe Thr Ala Thr 145 150 155 160 att cct tat aat gga cat ttg gtt att act gat agt gag tat acc gat 528 lie Pro Tyr Asn Gly His Leu Val lie Thr Asp Ser Glu Tyr Thr Asp 165 170 175 ttc ttt aag caa att gca aaa gaa agg aac aca aaa gtc ate gtc gca 576

Phe Phe Lys Gin Ile Ala Lys Glu Arg Asn Thr Lys Val lie Val Ala 180 185 190 gac aat tet aaa ata aca gat gaa tac etc aga cag ttt gag tac atg 624

Asp Asn Ser Lys lie Thr Asp Glu Tyr Leu Arg Gin Phe Glu Tyr Met 195 200 205 gta ttc cct gat aat geg tet ett geg etc ggt gta get caa geg ttg 672

Val Phe Pro Asp Asn Ala Ser Leu Ala Leu Gly Val Ala Gin Ala Leu 210 215 220 ggc att gac gaa gaa acc gcc ttt aaa ggc atg ctg aat geg ccg cct 720

Gly lie Asp Glu Glu Thr Ala Phe Lys Gly Met Leu Asn Ala Pro Pro 225 230 235 240 gat ccg gga gcc atg aga att ctg ccg ctg atg aac gcc aag aat ccc 768

Asp Pro Gly Ala Met Arg lie Leu Pro Leu Met Asn Ala Lys Asn Pro 245 250 255 gga cat ttc gtc aac ggt ttt geg gcc aat gac gca get tec act tta 816

Gly His Phe Val Asn Gly Phe Ala Ala Asn Asp Ala Ala Ser Thr Leu 260 265 270 aac att tgg aag cgt gta aaa gaa ata ggc tat cct aeg gat cag ccg 864

Asn He Trp Lys Arg Val Lys Glu lie Gly Tyr Pro Thr Asp Gin Pro 275 280 285 ate gtc att atg aac tgc ege gcc gac agg gta gac aga aca cag cag 912 lie Val lie Met Asn Cys Arg Ala Asp Arg Val Asp Arg Thr Gin Gin 290 295 300 ttt geg gaa gat gtc ett cct tat att gaa gca agt gaa ett gtg ctg 960

Phe Ala Glu Asp Val Leu Pro Tyr lie Glu Ala Ser Glu Leu Val Leu 305 310 315 320 att gga gaa aca aca gag ccg ate gtc aaa gca tat gaa gca ggc aaa 1008

He Gly Glu Thr Thr Glu Pro He Val Lys Ala Tyr Glu Ala Gly Lys 325 330 335 att cct geg gac aag ctg ttt gat ttt gag cac aaa tea aeg gaa gaa 1056

Ile Pro Ala Asp Lys Leu Phe Asp Phe Glu His Lys Ser Thr Glu Glu 340 345 350 ate atg ttc atg ctg aaa aac aag ett gag ggc ege gtt att tac gga 1104 lie Met Phe Met Leu Lys Asn Lys Leu Glu Gly Arg Val lie Tyr Gly 355 360 365 gtc gga aat ate cac gga gca geg gag cct etc att gaa aaa ata caa 1152

Val Gly Asn lie His Gly Ala Ala Glu Pro Leu lie Glu Lys lie Gin 370 375 380 gat tac aag att aag cag etc gtt age tag 1182

Asp Tyr Lys lie Lys Gin Leu Val Ser 385 390

<2104 <211 > 393 <212> PRT <213> Bacillus licheniformis DSM 13 <400 4

Met Trp Val Met Leu Leu Ala Cys Val lie Val Val Gly lie Gly lie 15 10 15

Tyr Glu Lys Arg Arg His Gin Gin Asn lie Asp Ala Leu Pro Val Arg 20 25 30

Val Asn lie Asn Gly lie Arg Gly Lys Ser Thr Val Thr Arg Leu Thr 35 40 45

Thr Gly lie Leu He Glu Ala Gly Tyr Lys Thr val Gly Lys Thr Thr 50 55 60

Gly Thr Asp Ala Arg Met lie Tyr Trp Asp Thr Pro Glu Glu Lys Pro 65 70 75 80

He Lys Arg Lys Pro Gin Gly Pro Asn He Gly Glu Gin Lys Glu Val 85 90 95

Met Lys Glu Thr Val Glu Arg Gly Ala Asn Ala He Val Ser Glu Cys 100 105 110

Met Ala Val Asn Pro Asp Tyr Gin lie He Phe Gin Glu Glu Leu Leu 115 120 125

Gin Ala Asn lie Gly Val lie Val Asn Val Leu Glu Asp His Met Asp 130 135 140

Val Met Gly Pro Thr Leu Asp Glu lie Ala Glu Ala Phe Thr Ala Thr 145 150 155 150 lie Pro Tyr Asn Gly His Leu Val lie Thr Asp Ser Glu Tyr Thr Asp 165 170 175

Phe Phe Lys Gin Ile Ala Lys Glu Arg Asn Thr Lys Val lie Val Ala 180 185 190

Asp Asn Ser Lys lie Thr Asp Glu Tyr Leu Arg Gin Phe Glu Tyr Met 195 200 205

Val Phe Pro Asp Asn Ala Ser Leu Ala Leu Gly val Ala Gin Ala Leu 210 215 220

Gly lie Asp Glu Glu Thr Ala Phe Lys Gly Met Leu Asn Ala Pro Pro 225 230 235 240

Asp Pro Gly Ala Met Arg lie Leu Pro Leu Met Asn Ala Lys Asn Pro 245 250 255

Gly His Phe val Asn Gly Phe Ala Ala Asn Asp Ala Ala Ser Thr Leu 260 265 270

Asn lie Trp Lys Arg val Lys Glu lie Gly Tyr Pro Thr Asp Gin Pro 275 280 285 lie val lie Met Asn Cys Arg Ala Asp Arg val Asp Arg Thr Gin Gin 290 295 300

Phe Ala Glu Asp Val Leu Pro Tyr lie Glu Ala Ser Glu Leu Val Leu 305 310 315 320

He Gly Glu Thr Thr Glu Pro lie Val Lys Ala Tyr Glu Ala Gly Lys 325 330 335 lie Pro Ala Asp Lys Leu Phe Asp Phe Glu His Lys Ser Thr Glu Glu 340 345 350

He Met Phe Met Leu Lys Asn Lys Leu Glu Gly Arg Val lie Tyr Gly 355 360 365

Val Gly Asn lie His Gly Ala Ala Glu Pro Leu He Glu Lys lie Gin 370 375 380

Asp Tyr Lys 11« Lys S.lss Leu VaJ Str 385 300 <2^{> » '-.'2' P- 4¾

</'?'- QNA <£*$> ΟβΜ 1¾ <tsf> <® :> ger* <&amp;S> aM;4S0) *i22:3?- fm, <Zii> <G\*CO$ -.Vs :480). «if- ttt gga tea gat, tt» tat: ate: gee etc ett ts* gga gtc tta etc 49 ..Met Phe OXy Ssr Asp Leu Tysr IX» Ala lea 11« Lett Cly VaJ Leu Lea

1 S 10 IS «St «tg «tt ttt gee gag asm aeg gga att gta cea gee gge etc gtc 99 S-cr Leu lie Phe -Me Glw Lys Its» Sly lie %1 Arc Ala fiiy Leo "Vial 20 as 30 ffca tsg ggt tat ttg gga ett gte tee aafc cag teg *tt etc atg ttg 144

Pel Pk* Sly Tyr Leu Sly Leu V«1 PLe Asm ©Xa fee lie 9fee Atee Lou 35 40 Ί3 etc gtt ett tt:t gtc aut tt.g etg «eg tut gee see gtg ««« etc ffa 192

Leu vai Leu Phe v«l i?et l©u Leu Thr lyt vai II» vel Lys Pte Sly so ss ' m eet: tec use set &amp;tg etc eta ess gee ege eg a use fete gca gee &amp; tg 340

Leu Ser Lye XL® Met lie Leu ffr Sly A*g Arg Lye PLe Me. AX&amp; Met 99 to 13 80 eeg act aeg gga att cut ttg aas ate ggt ttt get ttt ata tat teg 351

Leu lie Thx- O'.y Tie Leu Lew Lys Me Sly Pha Ary Ph« lie lye Pro SS 99 99 gtg a eg ccg ?:tt gag att gee ga* tec agg gga ate gga ate ate gtg 338

Val Het ?jrs> Aft» Liu lie Ala UIu Ph« Atf Sly lie c>!y lie Tip OaL LOO 108 110 ™5 .gfw ctg gee aat ace att caa age cag gga tea aeg act a©f 314

Pro Sly Leu lie Ale &amp;se Thr IX« Gl» Arg Ola #ly'I*eu Thr Tie The

US 330 I2S et:t gge age at§ ett tts tfcg age gga gea ata tee gee ate atg tat too

Law sly ggjf Thr Leu Leu Leu Set Sly Me T&amp;r Pise Vml He Met Tyr 1,30 135 140 get tac tat eta ate taa 450

Ala Tyr Tyr Leu lie 145

<210>6 <211 > 149 <212> PRT <213> Bacillus licheniformis DSM 13 <400> 6

Met Phe Gly Ser Asp Leu Tyr He Ala Leu lie Leu Gly Val Leu Leu 15 10 15

Ser Leu lie Phe Ala Glu Lys Thr Gly lie Val Pro Ala Gly Leu Val 20 25 30

Val Pro Gly Tyr Leu Gly Leu Val Phe Asn Gin Pro He Phe Met Leu 35 40 45

Leu Val Leu Phe Val Ser Leu Leu Thr Tyr Val He Val Lys Phe Gly SO 55 60

Leu Ser Lys lie Met He Leu Tyr Gly Arg Arg Lys Phe Ala Ala Met 65 70 75 80

Leu lie Thr Gly He Leu Leu Lys He Gly Phe Asp Phe lie Tyr Pro 85 90 95

Val Met Pro Phe Glu lie Ala Glu Phe Arg Gly He Gly lie lie Val 100 105 110

Pro Gly Leu lie Ala Asn Thr lie Gin Arg Gin Gly Leu Thr He Thr 115 120 125

Leu Gly Ser Thr Leu Leu Leu Ser Gly Ala Thr Phe Val lie Met Tyr 130 135 140

Ala Tyr Tyr Leu lie 145

<210>7 <211 > 1170 <212> DNA <213> Bacillus licheniformis DSM 13 <220> <Ώίν' get <;0>2> {1)..(1170) «220»

CDS «222» U}-(t1?0) «223» <4D€»7 atg ,&amp;aa aaa caa ctg aat ttt tag g&amp;a a&amp;a etg: etg sag ttg aeg a«$ 4® fries %s l#9 91» Łeu Asa Phe 91» 92» Lyis 2*»tt Lfcu feys Law The Lye i s m is tag gag &amp;«» sag a«a aca .«ac sag esc gtc Sfeh ate gta. tig eee gfci »6

Sin 92¾ Ly« Lye Lys Thr Am .fcys His val the xl« val Lew fee val 2® ®S 30 att stę tgt sea atf stt gtc set aet tgg gte gga age gee a»a set 244 -lie Fh® Cys .hm .Ket · #he Val phe Thy jtp yal Sly Ser Ala ty® Thr 3S 40 4 §

see teg ess stg gac aaa aaa gaa ga&amp; gee sag ett aea· get set see %9Z

Pro Se.r <3.1» Has Asp Lye Lye 91¾ Asp Ala i..ys le«t T&amp;r Ala The .fb® SO SS 60 gtt gsge gat ate atg atg gga agis a&amp;« gta gaa aaa. gtg; aea sac ttg 24.0

Vsl Sly Asp I la fiat Met Sly Arg Aa» Val 92« S»ys Val Thr Aa» 1«« «S 70 72 00

cat ggc teg gaa age gt« ste aaa sat gtg sag e«g tac Set. sat gtg ISO . Rls Sly S*r Glu S«r vai Pbe Lys Ann val Lya ft© Tyx Pbe Am val

»5 so . SS

tea gas tst ate see gga eat ttt gaa aac set gta ace eat gsa sag J2S

Ser Asp Phe lie Thr Sly As» Phe 91» Asa Pro Vsł Thr Asa Ał«. Łys 200 _ 10S 220 gae tat eaa gag ,ge* gas sag sac ate eat etg oaa aeg aac ess g&amp;a 304

Asp .Tys? 92» 91¾ Ala 91» Lys As» lie His Lae 91» Thsr As» 92» 91¾ US 220 22Ś tea gfe'e .gas sea ttg aaa -sag -cfeg aae etc age gta etg aat ttt gee 4 32

Sat Val Qlu The Lsis %s fcys &amp;m Am Ph* Smtv Val Leu Asa PJm Ala 130 US 140 sat a&amp;e eat geg atg gat fc«« -ggg gas gse ggS ttg sag gat sag etc 4,»9

Am Am" His AXs Met Asp %yx Sly Glu Asp Sly hm Lys Asp Thr Leo 245 ISO 1SS 140 safe aaa Sts tes ast gag sat ctf gag ess gte gga g«a gga aat sat S2&amp; •A»». Lys fh® Sat Ass 91» Am L«» 9lu Leu Vai Oly Ala 91 y Α9» As»

1€2 270 ITS stt f«a gae geg a»a esg eae gta tec tat sag eat gtg aae ggt gta S3®

Lett 91» Asp Ala Lys 91» his Val 'Sar Tyr Sift ASrs V»1 A»n Sly Va2 ISO 1S5 198 aaa att gca acg etc ggt ttt aca gac gtc tac aca aag aac ttt aca 624

Lys lie Ala Thr Leu Gly Phe Thr Asp Val Tyr Thr Lys Asn Phe Thr 195 200 205 gcc aaa aag aac aga ggc gga gtg ctg ccg etc agt ccg aaa ate ttt 672

Ala Lys Lys Asn Arg Gly Gly Val Leu Pro Leu Ser Pro Lys lie Phe 210 215 220 att cca atg att geg gaa gca teg aaa aaa geg gat ett gtc ett gtc 720 lie Pro Met lie Ala Glu Ala Ser Lys Lys Ala Asp Leu Val Leu Val 225 230 235 240 cat gtg cac tgg gga caa gaa tat gac aat gaa ccg aac gac aga cag 768

His Val His Trp Gly Gin Glu Tyr Asp Asn Glu Pro Asn Asp Arg Gin 245 250 255 aag gat ctg gcc aag geg att gca gat gcc gga gca gat gtc ate ate 816

Lys Asp Leu Ala Lys Ala lie Ala Asp Ala Gly Ala Asp Val lie lie 260 265 270 ggc get cat ccc cat gtt etc gaa ccg ate gaa gtg tat aac ggt act 864

Gly Ala His Pro His Val Leu Glu Pro lie Glu Val Tyr Asn Gly Thr 275 280 285 gtg att ttc tac age etc ggc aac ttt gta ttt gat cag ggc tgg tea 912

Val lie Phe Tyr Ser Leu Gly Asn Phe Val Phe Asp Gin Gly Trp Ser 290 295 300 aga aca egg gac age geg ett gta caa tac cat tta atg aat gac ggc 960

Arg Thr Arg Asp Ser Ala Leu Val Gin Tyr His Leu Met Asn Asp Gly 305 310 315 320 aaa ggg ege ttt gag gta acg cct etc aac att ege gaa gca acg ccg 1008

Lys Gly Arg Phe Glu Val Thr Pro Leu Asn lie Arg Glu Ala Thr Pro 325 330 335 acg cct tta ggc aag age gac ttc tta aaa ega aaa geg ate ttc cgt 1056

Thr Pro Leu Gly Lys Ser Asp Phe Leu Lys Arg Lys Ala lie Phe Arg 340 345 350 caa ttg aca aaa gga aca aac etc gac tgg aaa gaa gag aac gga aaa 1104

Gin Leu Thr Lys Gly Thr Asn Leu Asp Trp Lys Glu Glu Asn Gly Lys 355 360 365 tta acg ttt gaa gtc gat cat geg gac aag ctg aaa aat aat aaa aac 1152

Leu Thr Phe Glu Val Asp His Ala Asp Lys Leu Lys Asn Asn Lys Asn 370 375 380 gga gtg gtg aac aaa tga 1170

Gly Val Val Asn Lys 3 85

<210> 8 <211=» 389 <212> PRT <213> Bacillus licheniformis DSM 13 <400 8

Met Lys Lys Gin Leu Asn Phe Gin Glu Lys Leu Leu Lys Leu Thr Lys 1 5 10 15

Gin Glu Lys Lys Lys Thr Asn Lys His Val Phe lie Val Leu Pro Val 20 25 30 lie Phe Cys Leu Met Phe Val Phe Thr Trp Val Gly Ser Ala Lys Thr 35 40 45

Pro Ser Gin Met Asp Lys Lys Glu Asp Ala Lys Leu Thr Ala Thr Phe 50 55 60

Val Gly Asp lie Met Met Gly Arg Asn Val Glu Lys Val Thr Asn Leu 65 70 7S 80

His Gly Ser Glu Ser Val Phe Lys Asn Val Lys Pro Tyr Phe Asn Val 85 90 95

Ser Asp Phe lie Thr Gly Asn Phe Glu Asn Pro Val Thr Asn Ala Lys 100 105 110

Asp Tyr Gin Glu Ala Glu Lys Asn lie His Leu Gin Thr Asn Gin Glu 115 120 125

Ser Val Glu Thr Leu Lys Lys Leu Asn Phe Ser Val Leu Asn Phe Ala 130 135 140

Asn Asn His Ala Met Asp Tyr Gly Glu Asp Gly Leu Lys Asp Thr Leu 145 150 155 160

Asn Lys Phe Ser Asn Glu Asn Leu Glu Leu Val Gly Ala Gly Asn Asn 165 170 175

Leu Glu Asp Ala Lys Gin His Val Ser Tyr Gin Asn Val Asn Gly Val 180 185 190

Lys lie Ala Thr Leu Gly Phe Thr Asp Val Tyr Thr Lys Asn Phe Thr 195 200 205

Ala Lys Lys Asn Arg Gly Gly Val Leu Pro Leu Ser Pro Lys lie Phe 210 215 220 lie Pro Met lie Ala Glu Ala Ser Lys Lys Ala Asp Leu val Leu val 225 230 235 240

His Val His Trp Gly Gin Glu Tyr Asp Asn Glu Pro Asn Asp Arg Gin 245 250 255

Lys Asp Leu Ala Lys Ala lie Ala Asp Ala Gly Ala Asp Val Ile Ile 260 265 270

Gly Ala His Pro His Val Leu Glu Pro Ile Glu Val Tyr Asn Gly Thr 275 280 285

Val Ile Phe Tyr Ser Leu Gly Asn Phe Val Phe Asp Gin Gly Trp Ser 290 295 300

Arg Thr Arg Asp Ser Ala Leu Val Gin Tyr His Leu Met Asn Asp Gly 305 310 315 320

Lys Gly Arg Phe Glu Val Thr Pro Leu Asn Ile Arg Glu Ala Thr Pro 325 330 335

Thr Pro Leu Gly Lys Ser Asp Phe Leu Lys Arg Lys Ala Ile Phe Arg 340 345 350

Gin Leu Thr Lys Gly Thr Asń Leu Asp Trp Lys Glu Glu Asn Gly Lys 355 360 365

Leu Thr Phe Glu Val Asp His Ala Asp Lys Leu Lys Asn Asn Lys Asn 370 375 3 BO

Gly Val Val Asn Lys 385

<210> 9 <211> 1245 <212> DNA <213> Bacillus licheniformis DSM 13 <220> <221 > gen> <222> (1)..(1245)

<223> ywtD <220> <221 > CDS <222> (1)..(1245) <223> <220> <221 > Cecha dodatkowa <222> (1) ..(3) <%%$» Pimmif koite ofegająey OeaMoef ja&amp;b Met. **m>2 itg eta aee ««.* geg gee sac aa&amp; «eg fetg ftfe fetg feet tgt ff« ett 48 %<m χι® %*γ» &amp;ya Ma Aim as» *»y« &amp;y:s a«s %i xm. fA« fyo ®iy si# 1 s 10 is

geg ftg ®Z% Off atg t«t t-fcm «St feta meg sat sat a«£ fat gfea age M

Ala Wl A®# ’ftp last Mx Lau Xfe* £*« Br Mb »1« *«« *m 1?*i A*f SO 2% 10 gee gmft «eg ate g§a fag see ata g«g gem act gee aga. tag etfe gag 144

Ala Asp f*M: 'ii« fly fie 1¾¾ lip Ala Clu Tkr Ala Axg «1.» Lee gin* ,H 40 as ggt gef aaa feet age fees gge gg« gag am® ce§ aaa «eg fgf ftt gee 111 uly Ala Lys Tyy Set Tyr Oily fly flu Lys ?ra hya The Sly Pise asp SO 55 » teg tea ft« ttt ftg tee feat gtg ttt earn teg etc gat afefe «eg fit 24«

Ses Sat Illy £he its! «1» Tye Vml Pfe« Sit Sfer tew Asp lit fAt 1-0«

ss 10 IS M .«eg -«gm «eg gta ««g gas ®m teg met ett fgf mge mgt ft# gge eft 2S-®

Pse Atg TAe vai Ays Sl« Sirs Sat fhr %m* fly See Set wi @ly Axg g§ 00 08

tag c*g etc get sag ggf gme <tt gie fit fete **f safe gee gag tff 1M «2n «in Lett «2» Ays €ly Asp Lett V*| a# Phe Ays Amtt Ala «1« Lee 10$ tos no

gas teg «&amp;« ygs ccg ace eat gte fee ate fat fetg gga aat gat esa SSI fla Set Mp Oly .tre l*»t »ie Vet Ala lie fyr tee Gly Asa» Asp Ole US no ns ate ete see age aea. ««* tea «*« fgf get fee gig asm mag efefe -gam 422 ile Ile Sis Ser Hu- Lys i5sr A»» Oly val v«i v«i TOr ly® tee giu

UO US MS gge age feet See fef® age f#f ff'S feat tic aaa geg aaa agg ate ace 4to

Gly See Set Tyr Try Ser Ser Aly Tyr ths tya ala Ays Asg lie ihr ns iso ns iso

&amp;*&amp; gag cet fag ait teg »tg gat eefe gt« git eaa a«« gg« ««.« age 80S

Lya flu pro Giu n® far «*t Asp Ss:a Val val «la %t Ala tys Lee its 110 us tat gfee ggt gtfe eat feat ffea ttt gga gge tee fit «eg fat etc gga Si« fyt fal fly Vel fro lyr fal Ohe fly my M® tea Pee A«g Lee fly iso lis iff fefei ga« tgt tog ggg fetf aee eaa feme gt« tee afa gag gtf «fee gge <24

Oise Asp Cys fee fly tee The fie Tyr val Oha Arg «U Val. fee fly SOS 2M 208 f«. tat ttg tea teg get gas tag eaa egg get gfee ggte taa aag m2

Val Tyr imi Pro Arg Ster Ala Slu Girt Sl« Txp Ala Val Sly Sis Lys 21.» ns ase gtg aag ett gaa gat ate egg ©eg ggn gat gtt ttg ttt its ago &amp;&amp;t 720

Val t#m Leu Slu Asp lie Arg Pro Śly Asp val tm* the the Sot Asa 22&amp; 23© 23S 240 aeg tat aaa teg gga ata toe eat a&amp;e gge ate tat gee ggg ggc ©39 76 s T&amp;r Tyr Lys Vre Sly lie Ser Mis A«n Sly lie Tyr Ala Sly Sly Gly 24 5 IS© zm egg tit ate eat gtg age egi tea safe &amp;«a gtg at§ ata tee tec ttf Sl€

Arg ®%« 11a Si® Ala Set Atg mx ftsn Ly* val Thr ik Ser Tyt Leu 240 MS 22© teg get tee tat tgg tag a&amp;g a&amp;f tie sea gg* gte aga cgt ttt gac 0S4 set Ala set Tyr Trg sin hys fcy® She Thr Sly val Arg Rrg vhs Asp

27S 280 38S aaę atg tee sfcg eea asus aat c«g afet gfcs tee g&amp;a gee ate agg «at 512 ask «st Set Leu Pr© Lys Ash Fro lie val Set €1¾ Ala Ile Arg Hi* 29i> 2SS 300 ate gge gaa gte ggt tat can aaa gge gge sea teg eet as® gaa gge ®β®

He Sly Slu Val Sly Tyr Gla Lys Sly Sly Thr Sat pre Lye Slu Sly 305 * ' 310 315 320 ttt gat aeg get ggg ttt ate e*a tat gfee fcae aaa aeg geg gea gga 1008

Fke Asp Thr Ala Sly Rse lie ©In Tyr ml Tyt Lys Thr Ala Ala Sly 325 330 335 gtg gag ett eeg egg cafe get gac aai eaa tae age atg ggt aag aaa lOS-i

Val ©In Lae 3?r* Arg Tyr Ala Asp iys ©In Tyr See T&amp;k Sly Lys Lys 340 34 S 3Ś0 stt see aaa tag gag cfcfe gag set gga gas ate gte tie ttt aaa fga 1104

Ha Thr Lys ©In ©X» Lew Sla Fio Sly Asp lie Val Fhe spa* Lye Sly 3SS 350 355 ace act gtt atg ant eee gee ate tat ate gga aat gge tag gee §tt 1152

Thr Thi val Met Ann Pro Ala lie Tyr lie Sly Ash Sly Sin Val Val 370 375 300

Ctt gtc ate ttg ttt gee ggt gta aog aea gea gat atg gag aeg »g« 1200 ls« val Tfer Ls« ser Ala Sly val Thr Thr .Ala Asp Met sła Thr Ser 38S 300 38S 400 gee tat egg aaa gst aaa tae gee ggs age gtt aga htt gag tag 1245

Ala Tyr Trp Ly» Asp Lys Tyr Als Sly Ssr Val Arg He Glu 405 410

«210» 10 «211» 414 <2!2> PRT «213> Baeilus DSM 13 <220» <221> cecha dodatkowa <222» (I),. ¢3)

Pierwszy ko-ciion «legający translaj jako Met <40·> 10

Leu lie Lye Lys Ala Ala Ann Ly® Lys l&amp;u Vel Leu Pbe Cys Gly lie i s xo is

Ala vai Leu tzp Met Ser Leu The Lew Tisx A@« His Asn Asp val Arg 20 2S so"

Ala Asp Thr lie Sly Glu hy® lie Ala «la ths Ala ftr§ @1« Leu «1« 3.¾ 40 4$

Gly Ala Lye Tyr ger Ίγτε Gly Gly Clu Lya Pee I*ys Thr Gly Phe Asp SO $$ SO

See S-ee Gly Phe. Val Gl« tyr Val Phe Gla See Leu Asp lie Thr Leu 6$ 70 75 m

Pro Asrg Thr Val Lys Gla Gins Sex Thr Lea Gly Sex Sex Val Sly Arg §S SO 75

Gin Gin Leu LiU Lye Sly Α&amp;ρ Leu Vai Phe The Lya &amp;$» Ala Giu Leu 100 10S ' 110

Glu Ser Asp Gly *ro Tfer His val Ala lie Tyr Leu Gly fta« Asp Glaus ISO 125 lie Ile Mię Ser Thr Lye Ser .Asa Gly Val Val Val Thx Lys Leu Glu ISO 135 140

Gly Sex Set Tyr Trp Ser ser Gly Tyr Pte Lye Ale Lys ftrg lie Thr

14$ 150 15$ ISO &amp;ys Ola Pro Glu Ile Ser Met Asp Fro Val Val Gin Lye Ala Lye Ser 2.55 170 175

Tyr Val Gly Val Fro Tyr V&amp;l She Gly Gly Ass Sex Ro Asp Lew Gly 150 185 100 pile Asp cya ser Gly Leu Thr Gin Tyr val Phe Arg Glu Val Leu Gly its zoo ass

Val Tyr Leu Pro Arg Ser Ala Glu Gin Gin Trp Ala Val Gly Gin Lys 210 215 220

Val Lys Leu Glu Asp Ile Arg Pro Gly Asp Val Leu Phe Phe Ser Asn 225 230 235 240

Thr Tyr Lys Pro Gly Ile Ser His Asn Gly He Tyr Ala Gly Gly Gly 245 250 255

Arg Phe lie His Ala Ser Arg Ser Asn Lys Val Thr lie Ser Tyr Leu 260 265 270

Ser Ala Ser Tyr Trp Gin Lys Lys Phe Thr Gly Val Arg Arg Phe Asp 275 280 285

Asn Met Ser Leu Pro Lys Asn Pro He Val Ser Glu Ala He Arg His 290 295 300

He Gly Glu Val Gly Tyr Gin Lys Gly Gly Thr Ser Pro Lys Glu Gly 305 310 315 320

Phe Asp Thr Ala Gly Phe He Gin Tyr Val Tyr Lys Thr Ala Ala Gly 325 330 335

Val Glu Leu Pro Arg Tyr Ala Asp Lys Gin Tyr Ser Thr Gly Lys Lys 340 345 350

He Thr Lys Gin Glu Leu Glu Pro Gly Asp lie Val Phe Phe Lys Gly 355 360 365

Thr Thr Val Met Asn Pro Ala He Tyr lie Gly Asn Gly Gin Val Val 370 375 380

Leu Val Thr Leu Ser Ala Gly Val Thr Thr Ala Asp Met Glu Thr Ser 385 390 395 400

Ala Tyr Trp Lys Asp Lys Tyr Ala Gly Ser Val Arg lie Glu 405 410

Claims (41)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Białko YwsC (CapB, PgsB) uczestniczące w tworzeniu poli-gamma-glutaminianu i kodowane przez sekwencję nukleotydową ywsC, która względem sekwencji nukleotydowej podanej w SEK NR ID: 1 wykazuje co najmniej 94% identyczności.
2. 2. Białko YwsC według zastrz. 1, które jest kodowane przez sekwencję nukleotydową, która względem sekwencji nukleotydowej podanej w SEK NR ID: 1 wykazuje coraz bardziej korzystnie co najmniej 96%, 97%, 98%, 99% i szczególnie korzystnie 100% identyczności.
3. 3. Białko YwsC (CapB, PgsB) uczestniczące w tworzeniu poli-gamma-glutaminianu i mające sekwencję aminokwasową, która względem sekwencji aminokwasowej podanej w SEK NR ID: 2 wykazuje co najmniej 94% identyczności, coraz bardziej korzystnie co najmniej 95%, 96%, 97%, 98%, 99% i szczególnie korzystnie 100% identyczności.
4. 4. Białko YwsC' (jako skrócona odmiana YwsC) uczestniczące w tworzeniu poli-gamma-glutaminianu i kodowane przez sekwencję nukleotydową ywsC', która względem sekwencji nukleotydowej podanej w SEK NR ID: 3 wykazuje co najmniej 94% identyczności.
5. 5. Białko YwsC' według zastrz. 4, które jest kodowane przez sekwencję nukleotydową, która względem sekwencji nukleotydowej podanej w SEK NR ID: 3 wykazuje coraz bardziej korzystnie co najmniej 96%, 97%, 98%, 99% i szczególnie korzystnie 100% identyczności.
6. 6. Białko YwsC' (jako skrócona odmiana YwsC) uczestniczące w tworzeniu poli-gamma-glutaminianu, mające sekwencję aminokwasową, która względem sekwencji aminokwasowej podanej w SEK NR ID: 4 wykazuje co najmniej 94% identyczności, coraz bardziej korzystnie co najmniej 95%, 96%, 97%, 98%, 99% i szczególnie korzystnie 100% identyczności.
7. 7. Białko uczestniczące w tworzeniu poli-gamma-glutaminianu według jednego lub więcej zastrz. 1—3 lub 4—6, które naturalnie jest tworzone przez mikroorganizm, korzystnie bakterię, szczególnie korzystnie przez bakterię gram-dodatnią, spośród nich korzystnie bakterię z rodzaju Bacillus, spośród nich szczególnie korzystnie bakterię z gatunku B. licheniformis i spośród nich całkiem szczególnie korzystnie B. licheniformis DSM13.
8. 8. Kwas nukleinowy ywsC (capB, pgsB) kodujący produkt genowy uczestniczący w tworzeniu poli-gamma-glutaminianu, który ma sekwencję nukleotydową, która względem sekwencji nukleotydowej podanej w SEK NR ID: 1 wykazuje co najmniej 94% identyczności.
9. 9. Kwas nukleinowy ywsC według zastrz. 8, który ma sekwencję nukleotydową, która względem sekwencji nukleotydowe j podanej w SEK NR ID: 1 wykazuje coraz bardziej korzystnie co najmniej 96%, 97%, 98%, 99% i szczególnie korzystnie 100% identyczności.
10. 10. Kwas nukleinowy ywsC' (jako skrócona odmiana ywsC) kodujący produkt genowy uczestniczący w tworzeniu poli-gamma-glutaminianu i mający sekwencję nukleotydową, która względem sekwencji nukleotydowej podanej w SEK NR ID: 3 wykazuje co najmniej 94% identyczności.
11. 11. Kwas nukleinowy ywsC' według zastrz. 10, który ma sekwencję nukleotydową, która względem sekwencji nukleotydowej podanej w SEK NR ID: 3 wykazuje coraz bardziej korzystnie co najmniej 96%, 97%, 98%, 99% i szczególnie korzystnie 100% identyczności.
12. 12. Kwas nukleinowy według jednego z zastrz. 8 i/lub 9, 10 i/lub 11, który naturalnie występuje w mikroorganizmie, korzystnie w bakterii, szczególnie korzystnie w bakterii gram-dodatniej, spośród nich korzystnie bakterii z rodzaju Bacillus, spośród nich szczególnie korzystnie bakterii z gatunku B. lichen!formis i spośród nich całkiem szczególnie korzystnie B. lichen!formis DSM13.
13. 13. Kwas nukleinowy, kodujący białko jak określono w jednym z zastrz. 1—7.
14. 14. Wektor, który zawiera jeden z kwasów nukleinowych jak określono w zastrz. 8—13.
15. 15. Wektor według zastrz. 14, który zawiera dwa lub więcej kwasów nukleinowych jak określono w zastrz. 8-13.
16. 16. Wektor do klonowania według zastrz. 14 lub 15.
17. 17. Wektor ekspresyjny według zastrz. 14 lub 15.
18. 18. Komórka, która po modyfikacji metodą inżynierii genetycznej, zawiera jeden z kwasów nukleinowych jak określono w zastrz. 8—13.
19. 19. Komórka według zastrz. 18, w której wspomniany kwas nukleinowy jest częścią wektora, szczególnie wektora jak określono w jednym z zastrz. 14-17.
20. 20. Komórka według zastrz. 18 albo 19, którą jest bakteria.
21. 21. Komórka według zastrz. 20, którą jest bakteria gram-ujemna, szczególnie bakteria z rodzajów Escherichia coli, Klebsiella, Pseudomonas lub Xanthomonas, szczególnie szczepy E. coli K12, E. coli B lub Klebsiella planticola, i całkiem szczególnie pochodne szczepu Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV30 8, E. coli DH5a, E. coli JM109, E. coli XL-1 lub Klebsiella planticola (Rf).
22. 22. Komórka według zastrz. 20, którą jest bakteria gram-dodatnia, szczególnie bakteria z rodzajów Bacillus, Staphylococcus lub Corynebacterium, całkiem szczególnie z gatunku Bacillus lentus, B. lichen!formis, B. amyloliquefaciens, B. subtilis, B. globigii lub B. alcalophilus, Staphylococcus carnosus lub Corynebacterium glutamicum, i spośród nich znowu całkiem szczególnie korzystnie pochodna B. lichen!formis DSM 13.
23. 23. Spo sób wytwarzania jednego lub więcej produktów genowych YwsC i YwsC' jak określono w zastrz. 1-7 .
24. 24. Sposób według zastrz. 23, w którym stosuje się kwas nukleinowy jak określono w jednym z zastrz. 8—13, korzystnie wektor jak określono w jednym z zastrz. 14—17, szczególnie korzystnie komórkę jak określono w jednym z zastrz. 18—22.
25. 25. Sposób według zastrz. 23 albo 24, w którym sekwencja nukleotydowa w jednym lub korzystnie wielu kodonach została dopasowana do wykorzystania kodonów szczepu gospodarza.
26. 26. Zasto sowanie kwasu nukleinowego ywsC jak określono w zastrz. 8 i/lub 9, kwasu nukleinowego ywsC' jak określono w zastrz. 10 i/lub 11 lub odpowiedniego kwasu nukleinowego jak określono w zastrz. 13 lub każdorazowo ich części do czynnościowej inaktywacji każdego przynależnego genu ywsC bądź ywsC' w mikroorganizmie.
27. 27. Zasto sowanie według zastrz. 26, w którym czynnościowa inaktywacja zachodzi podczas fermentacji mikroorganizmu, korzystnie ze zmniejszeniem śluzu przypisywanego poliaminokwasom do 50%, szczególnie korzystnie do mniej niż 20%, całkiem szczególnie korzystnie do mniej niż 5%.
28. 28. Zasto sowanie według zastrz. 26 albo 27, w którym w celu czynnościowej inaktywacji każdorazowo wprowadza się kwas nukleinowy z mutacją punktową kodujący nieaktywne białko.
29. 29. Zasto sowanie według jednego z zastrz. 26—28, w którym do czynnościowej inaktywacji każdorazowo stosuje się kwas nukleinowy z mutacją delecyjną lub insercyjną, korzystnie obejmującą każdorazowo co najmniej 70—150 pozycji kwasu nukleinowego obejmujących sekwencje brzegowe obszaru kodującego białko.
30. 30. Mikroorganizm, w którym co najmniej jeden z genów ywsC lub ywsC' jak określono w jednym z zastrz. 8—11 jest inaktywowany czynnościowo.
31. 31. Mikroorganizm według zastrz. 30, w którym geny ywtA według SEK NR ID: 5 lub ywtB według SEK NR ID: 7 są inaktywowane.
32. 32. Mikroorganizm według zastrz. 30 albo 31, którym jest bakteria.
33. 33. Mikroorganizm według zastrz. 32, którym jest bakteria gram-ujemna, szczególnie bakteria z rodzajów Escherichia coli, Klebsiella, Pseudomonas lub Xanthomonasr szczególnie szczepy E. coli K12, E. coli B lub Klebsiella planticola, i całkiem szczególnie pochodne szczepu Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV30 8, E. coli DH5a, E. coli JM109, E. coli XL-1 lub Klebsiella planticola (Rf).
34. 34. Mikroorganizm według zastrz. 32, którym jest bakteria gram-dodatnia, szczególnie bakteria z rodzajów Bacillus, Staphylococcus lub Corynebacterium, całkiem szczególnie z gatunku Bacillus lentus, B. lichen!formis, B. amyloliquefaciens, B. globigii lub B. alcalophilus, Staphylococcus carnosus lub Corynebacterium glutamicum i spośród nich całkiem szczególnie B. lichen!formis DSM 13.
35. 35. Sposób fermentacji mikroorganizmu jak określono w jednym z zastrz. 30—34.
36. 36. Spo sób według zastrz. 35, do wytwarzania cennego produktu, szczególnie niskocząsteczkowego związku lub białka.
37. 37. Spo sób według zastrz. 36, w którym związkiem niskocząsteczkowym jest produkt naturalny, suplement diety lub związek farmaceutycznie istotny.
38. 38. Sposób według zastrz. 36, w którym białkiem jest enzym, szczególnie enzym z grupy a-amylaz, proteaz, celulaz, lipaz, oksydoreduktaz, peroksydaz, lakkaz, oksydaz i hemicelulaz.
39. 39. Mikrobiologiczny sposób wytwarzania, modyfikacji lub degradacji poli-gamma-glutaminianu, w którym jeden z kwasów nukleinowych jak określono w jednym z zastrz. 8 i/lub 9, 10 i/lub 11 lub odpowiedni kwas nukleinowy jak określono w zastrz. 13 stosuje się transgenicznie, korzystnie z tworzeniem odpowiedniego białka jak określono w jednym więcej z zastrz. 1—7.
40. 40. Sposób według zastrz. 39, w którym stosuje się mikroorganizm z rodzaju Bacillus, szczególnie B. licheniformis.
41. 41. Bezkomórkowy sposób wytwarzania, modyfikacji lub degradacji poli-gamma-glutaminianu przy zastosowaniu jednego z produktów genowych uczestniczących w tworzeniu poli-gamma-glutaminianu jak określono w jednym z zastrz. 1—3 lub 4—6, korzystnie przy zastosowaniu odpowiedniego kwasu nukleinowego jak określono w jednym z zastrz. 8—13. Henkel AG &amp; Co. KGaA Pełnomocnik: