PL176649B1 - Kombinacja związków farmakologicznie czynnych do zapobiegania infekcji HIV lub leczenia infekcji HIV lub leczenia AIDS albo ARC - Google Patents

Abstract

I K ombinacja zwiazków farm akologicznie czynnych do zapobiegania infekcji HIV lub leczenia infekcji HIV lub leczenia A IDS albo ARC, znam ienna tym , ze stanowi kombinacje now ego zwiazku o wzorze I w którym X oznacza atom chlorowca, X 1 oznacza grupe trichlorow com etylow a lub pentachlorowcoetylowa, Z oznacza atom tlenu, R oznacza. (a) grupe alkilowa, m epodstaw iona lub podstaw iona przez A, a A oznacza atom chlorowca, grupe C3-6 cykloalkilowa, CN, hydroksylow a, C 1-4 alkoksy lowa, C 2- 4 alkinylo-C1-4 alkoksylowa, aryloksylowa, alkilokarbonylowa, nitrowa, di(C1-2 alkilo)aminowa, C 1-2 alkilo- am ino-C1 -2 alkilow a, heterocykliczna lub arylotio, (b) grupe C2-4 alkenylowa, niepodstaw iona lub podstaw iona przez (1) A, albo (I ) grupa arylowa, niepodstaw iona lub podstaw iona przez A, (c) grupe C2.5 alkinylowa, niepodstaw iona lub podstaw iona przez (I) A, albo (II) grupa arylowa, niepodstaw iona lub podstaw iona przez A, albo (d) grupe C 3-4 cykloalkilowa, niepodstaw iona lub podstaw iona przez (I) A, albo (II) grupa arylowa, niepodstaw iona lub podstaw iona A, lub jego dopuszczalnej farmaceutycznie soli, lub o wzorze II w którym X oznacza atom chlorowca, X I oznacza grupe tnchlorow com etylow a, pentachlorowcoetylowa, C2.5 alkilowa, C2-5 alkinylowa, C3.5 cykloalkilow a lub arylowa, Z oznacza atom tlenu lub siarki, R oznacza (a) grupe C 1-8 alkilowa, niepodstaw iona lub podstaw ionaprzez A, a A oznacza atom chlorowca, grupe cykloalkilowa, CN, hydroksylow a, C 1-4 alkoksy lowa, C2-4 alkin ylo-C1-4 alkoksylowa, aryloksylowa, C 1-4 alkilokarbonylowa, nitrowa, di(C 1 -2 alkilo)aminowa, C 1 -4 alkiloam ino-C1 -2 alkilow a, heterocykliczna lub arylotio, (b) grupe C 2-4 alkenylowa, niepodstaw iona lub podstaw iona przez ( 1 ) A, albo (u) grupa arylowa, niepodstaw iona lub podstaw iona A, PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest kombinacja związków farmakologicznie czynnych do zapobiegania infekcji HIV lub leczenia infekcji HIV lub leczenia AIDS albo ARC, stanowiąca kombinację nowego związku, pochodnej benzoksazynonu o działaniu hamującym wirusa HIV, z inhibitorem proteazy HIV oraz ewentualnie jednym lub więcej niż jednym analogiem nekleozydu inhibitorem odwrotnej transkreptaay HIV. Kombinacja znajduje zastosowanie w inhibitowaniu odwrotnej transkryptuze HIV, (i jej odpornych odmian), w zapobieganiu infekcji HIV, w leczeniu infekcji HIV i w leczeniu AIDS i/lub ARC)

176 649

Retrowirus określany jako ludzki wirus niedoboru odporności (HIV) jest czynnikiem etiologicznym złożonej choroby obejmującej stopniowy rozkład układu odpornościowego (zespołu nabytego niedoboru odporności, AIDS) oraz zwyrodnieniem ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego. Wirus ten był poprzednio określany jako LAV, HTLV-III lub ARV. Wspólną cechąreplikacji retrowirusówjest odwrotna transkrypcja genomu RNA przez wirusowo kodowaną odwrotną transkryptazę, prowadząca do powstania kopii DNA sekwencji HTV; jest to niezbędny etap replikacji wirusa. Wiadomo, że pewne związki, np. azydotymidyna (czyli AZT), są inhibitorami odwrotnej transkryptazy i stanowią skuteczne środki w leczeniu AIDS i podobnych chorób.

Sekwencjonowanie nukleotydów HIV wykazało obecność genu poi w jednej z otwartych ramek odczytu [Ratner L. i inni, Nature, 313,277 (1985)]. Homologia sekwencji aminokwasów dostarcza potwierdzenia, że sekwencja poi koduje odwrotnątranskryptazę, endonukleazę i proteazę HIV [Toh H. i inni, EMBO J. 4,1267 (1985); Power M.D. i inni, Science, 231,1567 (1986); Pearl L.H. i inni, Nature 329, 351 (1987)].

Przedmiotem wynalazku jest kombinacja związków farmakologicznie czynnych do zapobiegania infekcji HIV lub leczenia infekcji HIV lub leczenia AIDS albo ARC, stanowiąca kombinację nowego związku o wzorze I:

i

w którym:

X oznacza atom chlorowca,

X^I oznacza grupę trichlorowcometylową lub pentachlorowcoetylową;

Z oznacza atom tlenu;

R oznacza:

(a) grupę C- alkilową, niepodstawioną lub podstawionąprzez A, a A oznacza atom chlorowca, grupę C3.6 cykloalkilową, CN, hydroksylową, C_M alkoksylową, C₂_4 alkinylo-C-j alkoksylową, aryloksylową, C_M alkilokarbonylową, nitrową, di(C1- alkilo)aminową, C_M alkiloammo-C12 alkilową, heterocykliczną lub arylotio;

(b) grupę C24 alkenylową, niepodstawioną lub podstawionąprzez:

(i) A, albo (ii) grupą arylową, niepodstawioną lub podstawionąprzez A;

(c) grupę C2.5 alkinylową, niepodstawioną lub podstawioną przez:

(i) A, albo (ii) grupą arylową, niepodstawioną lub podstawioną przez A; albo (d) grupę C3- cykloalkilową, niepodstawioną lub podstawioną przez:

(i) A, albo (ii) grupą arylową, niepodstawioną lub podstawioną A; lub jego dopuszczalnej farmaceutycznie soli, lub o wzorze Π:

176 649 w którym:

X oznacza atom chlorowca,

X^I oznacza grupę trichlorowcometylową, pentachlorowcoetylową, C_?__5 alkilową, C₂.₅ alkinylową, C3_₅ cykloalkilową lub arylową;

Z oznacza atom tlenu lub siarki;

R oznacza:

(a) grupę C_b8 alkilową, niepodstawionąlub podstawioną przez A, a A oznacza atom chlorowca, grupę C3-5 cykloalkilową, CN, hydroksylową, C_M alkoksylową, C₂_4 alkinylo-Cj alkoksylową, aryloksylową, Cj- alkilokarbonylową, nitrową, di(Ci2 alkilo)aminową, C_M alkiloamino-Cj.₂ alkilową, heterocykliczną lub arylotio;

(b) grupę C24 alkenylową, niepodstawionąlub podstawioną przez:

(I) A, albo (ii) grupą arylową, niepodstawioną lub podstawioną A;

(c) grupę C2.5 alkinylową, niepodstawionąlub podstawioną przez:

(i) A, albo (ii) grupą arylową, niepodstawioną lub podstawioną A; albo (d) grupę C3- cykloalkilową, niepodstawioną lub podstawioną przez:

(i) A, albo (ii) grupą arylową, niepodstawioną lub podstawioną A; lub farmaceutycznie dopuszczalnej soli związku o wzorze II, z inhibitorem proteazy HIV, oraz ewentualnie jednym lub więcej niż jednym analogiem nukleozydu będącym inhibitorem odwrotnej transkryptazy HIV.

Kombinacja według wynalazku zapewnia znaczne zmniejszenie poziomu RN A HIV we krwi w porównaniu z pacjentami, którym podaje się wyłącznie inhibitor proteazy lub inhibitor odwrotnej transkryptazy HIV. Efekt ten jest długotrwały. Stosowanie kombinacji zabezpiecza przed rozwojem oporności na pojedyncze stosowane leki i zwiększa długotrwałość pozytywnych skutków leczenia. Związki o wzorze I lub II hamują powstawanie mutantów substytucyjnych RNA wirusa.

Ilość związku o wzorze I lub wzorze II w kombinacji wynosi 0,1-20 mg na 50-5000 mg inhibitora odwrotnej transkryptazy HIV.

Związki o wzorze I zdefiniowanym powyżej są związkami nowymi, dotychczas nieopisanymi w literaturze. Związki te wykazują czynność hamowania odwrotnej trankryptazy HIV.

Do korzystnych związków należą związki 37.^, 4,2,5 i 24, zilustrowane poniżej w tabeli I, przy czym kolejne związki są coraz mniej korzystne.

Struktura związków jest następująca.

Cl (-)

Związek 37.2 (-)-6-chloro-4-cyklopropyloetynylo-4-trifluorometylo-1,4-dihydro-2H-3,1 -benzoksazyn-2-on, związek najkorzystniejszy;

176 649

Związek 4:

(-)-6-chloro-4-fenyloetynylo-4-trifluorometylo-1,4-dihydro-2H-3,1 -benzoksazyn-2-on; Związek 2:

(+/-)

(+/-)-6-chloro-4-(2-cyjariofenylo)etynylo-4-(1,1,1 -trifluorometylo)-1,4-dihydro-2H-3,1 -benzoksazyn-2-on;

Związek 5:

(+/-)

(+/)-4-( 1 -chloro-1,1 -difluorometylo)-4-(2-fenyloetynylo)-6-chloro-1 ,-dihydro-2H-3,1 -benzoksazyn-2-on;

Związek 24

CH, / ³

-^N

F₃C gG' ^CH3

Cl ><

o (+/-)

176 649

-3,1 tbenzoksazyn-2-on;

oraz ich farmaceutycznie dopuszczalne sole.

Korzystnie kombinacja według wynalazku zawiera jako związek o wzorze I lub wzorze II (-)-6-chloro-4-cyklopropyloetynylot4-Irifluoro-metylo-1,4-dihydro-2H-3,1 -benzoksazyn-2-on lub jego dopuszczalną farmaceutycznie sól.

Korzystna kombinacja składa się z (-)-6-chloro-4-cyklopropyloetynylo-4tIrifluoro-meIylo-l,4-dihydro-2H-3,l-^h^^r^z^c^k^sa^zyn-2-onu lub jego dopuszczalnej farmaceutycznie soli, w połączeniu z N-2(R)-hydroksy-1 (S)-mdanylo)-2(R)-fenylometylo-4-(S)-hydroksy-5-( 1 -(4-(3-pirydylo-mttylo)t2(S)tN'-(terttbutylckarbamcilo)piptrazynylo))ptntano-amidem o wzorze

lub jego dopuszczalną farmaceutycznie solą i ewentualnie jednym lub więcej niż jednym analogiem nuikleozydu będącym inhibitorem odwrotnej transkryptazy HIV.

Korzystnie kombinacja według wynalazku zawiera jako analog nukleozydu związek wybrany z grupy składającej się z azydotymidyny (AZT), dideoksycytydyny (ddC), dideoksyinozyny (ddl), didehydrodeoksytymidyny (d4T), alfa-bicyklo[2.2.1]-hept-5-en-2-ylo-alfa-fenylo-1tpφerydyno-propanolu (HEPT), acyklowiru i 3'-fluoro-2',3'-dideoksytymidyny oraz ich dopuszczalnych farmaceutycznie soli.

Konkretne związki o wzorze I zilustrowano poniżej w tabelach I i Π.

176 649

Tabela i 1

ro cn ·* U I-I U		kQ	> 200	CM Γ—ł
o LO ·* U M	4100 nM	08 ϊ	30 000	69	o lO CO	10 000	3 460
+J 3 o LO ·* o I-I	50 nM	25	2900	kO CO	CM I-1	1 700	i—1 cn
temp. topn. (°C)	186-187,5	245-246	178-179	-	154-155	225-226	160-161
τ—1 X	n h O 1	co d U 1	co di O 1	co Iż o 1	1—1 u CM fcl O 1	co d O	co d O 1
Cd	ro X o o -łc	CN	T +	T	T	(Ob +	Ci
Związek	i—1	CM	j 3 ( + )	4 (-)	ro	ko	o-

* podano w nM czyli nanomolach/litr

176 649

Tabela I (ciąg dalszy)

I\X\^= -CF3 |165-166 29 > 10⁵

176 649

Tabela I (ciąg dalszy)

LC ΟΊ * O I-I υ	78 000		O Lf)
o LC * o I-I	1900	lC O »—1 Λ	8 658 nM	28 000	Lf) O t—1	128 000	3 650	38 008 nM
+J 2 o LC u I-I	1900	2300	LC rH	’χΓ CN	145	Ί 860	55	1308 nM>
temp. topn. (°C)	230-240	132-133	148-149	136-137	162-164	145-146	150-151	131-132
Γ—·1 X	cc ph u 1	cc ph U 1	cc Pp υ 1	m Ph O 1	cn ph O 1	cc ph U 1	c	n ph U 1
cd	Γ'Χ..... Y 0 i	<.	i			ę ω * i	Y 7	* l
Związek	16	17	oo r~4	19	20	21	22	co CN

176 649

Tabela I (ciąg dalszy)

176 649

Tabela I (ciąg dalszy)

LG Ch -K O I-I O
O Lf •K O H			>300 000nM	> 300 000	> 300 000	Lf) O ι—1 Λ	S c + m 00
IC*50 wt	5400	30. nM	ia 500	650	52	5 300	CM
temp. topn. (°C)	172-173	277-278	125-126	184-185	151-152	186-187
i—1 X			> *		*		fO Em O f K ł
*
(A	*	+	) *	*	*	i *	γ II -K Σ
Związek	32	33	34	Lf) m	36	37	37.2(-)

Ό

Ό (0 r>H

Λί >Ί

N fi •H •m u

tn

O

P rtJ p

o α

co m

X

N (tf •H

N (U

U <tf

N

U +J

O

Ό <D

C (0

Ό

0) c

P

Tabela II

Η

-k	R	xl	temp. topn. (°C)	IC*50 wt	IC*50 dm	CI
	*	·*·	177-179	136 nM	>300 000nM
	*		135-136	510	>300 000nM
	*	-	125-126	48	29 000
		•o		1400 nM	>300 000nM
	*	GF	218-220	1450
		®o)	187-188	610
	*	Mo)	206-207	15 nM	>300 000nM	10
	★	★	147-148	560	>300 000nM
	*-M		186-187	41	>300 000nM

176 649

Związki o wzorze I mogązawierać centra asymetrii i mogą występować, z wyjątkiem konkretnie zaznaczonych, być w postaci racematów, mieszanin racemicznych lub poszczególnych diastereoizomerów albo enancjomerów, przy czym wszystkie formy izomeryczne objęte są zakresem wynalazku. Oznaczenie (+/-) obejmuje izomery optyczne (+), izomery optyczne (-) lub ich mieszaniny.

Jeśli dowolna zmienna (np. R) występuje więcej niż raz w dowolnym podstawniku lub we wzorze I, to jej określenie w każdym przypadku jest niezależne od jej określenia w innych przypadkach. Ponadto kombinacje podstawników i/lub zmiennych są dopuszczalne tylko wtedy, gdy związki zawierające takie kombinacje są trwałe.

W użytym znaczeniu, z wyjątkiem zaznaczonych przypadków, „alkil“ oznacza nasyconą alifatyczną grupę węglowodorową o rozgałęzionym lub prostym łańcuchu; „alkenyl“ oznacza grupę alkilową o rozgałęzionym lub prostym łańcuchu, zawierającą co najmniej jedno wiązanie podwójne węgiel-węgiel; „alkinyl oznacza grupę alkilową o rozgałęzionym lub prostym łańcuchu, zawierającą co najmniej jedno wiązanie potrójne węgiel-węgiel. W użytym znaczeniu “atom chlorowca lub „chlorowiec“ oznacza atom fluoru, chloru, bromu lub jodu.

W użytym znaczeniu, z wyjątkiem zaznaczonych przypadków, „ aryl“ oznacza grupę fenylową, naftylową, tetrahydronaftylową, bifenylową, fenantrylową, antrylową lub acenaftylową.

W użytym znaczeniu z wyjątkiem zaznaczonych przypadków, określenie heterocykl lub heterocykliczny oznacza trwały 5-7 członowy monocykliczny lub trwały 8-11 członowy bicykliczny układ heterocykliczny, nasycony, częściowo nienasycony lub nienasycony, który zawiera atomy węgla i 1-4 heteroatomy wybrane z grupy obejmującej atomy azotu, tlenu i siarki i w którym heteroatomy azotu i siarki mogą być ewentualnie utlenione, obejmujący dowolną grupę bicykliczną, w której dowolny z wyżej określonych pierścieni heterocyklicznych jest skondensowany z pierścieniem benzenowym. Pierścień heterocykliczny może być połączony poprzez dowolny heteroatom lub atom węgla w sposób zapewniający powstanie trwałej struktury. Do przykładowych grup heterocyklicznych należy piperydynyl, piperazynyl, 2-oksopiperazynyl, 2-oksopiperydynyl, 2-oksopirolidynyl, 2-oksoazepinyl, azepinyl, pirolil, 4-piperydonyl. pirolidynyl, pirazolil, pirazolidynyl, imidazolil, imidazolinyl, pirydyl, pirazynyl, pirymidynyl, pirydazynyl, oksazolil, oksazolidynyl, izoksazolil, izoksazolidynyl, morfolinyl, tiazolil, tiazolidynyl, izotiazolil, chinuklidynyl, izotiazolidynyl, indolil, chinolinyl, izochinoliny! benzimidazolil, tiadiazolil, benzopiranyl, benzotiazolil, benzoksazolil, furyl, tetrahydrofuryl, benzofuranyl, tetrahydropiranyl, tienyl, benzotienyl, tiamorfolinyl, sulfotlenek tiamorfolinylu, sulfon tiamorfolinylu i oksadiazolil.

Związki o wzorze I wytwarzać można następującymi sposobami (patrz schemat I - str. 15).

Przy wytwarzaniu benzoksazynonów o wzorze I ogólny sposób obejmuje zazwyczaj cyklizację przy pierścieniu benzenowym jako końcowy etap. Patrz schemat I. Grupę aminową w p-chloroanilinie najpierw blokuje się, np. chlorkiem piwaloilu, uzyskując 2. Do mniej korzystnych grup blokujących grupę aminową należy grupa tert-butoksykarbonylowa, octanowa lub izowaleroilowa. Następnie 2 poddaje się reakcji z około 2 równoważnikami alkilolitu, korzystnie n-butylolitu. W tym etapie metalowania inne związki metaloorganiczne nie sąprzydatne. W wyniku przeprowadzonej następnie reakcji z CF₃COOEt, po jej przerwaniu otrzymuje się 3.

Trzeciorzędowy karbinol 4 uzyskuje się w wyniku addycji Grignarda do ketonu 3. Odczynnik Grignarda musi być solą dwuwartościowego kationu, np. Mg++ lub Zn++ Do odpowiednich rozpuszczalników należy, ale nie wyłącznie, THF (tetrahydrofuran) lub eter. Reakcję można przeprowadzić w szerokim zakresie temperatur, od około 0°C do temperatury zbliżonej do temperatury pokojowej.

Zamknięcie pierścienia prowadzące do związków 5 według wynalazku przeprowadza się stosując środek kondensujący taki jak 1,1'-karbonylodiimidazol, fosgen, węglan dimetylu, węglan difenylu lub węglan di (p-nitrofenylu). Cyklizację można przeprowadzić stosując dowolny z tych związków, a także wiele innych związków.

176 649

Schemat Π

1. n-BuLi, następnie ZnC2₃ ->

2. (Ph₃P)₄Pd/CuI/ 2-jodocyjanobenzen

Na schemacie II przedstawiono sposób wytwarzania podstawionych pochodnych zawierających grupę acetylenową w pozycji 4 układu benzoksazynowego. Przykładowo związek 6 metalizowano, po czym dodano sól cynku. W reakcji Heck'a zastosowano jako katalizator tetrakis(trifenylofcsfinc)-pallad(0) skompleksowany z Cul, otrzymując 7.

Schemat III

Na schemacie III przedstawiono podstawienie grupy 4-acetylenowej związkiem heterocyklicznym zawierającym atom azotu. ReakcjaMannicha obejmuje reakcję kondensacji formaldehydu ze związkiem heterocyklicznym, np. z pirolidyną. Podstawienie końcowego atomu węgla przebiega w obecności Cul jako katalizatora.

176 649

Schemat I chlorek piwaloilu chlorek metylenu wodny roztwór Na CO 2 3

NH ,0 w©

1. 2 eq. n-BuLi/THF/O C

2. CF₃COOEt/0°C

3. 3N HCl/wrzenie

R-MgBr

THF/o° do temperatury pokojowej

1,1’-karbonylodiimidazol

THF/50°C

H

Konkretny przykład rozwiązania według schematu I podano na schemacie LA. Przedstawiono na nim syntezę L-741,211, będącego racematem związku 37.2, opisaną dokładniej w przykładzie 6.

176 649

ci

NH

Schemat IA tert-BuCOCl

NaOH/H ₂O CHC1 ₃ (100%)

1. 2 n-BuLi/THF -78°C > 0°C/lh

-μ

2. EtOOCCF₃/0°C

3. 3N HCl, wrzenie (60%)

O

1. EtMgBr/THF 50°C/lh

-►

2. A/1,5 h/temperatura pokojowa (73-74°C)

(L-742,211)

176 649

Schemat IV

(+/-)

Et₃N/4-DMAP/CH₂Cl₂

O

1. Chromatografia na żelu krzemionkowym

2. K₂C0₃/H₂0/2-propanol

Na schemacie IV przedstawiono rozdzielanie izomerów optycznych związków o wzorze I i o wzorze II. W tym przykładzie jako związek rozdzielający zastosowano kwas (-)-kamfanowy. Zastosować można wiele innych związków rozdzielających takich jak chlorek kwasu O-metylomigdałowego lub odczynnik Moshera. Rozdzielanie takich izomerów jest znane spcjalistom.

Na schemacie LVA przedstawiono w szczególności rozdzielanie L-741,211 przy wydzielaniu L-743,726. Patrz schemat IVA i przykład 6.

176 649

(L-741,211)

L-743,726 Związek 37.2

176 649

Schemat V

>

Cl

Cl tertBuOK/DMSO _r (42%)

Cyklopropyloacetylen wytworzono w sposób przedstawiony na schemacie V, zgodnie z opublikowanymi procedurami, np. C.E. Hudson i inni, J. Am. Chem. Soc. 94,1158 (1972) oraz W. Schoberth i inni, Synthesis, 703 (1972).

Analogi nukleozydowe azydotymidyna (AZT), dideoksycytydyna (ddC), dideoksyinozyna (ddl), didehydrodeoksytymidyna (d4T), alfa-bicyklo[2.2.1]hept-5-en-2-ylo-alfa-fenylo-l-piperydynopropanol (HEPT) i 3'-fluoro-2',3'-dideoksytymidyna są znanymi związkami o znanej czynności biologicznej przeciwko odwrotnej transkryptazie HIV. Sposoby ich wytwarzania są znane i opisane w literaturze.

AZT wytwarza się sposobami opisanymi przez J.P. Horwitza i innych, J. Org. Chem. 29, 2076 (1964); R.P. Glińskiego i innych, J. Org. Chem. 38,4299 (1973); C.K. Chu i innych, Tetrahedron Letters 29,5349 (1988). Zastosowanie AZT jako środka terapeutycznego w leczeniu HTV ujawniono w patencie USA nr 4 724 232.

Związek ddC wytwarza się sposobami opisanymi przez J.P.Horwitza i innych, J.Org. Chem. 32,817 (1967); R. Muramoto, Chem. Pharm. Buli 22,128 (1974); orazT.-S. Lina i innych, J. Med. Chem. 30, 440 (1987).

D4T wytwarza się sposobami opisanymi przez P. Herdewijna i innych, J. Med. Chem. 30. 1270(1987).

HEPT wytwarza się sposobami opisanymi przez T. Miyasaka i innych, J. Med. Chem. 32, 2507 (1989); i A. Rosowsky’ego, J. Med. Chem. 24,1177(1981). Syntezy ddC, ddl i AZT opisano również w EP 0484071.

3'-fluoro-2',3'-didezoksytymidynę wytwarza się sposobami opisanymi przez P. Herdewijna i innych, J. Med. Chem. 30, 1270 (1987).

Wytwarzanie inhibitora proteazy HIV N-2(R)-hydroksy-1(S)-indariylo)-2(R)-fenylometyla-4-(S)-hydroksy-5-(1-(4-(3-pirydylometylo)-2(S)-N'-(tert-butylokarbamoilo)piperazynylo)pentanoamidu (L-735524) opisano w opisie patentowym EP 0541168.

Kombinacje według wynalazku są przydatne w inhibitowaniu odwrotnej transkryptazy HIV, w zapobieganiu lub leczeniu infekcji ludzkim wirusem niedoboru odporności (HIV) oraz w leczeniu wynikłych z tego systemu patologicznych takich jak AIDS. Określenia leczenie AIDS albo zapobieganie lub leczenie infekcji HIV obejmują, ale nie wyłącznie, leczenie wielu różnych stanów infekcji HIV: AIDS, ARC (zespół spokrewniony z AIDS), obydwa w postaci objawowej i bezobjawowej, a także rzeczywiste i potencjalne narażenie na HIV. Tak np. kombinacje według wynalazku są przydatne w leczeniu infekcji HTV po podejrzeniu o wcześniejsze narażenie na HTV np. w wyniku transfuzji krwi, wymiany płynów ustrojowych, ukąszeń, przypadkowego ukłucia igłą lub narażenia krwi pacjenta podczas operacji.

Szczególną zaletę związków o wzorze I lub Π stanowi ich silne inhibitowanie odwrotnej transkryptazy HIV opornej na inne środki przeciwwirusowe. Stosowanie kompozycji związku o wzorze I lub II pozwala zapobiec rozwijaniu się oporności pacjenta na pojedynczy lek a także zwiększa skuteczność działania przeciwwirusowega. Kombinacje wykazują działanie synergistyczne na rozprzestrzenianie się wirusa.

Kombinacje według wynalazku podawać można doustnie, pozajelitowo (w tym na drodze iniekcji podskórnej, iniekcji dożylnej, domięśniowej lub domostkowej albo infuzji), przez wdychanie rozpylonego środka albo doodbytowo, w postaci dawek jednostkowych zawierających zwykłe nietoksyczne, farmaceutycznie dopuszczalne nośniki, dodatki i podłoża.

176 649

Takie środki farmaceutyczne mogą być w postaci doustnych zawiesin lub tabletek; środków do rozpylania do nosa; sterylnych preparatów do iniekcji takich jak sterylne wodne lub olejowe zawiesiny do iniekcji, albo czopków.

Środki doustne w postaci zawiesin wytwarzać można sposobami powszechnie znanymi w farmacji, przy czym mogą one zawierać celulozę mikrokrystalicznąjako wypełniacz, kwas alinowy lub alginian jako środek zawierający, metylocelulozę jako środek zwiększający lepkość oraz znane środki słodzące/smakowo-zapachowe. Jako tabletki natychmiast uwalniające lek, środki takie mogą zawierać celulozę mikrokrystaliczną, fosforan diwapniowy, skrobię, stearynian magnezowy, laktozę i/lub inne znane dodatki, spoiwa, wypełnicze, środki ułatwiające rozpad, rozcieńczalniki i środki smarujące.

Środki aerozolowe do nosa lub środki do inhalacji wytwarzać można sposobami powszechnie znanymi w farmacji, przy czym mogą one być w postaci roztworów w soli fizjologicznej, z wykorzystaniem alkoholu benzylowego lub innych środków konserwujących, środków ułatwiających wchłanianie i zapewniających biodostępność, związków fluorowęglowych i/lub innych znanych środków rozpuszczających lub dyspergujących.

Roztwory lub zawiesiny do iniekcji wytwarzać można znanymi sposobami stosując odpowiednie nietoksyczne, dopuszczalne do podawania pozajelitowego rozcieńczalniki lub rozpuszczalniki takie jak mannitol, 1,3-butanodiol, woda, roztwór Ringera lub izotoniczny roztwór chlorku sodowego, albo odpowiednie środki dyspergujące lub zwilżające i zawieszające takie jak sterylne, łagodne oleje roślinne, w tym syntetyczne mono- i diglicerydy, oraz kwasy tłuszczowe, w tym kas oleinowy?.

Środki do podawania doodbytowego w postaci czopków wytwarzać można w wyniku zmieszania leku z odpowiednim nośnikiem nie powodującym podrażnień, takim jak masło kakaowe, syntetyczne estry glicerydowe lub glikole polietylenowe, stałe w temperaturach otoczenia, ale upłynniające lub rozpuszczające się w jamie odbytowej z uwolnieniem leku.

Ilość związku o wzorze I lub wzorze II podawanego doustnie wynosi 0,1-20 mg/kg wagi ciała w podzielonych dawkach, a ilość inhibitora odwrotnej transkryptazy HIV podawanego doustnie wynosi od 50 mg do 5 g/kg wagi ciała w podzielonych dawkach. Należyjednak zdawać sobie sprawę, że konkretny poziom dawki i częstotliwość podawania określonemu pacjentowi może zmieniać się i zależy do wielu czynników takichjak aktywność konkretnego zastosowanego związku, stabilność metaboliczna i długotrwałość działania tego związku, wiek, waga ciała, ogólny stan zdrowia, płeć, rozdaj odżywiania, sposób i czas podawania, szybkość wydalania, kombinacje leków, ostrość konkretnego stanu chorobowego i leczony stan.

Poniżej przedstawiono przykłady ilustrujące wytwarzanie związków o wzorze I.

Przykład 1 (+/-)-4-( 1,1,1 -trifluorometylo)-4-( 1 -buten-4-ylo)-6-chloro-1,4-dihydro-2H-3,1 -benzoksazyn-2-on (związek 15)

Etap A: N-(4-chlorofenylo)-2,2-dimetylopropanoamid

Do 5 , trój szyjnej kolby okrągłodennej wyposażonej w mieszadło z napędem górnym załadowano 4-chloroanilinę (127,57 g, 1 mol), 1200 ml CHCl₃ i 1200 ml nasyconego wodnego roztworu Na₂CO₃. Do kolby przyłączono wkraplacz i wlano do niego chlorek 2,2-dimetylopropanoilu (129 ml, 1,05 mola). Chlorek kwasowy wkraplano do intensywnie mieszanej zawartości kolby w ciągu 1 godziny. Uzyskaną mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze otoczenia przez 23 godziny?. Część produktu wydzieliła się z mieszaniny w postaci białych kryształów. Kryształy te odsączono. Przesącz przeniesiono do rozdzielacza i warstwy rozdzielono. Warstwę chloroformową przemyto wodą i solanką. Po wysuszeniu nad MgSO₄, przesączeniu i usunięciu rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskano dodatkowy produkt. Obydwie porcje produktu połączono i rekrystalizowano z wrzącej mieszaniny octan etylu/heksany, uzyskując 185,6 g -(4-chlorofenylo)-2,2-dimetylopropanoamidu w postaci białej, krystalicznej substancji stałej.

176 649

Etap B: 1t(2-aminot5-chlorofenylo)-2,2,2-trifluoroetancn

Do wysuszonej w suszarce 3-litrowej trójszyjnej kolby okrągłodennej wyposażonej w mieszadło z napędem górnym, wlot argonu i wysuszony w suszarce wkraplacz o pojemności 500 ml załadowano N-(4-chlorofenylo)t2,2tdimeIylopropancamid (100 g, 472 mmole) w suchym THF (1 litr). Roztwór ten schłodzono w łaźni z lodem do 0°C i do wkraplacza załadowano n-butylolit (387 ml 2,5M roztworu w heksanach, 968 mmoli). Roztwór n-butylolitu powoli wkroplono do roztworu amidu w ciągu 1 godziny utrzymując temperaturę poniżej +5°C. Uzyskany roztwór utrzymywano w 0°C przez 1 godzinę. W tym czasie wytrącił się pomarańczowy osad. Do uzyskanej mieszaniny wkroplono w ciągu 1 godziny, l,l-trifluorooctanetylu(115ml, 968 mmoli). Uzyskany klarowny roztwór pozostawiono na 30 minut, po czym reakcję przerwano dodając 5% kwas solny. Mieszaninę rozcieńczono 1 litrem octanu etylu i warstwy rozdzielono. Fazę organicznąprzemyto solanką, wysuszono nad siarczanem magnezowym, przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskując 160 g żółtego oleju. Materiał ten zawieszono w 1 litrze 3N kwasu solnego i roztwór ogrzewano we wrzeniu pod chłodnicą zwrotną przez 24 godziny. Schłodzony roztwór rozcieńczono 1 litrem octanu etylu i mieszaninę zalkalizowano stężonym NH4OH. Warstwy rozdzielono i fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono nad siarczanem magnezowym, przesączono, zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem i chromatografowano na

1,5 kg żelu krzemionkowego stosując jako eluent 15% octan etylu w heksanie. Chromatografiowany materiał rekrystalizowano z wrzącego heksanu otrzymując 57 g (54%) czystego l-(2-amino-5-chlotofenylo)t2,2,2-Irifluorcetancnu w postaci jasno żółtych kryształów; temperatura topnienia 91-92°C; Ή NMR (CDClj): 5 6,46 (br s, 2H), 6,69 (d, 1H, J=9,2 Hz), 7,32 (dd, 1H, J=2,4, 9,2 Hz), 7,70 (d, 1H, J=2,4 Hz).

Etap C: (+/t)t2-(2tamino-5tchlorcfenylc)-2,2,2ttrifluorOt5theksent2-ol

Do wysuszonej w suszarce, 300 ml trójszyjnej kolby okrągłodennej wyposażonej w pręcik mieszający, wlot argonu, wkraplacz i chłodnicę zwrotną załadowano magnez (wiórki, 3,03 g, 125 mmoli) w suchym THF (75 ml). Do intensywnie mieszanej zawartości kolby dodano 4-bromo-1 -buten (12,0 ml, 118,21 mmola) z taką szybkością, aby utrzymać łagodne wrzenie. Po zakończeniu wkraplania mieszaninę reakcyjną mieszano przez 30 minut, po czym schłodzono do 0°C w łaźni z lodem. Do tego intensywnie mieszanego roztworu wkroplono roztwór ©('-amino^chlorofenylc)-2,2,2-Irifluotoetanonu (5,00 g, 22,36 mmola) w THF 935 ml) w ciągu 30 minut. Łaźnię pozostawiono do ogrzania się i mieszaninę reakcyjną mieszano przez 20 godzin w temperaturze otoczenia. Mieszaninę rozcieńczono octanem etylu i 10% wodnym roztworem kwasu cytrynowego. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 4 godziny. Warstwy rozdzielono, po czym fazę organiczną przemyto wodnym roztworem NaHCO3 i solanką. Po wysuszeniu nad MgSO4, przesączeniu, usunięciu rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem i chromatografowaniu na 300 g żelu krzemionkowego z zastosowaniem 15% octanu etylu w heksanie jako eluentu otrzymano 4,80 g (+/-)t2-(2taminot5-chlorofenylo)-2,2,2ttrifluoro-5thtksen-2-clu w postaci żółtej substancji stałej.

Etap D: (+/-)-4-( 1,1,1 -trifluorometylo)-4-( 1 -buten^-ylcj-ó-chloro-1,4-dihydro-2H-3,1 -benzoksazynDo 300 ml trójszyjnej kolby okrągłodennej wyposażonej w pręcik mieszający, wlot argonu i chłodnicę zwrotną załadowano (+/-)t2t(2-aminot5-chlorofenylo)t2,2,2ttrifluoro-5-hekstnt2-ol (4,80 g, 17,16 mmola), l,l'-karbonylcdiimidazcl (13,91 g, 85,81 mmola) i suchy THF (75 ml). Uzyskaną mieszaninę ogrzewano w 60°C przez 18 godzin. Schłodzoną mieszaninę reakcyjną rozcieńczono octanem etylu i przemyto wodą(3 x 200 ml) i solanką(250 ml). Po wysuszeniu nad MgS(04, przesączeniu i usunięciu rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem, a następnie rekrystalizacji z wrzącej mieszaniny octan etylu/heksan otrzymano 3,22 g (+/-)-4-( 1,1,1 -trifluorometylo^^ 1 -buten^-ylo^-chloro-1,4-dihydro-2H-3,1 -benzoksazyn-2-onu w postaci białej, krystalicznej substancji stałej; temperatura topnienia 165-166°C; *H NMR(CDCl3): δ 1,99(m, 1H), 2,09-2,40 (m,3H), 5,00 (d, 1H, J=1,4Hz),5,03(dd, 1H, J=1,4,7,9), 5,78 (m, 1H), 6,85 (d, 1H, J=8,6Hz),7'1 (brs, 1H),7,35(dd, 1H, J=2,2,8,6 Hz), 9,63(brs, 1H).

176 649

P rzykład 2 (+/-)-6-chlo^^-^-^^<e^i^3^^<^^-^^(l, 1,1 -trifluorometylo)-1,4-di.hy dro-2H-3, 1 -benzoksazyn-2-on (związek 26)

Etap A: (2-amino-5-chlorofenylo)-1,l,l-trifluoro-3-butyn-2-ol

Do 500 ml trójszyjnej kolby okrągłodennej wyposażonej we wkraplacz, wlot argonu, pręcik mieszający i termometr cyfrowy załadowano bromek etynylomagnezowy (0,5M w heksanie, 268 ml, 134 mmole), po czym kolbę schłodzono do -78°C. Wkraplanie roztworu l-(2-amino-5chlorofenylo)-2,2,2-trifluoroetanonu (6,0 g, 26,8 mmola) w 50 ml THF zakończono po 15 minutach, utrzymując temperaturę < -55°C. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 16 godzin po powolnym ogrzaniu do temperatury pokojowej. Reakcję przerwano wkraplając do ciemno czerwonego roztworu w -5°C nasycony wodny roztwór chlorku amonowego (60 ml). Po ekstrakcji octanem etylu, a następnie przemyciu 10% roztworem kwasu cytrynowego, nasyconym roztworem wodorowęglanu sodowego, wodą i solanką, a następnie wysuszeniu nad siarczanem sodowym, przesączeniu i odparowaniu rozpuszczalnika otrzymano 8,5 g surowego produktu. Po oczyszczaniu metodąchromatografii rzutowej z zastosowaniem 15-20% octanu etylu w heksanie uzyskano czysty 2-(2-ammo-5-chlorofenylo)-1,1,1-trifluoro-3-butyn-2-ol (5 g jasno brunatnego oleju, 75% wydajności).

Etap B: (+/-)-6-chloro-4-etynylo-4-(1,1,1-trifluorometylo)-1,4-dihydro-2H-3,1-benzoksazyn-2-on

Do roztworu (2-amino-5-chlorofenylo)-1,1,1-trifluoro-3-butyn-2-olu w THF (5,0 g, 20,0 mmoli w 225 ml THF) dodano 1, l'-karbonylodiimidazol (13,0 g, 80,0 ml) i mieszaninę ogrzewano w łaźni olejowej w 60°C przez 17 godzin. THF usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość rozpuszczono w octanie etylu, po czym przemyto 10% roztworem kwasu cytrynowego, roztworem wodorowęglanu sodowego, wodą i solanką, a następnie wysuszono nad siarczanem sodowym. Po przesączeniu i odparowaniu pod zmniejszonym ciśnieniem wydzielono surowy produkt (3,6 g), który rekrystalizowano z mieszaniny octan etylu/heksan. Produkt (+/-)-6-chloro-4-etynylo-4-( 1,1,1 -trifluorometylo)-1 ,-dihydro-2H-3,1 -benzoksazyn-2-on wydzielono w postaci białej, krystalicznej substancji stałej (3,22 g, 58,4% wydajności); temperatura topnienia 226-227°C. ¹HNMR(CDCl3+śladowe ilości DMSO): 83,16 (s, 1H),6,98 (d, J=3,3Hz, 1H),7,35 (m, 1H), 7,51 (s, 1H), 10,66 (s, 1H).

Przykład 3 (+/-)-6-chloro-4-( 1,1,1 -trifluorometylo)-4-[(3-( 1 -pirolidynylo))-1 -propynylo]-1 ,-dihydro-2H-3,l-benzoksazyn-2-on (związek 7)

Dioksanowy roztwór (+/-)-6-chloro-4-etynylo-4-( 1,1,1 -trifluorometylo)-1,4-dihydro-2H-3,l-benzoksazyn-2-onu (150 mg, 0,544 mmola), pirolidyny (52,2 fil, 0,626 mmola), paraformaldehydu (20,5 mg, 0,681 mmola), kwasu octowego (31,1 (ii, 0,544 mmola) i chlorku miedzi (I) (20,5 mg, 0,207 mmola, w 3,5 ml dioksanu) ogrzewano w 50°C w łaźni olejowej przez około 2 godziny. Reakcję przerwano 2N HC1 i mieszaninę wyekstrahowano octanem etylu. Warstwę dolną zobojętniono stałym węglanem potasowym i wyekstrahowano octanem etylu (3 razy). Połączone ekstrakty przemyto wodą i solanką, po czym wysuszono nad siarczanem sodowym uzyskując 140 mg surowego produktu. W wyniku chromatograficznego oczyszczania na żelu krzemionkowym i rekrystalizacji z mieszaniny octan etylu/heksan otrzymano krystaliczny (+/-)-6-chloro-4-( 1,1,1 -trifluorometylo)-4-[(3-( 1 -pirolidynylo))-1 -propynylo]-1,4-dihydro-2H-3,l-benzoksazyn-2-on (89 mg, 46% wydajności); temperatura topnienia 160-161°C (rozkład). ¹HNMR(CDCł₃381, W- 1,89 (m,4H), 2,68-2,71 (m,4H), 3,67 (s, lH),6,88(d, J=8,55 Hz, 1H), 7,40 (dd, J=2,19, 8,54 Hz, 1H), 7,55 (s, 1H), 9,45 (s, 1H).

(+/-)-6-chloro-4-(2-cyjanofenylo)etynylo-4-(1,1,1 -tlifluorometylo)-1,4-dlhydlo-2H-3,1-benzoksazyn-2-on (związek 2)

Roztwór 6-chloro-4-etynylo-4-( 1,1,1 -trifluorometylo)-1,4-dihydro-2H-3,1 -benzoksazyn-2-onu (138 mg, 0,5 mmola) w 3 ml suchego THF mieszano w -78°C. Do roztworu tego dodano 0,4 ml (1,0 mmola) n-butylolitu, 2,5M roztwór w heksanie. Anion mieszano przez 10 minut w -78°C, po czym dodano 1 ml IM roztworu ZnCl2 w eterze. Mieszaninę reakcyjną mieszano w

176 649

-78°C przez 15 minut, po czym łaźnię z lodem usunięto i mieszaninę powoli ogrzano do 0°C w ciągu 3θ minut. Do mieszaniny reakcyjnej dodano roztwór 2-jodobenzonitrylu (149 mg, 0,65 mmola) w 2 ml THF, a następnie tetrakis(trifenylofosfino)pallad (0) (56 mg, 0,05 mmola). Mieszaninę reakcyjnąpozostawiono do ogrzania się do temperatury pokojowej i mieszanie kontynuowano przez 15 godzin. Reakcję przerwano dodając do mieszaniny reakcyjnej 10 ml 2N HCl, po czym mieszaninę wyekstrahowano 2 x 200 ml octanu etylu i połączone ekstrakty przemyto wodą i solanką, a następnie wysuszono nad siarczanem magnezowym. Rozpuszczalnik usunięto uzyskując 195 mg oleju, który poddano chromatografii rzutowej na żelu krzemionkowym (20% octan etylu w heksanie) otrzymując 60 mg nieprzereagowanej substancji wyjściowej i 35 mg sprzężonego produktu. Produkt ten ucierano z eterem uzyskując 25 mg (+/-)-6-chloro-4-(2-cyj anofenylo)etynylo-4-( 1,1,1 -tri-fluorometylo)-1,4-dihydro-2H-3,1 -benzoksazyn-2-onu; temperatura topnienia 245-246°C; FAB.MS M+l = 377 m/e. Ή NMR (CDCl·)): δ 6,82-6,85 (d, J=8,5 Hz, 1H), 7,40-7,44 (dd, J=2,1, 8,5 Hz, 1H); 7,56-7,79 (m, 5H), 8,00 (s, 1H).

Przykład 4 (+/-)-4-( 1-chloro-1,1 -difluorometylo)-4-(2-fenyloetynylo)-6-chloro-1,4-dihydro-2H-3,1-benzoksazyn-2-on (związek 5)

Etap A: 1-(2-amino-5-chlorofenylo)-2-chloro-2,2-difluoroetanon

Do wysuszonej w suszarce, 300 ml trójszyjnej kolby okrągłodennej wyposażonej w pręcik mieszający, wlot argonu i 100 ml wkraplacz wysuszony w suszarce załadowano N-(4-chlorofenylo)-2,2-dimetylopropanoamid (10 g, 47,2 mmola) i suchy THF (100 ml). Roztwór ten schłodzono w łaźni z lodem do 0°C, a do wkraplacza dodano n-butylolit (38,7 ml 2,5M roztworu w heksanach, 96,8 mmola). Roztwór n-butylolitu powoli wkroplono do roztworu amidu w ciągu 1 godziny, utrzymując temperaturę poniżej +5°C. Uzyskano roztwór mieszano w 0°C przez 1 godzinę; w tym czasie wytrącił się pomarańczowy osad. Do mieszaniny tej wkroplono w ciągu 15 minut 1-chloro-1,1-difluorooctan etylu (10,2 ml, 96,8 mmola). Uzyskany klarowny roztwór mieszano przez 30 minut. Reakcję przerwano dodając 5% kwas solny. Mieszaninę rozcieńczono 1 litrem octanu etylu, po czym warstwy rozdzielono. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono nad siarczanem magnezowym, przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskując 160 g żółtego oleju. Materiał ten zawieszono w 200 ml 3N kwasu solnego i roztwór ogrzewano we wrzeniu pod chłodnicązwrotnąprzez 24 godziny. Schłodony roztwór rozcieńczono 500 ml octanu etylu i mieszaninę zalkalzowano stężonym NH4OH. Warstwy rozdzielono i fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono nad siarczanem magnezowym, przesączono, zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem i chromatografowano na 350 g żelu krzemionkowego stosując jako eluent 15% octan etylu w heksanie. Chromatografowany materiał rekrystalizowano z wrzącego heksanu otrzymując 5,5 g czystego 1-(2-amino-5-chlorofenylo)-2-chloro-2,2-difluoroetanonu w postacijasno żółtych kryształów; temperatura topnienia 55-56°C. *H NMR (CDClj): δ 6,43 (br s, 2H), 6,69 (d, 1H, J=9,0 Hz), 7,31 (dd, 1H, J=2,4, 9,0 Hz), 7,80 (d, 1H, J=2,4 Hz).

E t a p B: (+/-)-2-(2-amino-5-chlorofenylo)-4-fenylo-1 -chloro-1,1 -difluoro-3-butyn-2-ol Do wysuszonej w suszarce, 100 ml trójszyjnej kolby okrągłodennej wyposażonej w pręcik mieszający, wlot argonu, chłodnicę zwrotną i przegrodę załadowano etynylobenzen (2,13 g, 20,83 mmola), suchy THF (50 ml) i bromek etylomagnezowy (6,94 ml 3,OM roztworu w eterze). Uzyskaną mieszaninę reakcyjną mieszano 2 godziny w temperaturze pokojowej, po czym dodano ze strzykawki roztwór 1-(2-amino-5-chlorofenylo)-2-chloro-2,2-difluoroetanonu (1,100 g, 4,17 mmola) w THF (6 ml). Uzyskany pomarańczowo-czerwony roztwór mieszano w temperaturze pokojowej przez 21,5 godziny. Reakcję przerwano dodając IN HC1 (50 ml), po czym mieszaninę rozcieńczono octanem etylu. Roztwór zalkalizowano stężonym NH4OH i warstwy rozdzielono. Fazę organiczną przemyto wodą i solanką. Po wysuszeniu nad siarczanem magnezowym, przesączeniu, usunięciu rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem i chromatografii na żelu krzemionkowym z zastosowaniem 20% octanu etylu w heksanie jako eluentu otrzymano 1,02 g (+/-)-2-(2-amino-5-chlorofenylo)-4-fenylo-1-chloro-1,1 -difluoro-3-butyn-2-olu jako białawej substancji stałej. *H NMR (cDÓ)): 84,42 (br s, 2H), 5,10 (br s, 1H), 6,65 (d, 1H, J=8,5 Hz), 7,15 (dd, 1H, J=2,4, 8,5 Hz), 7,38 (m, 3H), 7,55 (m, 2H), 7,70 (d, J=2,4 Hz).

176 649

Etap C: (+/-)-4-( 1 -chloro-1,1 -difluorometylo)-4-(2-fenyloetynylo)-6-chloro-1,4-dihydro-2H-3,1 -benzoksazyn-2-on

Do 1.00 ml trójszyjnej kolby okrągłodennej wyposażonej w pręcik mieszający, chłodnicę zwrotną i wlot argonu załadowano (+/-)-2-(2-ami:tn^-^:5^(^^loi^otf2r^y^ic^)-^--^:ce^y^lc^--^(^^l<^o^<^^1,1-difluoro-3-butyn-2-ol (0,81 g, 2,37 mmola), suchy THF (25 ml) i 1,1'-karbonylodiimidazol (l,919g, 11,84 mmola). Roztwór ten ogrzewano w 60°C przez 20 godzin. Schłodzoną mieszninę reakcyjną rozcieńczono octanem etylu i przemyto 0,5N HC1, wodąi solanką. Po wysuszeniu nad siarczanem magnezowym, przesączeniu i usunięciu rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymano 890 mg oleju. Materiał ten chromatografowano na 80 g żelu krzemionkowego stosując jako eluent 20% octan etylu w heksanie. Chromatografowany materiał rekrystalizowano z wrzącej mieszaniny octan etylu/heksany otrzymując 507 mg (58%) (+/-)-4-(1-chloro-1,1-difluorometylo)-4-(2-fenyloetynylo)-6-chloro-1,4-dihydro-2H-3,1 -benzoksazyn-2-onu w postaci białych igieł, o temperaturze topnienia 154-155°C. ^!H NMR (CDO3): δ 6,89 (d, 1H, J=8,4 Hz), 7,35-7,48 (m, 4H), 7,56 (m, 2H), 7,64 (br s, 1H), 9,19 (br s, 1H).

Przykład 5 (-/-)-6-chloro-4-fenyloetynylo-4-trifluorometylo-1,4-dihydro-2H-3,1-benzoksazyn-2-on (związek 4)

Etap A: 2-(2-amlno-5-chloϊΌfenylo)-4-fenylo-C ,1,1 -tnfluoro-3-butyn-2-ol

Do roztworu fenyloacetylidku litu wytworzonego z 4,83 ml fenyloacetylenu (0,044 mola) i 17,2 ml 2,5N rozworu n-butylolitu w heksanie (0,043 mola) w 50 ml ThF w -78°C dodano 11,4 g eteratu bromku magnezowego (0,044 mola) w ciągu 5 minut. Mieszaninę pozostawiono do ogrzania się do -20°C i mieszanie w atmosferze argonu kontynuowano przez 30 minut. Mieszaninę schłodzono następnie do -60°C i dodano roztwór zawierający 2,5 g (0,011 mola) l-(2-amino-5-chloro)-2,2,2-trifluorometyloetanonu skompleksowanego uprzednio z równoważnąilością (2,8 g, 0,011 mola) eteratu bromku magnezowego w 25 ml THF. Mieszaninę reakcyjną mieszano w 15°C przez 1 godzinę, o czym schłodzono do 0°C i wkroplono do niej mieszaninę zawierającą po 30 ml nasyconego wodnego roztworu chlorku amonowego i wody. Mieszaninę wyekstrahowano dwoma porcjami po 100 ml eteru etylowego, po czym połączone fazy organiczne przemyto solanką i wysuszono nad siarczanem magnezowym. Po usunięciu środka suszącego i rozpuszczalników uzyskano 6 g oleju, który poddano chromatografii rzutowej na żelu krzemionkowym, stosując do eluowania 20% octan etylu' w heksanie; otrzymano 2,5 g 2-(2-amino-5-chlorofenylo)-4-fenylo-1,1,1-trifluoro-3-butyn-2-olu. *H NMR (CDO3): 8,63 (br s, 3H),

6,69 (d, J=8,5 Hz, 1H), 7,15 (d, J=2 Hz, 1H), 7,17 (d, J=2 Hz,'IH), 7,35-7,44 (m, 3H), 7,53-7,56 (m, 2H), 7,66 (d, J=2 Hz, 1H). FAB MS M+H = 326 m/e.

Etap B: (±)-6-cWoro-4-fenyloetynylo-4-trifluorometylo-1,4-dihydro-2H-3,1 -benzoksazyn-2-on (związek 12)

Roztwór 2-(2-amino-5-chlorofenylo)-4-fenylo-1,1,1-trifluoro-3-butyn-2-olu (2,0 g, 6,1 mmola) i 11,0 g (12,0 mmola) 1, f-karbonylodiimidazolu w 300 ml suchego THF mieszano w atmosferze argonu w 55°C przez 24 godziny. Rozpuszczalnik usunięto w wyparce rotacyjnej, a pozostałość wymieszano z 200 ml eteru i 400 ml wody. Warstwy rozdzielono i warstwę wodną wyekstrahowano jeszcze raz eterem. Połączone ekstrakty eterowe przemyto dwoma porcjami po 200 ml 10% roztworu kwasu cytrynowego, a następnie solanką, po czym wysuszono nad siarczanem magnezowym. Po usunięciu środka suszącego i rozpuszczalników uzyskano 1,5 g (70%) surowego tytułowego związku w postaci oleju. W wyniku ucierania z mieszaniną eter/heksan otrzymano 875 mg (±)-6-chloro-4-fenyloeeynylo-4--rifluo)omeeyk>--,4-dihydro-2II-3,C-benzoksazyn-2-onu w postaci białej substancji stałej, która częściowo topi się w 137°C, a staje się klarowna w 147°C. Ή NMR (CDCl3): δ 6,92 (d, J=8 Hz, 1H), 7,30-7,49 (m, 4H), 7,58-7,65 (m, 3H), 8,99 (s, 1H).

Etap C: 6-chloro-1-(1S)-kamfanoilo-4-fenyloetynylo-4--rifluoromeeyło-1,4-dihydro-2H-3,1 -benzoksazyn-2-on

Do roztworu zawierającego (±)-6-chloIΌ-4-fenyloeeynylo-4--nfluorometylo-1,4-dίhydro-2H'-3;1-benzoksazyn-2-on (2,24 g, 6,37 mmola), 4-dimetyloamino-pirydynę (0,10 g,

176 649

0,8 mmola) i chlorek kwasu (-)-kamfanowego (2,07 g, 9,55 mmola) w 60 ml suchego dichlorometanu, mieszanego w atmosferze aragonu w łaźni z lodem, dodano trietyloaminę (2,22 ml,

15,9 mmola). Łaźnię chłodzącąusunięty i reakcję kontynuowano w temperaturze pokojowej. Po stwierdzeniu, że reakcja została zakończona, na podstawie chromatografii cienkowarstwowej (SiO2, 4% octan etylu w CHCl₃) roztwór rozcieńczono 200 ml CHC1₃ i przemyto dwukrotnie 10% roztworem kwasu cytrynowego, a następnie solanką. Po wysuszeniu nad siarczanem magnezowym rozpuszczalnik usunięto w wyparce rotacyjnej i piankowatą pozostałość poddano chromatografii rzutowej stosując do eluowania CHCty Uzyskano 575 mg diastereoizomeru I

6-chloro-1 -(S)-kamfanoilo-4-fenekletenylo-4-trifluyrometylo-1,4-dihydro-2H-3,1 -benzoksaaen-2-one w postaci oleju; 'H NMRJCDClj)·. 80,85 (s, 3H), 1,08 (s, 3H), 1,22 (s, 3H), 1,73-1,85 (m, 1H), 1,92-2,08 (m, 1H), 2,50-2,67 (m, 2h), 7,30-7,79 (m, 8H). Następnie uzyskano 1,52 g mieszanych frakcji (diastereoizymery I i II). Kontynuując eluowanie otrzymano 680 mg wolniej przemieszczającego się distereoiaomere (II) tytułowego związku, z którego w wyniku ucierania z mieszaninę eter/heksan otrzymano grudki białych igieł o temperaturze topnienia 177-178,5°C. ’HNMR(CDCl3): δ 0,83 (s,3H), 1,12 (s,3H), 1,23 (s,3H), 1,73-1,86 (m, 1H), 1,93-2,06 (m, 1H), 2,50-2,63 (m, 2H), 7,38-7,51 (m, 4H), 7,49-7,62 (m, 2H), 7,72 (d, J=9 Hz, 1H), 7,76 (d, J=2 Hz, 1H).

1,52 g mieszaniny izomerów z chromatografii rzutowej rozpuszczono w 75 ml eteru, roztwór rozcieńczono 50 ml heksanu i zaszczepiono kryształem izomeru II. W wyniku powolnej krystalizacji otrzymano dodatkowy 385 mg izomeru II, który rekrystalizowano z mieszaniny eter/heksan otrzymując materiał o czystości diastereoiaomerycznej (oznaczonej metodą HPLC) ponad 96%.

Etap D: (-)-6-chloro-4-fenylyetyly-4-trifluorometylo-1,4-aihydro-2H-3,1-benaoksazyn-2-on

Krystaliczny diastereoiaymer II 6-chloro-l-(lS)-kamfanoilo-4-fenyloetynylo-4-trifluorome^ł^^ 1^^hydro^H)^,1 -benaoksazen-2-onu (53 mg, 0,10 mmola) rozpuszczono w 8 ml 2-propanolu w 45°C w atmosferze aragonu. Do roztworu dodano 0,27 ml 10% wodnego roztworu K2CO3. Mieszanie kontynuowano przez 10 minut, gdy stwierdzono, że cały materiał wyjściowy przereagował (TLC, SiO2,4% octan etylu w CHCty). Roztwór zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość rozpuszczono w eterze. Po przemyciu 0, IN HC1 i solanką roztwór eterowy wysuszono nad siarczanem magnezowym, przesączono i odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymując oleistą substancję stałą, którą oczyszczano metodą chromatografii na S1O2 stosując do eluowania 5% 2-propanol w heksanie. Uzyskano (-)-6-chloro-4-fenyloetylo-4-trίfluorometylo-1,4-dlhearo-2H-3,l-benayksaaen-2-on w postaci białych igieł po krystalizacji z mieszaniny eter/heksan; temperatura topnienia 178-179°C. a D2° = -92,5° (CHCty c-0,0012 g/ml); Ή NMR (CDC^): δ 6,87 (d, J=8,5 Hz, 1H), 7,37-7,50 (m, 4H), 7,56-7,63 (m, 3H), 8,60 (s, 1H).

Etap E: (+)-6-chloro-4-feneloetylo-4-trifluorometylo-1,4-dihydro-2H-3,1-benzoksazyn^-on '(+)-6-chloro-4-fenyloetelo-4-trifluyrometyly-1,4-dihydro-2H-3,1-benzoksazyn-2-on otrzymano z niekrystαlicanego produktu z etapu C, aiastereoizomeru I, w sposób podany w etapie D; temperatura topnienia 178-179°C; [a]D²⁰ = +87,6° (CHO3, c = 0,0050 g'ml); *H NMR (CDC13): δ 6,87 (d J=8,5 Hz, 1H), 7,37-7,50 (m, 4H), 7,56-7,63 (m, 3H), 8,60 (s, 1H).

Przykład 6 (-)-6-dhloro-4-cyklopropeloetynelo-4-trifluyrometylo-1,4-dihedro-2H-3,1-benzoksaaen-2-on (L-743,726, związek 37.2) i (+)-6-chloro-4-cyklopropyloetynylo-4-trifleorometelo-1,4-dihydro-2H-3,1 -benaoksazyn-2-yn (L-743,725)

Etap A: 2-(2-amml)-5-chlorofenylo)-4~oykk)yrooplOll,l,l-trifluoro-3-buten-2-ol

Roztwór cyklopropyloacetylidku bromymaznezowego otrzymano z 23 g cyklopropyloacetylenu (0,348 mola) w 250 ml THF, do którego wkroplono 116 ml 3,0M roztworu bromku etylomagnezowego w eterze (0,348 mola) w ciągu 1 zoaniny. Roztwór ten utrzymywano w 0°C przez 1 godzinę, a następnie w 40°C przez 3 zyaainy. Do roztworu tego, schłodzonego ponownie

176 649 do 0°C dodano porcjami w ciągu 5 minut stały l-(2-amino-5-chlorofenylo)-2,2,2-trifluorometyloetanon (0,0696 mola). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 0°C przez 1,5 godziny. Reakcję przerwano w 0°C wkrapląjąc 700 ml nasyconego wodnego roztworu chlorku amonowego. Mieszaninę wyekstrahowano 2 porcjami po 400 ml octanu etylu, po czym połączone fazy organiczne przemyto solanką i wysuszono nad siarczanem magnezowym. Po usunięciu środka suszącego i rozpuszczalników uzyskano ż.ółtą substancję stałą. Materiał ten rekrystalizowano z wrzących heksanów (ostateczna objętość 100 ml) otrzymując 14,67 g 2-(2-amino-5-chlorofenylo)-4-cyklopropylo-1,1,1-trifluoro-3-butyn-2-olu. Drugi rzut (2,1 g) uzyskano z zatężonego ługu macierzystego. Temperatura topnienia 153-154°C. ’H NMR (CDCI3): 8 0,84 (m, 2H), 0,90 (m, 2H), 1,38 (m, 1H), 4,50 (br s, 3H), 6,69 (d, J=8,5 Hz, 1H), 713 (dd, J=2,5, 8,5 Hz, 1H), 7,55 (d, J=2,5 Hz, 1H).

Etap B: (±)-6-chloro-4-cyklopen tyloetyny lo-4-triif uorometylo-1,4-dihydro-2H-3,1 -benzoksazyn-2-on (L-741,211)

Roztwór 2-(2-amino5-chlorofcnylo))4-cyklooropylo--,l,l-trifluoro-3-butyn-2-olu (15,00 g, 0,0518 mola) i 41,98 g (0,259 mola) 1,1'-karbonylodiimidazolu w 250 ml suchego THF mieszano w atmosferze argonu w 55°C przez 24 godziny. Rozpuszczalnik usunięto w wyparce rotacyjnej, a pozostałość wymieszano z 500 ml octanu etylu i 400 ml wody?. Warstwy rozdzielono i fazę wodną wyekstrahowano jeszcze raz octanem etylu. Połączone ekstrakty w octanie etylu przemyto 2 porcjami po 200 ml 2% kwasu solnego, nasyconym wodnym roztworem NaHCO₃ i solanką. Po wysuszeniu nad siarczanem magnezowym, przesączeniu i usunięciu rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymano 16,42 g tytułowego związku w postaci substancji stałej. W wyniku rekrystalizacji z mieszaniny octan etylu/heksan uzyskano 12,97 g analitycznie czystego (±)-6-ch loro-4-cyklopenty loety ny 1 ο-4-trifl uoromety lo-1,4-dihydro-2H-3,1 -benzoksazyn-2-onu w postaci białych kryształów. Temperatura topnienia 178-180°C. ¹HnMr(CDC1₃): δ 0,85 (m, 2H), 0,94 (m, 2H), 1,40 (m, 1H), 6,81 (d, J=8,5 Hz, 1H), 7,37 (dd, J=2,5,8,5 Hz, 1H), 7,49 (d' J-2,5 Hz, 1H), 8,87 (brs, 1H).

Etap C: 6-chloro-l-(lS--4-cyk-opropylpetynylo-4-trif.uorometylo-1,4-dihydrp-2Hc -3,1 -benzpksazyn-2-pn.

Do roztworu zawierającego (±)-6-chloro-4-cyklopentyloetynylo-4-trif^upopmetylo-l,4^-d^ihydro-2H-3,l-^benzoksazyn-2-on (12,97 g, 0,041 mola), 4-dimetyloaminpc pirydynę (1,02 g, 0,0083 mola) i chlorek kwasu (O-kamfanowego (14,22 g, 0,06556 mola) w 350 ml suchego dichlorometanu, mieszanego w atmosferze argonu w łaźni z lodem dodano trietyloaminę (22,84 ml, 0,164 mola). Łaźnie chłodzącą usunięto i reakcję kontynuowano w temperaturze pokojowej. Po 75 minutach stwierdzono, że reakcja została zakończona, na podstawie chromatografii cienkowarstwowej (SiO₂,4% octan etylu w CHCI3) roztwór rozcieńczono 500 ml CHO3, a następnie przemyto 10% roztworem kwasu cytrynowego (2 razy), wodą(l raz) i solanką (1 raz). Po wysuszeniu nad siarczanem magnezowym, przesączeniu i usunięciu rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskano bezbarwną piankę. Materiał ten ucierano z 200 ml wrzącego heksanu. Podczas schładzania do temperatury pokojowej wytrącił się pożądany diasteoepizpmeryczny imid kamfanianu. Osad oddzielono na filtrze spiekanym, przemyto niewielką ilością zimnych heksanów i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymując 7,79 g 6-chlpro-1 -(1 S)-4-cyklopoppyloetynylp-4-toifluorpmetylp-1,4-dihydoo-2H-3,1 -benzoksazynM-onu w postaci białych kryształów. Temperatura topnienia 164-165°C. czystość na podstawie HPLC: 99,2% przy około 254 nm. ^lH NMR (CDCI3): δ 0,77 (s, 3H), 0,86-0,96 (m, H), 1,08 (s, 3H), 1,19 (s, 3H), 1,44 (m, 1H), 1,76 (m, 1H), 1,95 (m, 1H), 7,42 (dd, J=2,4, 9,0 Hz, 1H), 7,63 (m, 2H).

Etap D: (-)-6-chlooo-4-cyklopoopyloetynylo-4-trifluorometylo-l,4-dihydop-2H-3,1-benzoksazyn-2-on (L-743,726, związek 37.2)

6-chloro-1-(1 SM-cyklopropyloetynyloM-tTifluorometylo-1 ^-dihydro^H^, 1 -benzoksazyn-2-pn (7,50 g, 0,01512 mola) rozpuszczono w 150 ml n-butanolu w 60°C w atmosferze argonu. Uzyskany roztwór mieszano w 60°C przez 72 godziny. Mieszaninę zpbpjęt:nipnp wodnym roztworem NaHCO3 i n-butanol usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszczono w 150 ml THF, do uzyskanego roztworu dodano 50 ml 2N LiOH i uzyskaną

176 649 mieszaninę reakcyjną mieszano przez 3 godziny w temperaturze pokojowej. Mieszaninę rozcieńczono octanem etylu, po czym przemyto dwoma porcjami wody i jedną porcją solanki. Po wysuszeniu nad siarczanem magnezowym, przesączeniu i odparowaniu rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymano białą substancję stałą. Materiał ten rekrystalizowano z gorącego heksanu uzyskując 3,43 g (-)-6-chloro-4-cyklopropyloetynylo-4-trifluorometylo-1,4-dihydro-2H-3,1-benzoksazyn-2-onu w postaci białych kryształów o temperaturze topnienia 131-132°C; [a]D2° = -84,7° (CHC^, c = 0,005 g/ml); Ή NMR (CDO3): 80,85 (m, 2H), 0,94 (m, 2H), 1,40 (m, 1H), 6,81 (d, J=8,5 Hz, 1H), 7,37 (dd, J=2,5, 8,5 Hz, 1H), 7,49 (d, J=2,5 Hz, 1H),

8.87 (br s, 1H).

Etap E: (+)-6-chkaro-4-cyklopropyloeeynylo-4--πflooaomeeylo-ll4-dihydro-2Π-3,l-benzoksazyn-2-on (L-743,725)

Ług macierzysty z etapu C oczyszczano metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym stosując jako eluent 10% octan etylu w heksanach. Czysty, niepożądany diastereoizomer (w postaci białej pianki) hydrolizawano w sposób podany w etapie D. Uzyskano enancjomeryczny benzoksazynon, (+)-6-chlalΌ-4-cyklopropyloetynylo-4-trifluorometylo-l,4-dihydro-2H-3,1 -benzoksazyn-2-on w postaci białych kryształów o temperaturze topnienia 131-132°C; [a]D2° = +84,4° (CHCŁ,, c = 0,005 g/ml); Ή NMR (CDCŁ,): 8 0,85 (m, 2H), 0,94 (m, 2H), 1,40 (m, 1H),6,81 (d, J=8,5Hz, 1H),7,37(dd,J=2,2,8,5 Hz, lH),7,49(d, J=2,5 Hz, 1H),

8.87 (br s, 1H).

Przykład 7

Receptura tabletek

Substancja	Ilość substancji w	tabletce	a
50,0 mg	75,0mg	100,0 mg	150,0 mg	200,0 mg
Substancja czynna	50,0 mg	75,0 mg	100,0 mg	150,0 mg	200,0 mg
laurylosiarczan sodu	2,50 mg	3,75 mg	5,0 mg	7,5 mg	10,0 mg
wewnątrzgranulkowy glikolan sodu skrobi	40,0 mg	60, 0 mg	80,0 mg	120,0 mg	160,0 mg
zewnątrzgranulkowy glikolan sodu skrobi	5,00 mg	7,50 mg	10,0 mg	15,0 mg	20,0 mg
monohydrat laktozy	28,5 mg	42,75 mg	57,0 mg	85,5 mg	114,0 mg
stearynian magnezu	2,0 mg	3,0 mg	4,0 mg	6, 0 mg	8,0 mg
waga łączna	128,0 mg	192,0 mg	25 6,0 mg	384,0 mg	512,0 mg

176 649

Badania farmakologiczne.

Test z odwrotną transkryptazą

W teście oznacza się wbudowywanie irytowanego mcnofosfotanu dezoksyguanozyny przez zrekombinowaną odwrotną transkryptazę HIV (HIV RTr) (lub inną RT) do strącanego kwasem cDNA przy wielkościach Km dGTP i poli r(C)oligo d(G)₁'.i ₈. Inhibitory według wynalazku inhibitILljątc wbudowywanie. Testy prowadzono w 55 mM Tris (pH 8,2) - 30 mM KC1 30 mM MgCl₂ -1 mM dittctreitcl - 20 |ig rC:dG₁'.i₈ (Pharmacia) na ml - 8 mM pHJdGTP (New England Nuclear) - 0,01% Triton X - 50 mM kwas eIylenoglikol-bis-(β-amlnoetylc-eIero)tNtNtN',N'-tetracctowy (EGTA) - 1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej. Po inkubowaniu przez 60 minut w 37°C materiał strącony kwasem zebrano na filtrach z włókien szklanych za pomocą półautomatycznego aparatu do zbierania komórek. Ekstrakty komórek bakteryjnych zawierające RT rozcieńczono do wielkości przypadającej w obszarze zależności liniowych w teście i zmierzono aktywność w obecności i bez inhibitora. Jako środek kontrolny zastosowano oczyszczony heterodimer HTV-1 RT wytwarzany przez E.coli. Wyniki podawano jako stężenie inhibitora zapewniające inhibitowanie w 50% (IC₅₀ wt), w nanom-iolach/litr.

W przypadku testu podwójnego mutanta (dm) zastosowano A17 RT. A17 RT j est odporna na różne aminopirydony, jak to opisali J.H. Nunberg i inni, J. Virol. 65,4887 (1991). Wyniki podano jako wielkości IC50 dm w M^molach/litr.

Test rozprzestrzeniania w komórkach

Inhibitowanie rozprzestrzeniania się HIV w hodowli komórek oznaczano metodą J.H. Nunberga i innych, J. Virol. 65,4887 (1991). W teście komórki T-limtoidalne MT- zainfekowano HIV-1 (typu dzikiego, o ile nie zaznaczono tego inaczej) stosując ustalone inokulum, po czym hodowle inkubowano przez 24 godziny. Po tym czasie < 1% komórek wykazywała odczyn dodatni w teście pośredniej immunofluorescencji. Następnie komórki dokładnie przemyto i rozprowadzono na płytkach do hodowli z 96 zagłębieniami. Do zagłębień dodano inhibitor kolejno dwukrotnie rozcieńczany i hodowle kontynuowano przez 3 kolejne dni. Po dniach od zainfekowania 100% komórek w hodowlach kontrolnych zostało zainfekowanych. Nagromadzenie się HIV-1 p24 było bezpośrednio powiązane z rozprzestrzenianiem się wirusa. Stężenie inhibitujące hodowlę komórek określano jako stężenie inhibitora w nanomolach/litr (CIC95), zmniejszające rozprzestrzenianie się infekcji o co najmniej 95%.

Zestawienie wyników dla związku 37.2

A. Test z odwrotną transkryptazą i test rozprzestrzeniania się w komórkach

	WT	K103N*	Y181C	DM	RT-2
ΙΟ,ο (μΜ)	0,002	0,030	0,008	0,085	80,8
CIC95 (μΜ)	<0,006 (N=2)	0,100	<0,025	0,400	NO

B. Dane farmakologiczne Rezus:

mg kg⁴ dożylnie: t_ia = 210 minut O.B.=0),55 (A.U:C) mg - kg.] doustnie (methocel): C_max - 4,4 jM @ 2h

C'4h = M μΜ

Wiązanie białka: 98.0% zwykłego ludzkiego osocza (metoda HPLC) * Mutanty K103N i Y181C stanowią oporne na leki odwrotne transkryptazy HTV-1. DM jest mutantem podwójnym, co wyjaśniono w teście z odwrotną transkryptazą. RT-2 oznacza odwrotną transkryptazę HIV-2.

Działanie synergistyczne

A. Preparowanio zawtozOay komórek MT-4 zainfekowanych prych HIV

Komórki MT zainfekowano w dniu 0 w stężeniu 250 000 na ml w rozcieńczeniu 1:1000 szczepem podstawowym IIIb HIV-1 (ostateczne stężenie 125 pg p24/ml; wystarczające do

176 649 osiągnięcia< 1% zainfekowanych komórek w dniu 1 i 25-100% w dniu 4). Komórki zainfekowano i hodowano w następującym ośrodku: RPMI1640 (Whittaker BioProducts), 10% zdezaktywowanej płodowej surowicy bydlęcej, 4 mM glutaminy (Gibco Labs) i 1:100 penicyliny-streptomycyny (Gibco Labs).

Mieszaninę inkubowano przez noc w 37°C w atmosferze z 5% CO2.

B. Obróbka inhibitorami

Przygotowano matrycę kombinacji par związków (patrz tablica S) o stężeniach w zakresie nanomolowym. W dniu 1 porcje po 125 fl inhibitorów dodano do takich samych objętości komórek MT-4 zainfekowanych przez HIV (50 000 komórek/zagłębienie) na płytce do hodowli komórek o 96 zagłębieniach. Inkubację kontynuowano przez 3 dni w 37°C w atmosferze z 5% CO2.

C. Pomiar rozprzestrzeniania się wirusa

Wykorzystując aparat do wielokanałowego pipetowania osadzone komórki ponownie zawieszono i po 125 pi hodowli zebrano na odrębnąpłytkę Antygen p24 HIV oznaczano w supematancie.

Stężenie antygenu p24 HVO oznaczano metodą enzymatycznego testu immunologicznego w sposób następującym. Próbki, w których oznaczano antygen p24 dodawano do mikrozagłębień powleczonych monoklonalnym przeciwciałem specyficznym względem antygenu rdzenia HIV. Mikrozagłębienia przemywano w tym stadium oraz w kolejnych innych odpowiednich etapach. Z kolei dodawano biotynylowane przeciwciało specyficzne względem HIV, a następnie strepawidynę skoniugowaną z peroksydazą chrzanową. Po dodaniu nadtlenku wodoru i tetrametylobenzydyny jako substratu występowała barwna reakcja. · Intensywność zabarwienia jest proporcjonalna do stężenia antygenu p24 HIV.

Stwierdzono, że kombinacje par inhibitorów (patrz tablica) powodują znacznie silniejsze inhibitowanie rozprzestrzeniania się wirusa w porównaniu z każdym z inhibitorów stosowanych pojedynczo oraz w porównaniu ze zsumowanym inhibitowaniem każdego z inhibitorów. Tak, np. stwierdzono, że kombinacja 726 i AZT powoduje silniejsze inhibitowanie rozprzestrzeniania się wirusa w porównaniu z samym 726 lub z samym AZT, albo w porównaniu z sumą inhibitowania przez 726 i inhibitowania przez AZT.

Obróbkę danych wykonywano w sposób następujący: ułamkowe stosunki stężeń inhibitujących (FIC) wyliczano metodąEliona i innych, J. Biol. Chem., 208,477 (1954). Dla różnych kombinacji par wyznaczano minimum sumy FICS będące maksimum synergizmu. Alternatywnie wyliczano średnią sumę FICS stanowiącą średni synergizm. Wyniki podane w tabeli poniżej wskazująna znaczny synergizm w inhibitowaniu rozprzestrzeniania się wirusa. Im mniejsza jest liczba, tym synergizm jest większy.

Tabela

Wyniki obliczeń synergizmu

Kombinacje par	Średni synergizm
726 + 524	0,65
726 + 524 + AZT

* 726 oznacza L-743726 (przykład 6),

524 oznacza N-2(R)-hydroksy-1(S)-indanylo)-2(R)-fenylometylo-4-(S)-hydroksy-5-( 1-(4-(3-pirydylometylo)-2(S)-N'-(tert-butylokarbamoilo)-piperazynylo))pentanoamid.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims (4)

Zastrzeżenia patentowe

1. Kombinacja związków farmakologicznie czynnych do zapobiegania infekcji HIV lub le czenia infekcji HIV lub leczenia AIDS albo ARC, znamienna tym, że stanowi kombinację no wego związku o wzorze I:

i

X.

X w którym:

X oznacza atom chlorowca,

X^I oznacza grupę trichlorowcometylową lub pentachlorowcoetylową;

Z oznacza atom tlenu;

R oznacza:

(a) grupę C_u alkilową, niepodstawioną lub podstawionąprzez A, a A oznacza atom chlo rowca, grupę C3- cykloalkilową, CN, hydroksylową, C_M alkoksylową, C24 alkinylo-C_M alko ksylową, aryloksylową, C_M alkilokarbonylową, nitrową, di(C1- alkilo)aminową, C_M alkilo amino-Ci- alkilową, heterocykliczną lub arylotio;

(b) grupę C24 alkenylową, niepodstawioną lub podstawionąprzez:

(i) A, albo (ii) grupą arylową, niepodstawioną lub podstawioną przez A;

(c) grupę C2.5 alkinylową, niepodstawioną lub podstawioną przez:

(i) A, albo (ii) grupą arylową, niepodstawioną lub podstawioną przez A; albo (d) grupę C34 cykloalkilową, niepodstawioną lub podstawioną przez:

(i) A, albo (ii) grupą arylową, niepodstawioną lub podstawioną A; lub jego dopuszczalnej farmace utycznie soli, lub o wzorze II:

w którym:

X oznacza atom chlorowca,

XI oznacza grupę trichlorowcometylową, pentachlorowcoetylową, C2.5 alkilową, C2- al kinylową, C3.5 cykloalkilową lub arylową;

Z oznacza atom tlenu lub siarki;

176 649

R oznacza:

(a) grapę C_b8 alkilową, niepodstawionąlub podstawioną przez A, a A oznacza atom chlorowca, grupę C₃- cykloalkilową, CN, hydroksylową, C_M alkoksylową, CJ- alkInylo-C_M alkoksylową, aryloksylową, C,- alkilokarbonylową, nitrową, di(C,_2 alkilo)aminową, Cty alkiloamino-C].2 alkilową, heterocykliczną lub arylotio;

(b) grupę C₃- alkenylową, niepodstawionąlub podstawioną przez:

(i) A, albo (ii) grupą arylową, niepodstawioną lub podstawioną A;

(c) grupę C2— alkinylową, niepodstawioną lub podstawioną przez:

(i) A, albo (ii) grupą arylową, niepodstawioną lub podstawioną A; albo (d) grapę C₃_4 cykloalkilową, niepodstawioną lub podstawioną przez:

(i) A, albo (ii) grupą arylową, niepodstawioną lub podstawioną A; lub farmaceutycznie dopuszczalnej soli związku o wzorze II, z inhibitorem proteazy HIV, oraz ewentualnie jednym lub więcej niż jednym analogiem nukleozydu będącym inhibitorem odwrotnej transkryptazy HIV

2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że jako związek o wzorze I lub wzorze II zawiera (-)-6-chloro-4-cyklopropyloetynylo-4-tnfluorometylo-1,4-dihydro-2H-3,1 -benzoksazyn-2-on lub jego dopuszczalną farmaceutycznie sól.

3. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że składa się z (-)-6-chloro-4cyklopropyloetynylo-4-trifluorometylo- 1,4-dihydro-2 i 1-3,1 -benzoksazyn-2-onu lub jego dopuszczalnej farmaceutycznie soli, w kombinacji z N-2(R)-hydroksy-l(S)-mdanylo)-2(R)-fenylometylo-4-(S)-hydroksy-5-(l-(4-(3-pirydylometylo)-2(S)-N'-(tert-butylokarbamoilo)piperazyn ylo))pentanoamidem o wzorze lub jego dopuszczalną farmaceutycznie solą i ewentualnie jednym lub więcej niż jednym analogiem nukleozydu będącym inhibitorem odwrotnej transkryptazy HIV.

4. Kompozycja według załfrz. 3, znamienna tym, że jako analog nukleozyku zziwiera związek wybrany z grupy składającej się z aaedotymldyny (AZT), dldeoksycetydyny (ddC), dldeoksylnozeny (ddl), dlaehydrodeoksytemidyny (d4T), alfabicyklo[2.2.1]-hept-5-en-2-ylo-alfa-fenylo-l-piperydynopropanohi (HEPT), acyklowiru i 3'-fluoro-2',3'-dlaeoksytymi dyny oraz ich dopuszczalnych farmaceutycznie soli.