PL176936B1 - Sposób zwalczania owadów na roślinach i sposób wytwarzania genetycznie transformowanych roślin - Google Patents

Abstract

1. Sposób zwalczania owadów na roslinach, znamienny tym, ze stosuje sie skuteczna ilosc owadobójczej patatyny. 5. Sposób wytwarzania genetycznie transformowanych roslin odpornych na owady i wydzielajacych w wyniku ekspresji owadobójczo skuteczna ilosc patatyny polegajacy na transformacji komórki gospodarza genem kodujacym pozadane bialko, otrzymywaniu trans- formowanych komórek roslinnych oraz regenerowaniu z tych transformowanych komórek ro- slinnych roslin wykazujacych ekspresje owadobójczo skutecznej ilosci patatyny, znamienny tym, ze wstawia sie do genomu komórki roslinnej rekombinacyjna, dwulancuchowa czastecz- ke DNA zawierajaca promotor powodujacy powstawanie w komórkach rosliny sekwencji RNA; strukturalna sekwencje kodujaca patatyne; nietranslowany region 3' powodujacy doda- nie w komórce rosliny nukleotydów poliadenylujacych do konca 3' sekwencji RNA, przy czym promotor jest heterologiczny w odniesieniu do strukturalnej sekwencji kodujacej oraz jest operatywnie polaczony ze strukturalna sekwencja kodujaca, która jest z kolei operatywnie polaczona ze wspomnianym nietranslowanym regionem; przy czym promotor jest heterologi- czny w odniesieniu do strukturalnej sekwencji kodujacej, a rosliny wybiera sie sposród bawelny, kukurydzy, pomidora i ziemniaka. PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazkujest sposób zwalczania owadów na roślinach i sposób wytwarzania genetycznie transformowanych roślin. Wynalazek realizuje się dzięki białku, które można nakładać bezpośrednio na roślinę albo może być ono wytwarzane na niej przez mikroorganizmy lub przez samą roślinę dzięki genetycznej modyfikacji.

Zastosowanie produktów naturalnych, w tym białek, jest dobrze znanym sposobem zwalczania wielu szkodliwych owadów. Np., endotoksyny Bacillus thuringiensis (B. t.) stosuje się do zwalczania zarówno szkodliwych motyli, jak i tęgopokrywych. Geny wytwarzające te endotoksyny wprowadzano i poddawano ekspresji w różnych roślinach, w tym bawełnie, tytoniu i pomidorach.

Istnieje jednak kilka ekonomicznie ważnych szkodliwych owadów, które nie są wrażliwe na endotoksyny B. t.. Przykłady takich ważnych szkodników to ryjkowiec (BWV), Anthonomus grandis i gatunki Diabrotica (CRW). Ponadto posiadanie innych produktów genetycznych do zwalczania owadów podatnych na endotoksyny B. t. jest ważne, a nawet doniosłe, z punktu widzenia problemów uodparniania.

176 936

W roślinach znajduje się kilka innych znanych białek owadobójczych. Obejmują one lektyny, inhibitory amylazy i inhibitory proteazy, które mogąwpływać na wzrost i rozwój owadów po spożyciu w dużych dawkach [Boulter i in., 1989; Broadway i Duffey, 1986; Czapla i Lang, 1990; Gatehouse i in., 1986; Heusing i in., 1991; Ishimoto i K. Kitamura, 1989; Murdock i in., 1990; Shukle i Murdock, 1983), ale nie bywają przyczyną ostrej śmiertelności wywoływanej przez białka B. t.

Celem wynalazkujest zatem wytworzenie takich białek które byłyby zdolne do zwalczania BWV, CRW, lub innych szkodliwych owadów, i geny przydatne do wytwarzania takich białek. Ponadto celem wynalazku było wytworzenie genetycznych konstruktów i sposobu insercji materiału genetycznego do mikroorganizmów i komórek roślinnych.

Odkryto, że patatyny, główne białko magazynowe bulw ziemniaka, zwalczają różne owady, w tym Diabrotica virgifera (WCRW), Diabrotica undecimpunctata (SCRW) i ryjkowca (BWV), Anthonomus grandis. Patatyny zabijają niektóre larwy i wstrzymują wzrost pozostałych, a więc zapobiegają ich dojrzewaniu lub poważnieje opóźniają, co uniemożliwia reprodukcję. Białka te, wykazujące znanąaktywność esterazową(lipidowąactlohydrolazową), można podawać (SCRW), podawać bezpośrednio na rośliny lub wprowadzać w inny sposób, np. stosując kolonizujące rośliny mikroorganizmy przetransformowane tak, aby wytwarzały enzymy, lub poddając podobnej transformacji same rośliny.

Patatyny sąrodzinąbiałek występujących w ziemniakach (Gaillaird, 1971; Racusen, 1984; Andrews i in., 1988) i innych roślinach, szczególnie psiankowatych [Ganal i in., 1991; Vancanneyt i in., 1989]. W ziemniakach patatyny znajduje się głównie w bulwach, ale także w znacznie mniejszej ilości w innych organach rośliny [Hofgen i Willmitzer, 1990]. Badano specyficzność esterazową kilku izozymów patatyny [Hofgen i Willmitzer, 1990; Racusen, 1986].

Geny kodujące patatyny wydzielił uprzednio Mignery i in., 1984, Mingnery i in., 1988, Stiekema i in., 1988 i inni badacze. Rosahl i in., 1987, przenieśli je do tytoniu i zaobserwowali ekspresję patatyny. Pokazuje to, że geny patatyny mogą ulegać ekspresji heterologicznej w roślinach.

Geny patatyn można wydzielić w podobny sposób i wprowadzić do odpowiednich kaset wektorów transformacji, które następnie (1) stosuje się do transformacji kolonizujących rośliny mikroorganizmów, które umieszczone na roślinach pozwalają na ekspresję genów wytwarzających patatynę i w ten sposób zwalczają owady, lub (2) wprowadza się do genomu rośliny, która następnie chroni się sama przed atakiem owadów dzięki ekspresji genu i wytwarzaniu patatyny. Ponadto roślinę można także przekształcić lub wyhodować tak, aby wykazywała współekspresjęjednego lub wielu genów B. t. kodujących białka zwalczające owady. Dzięki temu otrzyma się rośliny, które (1) są zabezpieczone przed wieloma szkodnikami i/lub (2) wykazują dwojakie działanie zwalczające pewne szkodniki, co stanowi ważne narzędzie z punktu widzenia problemów uodparniania. Przykłady roślin transformowanych w celu wykazywania ekspresji genów B. t. opisano w europejskim opisie patentowym nr 0385962, odpowiadającym zgłoszeniu patentowemu Stanów Zjednoczonych Ameryki nr kolejny 476661, złożonemu 12 lutego 1990, [Fischhoff i in.], dołączonemu niniejszym jako odnośnik literaturowy. Ponadto roślinę można także transformować lub hodować tak, aby wykazywała współekspresję genu inhibitora proteinazy, takiego jak kodujący inhibitor papainy ziemniaka [Rodis i Hofff, 1984] lub inhibitor trypsyny soi [przegląd u Ryana, 1990], ponieważ inhibitory proteinaz wykazały wzmacnianie aktywności innych owadobójczych białek.

Przedmiotem wynalazkujest sposób zwalczania owadów na roślinach, polegający na tym, że stosuje się skutecznąilość owadobójczej patatyny. W sposobie korzystnie stosuje się patatynę wytwarzaną przez kolonizujące roślinę mikroorganizmy wytwarzające patatynę po umieszczeniu ich na roślinie. Rośliny korzystnie sąprzetransformowane tak aby wykazywały ekspresję patatyny wytwarzaną dzięki ekspresji genu patatyny wstawionego w roślinę metodą wcześniejszej transformacji genetycznej macierzystej komórki rośliny.

W korzystnym wykonaniu sposobu według wynalazku jako roślinę stosuje się bawełnę, kukurydzę, pomidor lub ziemniak.

176 936

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania genetycznie transformowanych, roślin odpornych na owady i wydzielających w wyniku ekspresji owadobójczo skuteczną ilość patatyny w którym transformuje się komórki gospodarza genem kodującym pożądane białko, otrzymuje się transformowane komórki roślinne oraz regeneruje się z tych transformowanych komórek roślinnych rośliny wykazujące ekspresję owadobójczo skutecznej ilości patatyny, polegający na tym, że wstawia się do genomu komórki roślinnej rekombinacyjną, dwułańcuchową cząsteczkę DN A zawieraj ącąpromotor powoduj ący powstawanie w komórkach rośliny sekwencji RNA; strukturalną, sekwencję kodującąpatatynę; nietranslowany region 3' powodujący dodanie w komórce rośliny nukleotydów poliadenylujących do końca 3' sekwencji RNA, przy czym promotorjest heterologiczny w odniesieniu do strukturalnej sekwencji kodującej orazjest operatywnie połączony ze strukturalną sekwencją kodującą, która jest z kolei operatywnie połączona ze wspomnianym nietranslowanym regionem; przy czym promotorjest heterologiczny w odniesieniu do strukturalnej sekwencji kodującej, a rośliny wybiera się spośród bawełny, kukurydzy, pomidora i ziemniaka.

Korzystnie jako strukturalną sekwencję kodującą stosuje się sekwencję nr id. 30 lub · sekwencję nr id. 31. Jeżeli jako korzystne wykonanie wynalazku jako roślinę stosuje się kukurydzę, korzystną sekwencjąjest strukturalna sekwencję o numerze identyfikacyjnym id. 33.

Korzystnie roślina wykazuje ekspresję patatyny w ilości stanowiącej około 0,1-0,5% całkowitego białka.

W niniejszym opisie, termin „zwalczanie owadów“ oznacza zmniejszanie liczby owadów zmniejszających wydajność roślin, dzięki zwiększonej śmiertelności, opóźnieniu rozwoju larw (zahamowaniu rozwoju), lub obniżeniu zdolności do reprodukcji. W niniejszym opisie, termin „owadobójczy“oznacza zdolny zmniejszenia liczby owadów zmniejszających wydajność roślin, dzięki zwiększonej śmiertelności, opóźnieniu rozwoju larw (zahamowaniu rozwoju), lub obniżeniu zdolności do reprodukcji.

W niniejszym opisie, termin „strukturalna sekwencja kodująca“ oznacza sekwencję DNA kodującą polipeptyd, który można otrzymać w komórce dzięki kolejnej transkrypcji DNa do mRNA, i następnie translacji do żądanego polipeptydu.

W niniejszym opisie, termin „patatyna“ oznacza roślinne białko wykazujące 75% lub więcej homologii do białka kodowanego przez sekwencję nr identyfikacyjny 31, pokazaną dalej, korzystniej co najmniej 80% homologii, a najkorzystnej co najmniej 85% homologii. Termin ten obejmuje także białka wytwarzane przy pomocy syntetycznych sekwencji DNA zaprojektowanych z punktu widzenia polepszonej ekspresji w roślinach jednoliściennych.

Patatyny są rodziną esteraz występujących w ziemniakach (Gaillaird, 1971; Racusen, 1984; Andrews i in., 1988) i innych roślinach, szczególnie psiankowatych [Ganal i in., 1991; Vancanneyt i in., 1989]. W ziemniakach patatyny znajduje się głównie w bulwach, ale także w znacznie mniejszej ilości w innych organach rośliny [Hofgen i Willmitzer, 1990]. Badano specyficzność esterazową kilku izozymów patatyny [Hofgen i Willmitzer, 1990; Racusen, 1986] i stwierdzono ich szeroką specyficzność na substrat, wskazującą na ograniczone wymagania enzymów wobec substratów. Stosowanie wszystkich pochodzących z roślin patatyn i ich równoważników, zarówno opisanych tutaj szczegółowo, jak i białek homologicznych, niezależnie od pochodzenia z naturalnych czy syntetycznych sekwencji DNA, do celów zwalczania plag owadów na roślinach mieści się w zakresie wynalazku.

Surowe preparaty patatyny z ziemniaków są dostępne w handlu. Np. Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, oferuje preparaty białka ziemniaka określane przez firmę jako kwaśna fosfataza (P-1146 i P-3752) lub apiraza (A-9149). Można także wytworzyć ekstrakty białka z bulw ziemniaczanych sposobami opisanymi w literaturze (Racusen i Foote, 1980; Park i in., 1983).

Testy skuteczności biologicznej

Testy biologiczne przy diecie sztucznej

Przeprowadzono testy aktywności wobec larw SCRW, BWV, stonki ziemniaczanej (CPB), Leptinotarsa decemlineata, i europejskiego gatunku Ostrinia nubilalis (ECB) nakładając badaną próbkę na pokarm agarowy, podobnie jak opisał dla SCRW Marrone i in., 1985. Badane próbki

176 936 wytworzono rozpuszczając białko w 4-5 ml 10 mM HEPES, pH 7,5, i dializując w tym samym buforze stosując układ rurek odcinających przy masie cząsteczkowej 3500. Świeżo wylęgnięte larwy karmi się pokarmem z próbkąw temperaturze 26°C i bada śmiertelność oraz zahamowanie rozwoju po 5 lub 6 dniach. Wyniki testów P-3752 (Sigma) podano w tabeli 1. Ten surowy preparat ziemniaczany wykazał szerokie spektrum działania owadobójczego.

Tabela 1

Ilość	% Śmiertelności/Zahamowania rozwoju’
SGRW	BWV	CPB	ECB
0,01X	0	11	0	0
0,03X	0*	20’	0	13
0,10X	19**	20»»	6	0»
0,30X	*»_»»» 6	46»u	13»	6»
1,00X	··· 6	73”»	13»»	6»»

= nieznaczne zahamowanie rozwoju (około 30-40% zmniejszenie rozmiarów) _t(= umiarkowane zahamowanie rozwoju (około 50-80% zmniejszenie rozmiarów) = ostre zahamowanie rozwoju (ponad 90% zmniejszenie rozmiarów)

Dokonano dokładnych ważeń SCRW (tabela 2) po 5 dniach testu i ECB (tabela 3) po 6 dniach testu i przedstawiono je poniżej. Larwy SGRW rozwijające się na pokarmie zawierającym P-3752 wykazały 92% zmniejszenie masy w porównaniu z kontrolnymi, a larwy ECB wykazały 62% Zmniejszenie masy w porównaniu ' z kontrolnymi.

Tabela 2

Obróbka	śred. masa przeżywających (SEM)	% zmniejszenia masy	% śmiertelności
Tris	4,00 mg (0,60)’	—poziom kontrolny—
P-3752	0,30 mg (0,03)’	92	6

średnia masa przeżywających znacząco różna na poziomie 95% (jeden czynnik ANOYA).

Tabela 3

Obróbka	śred. masa przeżywających (SEM)	% zmniejszenia masy	% śmiertelności
Tris	5,39 mg (0,49)’	—poziom kontrolny—
P-3752	2,05 mg (0.27)’	62	7

średnia masa przeżywających znacząco różna na poziomie 95% (jeden czynnik ANOYA).

Białkową naturę składnika owadobójczego P-3752 aktywnie działającego na SCRW i BWV określono dzięki nietrwałości na ogrzanie, wytrącanie siarczanem amonu, frakcjonowanie względem masy cząsteczkowej i eksperymenty z podatnością na proteazę.

Aby potwierdzić, że działanie P-3752jest bezpośrednio związane ze spożyciem patatyny, a nie jest pośrednim efektem reakcji na pokarm, przeprowadzono studium doboru pokarmu z ECB i SCRW. Wyniki tego studium wskazują, że larwy spożywały pokarm zarówno z P-3752, jak i Tris, bez wyraźnych preferencji. Nie zauważono unikania pokarmu z P-3752 w porównaniu z pokarmem z Tris.

176 936

Długoterminowy (25 dni) test działania P-3752 na SCRW wykorzystywał larwy po 2 wylince i kilkakrotne przenoszenie przeżywających owadów na świeżo poddany obróbce pokarm. Na koniec studium wszystkie larwy kontrolne przeszły w poczwarki. W przeciwieństwie do tego 50% larw po zabiegu nie żyło, a pozostałe 50% zwiększyło masę ciała tylko o 16% początkowej (2,48 mg wobec 2,14 mg). Wskazuje to na zatrzymanie, a nie tylko spowolnienie rozwoju larw. Jest to bardzo ważne z punktu widzenia zwalczania owadów, ponieważ larwy nie osiągają dojrzałości. Liczba Diabrotica undecimpunctata będzie mniejsza w przyszłych pokoleniach.

Larwy Diabrotica virgifera (WCRW) można stosować w laboratoryjnych eksperymentach tylko w stanie po 2 wylince. W celu zbadania działania P-3752 na WGRW zaprojektowano równoległy test z użyciem larw SCRW po 2 wylince. Działanie P-3752 spowodowało tylko odpowiednio 13% i 11% przyrostu masy larw po 2 wylince SCRW i WcRw. Kontrolne larwy SCRW zwiększyły masy o 474%, a WCRW o 200% w ciągu 7 dni. Wskazuje to, że» aktywność patatyny wobec WCRW i SCRW jest w przybliżeniu jednakowa.

P-3752 wykazywał niewielką aktywność wobec Heliothis virescens (TBW), Spodoptera exigua (BAW), Helicoverpa zea, Pectinophora gossypiella i Manduca sexta, dając wskaźnik zahamowania rozwoju od 1 to 1,5 przy tych smych stężeniach, przy których SCRW wykazywał wskaźnik zahamowania rozwoju 3. P-3752 dał wskaźnik zahamowania rozwoju 2,5 dla Agrotis ipsilon. (Wskaźniki zahamowania rozwoju zdefiniowano powyżej w tabeli 1.) Nie wykazał aktywności wobec mszycy Myzus persicae w badanych stężeniach.

Testy biologiczne przy diecie roślinnej (1) Ziemniak: 1 g surowego P-3752 rozpuszczono w 4 ml 25 mM Tris, bufora o pH 7,5, następnie dializowano i przesączono przez membranę 0,2 gm. Dodano Triton®X-100 w celu utworzenia roztworu 0,1%. Liście ziemniaków zanurzono w preparacie enzymu i umieszczono na zwilżonym sączku bibułowym w szalce Petriego. Dodano larwy CPB i szalki poddano inkubacji w temperaturze 27°C przez 3 dni. Obróbka liści ziemniaka P-3752 pozwoliła na zahamowanie rozwoju i spowolnione odżywianie larw CPB. Na końcu testu, znacznie mniej tkanki listnej pozostało na liściach kontrolnych w porównaniu z traktowanymi P-3752.

(2) Kukurydza i bawełna: Callus czarnej meksykańskiej słodkiej kukurydzy (BMS) lub bawełny zdjęto z płytek agarowych i przeniesiono do 50 ml probówek do wirownia. Callus odwirowano w wirówce klinicznej IEC przez 5 minut przy nastawie 8 i supernatant zdekantowano. Do probówki o pojemności 50 ml zawierającej 15 ml granulek calłusa dodano 30 ml ciekłego 2% agaru. Po starannym zmieszaniu pokarm pipetowano na miejsce testu biologicznego owadów. Pokarm pokryto dializowanym P-3752 (20% objętościowych) i test prowadzono tak, jak opisano powyżej.

Ucięte korzenie i pędy kukurydzy nasączono pod zmniejszonym ciśnieniem (nas.) surowym P-3752 lub 25 mM Tris, buforem o pH 7,5. Próbkę kontrolną zanurzono w buforze Tris. W studzienkach umieszczono około 10-15 kawałków korzenia lub 3 kawałki pędu na płytce do hodowli z 24 studzienkami, co powtórzono 4 razy. Do każdej studzienki dodano cztery właśnie wylęgnięte larwy SCRW. Testowe płytki poddano inkubacji w temperaturze 26°C przez 4 dni, po czym określono śmiertelność i przeciętnąmasę larwy. Wyniki testów pokazano w tabeli 4.

Tabela 4

tkanka nas. korzenie	owad	% śmiertelności	% spadku masy
1	2	3	4
kukurydzy	SCRW	90	44
nas. pędy
kukurydzy	SCRW	51	52

176 936 cd. tabeli 4

1	2	3	4
callus BMS po obróbce	SCRW	24	51
callus BMS po obróbce	WCRW	0	23
callus BMS po obróbce	ECB	0	33
callus bawełny po obróbce	BVW	60	brak danych

Tak więc działanie owadobójcze na wszystkie cztery gatunki (SCRW, BWV, CPB, i ECB) zachowuje się, gdy P-3752jest spożywany razem z tkanką rośliny. Powyższe studia pokarmowe wykazują, że patatyny są aktywne owadobójczo w testach pokarmów, których składniki są wyłącznie tkanką roślinny (korzenie, pędy, callus lub liście).

Badania sposobu działania

Poniższe badania sugerują, że patatyna, owadobójczo aktywny składnik P-3752, oddziaływuje bezpośrednio na owada i że działanie ukazane w doświadczeniach opisanych powyżej nie może być przypisane działaniu składnika aktywnego na pokarm owada przed spożyciem.

Studium wpływu pokarmu

Rozpuszczono 1 g P-3752 w 10 ml 25 mM Tris, bufora o pH 7,6, następnie dializowano go w układzie rurek MWCO 12-14000 wobec tego samego bufora. Po filtracji 0,2 μη, porcje 50 pl dodano do studzienek z pokarmem owada na dwu płytkach na 4 dni przed dodaniem owadów. Obie płytki poddano inkubacji w temperaturze 27°C przez 4 dni. Po inkubacji, jedną płytkę ogrzano do temperatury 80°C przez 1 godzinę w celu deaktywacji enzymów. Na trzecią płytkę nałożono porcje 50 pl. Do testu z SCRW wykorzystano więc płytki inkubowane, inkubowane i ogrzane oraz nieinkubowane.

Aktywność wobec SCRW w studium preinkubacyjnym była następująca: nieinkubowane P-3752 - 6*** inkubowane P-3752 - 0** inkubowane, ogrzewane P-3752 - 0

Chociaż część aktywności uległa utracie w czasie inkubacji pokarmu, całkowitąutratę spowodowało ogrzewanie. Dane te są zgodne z teorią bezpośredniego działania po spożyciu, a rozpatrywane w połączeniu z testami z tkanką roślinną i zmiennością działania wobec różnych owadów wskazują, że działanie białka na SCRW i inne owady nie polega na efekcie pokarmowym.

Identyfikacja białka

Składnik owadobójczo aktywny z P-3752 oczyszczono, częściowo sekwencjonowano, i scharakteryzowano. Czynniki aktywne zidentyfikowano jako patatynę, rodzinę lipidowych acylohydrolaz z ziemniaka.

Wydzielenie białka

W celu oczyszczenia bioaktywnego wobec SCRW składnika P-3752 zastosowano cztery różne protokoły.

Oczyszczanie aktywnego wobec SCRW składnika metodą chromatografii anionowymiennej. Aktywny wobec SCRW składnik z P-3752 oczyszczono metodą chromatografii anionowymiennej na Q-Sepharose (Pharmacia), a następnie na MONO-Q (HR 5/5, Pharmacia). Ilości białka w aktywnych wobec SCRW frakcjach wskazały, że zaobserwowane ** zahamowanie rozwoju osiągnięto przy stężeniu białka w pokarmie wynoszącym 31 ppm. Chromatografia SDS-PAGE wskazała, że w aktywnych frakcjach były obecne 3 główne pasma białka (M_r 42000, ~26000 i ~ 16000).

176 936

Pięcioetapowe oczyszczanie aktywnego wobec SCRW składnika - Zastosowano 5 kolejnych etapów oczyszczania aktywnego wobec SCRW składnika z P-3752. Było to odsiewanie na membranie, wytrącanie siarczanem amonu, chromatografia jonowymienna na Q-Sepharose, chromatografia jonowymienna na S-Sepharose i chromatografia z wykluczaniem rozmiarów na P-200. Chromatografia SDS-PAGE najczystszych aktywnych wobec SCRW frakcji wykazała pasma białka Mr 42000, ~26000 i ~ 16000.

Oczyszczanie bioaktywnego składnika metodą ogniskowania izoelektrycznego - Bioaktywnych wobec SCRW białka ziemniaka oczyszczono w dwu kolejnych przebiegach na frakcjonatorze białek RF3 (Rainin) zgodnie z instrukcją producenta. Profil uzyskany metodą SDS-PAGE aktywnych wobec SCRW frakcji był bardzo podobny do profilu obserwowanego dla aktywnych frakcji z 5-etapowego oczyszczania i anionowymiennego oczyszczania. Metoda IEF na żelu wykazała, że białka ulegają frakcjonowaniu przy pH od 4,6 to 5,1, zgodnie z publikowanym zakresem pl dla patatyny (Racusen i Foote, 1980).

Zastosowano kolejne ogniskowania izoelektryczne na RF3 w wąskim zakresie pH (4-5) w próbie rozdzielenia izozymów patatyny. Zgodnie z oczekiwaniami pik frakcji bioaktywnych zauważono u białek o pl 4,6-5,1. Frakcje te mająodrębny układ izozymów i inne zawartości składnika bioatywnego. Bioaktywność we frakcjach wahała się od zerowej śmiertelności do **** zahamowania rozwoju przy dawkach 80-512 ppm. Niektóre z bioaktywnych frakcji majątylko 2 główne izozymy, co wskazuje, że bioktywność nie wymaga złożonego wzoru izozymów.

Oczyszczanie metodą rodzimą. PAGE - P-3752 poddano elektroforezie w rodzimych warunkach i wydzielono tryplet pasm o aktywności esterazy (stosując octana-naftylujako substrat). Oczyszczona na żelu substancja esterazowa wskazywała aktywność wobec SCRW dając zahamowanie rozwoju 1,5*. Chromatografia SDS-PAGe substancji wykazała główne pasma dla Mr 42000, ~26000 i ~16000, co jest profilem obserwowanym już przy innych oczyszczaniach. Potwierdza to dodatkowo, że patatyna jest owadobójczą substancją z ziemniaka.

Sekwencje aminokwasowe

NH2-terminalną sekwencję amihokwasową otrzymano dla wszystkich białkowych pasm (Mr 42000, ~26000 i ~16000) w aktywnej wobec SCRW frakcji z oczyszczania anionowymiennego i oczyszczania pięcioetapowego. Ogólnie, dane sekwencyjne wygenerowano dla wszystkich pasm aktywnych frakcji. Większość pasm wykazała >85% homologii z 15-aminokwasową sekwenciąna końcu NH2 (sekw. nr id. 1) lub wewnętrzną sekwencją (sekw. nr id. 7) izozymu patatyny (Stiekema i in., 1988). Jedno z pasm 7 kD wykazało 75% homologii z początkowymi ośmioma aminokwasami opublikowanej sekwencji NH2-teminalnej patatyny. Inne pasmo 7 kD wykazało >85% homologii z początkowymi ośmioma aminokwasami opublikowanej sekwencji wewnętrznej. Pasma te reprezentująproteolizowane produkty patatyny. Na obecność izozymów jasno wskazuje zmienność aminokwasów w pozycjach 1 i 3 zarówno dla NH2-terminalnej, jak i wewnętrznej sekwencji.

opubl. sekw.: (sekw. nr id. 1) pasmo 1 (42 kD):

(sekw. nr id. 2) pasmo 2 (28 kD):

(sekw. nr id. 3) pasmo 3 (26 kD):

(sekw?. nr id. 4) pasmo 4 (24 kD):

(sekw. nr id. 5) pasmo 5a(17 kD) (sekw. nr id. 6)

N-terminalna sekwencja aminokwasowa KLEEMVTVLSIDGGG

XLGMVTVI^SIf^(](^G

T L G Μ V Τ V L SID G G G

T L G Μ V Τ V L SID G G G

KLXMVTVLSIDGGG

XXEEMVT

176 936

Wewnętrzna sekwencja (pozycja aminokwasowa 224) opubl. sekw.: (sekw. nr id. 7)

Pasmo 5b (17 kD) (sekw. nr id. 8) Pasmo 6 (16 kD):

(sekw. nr id. 9) Pasmo 7 (15 kD):

(sekw. nr id. 10)

SLDYKQMLLLSLGTG KLDYKQML SLXYKQMLLL SLGTG SLNYKQMLLLSLGTG

Aktywność esierazowa

Wykonano kilka doświadczeń w celu zbadania the esterazowej aktywności we frakcjach aktywnych wobec SCRW.

Substrat - octan α-naftylu: Wykorzystano chromatografię SDS-PAGE (10-20%) do określenia, czy frakcje aktywne wobec SCRW (z 5-etapowego oczyszczania) wykazywały aktywność esterazową [Racusen, 1984]. Na dwie jednakowe porcje żelu nałożono ogrzewane i nieogrzewane frakcje aktywne wobec SCRW. Zaobserwowano pojedyncze esterazopozytywne pasmo w nieogrzewanej próbce przy Mr 55000.

Próbka ogrzewana wykazała oryginalne pasmo Mr 42000 i jednoczesną nieobecność pasma 55000. Wynik tenjest zgodny z doniesieniami literaturowymi na temat elektroforetycznej ruchliwości frakcji aktywnych esterazy patatyny (Racusen, 1984). Pasma Mr 55000 nie zaobserwowano w ogrzanej próbce, co wskazuje, że obróbka cieplna SDS eliminuje aktywność esterazową. Pod nieobecność pasma Mr 55000 w ogrzanej próbce oryginalne pasmo Mr 42000 zaobserwowano przy pomocy barwienia barwnikiem coomassie.

Studium specyficzności substratup-nitrofenylowego: Zbadano serię estrów p-nitrofenylowych (estry C-2, C-4, C-6, C-8, C-10, C-12, C-14, i C-16) w celu określenia specyficzności substratu. Estry nitrofenylowe C-8 i C-10 były w porównaniu z innymi konsekwentnie najlepszymi substratami dla esterazowej aktywności większości badanych patatyn.

Substraty - estry lipidowe: Oczyszczoną frakcję aktywną wobec SCRW (z 5-etapowego oczyszczania) przetestowano pod względem zdolności do hydrolizowania kilku lipidów. Każdy lipid rozpuszczono i inkubowano z porcją oczyszczonej frakcji aktywnej wobec SCRW. Próbki zanalizowano metodąchromatografii cienkowarstwowej rozwij aj ąc układem trzech rozpuszczalników (Pemes i in., 1980). Cztery lipidy wykazały w tej analizie znaczące modyfikacje. Była to oleilolizolecytyna, dioleilo-L-a-fosfatydylocholina, 1-monolinoleilo-rac-gliceryna i dioleina (Sigma). Nowa plamka w analizie cienkowarstwowej przy Rf 0,37 dla ekstraktu organicznego mieszaniny reakcyjnej lipid/aktywna frakcja zidentyfikowano jako wolny kwas tłuszczowy przez porównanie ze standardami kwasu tłuszczowego linolowego i oleinowego. Tak więc substancja aktywna wobec SCRW wykazuje działanie esterazowe na te cztery estry lipidów.

U sunięto j elita cienkie WCRW z larw po trzeciej wylince karmionych korzeniami kukurydzy. Lipidy z jelit ekstrahowano, rozpuszczono i inkubowano w warunkach pH jelita (pH 6,55) z oczyszczoną frakcją aktywną wobec SCRW. Próbki zanalizowano metodą chromatografii cienkowarstwowej w wyżej opisany sposób. Oczyszczona frakcja aktywna wobec SCRW wykazała aktywność esterazową wobec lipidów z jelita WCRW przy pH jelita. Ilustruje to przypuszczalny sposób owadobójczego działania patatyny.

Alternatywne źródła patatyny

Ponieważ wszystkie początkowe doświadczenia prowadzono z P-3752, handlowo dostępnym preparatem enzymowym (Sigma) z bulw ziemniaka Minnesota Russet var. Kranz, pożądane było wykazanie, że owadobójczo aktywne patatyny można odzyskać ze świeżej tkanki bulw ziemniaka. Ekstrakty bulw wytworzono dokładnie w sposób opisany w literaturze (Racusen i Foote, 1980; Park i in., 1983). Zbadano trzy handlowo dostępne odmiany S. tuberosum (Russet, Desiree, i LaChipper) i siedem dzikich gatunków (S. kurtzianum, S. berthaultii, S. tarijense, S. acaule, S. demissum, S. cardiophyllum i S. raphanifolium, wszystkie z Inter-Regional Potato Introduction

176 936

Station, USDA, ARS, Sturgeon Bay, WI). Wszystkie ekstrakty zawierały patatynę zgodnie z testami SDS-PAGE i Western biot; wszystkie zawierały esterazę zgodnie z testem esterazowym C-10 i wszystkie wykazywały działanie owadobójcze wobec SCRW, to jest wskaźnik zahamowania rozwoju 2-3. Patrz tabela 5. Wynika z tego, że owadobójczo aktywne patatyny można wydzielić z bulw kilku gatunków i wielu członków tej całej klasy białek może wykazywać owadobójcze właściwości.

Tabela 5

gatunki	[Białko] (mg/ml)	ΔΟ. D./minml	SCRW“
IX	0,1X
S. acaule	26,6	82500	2	1
S. berthaultii	23,1	29	3	1
S. cardiophyllum	14,6	89	2,5	1,5
S. demissum	35,3	375000	3	1,5
S. kurtzianum	25,0	2700	2,5	1
S. raphanifolium	33,7	3725	3	2
S. tarijense	27,2	1008	2,5	1

“Aktywność wobec SCRW wyrażono w kategoriach zahamowania rozwoju larw:

= słabe zahamowanie rozwoju (zmniejszenie rozmiarów 30-40%), = umiarkowane zahamowanie rozwoju (zmniejszenie rozmiarów 50-80%), = ostre zahamowanie rozwoju (zmniejszenie rozmiarów >90%).

Ekstrakty S. berthaultii, S. kurtzianum i S. tarijense poddano biologicznym testom wobec dwu innym owadom, CPB i ECB. Dane testowe podsumowano poniżej w tabeli 6. Stwierdzono słabe działanie tych ekstraktów na CPB, a u larw ECB umiarkowane do ostrego zahamowanie rozwoju przy dawce 1X. Jednak larwy ECB sąnieco mniej wrażliwe na te ekstrakty ziemniaka w porównaniu z larwami SCRW, na co wskazuje całkowity brak działania na EBC przy dawce 0,1X.

Tabela 6

Gatunek	CPB“	ECB“
IX	0,1X	IX	0,1X
S.berthaultii	0	0	3	0
S. kurtzianum	1	0	2,5	0
S. tarijense	0	0	3	0

“Zahamowanie rozwoju larw

Genomowy DNA z dziewięciu różnych roślin poddano testowi metodąanalizy Southern na białka homologiczne z patatyną. Plamki Southern z sondą znaczoną a-³²P sekwencji nr id. 11 wskazały na istnienie homologicznych sekwencji w kilku innych gatunkach roślin. Silne sygnały otrzymano dla kukurydzy, pomidora, buraka cukrowego, ryżu i ziemniaka. Indywidualne pasma nie nadawały się do rozdzielenia w tym doświadczeniu, jednak rozmiar plam i ich intensywności były podobne dla wszystkich tych gatunków. Słabsze sygnały otrzymano także dla cukini, soi i kanoli, a pojawiły się one jako mała liczba pojedynczych pasm w DNA z każdego gatunku. Ogórek i Arabidopsis nie wykazały wykrywalnej hybrydyzacji z sondą patatynową w warunkach

176 936 tego doświadczenia, być może wskutek niewielkiej ilości użytego DNA na co wskazywało zabarwienie żelu bromkiem etydyniowym.

Fachowiec może łatwo wytworzyć sekwencje DNA tych homologicznych białek i wprowadzić je do roślin lub innych organizmów znanymi środkami. Owadobójcze właściwości takich białek można najlepiej przetestować po heterologicznej ekspresji, np. z wirusa pałeczkowatego lub E. coli. Tak więc inne białka, które można stosować w sposobie według wynalazku można otrzymać po zwykłej liczbie eksperymentów stosując znane sposoby, a następnie stosować do zapewniania roślinom ochrony przed plagą owadów.

Identyfikacja genetyczna

Geny dla patatyn klonowało kilku badaczy. Sekwencję opisanąprzez Mignery i in., 1984, określono nazwą GM203. Zawierała ona niekompletną sekwencję sygnałową. Mignery i in., 1988, zidentyfikowali genomowy klon, oznaczony P520, obejmujący GM203 i zawierający kompletną sekwencję sygnałową. Sekwencję nr id. 11 skonstruowano z sekwencją sygnał owąP520 i kodującącDNA część GM203, dalej określanąjako PatA+. Zawiera także miejsce restrykcji an Ncol i miejsce EcoRI zaraz za kodonem zakończenia translacji.

Solanum tuberosum odmiana Russet Burbank

Dwadzieścia łańcuchów cDNA wydzielono z bulw ziemniaka odmiany Russet Burbank i sekwencjonowano. Wydedukowane sekwencje aminokwasowe pokazują, że te cDNA kodująjedenaście różnych izozymów patatyny. Jedenaście białek wykazuje od około 82% do 100% identyczności z PatA+, sekw. nr id. 11, z różnicami występującymi na różnych pozycjach na długości cDNa. Sekwencje dla jedenastu różnych reprezentatywnych cDNA kodujących jedenaście różnych izozymów patatyn nazywają się w sposób podany w tabeli 7. Sekwencje cDNA poddano obróbce procedurami PCR stosując jako primery sekwencje nr id. 26 i nr id. 27, odpowiadające nukleotydom 5' kodującym kilka pierwszych kodonów sekwencji sygnałowej i końcowi 3' sekwencji kodującej, dla potrzeb dalszych klonowań. Symbol „+“ wskazuje, że na zawieranie rodzimej sekwencji sygnałowej. Niektóre cDNA nie zawierają kompletnej rodzimej kodującej sekwencji sygnałowej i tylko sekwencję kodującądojrzałe białko otrzymano przy pomocy podobnej procedury PCR stosując primery z sekwencji nr id. 32 i nr id. 27. Oznaczono je dolnym indeksem „m“.

Tabela 7

Izozym	nr id. sekwencji
PatA+	sekw. nr id. 11
PatAm	sekw. nr id. 14
PatB+	sekw. nr id. 16
PatC+	sekw. nr id. 17
PatDra	sekw. nr id. 18
PatE+	sekw. nr id. 19
PatEm	sekw. nr id. 20
PatFm	sekw. nr id. 21
PatG+	sekw. nr id. 22
PatHra	sekw. nr id. 15
PatIm	sekw. nr id. 23
PatL+	sekw. nr id. 24
PatM+	sekw. nr id. 25

176 936

Solasram berthaultii

Sekwencje cDNA patatyn z diploidalnego ziemniaka S. berthaultii wydzielono metodąodwrotnej transkrypcji mRNA bulwy, a następnie PCR z primerami o sekwencjach nr id. 26 i nr id. 27, opisanych powyżej. Przeprowadzono wiele niezależnych reakcji PCR, aby uniknąć wydzielania duplikowanych klonów wskutek procesu wzmacniania.

Częściowo sekwencjonowano łącznie 14 cDNA patatyn. Wszystkie sekwencje cDNA (nazwane Patl do Pat14) wydają się mieć unikalne sekwencje nukleotydowe, co sugeruje, że co najmniej 14 różnych mRNA patatyn ulega ekspresji w bulwach S. berthaultii. Sekwencjądla Pat3+ jest sekwencja nr id. 28. Sekwencjądla Pat10+jest sekwencja nr id. 29. Wydedukowana sekwencja aminokwasowa pokazuje, że 14 cDNA kodująco najmniej 11 różnych białek. Ogólnie, sekwencje cDNA z bulw S. berthaultii były bardzo podobne. Tylko 12 pozycji aminokwasów na 367 reszt (3%) wykazało zmienność sekwencji. Reszty aminokwasowe obecne w każdej z tych pozycji pokazano w tabeli 8. Na 5 z tych pozycji istnieje tylko pojedynczy wariant klonu z unikalną resztą. Zmiany te mogą odzwierciedlać rzeczywiste różnice pomiędzy mRNA lub wynikać z błędów procesu PCR. W pozostałych 7 pozycjach zmienność była większa; co najmniej dwa cDNA miały alternatywny aminokwas. Każdy z 9 różnych grup sekwencji aminokwasowych miała różny wzór reszt w tych siedmiu pozycjach. W pewnych przypadkach zmiany były konserwatywne, takie jak zmiana Tre na Ser w pozycji 164. W innych przypadkach występowały znacznie istotniejsze różnice, takie jak wprowadzenie proliny w pozycji 148.

Tabela 8 cDNA Pozycje różnic aminokwasowych

89

96

106

113

120

123

148

164

187

200

PAT3+

GLN

LEU

GLN

TYR

GLU

WAL

ALA

ALA

TRE

ASP

ASP

PAT4+

GLN

SER

ASP

HIS

GLU

WAL

ALA

PRO

SER

ASP

WAL

PAT5+

GLN

SER

ASP

HIS

GLU

WAL

ALA

PRO

TRE

ASP

ASP

PAT7+

GLN

LEU

GLN

TYR

GLU

WAL

ALA

ALA

TRE

ASP

ASP

PAT8+

LIZ

SER

GLI

TYR

LIZ

WAL

ALA

PRO

TRE

ASP

ASP

PAT9+

LIZ

SER

ASP

TYR

LIZ

WAL

ALA

PRO

TRE

ASP

ASP

PAT10+

GLN

SER

ASP

HIS

GLU

WAL

TRE

PRO

TRE

ASP

ASP

PAT11+

GLN

SER

ASP

HIS

GLU

ALA

ALA

ALA

TRE

ASP

ASP

PAT 12+

GLN

SER

GLI

HIS

GLU

WAL

ALA

ALA

TRE

ASP

ASP

PATA+

HIS

-

SER

-

TYR

GLU

WAL

ALA

ALA

TRE

GLU

ASP

Solanum cardiophyllum

Dziesięć klonów cDNA wygenerowano metodą PCR stosując mRNA wydzielony z bulw Solanum cardiophyllum w sposób opisany powyżej. Otrzymano sekwencję nukleotydową co najmniej 75% długości każdego klonu. Pełnej długości sekwencją. klonu nazwanego Pat17+jest sekwencja nr id. 30. Sekwencja nr id. 31 jest otrzymaną inżynieryjnie formą dojrzałą, Pat17_m. Klony S. cardiophyllum były prawie identyczne, tylko z przypadkowymi zmianami sekwencji nukleotydowych, które mogły być różnicami rzeczywistymi lub błędami PCR. Jednak w pozycjach 54 i 519 zaobserwowano kilka klonów z identycznymi zmianami, co sugeruje, że nie sąone związane z procesem wzmacniania. Wzory nukleotydów w tych pozycjach wskazały, że reprezentują one co najmniej 4 różne mRNA. mRNA dwu z tych grup wyizolowano kilkakrotnie, a mRNA dwu pozostałych tylko raz w tym zestawie klonów cDNA.

Wydedukowane sekwencje aminokwasowe klonów S. cardiophyllum były także niezwykle podobne. Wystąpiło 8 unikalnych grup sekwencji aminokwasów, każda różniąca się od in176 936 nych sekwencji jedną resztą. Klony cDNA kodujące sekwencję aminokwasową identyczną z sekwencjąPat 17+ uzyskano dwu&rotaie, a f^c^^c^^’ćłłe 7 cDNA (Pat18+, 19+, 20+, 21+, 22+, 23+ i 24+) zawierały jedną unikalną resztę.

Przykład realizacji sposobu wytwarzania genetycznie transformowanych roślin

Transformacja genetyczna

Jak opisano powyżej, geny patatyny można wydzielić z różnych źródeł roślinnych. Jeden lub więcej takich genów można następnie zastosować do transformacji komórek bakteryjnych lub roślinnych, aby umożliwić wytwarzanie patatyny.

Przykład dokonywania tego przy pomocy różnych sekwencji patatyny podano poniżej.

Wytwarzanie cDNA patatyny

W celu włączenia genu patatyny w wektory odpowiednie dla ekspresji patatyny w heterologicznych komórkach gospodarza, konieczne było wprowadzenie odpowiednich miejsc restrykcji w pobliżu końców genu. Celem mutagenezy było utworzenie kasety obejmującej sekwencję kodującą białko z minimalnymi niekodującymi sekwencjami flankującymi i włączenie przydatnych miejsc restrykcji w celu zmobilizowania kaset. Kasety zaprojektowano tak, aby pozwalały na mobilizację nietkniętej sekwencji kodującej wraz z peptydem sygnałowym lub tylko dojrzałej sekwencji kodującej. Dla PatA_m zaprojektowano dwa primery mutagenezy w celu stworzenia takich kaset. Mutageneza sekwencją nr id. 12 spowodowała podstawienie dwu aminokwasów (metionina-alanina) za lizynę naN-końcu dojrzałego białka i wprowadzenie miejsca Ncol, a sekwencja nr id. 13 dodała drugi kodon terminacji i miejsce EcoRI.

Powstałą zmodyfikowaną sekwencję zidentyfikowano jako PatAm sekw. nr id. 14. Dla wszystkich innych cDNA dokonano podobnych modyfikacji i wprowadzenia miejsc restrykcji z zastosowaniem metody PCR i albo primerów z sekwencji nr id. 26 i sekwencji nr id. 27, albo primerów z sekwencji nr id. 32 i ' sekwencji nr id. 27, jak opisano poprzednio.

Ekspresja patatym w E. coli

Sekwencję kodującą DNA dla PatAm (sekwencja nr id. 14) wprowadzono do pMON5766, wektor ekspresji E. coli pochodzący z pBR327 (Soberon i in., 1980) z promotorem recA i sekwencjąpoczątkowąG10 (Olins i in, 1989). Powstały wektor, pMON 19714i zostoi zmobiiizowany w szczepie E. coli JM 101, który następnie wytworzył PatAm, co potwierdziła analiza Western i działanie esterazowe na p-nitrofenylowy ester C-10. Sekwencję kodującąDNA dla Pat 17m, a także dla PatAm wprowadzono w wektor ekspresji E. coli pochodzący z pMON6235 z promotorem AraBAD (indukowalny, gdy komórki hodowano w arabinozie), sekwencję początkową G10 i gen znacznikowy oporności na ampicylinę. Powstałe wektory, pMON25213, zawierający Pat17m, oraz pMON25216, zawierający PatAm, wprowadzono w szczep JM101 E. coli.

Patatyna ulega ekspresji w transformowanej E. coli; jednak gromadzi się ciałkach załamujących światło (RB). W testach SCRW zastosowano nietknięte komórki i rozpuszczone RB. Wyniki pokazano w tabeli 9.

Tabela 9

Próbka (pMON)	Rep	nietknięte komórki aktywność SCRW1	rozpuszczone RB aktywność SCRW1
19714 Am	1	2,5	nie badane
	2	1,5	1,0
25216 Am	1	1,0	0
	2	0	1,0
25213 17m	1	3,0	3,02
	2	1,5	0,5

'Aktywność wobec SCRW wyrażono w kategoriach zahamowania rozwoju larw:

= słabe zahamowanie rozwoju (zmniejszenie rozmiarów 30-40%), = umiarkowane zahamowanie rozwoju (zmniejszenie rozmiarów 50-80%), = ostre zahamowanie rozwoju (zmniejszenie rozmiarów >90%). śmiertelność w tej próbce wynosiła 81%.

Ekspresja patatyn w bakteriach kolonizujących rośliny

Przy zwalczaniu owadów może być pożądana ekspresja jednej lub wielu patatyn w bakteriach kolonizujących rośliny i następnie nałożenie tych bakterii na rośliny. Gdy owad żywi się rośliną, wchłania toksyczną dawkę patatyny wytworzonej przez kolonistów rośliny. Bakterie takie mogą zamieszkiwać powierzchnię roślin, takjak gatunki Pseudomonas lub Agrobacterium, albo być endofitami zamieszkującymi układ naczyniowy roślin, takimi jak gatunki Clavibacter. W przypadku bakterii kolonizujących powierzchnię gen patatyny można wprowadzać w wiele wektorów zdolnych do replikacji w Gram-ujemnych gospodarzach. Przykładami takich wektorów sąpKT231 z grupy niedopasowania IncQ [Bagdasarian i in., 1981] lub pVK100 z grupy IncP [Knauf, 1982]. W przypadku endofytów gen patatyny można wprowadzać w chromosom metodą homologicznej rekombinacji lub metodą inkorporacji genu w odpowiedni transpozon zdolny do insercji chromosomalnej w bakteriach endofitycznych.

Ekspresja patatyny w bakulowirusie

Geny patatyny klonowano w donorowy wektor bakulowirusa pMON4327, opisany w jednoczesnym zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 07/941363, złożonym 4 września 1992, dołączanym niniejszymjako odnośnik literaturowy, jako fragmenty Ncol/EcoRI. Donorowy wektor pMON14327 zawiera gen oporności na ampicylinę, lewe i prawe ramię transpozona Tn7, i, pomiędzy ramionami, gen oporności na gentamycynę, silny polihedrynowy promotor bakulowirusa i polilinker. 'Wektor typu shuttle bakulowirusa, albo bakmid, składa się z miejsca miniattTn7 w ramce wewnątrz genu lacZ i genu oporności na kanamycynę rekombinowanego w genom wiralny AcNPV. Z pomocą pomocniczego plazmidu oporności na tetracyklinę, pMON7124, wytworzono rekombinacyjny wirus AcNPV metodą transpozycji genów patatyny lub GUS i genów znacznikowych w genom wirusa (Lucków i in., 1993). W pMON14327 włączono następujące geny: geny wymienione w tabeli 7 i Pat3+, Pat10+ i Pat17+.

Zgodnie z procedurami zgłoszenia patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 07/941363 i publikacji Luckowa i in., wytworzono z powyższych genów pewne ilości patatyny. Obecność patatyny potwierdzono metodą analizy Western i esterazowym działaniem na p-nitrofenylowy ester C-10. Za wyjątkiem PatA_m, który izozym był wzmacniany co najmniej dwukrotnie dla potrzeb biotestu SCRW. Podczas gdy hodowle PatE+ i PatEm spójnie wykazywały niewielką lub żadną ekspresję patatyny, wszystkie inne izozymy wydawały się być poddawane ekspresji w zadawalającej ilości dla potrzeb biotestu. Jednak nie określono natury potranslacyjnego przetwarzania patatyny w bakulowirusach w porównaniu z ziemniakiem. Bioaktywność izozymów poddanych ekspresji w bakulowirusie wobec SCRW zaobserwowano w przypadku Pat 17+, PatB+, PatD_m, PaII_m, PatL+ i Pat3+.

Określono efekty działania wielokrotnych izozymów (wytwarzanych przez bakulowirus) na wzrost i rozwój owadów. Próbki 11 izozymów Russeta połączono wjedną dla biotestu wobec SGRW, ECB, gąsienicy rolnicy zbożówki i TBW. Połączono 10 do 15 mg każdego oczyszczonego na Q-Sepharose izozymu poza PatDm, dostępnego w ilości tylko 1,7 mg. Powstała mieszanina wykazywała 100% śmiertelności w testach TBW i 93% redukcji masy wobec ECB. Tak więc każdy izozym poddano oddzielnie testowi wobec TBW i ECB. W porównaniu z larwami kontrolnymi larwy TBW i ECB karmione pokarmem traktowanym izozymami PatC+, PatL+ i PatIm wykazały znaczące zahamowanie rozwoju (>75%) i/lub śmiertelność. Pat B+ i PatDm także hamowały rozwój TBW, odpowiednio o 69 i 78%.

Konstrukcja genu rośliny

Ekspresja genu rośliny występującego w postaci dwułańcuchowego DNA wymaga transkrypcji informacyjnego RNA (mRNA) z jednego łańcucha DNA działaniem polimerazy RNA i następnie przetwarzania pierwotnego transkryptu w jądrze. Takie przetwarzanie obejmuje nietranslowany region 3', dodający poliadenylujące nukleotydy do końca 3' RNA. Transkrypcja DNA w mRNA jest regulowana przez region DNA nazywany zwykle „promotorem“. Region promotora zawiera sekwencję zasad sygnalizujących polimerazie RNA wiązanie z DNA z inicjację transkrypcji mRNA na podstawie jednego z łańcuchów DNA jako wzorca z utworzeniem odpowiedniego łańcucha RNA.

176 936

W literaturze opisano pewną liczbę promotorów aktywnych w komórkach roślinnych. Takie promotory można otrzymać z roślin lub wirusów roślinnych i obejmują one między innymi promotory takie jak syntazę nopaliny (NOS) i syntazę oktopiny (OCS) (naniesione na plazmidach indukujących nowotwór Agrobacterium tumefaciens), promotory 19S i 35S wirusa mozaiki kalafiora (CaMV), indukowalny światłem promotor z małej podjednostki 1,5-bis-fosfaoranokarboksylazy rybulozy (ssRUBISCO, występujący w dużych ilościach polipeptyd roślinny), oraz promotor 35S wirus mozaiki Fig-worta (FM^’), Wszystkie te promotory zastosowano do wytworzenia różnych typów konstruktów DNA, które poddano ekspresji w roślinach (patrz np. publikacja PCT WO 84/02913). Może być również konieczne ograniczanie ekspresji do pewnych części roślin podatnych na atak owada. Np., można zastosować specyficzny wobec korzenia promotor do ograniczenia ekspresji do rejonu korzenia lub promotor ułatwiający ekspresję w korzeniu do zwiększenia poziomu aktywnego białka w korzeniach. Jest to sposób korzystny w przypadku roślin atakowanych przez owady zjadające korzeń.

Pewne promotory roślin są także bardziej skuteczne w roślinach jednoliściennych. Na przykład promotor aktynowy ryżu opisany w publikacji WO 91/09948 jest skuteczny do ekspresji w kukurydzy. Promotor ubikwityny kukurydzy, opisany w europejskim opisie patentowym Ep 0342926, można stosować także w roślinach jednoliściennych.

Promotory stosowane w konstruktach DNA (to jest chimeryczne geny roślin) można modyfikować w razie potrzeby w celu wpłynięcia na ich charakterystykę sterującą. Np., promotor CaMV35S można ligować do części genu ssRUBISCO tłumiącego ekspresję ssRUBISCO pod nieobecność światła w celu wytworzenia promotora aktywnego w liściach, ale nie w korzeniach. Powstający chimeryczny promotor można zastosować w sposób opisany powyżej.

Dla celów niniejszego opisu termin „promotor CaMV35S“ obejmuje odmiany promotora CaMV35S, np., promotory pochodzące z ligacji z regionami operacyjnymi, przypadkowe lub kontrolowane mutacje i tym podobne. Ponadto promotory można zmieniać tak, aby zawierały wielokrotne „sekwencje ulepszające⁴¹, podwyższające ekspresję genu. Przykłady takich sekwencji ulepszających podaje Kay i in. (1987).

Konkretny wybrany promotor powinien być zdolny do spowodowania dostatecznej ekspresji sekwencji kodującej enzym, co powoduje wytwarzanie skutecznej ilości patatyny. Korzystnym promotorem jest promotor CaMV E35S (ulepszony CaMV35S).

RNA powstający z konstruktu DNA także zawiera nietranslowaną sekwencję początkową 5'. Sekwencja ta może pochodzić z promotora wybranego do ekspresji genu i może być poddana specyficznej modyfikacji, aby podwyższyć translację mRNA. Nietranslowane regiony 5' można także otrzymać z wirusowych RNA, z odpowiednich eukariotycznych genów lub z syntetycznej sekwencji genowej. Wynalazek nie jest ograniczony do konstruktów, w których nietranslowany region pochodzi z nietranslowanej sekwencji towarzyszącej sekwencji promotora.

Jak zauważono powyżej, nietranslowany region 3' chimerycznego genu roślinnego zawiera sygnał poliadenylacji, który służy w roślinach do spowodowania dołączenia adenylanowych nukleotydów do końca 3' RNA. Przykłady korzystnych regionów 3' to (1) transkrybowane nietranslowane regiony 3' zawierające sygnał poliadenylacji genów plazmidowych indukujących nowotwór (Ti) Agrobacterium, takie jak gen syntazy nopaliny (NOS) i (2) geny roślinne takie jak geny białka magazynowego 7s soi oraz gen ssRUBISCO E9 groszku [Fischhoff i in.]

Lokalizacja

Wektory zawierające kasety patatyny opisane powyżej pozwalajjąna ekspresję aktywnego białka w cytoplazmie lub wakuolach komórek roślinnych. Może być pożądane skierowanie większej części lub całości patatyny do układu wydzielniczego rośliny. Aby to osiągnąć, korzystne może być zastosowanie sekwencji sygnałowej pochodzącej z genu bakteryjnego lub roślinnego, ale prawdopodobnie korzystny jest gen roślinny. Przykłady takich sekwencji sygnałowych są sekwencje pochodzące z genu endoproteinazy B (Koehler i Ho) i genu tytoniu PR1b (Comelissen i in.). pMON 10824, opisany w publikacji EP 0385962, jest wektorem transformacji roślin zaprojektowanym dla ekspresji białka B. t. kurstaki aktywnego wobec motyli. W pMON10824, sekwencję kodującą B. t. k. skleja się z sekwencją sygnałową PR1b i 10 aminokwasami dojrzałej

176 936 sekwencji kodującej PR1b. W celu utworzenia wektora, w którym sygnał PR1b jest sklejony z genem patatyny, pMON10824 odcina się Bg1II iNcoI i wydziela mały fragment Bg1II-NcoI zawieraj ący sygnał PR1b. W reakcj i ligowania mały fragment Bg1 II-Ncol pMON 10824 miesza się z fragmentem 1000 par zasad NcoI-EcoRI z pMON19714 i trawionym BamHI-EcoRI pMON19470 (Brown i in.). W reakcji powstaje plazmid, w którym sekwencja kodująca patatyny jest sklejona z sygnałem wydzielania z genu PRIb i napędzana promotorem CaMv35S i intron do ekspresji w roślinachjednoliściennych. Do potrzeb ekspresji w roślinach dwuliściennych można przeprowadzić podobną reakcję. Fragment NotI-NotI wektora ekspresji w roślinach dwuliściennych można wstawić do wektora transformacji w roślinach dwuliściennych w sposób opisany poniżej i zmobilizować w rozbrojonym gospodarzu Agrobacterium w celu transformacji roślin dwuliściennych. Tak więc można otrzymać rośliny wytwarzające patatynę wydzielaną w przestrzeń międzykomórkową.

Fragment NotI-NotI tego plazmidu dla roślinjednoliściennych można wprowadzić do wektora transformacji dla kukurydzy (takiego jak pMON18181 opisany powyżej) w celu wytworzenia kukurydzy wydzielającej patatynę.

Mogłoby być korzystne skierowanie lokalizacji patatyny do innej przestrzeni komórkowej, chloroplastu. Białka można kierować do chloroplastu przez wprowadzenie naN-końcu tranzytowego peptydu chloroplastu (CTP). Jednym z opracowanych CTP, który kieruje heterologiczne białka do chloroplastu, jest CTP otrzymany z małej genowej podjednostki RUBISCO Arabidopsis, oznaczanej ats1A. Skonstruowano wariant tego peptydu tranzytowego kodujący peptyd tranzytowy, 23 aminokwasy dojrzałej sekwencji RUBISCO, plus a reiterację miejsca odcinania peptydu tranzytowego, do korzystnej localizacji chloroplastowej białka B. t. k. pMON19643, opisany przez Browna i in., zawiera peptyd tranzytowy ats1A Arabidopsis sklejony z genem GOX, i można go stosować jako podstawę do konstruowania wektora dla chloroplastowej lokalizacji patatyny. Przeprowadza się całkowite trawienie EcoRI i częściowe NcoI pMON19643 i wydziela się duży fragment (4000 par zasad). W reakcji ligacji, fragment NcoI-EcoRI z pMON 19714 miesza się z dużym fragmentem pMON19643. W reakcj i po wstaj e plazmid, w którym patatynowa sekwencja kodująca jest sklejona z peptydem tranzytowym Arabidopsis z 23 aminokwasami dojrzałego RUBISCO i napędzana promotorem CaMV E35S. Alternatywnie, podobny plazmid można skonstruować w celu zastąpienia promotora promotorem FMV35S. Takie plazmidy mobilizuje się w rozbrojonym gospodarzu Agrobacterium w celu transformowania roślin dwuliściennych. Alternatywnie, fragment NotI-NotI klonuje się do wektora transformacji kukurydzy w sposób opisany powyżej. Można w ten sposób otrzymywać rośliny wytwarzające patatynę lokalizowaną, w chloroplastach.

Transformacja i ekspresja w roślinach

Chimeryczny gen roślinny zawierający strukturalną sekwencję kodującą można wprowadzić w genom rośliny w dowolny dogodny sposób. Odpowiednie wektory transformacji roślin obejmują wektory pochodzące z plazmidu Ti Agrobacterium tumefaciens, jak też opisane, np., przez Herrerę-Estrella (1983), Bevana (1983), Klee (1985) i w publikacji EPO 0120516 (Schilperoort i in.). Poza wektorami transformacji roślin pochodzącymi z plazmidów Ti lub indukującymi w korzeniu (Ri) Agrobacterium, można zastosować alternatywne sposoby insercji konstruktów DNA według wynalazku w komórki roślin. Takie sposoby mogą obejmować np. zastosowanie liposomów, electroporację, związki chemiczne zwiększające pobór wolnego DNA, dostarczanie wolnego DNA przez mikrobombardowanie oraz transformację przy pomocy wirusów lub pyłku.

Przejściowa ekspresja patatyny w komórkach tytoniu

Szczególnie przydatnym plazmidowym kasetowym wektorem transformacji rośliny dwuliściennej jest pMON11794. Kaseta ekspresji pMON11794 składa się z promotora CaMVE35S, nietranslowanej sekwencji początkowej petunii Hsp70 5' i końca 3' obejmującego sygnały poliadenylacji z genu NOS. pMON11794 obejmuje miejsca NcoI i EcoRI do insercji sekwencji kodujących i miejsca NotI-NotI flankujące kasetę ekspresji genu rośliny.

176 936

PatA+ (sekw. nr id. 11), PatB+ (sekw. nr id. 16), PatC+ (sekw. nr id. 17) i PatG+ (sekw. nr id. 22) wstawiono w pMON11794 w celu wytworzenia odpowiednio pMON 19745, pMON19742, pMON19743 i pMO'N19744. Każdy z wektorów poddano elektroporacji w protoplastach tytoniu. Ekspresję patatyny w transformowanych komórkach tytoniu potwierdzono metodą analizy Western.

Trwała transformacja roślin dwuliściennych

Trwałą transformację roślin dwuliściennych genem patatyny opisał Rosahl i in. Tytoń transformowano genem patatyny pod kontrolą promotora specyficznego wobec liści i łodyg. Patatyna uległa ekspresji.

Fragment Notl-Notl z pMON19745 wprowadzono do pMON17227, wektora plazmidowego Ti opisanego przez Barry'ego i in. w publikacji WO 92/04449, dołączonej niniejszym jako odnośnik literaturowy, w celu wytworzenia pMON22566. Wektor ten zawiera glifosanowy gen oporności opisany przez Barr/ego dla selekcji transformowanych roślin. Podobnie zastosowano sekwencje nr id. 16, 17i22dowytworzeniaodpowiedniowektorapMON22563,22564, i 22565.

Wektor wprowadzono do rozbrojonego gospodarza Agrobacterium ABI w celu transformacji eksplantowanych pomidorów w kulturze tkankowej. Po selekcji na oporność glifozanowąi regeneracji roślin, otrzymano pełne rośliny wykazujące ekspresję genu patatyny. Ekspresję genu patatyny potwierdzono metodą analizy Western, a wstępne wyniki wskazują na ekspresję na poziomie od 0,1 do 0,5% łącznej ilości białka. Biotesty z larwami owadów są prowadzone.

Przejściowa ekspresja patatyny w komórkach kukurydzy

Fragment 1000 par zasad Ncol-EcoRI pMON19729, opisany powyżej, wprowadzono do pMON19433, opisanego w publikacji WO 93119189 i wspólnie złożonym zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 07/855857, złożonym 19 marca 1992 (Brown i in.), dołączanym niniejszym jako odnośnik literaturowy. Powstały plazmid, pMON19731, trawiono Notl, a powstały fragment wstawiono w pMON10081, także opisany przez Browna i in., otrzymując pMON 19740. Plazmid ten poddano elektroporacji w protoplastę liści kukurydzy zgodnie’ z opisem Sheena, 1991. Ekspresję patatyny w transformowanych komórkach protoplastów kukurydzy potwierdzono metodą analizy Western.

W celu osiągnięcia cytoplazmatycznej ekspresji patatyny fragment Ncol-EcoRI pMON 19714 wprowadzono do pMON19433 otrzymując pMON19730. Fragment Notl pMON19730 wprowadzono do pMON10081 i powstały plazmid, pMON 19739, poddano elektroporacji w protoplastę liści kukurydzy, które wytworzyły patatynę, co potwierdzono metodą analizy Western.

Pat17, w obecności i bez sygnałów lokalizujących, poddano także ekspresji w protoplastach kukurydzy. pMON19761 skonstruowano wstawiając fragment 1100 par zasad NcoI-EcoRI (sekw. nr id. 30) kodujący białko Pat17+ (dojrzałe białko Pat17 i jego własna sekwencja sygnałowa dla lokalizacji w wakuolach) do pMON19648. Tak więc pMON19761 zawiera promotor CaMV E35S, intron Hsp 70, gen Pat17+ i terminator NOS dla ekspresji w komórkach kukurydzy.

W celu otrzymania wektora dla cytoplazmatycznej ekspresji, sekwencję Pat17+ w pMON 19761 zastąpiono fragmentem NcoI-EcoRI kodującym białko PatI7_m (sekw. nr id. 31) z pMON25213 w celu otrzymania konstruktu pMON25223.

pMON25224 otrzymano wstawiając dwa fragmenty, fragment 300 par zasad XbaINcoI zawierający chloroplastowy peptyd tranzytowy (CTP) z genu SSU 1 a Arabidopsis thaliana (Timko i in.) z pMON19643 (Brown i in.) oraz fragment 1000 par zasad NcoI-EcoRI dla Pat17_m z pMON25213, wstawiony w pMON19761 (XbaI-EcoRI). Tak więc pMON25224 zawiera promotor CaMV E35S, intron Hsp 70, sekwencję kodującą CTP/Pat17m i terminator NOS.

Dla lokalizacji pozakomórkowej koniec 5' endoproteinazy B cDNA (Koehler i Ho) kodujący pozakomórkowy peptyd sygnałowy wydzielanego białka połączono z genem Pat17m z pMON25213. Fragment BgUI-EcoRI zawierający chimeryczny gen otrzymano techniką splata18

176 936 nia nakładających się zakończeń (Horton i in.) i wstawiono w pMON19761 (BamHI-EcoRI) otrzymując pMON25225.

Wszystkie te konstrukty poddano elektroporacji w protoplastę liści kukurydzy, a ekspresję Pat17_m potwierdzono metodą analizy Western.

Trwała transformacja kukurydzy genem patatyny

Wektor transformacji kukurydzy, pMON18181, skonstruowano z pMON19653 i pMON19643 (Brown i in.). Konstrukt ten zawiera kasetę promotora CaMV E35S, intronHsp70, glifosanowy znacznik selekcyjny CP4 i terminator NOS; kasetę promotora CaMV E35S, intron Hsp70, glifosanowy znacznik selekcyjny GOX i terminator NOS; oraz pojedyncze miejsce NotI dla insercji kasety ekspresji genu zawierającej gen patatyny. Sekwencję nr id. 11 i sekwencję nr id. 30 wprowadzono jako fragmenty NotI-NotI do pMON 18181 w celu wytworzenia odpowiednio pMON 19746 i pMON 19764.

Wektory te wprowadzono metodą bombardowania zarodkowej kultury tkankowej stosując biolistyczną wyrzutnię opisaną przez Browna i in. Transformowane komórki selekcjonowano ze względu na oporność na glifosan i pełne rośliny zregenerowano. Odporne na owady rośliny wykazująekspresję genu 0,1 -0,5% łącznej ilości białka w analizie metodą Western, działaniu esterazowym i/lub teście odporności na owady.

Syntetyczne geny do ulepszonej ekspresji roślin jednoliściennych

Otrzymano modyfikacje sekwencji kodującej polepszające ekspresję innych genów owadobójczych białek takich jak sekwencje delta endotoksyny z Bacillus thuringiensis (Fischhoff i Perlak; publikacja WO 93/07278, Ciba-Geigy). Zaprojektowano w ten sposób zmodyfikowaną, sekwencję kodującąulepszającąekspresję patatyn w roślinach, szczególnie kukurydzy. Zmodyfikowaną sekwencję Pat17+ pokazano jako sekwencję nr id. 33. Fragment DNA zawierający sekwencję nr id. 33 można zsyntetyzować i wprowadzić w wektor kasety ekspresji kukurydzy taki jak pMON19470 (Bown i in.). Kasetę ekspresji kukurydzy wstawia się następnie do pMON18181 lub innego wektora transformacji kukurydzy zawierającego gen wybieralnego znacznika w celu transformacji kukurydzy, otrzymując pełnąkukurydzę wytwarzając ąPat17+.

Wszystkie wymienione w opisie publikacje i opisy patentowe dołączane są niniejszym jako odnośniki literaturowe, tak jakby każda z nich była odrębnie opisana jako dołączana w charakterze odnośnika.

Literatura

Andrews, i in. Biochem. J. 252: 1988.

Bagdasarian i in., Gen, 16: 237-47,1981.

Barry i in. WO 92/04449.

Bevan, M. i in., Naturę, 304:184,1983.

D. Boulter, A. M. R. Gatehouse i V. Hilder, Biotech Adv. 7: 489, 1989.

Broadway i Duffey, J. Insect Physiol. 23: 827,1986.

Brown i in. WO 93/19189 i jednocześnie złożone zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr kolejny 07/855857, złożone 19 marca 1992.

Cornelissen, B. J. C., i in. EMBO Journal, 5: 37-40,1986.

Czapla i Lang, J. Econ. Entomol. 83: 2480,1990.

Fischhoff, D. A. i Perlak, F. J. Europejskie zgłoszenie patentowe, nr 0385962, 1990.

Fischhoff i in., Bio/Technol. 5: 807, 1987.

176 936

Gaillaird, T. Biochem. J. 121: 379-390,1971.

Ganal i in., Mol. Gen. Genetics, 225: 501-509,1991.

Gatehouse i in., J. Sci. Agric. 37: 727,1986.

Herrera-Estrella, L. i in., Nature, 303:209, 1983.

Heusing i in., Plant Physiol. 96: 993, 1991.

Hofgen, R., i Willmitzer, L. Plant Science, 66: 221-230, 1990.

Horton i in., Gen, 77: 61-68, 1989.

Ishimoto i K. Kitamura, Appl. Ent. Zool. 24: 281,1989.

Kay, R. i in., Science, 236: 1299-1302, 1987.

Klee, H. J. i in., Bio/Technology, 3: 637-642, 1985.

Knauf, V. C. i Nester, E. Plasmid, 8: 43-54,1982.

Koehler, S., i Ho., T. -H. D., Plant Cell, 2: 769-783,1990.

Luckow, V. A., i in., J. Virol. 67:4566-4579,1993.

Marrone, P. G., i in. J. Econ. Entom., 78: 290-3,1985.

Mignery, i in., Nucleic Acids Research, 12: 7987^^^(^(^, 1984.

Mignery, i in., Gene, 62: 27-44, 1988.

Murdock i in., Phytochemistry, 29: 85, 1990.

Olins, P., i in., J. Biol. Chem., 264: 16973-16976,1989.

Park, W. D., i in., Plant Physiol., 71: 156-160, 1983.

Pernes, J. F., i in., J. Chromatography, 181: 254-258,1980.

Racusen, D., Can. J. Bot., 62: 1640-1644,1984.

Racusen, D., Can. J. Bot., 64: 2104-2106,1986.

Racusen i Foote, J. Food Biochem., 4: 43-52,1980.

Rodis, P. i Hoff, J. E., Plant Physiol., 74: 907-911 1984.

Rosahl i in., The EMBO Journal, 6(5): 1155-1159.

Ryan, Ann. Rev. Phytopath., 28: 425-449,1990.

Schilperoort, i in., Publikacja EPO nr 0120516.

Sheen, Jen, Plant Cell, 3: 225-245, 1991.

Shukle i Murdock, Environ. Ent. 12: 787, 1983.

Soberon, X., i in., Gene, 9: 287-305, 1980.

Stiekema i in., Plant Mol. Biol., 11: 255-269, 1988.

Timko i in. The Impact of Chemistry on Biotechnology, ACS Books, 1988, 279-295. Vancanneyt i in., Plant Cell, 1: 533-540, 1989.

176 936

LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJA OGÓLNA:

(1) ZGŁASZAJĄCY:

CA) NAZWA: Monsanto Company (B) ULICA: 800 North Lindbergh Boulevard (C) MIASTO: St. Louis (D) STAN: Missouri (E) KRAJ: St. Zjedn. Ameryki (F) KOD POCZTOWY (ZIP): 63167 (G) TELEFON: (314)694-3131 (H) TELEFAX: (314)694-5435 (ii) NAZWA WYNALAZKU: Sposób zwalczania owadów (iii) LICZBA SEKWENCJI: 33 (iv) POSTAĆ DLA KOMPUTERA:

(A) TYP NOŚNIKA: dyskietka elastyczna (B) KOMPUTER: zgodny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: PatentIn Release 1.0,

1.25 (EPO) (vi) DANE O WCZEŚNIEJSZYCH ZGŁOSZENIACH:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: US 08/031146 (B) DATA ZŁOŻENIA: 12 MARCA 1993 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID.: 1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 15 aminokwasów

Wersj a

176 936 (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYi CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:1

Liz Leu Glu Glu Met Wal Tre Wal Leu Ser Ile Asp Gli

Gli Gli

10 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID.: 2 (1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 15 aminokwasów (B) TYi: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYi CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NR ID. : 2.·.

Xaa Leu Gli Glu Met Wal Tre Wal Leu Ser Ile Asp Gli Gli Gli

10 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID.: 3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 15 aminokwasów

176 936 (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYi CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIP SEKEKNEJI: SEEKEECCA NR ID.: 3:

Tre Leu Gli Glu Met Eal Tre Eal Leu Ser Ile Asp Gli

Gli Gli

10 (2) IRFORMACJA DLA SEKWENCJI jr id.: 4:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 15 aminokwasów (B) TYi: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYi CZĄSTECZKI: białko (xi) OPOi SEEWEECJI: SSKKENJCA EJ ID.: 4:

Tre Leu Gli Glu Met Eal Tre Eal Leu Ser Ile Asp Gli Gli Gli

10 (2) INFORMACJA DLA SEKEERCJI CR ID.: 5:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKEERCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 15 aminokwasów

176 936 (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NR ID.: 5:

Liz Leu Xaa Glu Met Wal Tre Wal Leu Ser Ile Asp Gli

Gli Gli

10 (2) INFORMACJĄ DLA SEKWENCJI NR ID.: 6:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 8 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NR ID.: 6:

Xaa Xaa Glu Glu Met Wal Tre Wal

5 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID.: 7:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 15 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa

176 936 (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NR ID.: 7:

Ser Leu Asp Tyr Liz Gln Met Leu Leu Leu Ser Leu Gli

Tre Gli

10 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID.: 8:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A)	DŁUGOŚĆ: 8 aminokwasów
(B)	TYP: aminokwas
(D)	TOPOLOGIA: liniowa
(ii) TYP	CZĄSTECZKI: białko

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NR ID.: 8:

Liz Leu Asp Tyr Liz Gln Met Leu

5 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID.: 9:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 15 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NR ID.: 9:

176 936

Ser Leu Xaa Tyr Liz Gln Met Leu Leu Leu Ser Leu Gli Tre Gli

10 (2) INFORMACJA DRA SEKWENCJI NR ID.: :3.0:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 15 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTCCZKI: białOo (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NR ID.: 10:

Ser Leu Asn Tyr Liz Gln Met Leu Leu Leu Ser Leu Gli

Tre Gli

10 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID.: :11:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(AA) DŁUGOŚĆ: 1171 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CCASTECCKI: cDNA

176 936 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NR ID.: 11:

CCATGGCAAC

ACTACTAGTT

CAACATGTGC

GGTGGAATTA

AGGGAATCAT

GAAGTGGACA

ATAATAAAGA

AGTACAGGAG

GTTTATTGAC

GCTGCTGCCA

AAGATATTGT

AGTGGTTCAA

TTATTGGCCC

AAACTTGGAG

AAACTCGTGT

ATCAAAACAA

ATAAGCCAGT

GATGCTAAGA

TGTATGACAT

CATTACTTTA

TTACTCATAC

GGTGTTGCTA

CTGTTGGTGA

CAAGAGGATC

CAGCATTTTC

TCATTAGGCA

TACTAAATCT

TTTTTAATTT

TATTTTTTAT

TAAGTTGGAA

TCCAGCTATC

TGCAAGACTT

TGCTATGATA

ACCCTTTTAC

AATGTATGAT

GCATCAAGCT

AATATTCACT

ATGCTATTCC

TAGTAATGGT

TCCGGCGTTA

TTCAATTAAG

GAAATGGTGA

ATTCTCGAAT

GCAGATTACT

ACTACTCCAA

TTCGAACATG

GGAAAATATC

TTGACAGAAG

AAGTCAAATT

ACAGCAGCAG

GATATATATG

TTATCCCTTA

TCATTGGATT

CTGTTCTTAG

TTCTTGAAGG

TTGATGTAAT

ATGAAAACAA

GCCCTCATAT

TTCTGCAAGT

TTGCCATCTC

TAGCAAAGTC

CTCCAATATA

AGTTCAATCT

GCGTTGCAAC

ACAAGCAAAT

GATATTAGCA

TATTGATGGA

120

ACAACTTCAG

180

TGGAGGAACA

240

TCGACCCTTT

300

TTTTAATTAT

360

TCTTCAAGAA

420

AAGCTTTGAC

480

TCCAGAATTG

540

TTTTCCTCCA

600

TGTTGATGGT

6660

GAGACTTGCA

7^C

GTTGTTGCTC

780

176 936

CTGGCACTAA AAATGGGGTC	TTCAGAGTTT	GATAAAACAT	ATACAGCACA	AGAGGCAACT 880
CTCTACGATG	GATGTTAGCT	ATACAGCAAA	TGACTAATGC	AGCAAGTTCT
TACATGACTG				900
ATTATTACAT	TTCTACTGTT	TTTCAAGCTC	GTCATTCACA	AAACAATTAC
CTCAGGGTTC				900
AAGAAAATGC	ATTAACAGGC	ACAACTACTG	AAATGGATGA	TGCGTCTGAG
GCTAATATGG				1000
AATTATTAGT	ACAAGTTGGT	GAAACATTAT	TGAAGAAACC	AGTTTCCAAA
GACAGTCCTG				H00
AAACCTATGA	GGAAGCTCTA	AAGAGGTTTG	CAAAATTGCT	CTCTGATAGG
AAGAAACTCC				1110
GAGCAAACAA	AGCTTCTTAT	TGATAGAATT	C	1111

(2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID.: 12:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 37 par zasad (B) TYi: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (syntetyczny) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NR ID.: 12:

CATGTGCTCT AGAAGATCTC CACCATGGCG TTGGAAG (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID.: 13:

176 936 (1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 26 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (syyteeyczny) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKKWNNCA NR ID.: 13:

GCTTCTTATT GATAGAATTC AAGGTC 2 6 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID.: 34:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 3305 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: NR 110.: 13:

CCATGGCGTT ATTAAGGGAA	GGAAGAAATG	GTGACTGTTC	TTAGTATTGA	TGGAGGTGGA 66
TCATTCCAGC	TATCATTCTC	GAATTTCTTG	aaggacaact	TCAGGAAGTG
GACAATAATA				120
AAGATGCAAG	ACTTGCAGAT	TACTTTGATG	TAATTGGAGG	AACAAGTACA

GGAGGTTTAT

130

176 936

TGACTGCTAT

GCCAAAGATA τaGTACccaa ^AATTATTG

GCCCAATGTA

GGAGAAACTC

GTGTGCATCA

ACAAATAAGC

CAGTAATATT

AACATCTATG

ACATATGCTA ^TATTACTC

ATACTAGTAA

GCTACTGTTG

GTGATCCGGC

GATCCAGCAT

TTTCTTCAAa

GGCACTGGCA

CT^ATTCAGA

GGTCCTCTAC

GAaGGATGaT

ACrGATTATT

ACATTTCTAC

GTTCAAGAAA

ATGCATTAAC

ATGGAATTAT

TAGTACAAGT

GATAACTACT

TTACTTCG^A

TGATGGAAAA

AGCTTTGACA

CACTAAGTCA

TTCCACAGCA aGGTGAaAaA

GTTATTATCC aAAGacAτaG

GTTTGATAAA

AGCTATACAG aGTTTTTCAA

AGGCACAACT

TGGTGAAACA

CCAAATGAAA

CATGCCCCTC

GAAGTTGCCA

AATTTAGCAA

GCAGCTCCAA

TATGAGTTCA

CaTAGCGaTG

GATTACAAGC

ACATATACAG

CAAATGACTA

GCTCGTCATa

ACTGAAATGG

TTATTGAAGA

CCTGAAACCT

ACAATCGACC

AaAaaτττAA

AACTTCTTCA

TCTCiAGCTT

AGTCTCCAGA aAaATττacc

ATcaaGaaGA

CAACGAGACT

AftATCTTCTT

CACAAGAGGC

ATGCAGCAAG

CACAAAACAA

ATGATGCG^

AACCAGTTTC cττaGcaGCτ

240

TTATAGTGGT

300

AGAAAAACTT

360

TGACATCAAA

420

ATTGGATGCT

480

TCCACATTAC

540 aGGaGGTGTT

600

TGCACAAGAG

660

GCTCTCATTA

720

AGCTAAATGG

780

TTCTTACATG

840

TTACCTCAGC

0

TGAGGCTAAT

960

CAAAGACAGT

1020

176 936

ATGAGGAAGC TCTAAAGAGG TTTGCAAAAT TGCTCTCTGA TAGGAAGAAA

CTCCGAGCAA 1080

ACAAAGCTTC TTATTGATAG AATTC 1105 (2) INFORMACJA DLA SEKEERCJI RR ID.: 15:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKE/ERCJ! :

(A) DŁUGOŚĆ: 1106 par zasad (B) TYi: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOiOLOGIA: liniowa (ii) TYi CZĄSTECZKI: cDRA (xi) OiIS SE^^OJI: SEKEERCJA RR ID.: 15:

CCATGGCGTT	GGAAGAAATG	GTGACTGTTC	TTAGTATTGA	TGGAGGTGGA
ATTAAGGGAA				60
TCATTCCAGC	TACCATTCTC	GAATTTCTTG	AAGGACAACT	TCAGGAAGTG
GACAATAATA				120
AAGATGCAAG	ACTTGCAGAT	TACTTTGATG	TAATTGGAGG	AACAAGTACA
GGAGGTTTAT				110
TGACTGCTAT	GATAACTACT	CCAAATGAAA	ACAATCGACC	CTTTGCTGCT
GCCAAAGATA				200
TTGTACCCTT	TTACTTCGAA	CATGGCCCTC	ATATTTTTAA	TTATAGTGGT
TCAATTATTG				300
GCCCAATGTA	TGATGGAAAA	TATCTTCTGC	AAGTTCTTCA	AGAAAAACTT
GGAGAAACTC				300)
GTGTGCATCA	AGCTTTGACA	GAAGTTGCCA	TCTCAAGCTT	TGACATCAAA
ACAAATAAGC				400

176 936

CAGTAATATT	CACTAAGTCA	AATTTAGCAA	AGTCTCCAGA	ATTGGATGCT
AAGATGTATG				480
ACATATGCTA	TTCCACAGCA	GCAGCTCCAA	TATATTTTCC	TCCACATTAC
TTTATTACTC				540
ATACTAGTAA	TGGTGATATA	TATGAGTTCA	ATCTTGTTGA	TGGTGGTGTT
GCTACTGTTG				600
GTGATCCGGC	GTTATTATCC	CTTAGCGTTG	CAACGAGACT	TGCACAAGAG
GATCCAGCAT				6650
TTTCTTCAAT	TAAGTCATTG	GATTACAAGC	AAATGTTGTT	GCTCTCATTA
GGCACTGGCA				720
CTAATTCAGA	GTTTGATAAA	ACATATACAG	CACAAGAGGC	AGCTAAATGG
GGTCCTCATC				780
GATGGATGTT	AGCTATACAG	CAAATGACTA	ATGCAGCAAG	TTCTTACATG
ACTGATTATT				840
ACATTTCTAC	TGTTTTTCAA	GCTGGTCATT	CACAAAACAA	TTACCTCAGG
GTTCAAGAAA				900
ATGCATTAAC	AGGCACAACT	ACTGAAATGG	ATGATGCGTC	TGAGGCTAAT
ATGGAATTAT				960
TAGTACAAGT	TGGTGAAAAA	TTATTGAAGG	AACCAGTTTC	CAAAGACAGT
CCTGAAACCT				1020
CTGAGGAAGC	TCTAAAGAGG	TTTGCAAAAT	TGCTCTCTGA	TAGAAAGAAA
CTCCGAGCAA				1080
ACAAAGCTTC	TTATTAATGA	GAATTC		1106

(2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID.: 16:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1172 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy

176 936 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ci) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NR ID.: 10:

CCATGGCAAC

ACTACTAGTT

CAACATGTGC

GGTGGAATTA

AGGGAATCAT

GAAGTGGACA

ATAATAAAGA

AGTACAGGAG

GTTTATTGAC

GCTGCTGCCA

AAGATATTGT

AGTGGTTCAA

TTTTTGGCCC

AAACTTGGAG

AAACTCGTGT

ATCAAAACAA

ATAAGCCAGT

GATGCTAAGA

TGAATGACAT

CATTACTTTG

TTACTCATAC

GCTGTTGCTA

CTGTTGGTGA

CAAGTGGATC

TACTAAATCT

GTTTTAGTTT

TATTTTTTAT

TACGTTGGGA

GAAATGGTGA

CTGTTCTTAG

TCCGGCTACC

TGCAAGACTT

TGCTATGATA

ACCTTTTTAC

AATGTATGAT

GCATCAAGCT

AATATTCACT

ATGCTATTCC

TAGTAATGGA

TCCGGCGTTA

ATTCTCGAAT

GCAGATTACT

ACTACTCCAA

TTCGAACATG

GGAAAATATT

TTGACAGAAG

AAGTCAAATT

ACAGCAGCAG

GATAAATATG

TTATCCCTTA

TTCTTGAAGG

TTGATGTAAT

ATGAAAACAA

GCCCTCATAT

TTCTGCAAGT

TTGCCATCTC

TAGCAAAGTC

CTCCAACATA

AGTTCAATCT

GCGTTCGAAC

GATATTAGCA

TATTGATGGA

120

ACAACTTCAG

180

TGGAGGAACA

240

TCGACCCTTT

30Ό

TTTTAATTCT

60

TCTTCAAGAA

020

AAGCTTTGAC

080

TCCAGAATTG

540

TTTTCCTCCA

000

TGTTGATGGT

060

GAAACTTGCA

720

176 936

CAAAATTTGC TCATTAGGCA	TTCAATTAAG	TCATTGAATT	acaacgaaaa	GTTGTTGCTC 7 70
CTGGCACTAA	TTCAGAGTTT	GATAAAACAT	ATACAGCAGA	AGAGGCAGCT
AAATGGGGTC				840
CTCTACGATG	GATATTAGCT	ATACAGCAAA	TGACTAATGC	AGCAAGTTCT
TACATGACTG				900
ATTATTACCT	TTCTACTGTT	TTTCAAGCTC	GTCATTCACA	AAACAATTAC
CTCAGGGTTC				960
AAGAAAATGC	ATTAACAGGC	ACAACTACTG	AAATGGATGA	TGCGTCTGAG
GCTAATATGG				1020
AATTATTAGT	ACAAGTTGGT	GAAAAATTAT	TGAAGAAACC	AGTTTCCAAA
GACAGTCCTG				1080
AAACCTATGA	GGAAGCTCTA	AAGAGGTTTG	CAAAATTGCT	CTCTGATAGG
AAGAAACTCC				1140
GAGCAAACAA	AGCTTCTTAT	TAATGAGAAT	TC	1172

(2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID.: 17:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1175 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CCASTECCKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NR ID.: 17:

CCATGGCAAC TACTAAATCT TTTTTAATTT TAATTGTTAT GATATTAGCA

ACTACTAGTT 60

176 936

CAACATTTGC

GGTGGAATTA

AGGGAATCAT

AAAATGGACA

ATAATGCAGA

AGTACAGGAG

GTTTATTGAC

GCTGCTGCCA

ATGAAATTGT

AGGTACTGGC

CAATTTTTTG

GAAAACCTTG

GAGAAACTCG

GACATCAAAA

CAAATAAGCC

TTGGATGCTA

AGATGTATGA

CCACATTACT

TTACTACTAA

GGTGCTGTTG

CTACTGTTGC

GCAGAAAAGG

ATCCAGCATT

CTCTCATTAG

GCACTGGCAC

GCTAAATGGG

GTGCTATACA

TCTTACATGA

TTCGTTGGAA

TCCGGGTACC

TGCAAGACTT

TTCTATGATA

ACCTTTTTAC

GCCAAAATAT

TGTGCATCAA

AGTAATATTC

CATATGTTAT

TACTATTAAT

TGATCCGGCG

TGCTTCAATT

TACTTCAGAG

ATGGATGTTG

GAAATGGTGA

ATTCTCGAAT

GCAGATTACT

ACTACTCCAA

TTCGAACATG

GATGGAAAAT

GCTTTGACTG

ACCAAGTCAA

TCCACAGCAG

GGAGATAAAT

TTATTATCCA

AGGTCATTGA

TTTGATAAAA

GTTATACAGC

CTGTTCTTAG

TTCTTGAAGG

TTGATGTAAT

ATGAAAACAA

GCCCTCATAT

ATCTTATGCA

AAGTTGCCAT

ATTTAGCAAA

CAGCTCCAAC

ATGAGTTCAA

TTAGCGTTGC

ATTACAAAAA

CATATACAGC

GAATGACTGA

TATTGATGGA

120

ACAACTTCAG

00

TGGAGGAACA

200

TCGACCCTTT

300

TTTTAATTCT

360

AGTTCTTCAA

420

CTCAAGCTTT

480

GTCTCCAGAA

540

ATATTTTCCT

600

TCTTGTTGAT

660

AACGAGACTT

720

AATGTTGTTG

780

AGAAGAGACA

040

TGCAGCAAGT

900

176 936

CTGATTATTA	CCTTTCTACT	GTTTTTCAAG	CTCAAAATTC	ACAAAAGAAT
TACCTCAGGG				900
TTCAAGAAAA	TGCGTTAACA	GGCACAACTA	CTGAAATGGA	TGATGCTTCT
GAGGCTAATA				1102
TGGAATCATT	AGTACAAGTT	GGTGAAAATT	TATTGAAGAA	ACCAGTTCCC
AAAGACAATC				1100
CTGAAACCTA	TGAGGAAGCT	CTAAAGAGGT	TTGCAAAATT	GCTTTCTGAT
AGGAAGAAAC				1110
TTCGAGCAAA	CAAAGCTTCT	TATTAATGAG	AATTC	1117)

(2) INFORMACJA DLA SEKEERCJI JR ID.: 10:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKEERCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1100	par zasad
(B) TYi: kwas nukleinowy
(C) ŁAŃCUCH: pojedynczy
(D) Topologia: liniowa
(ii) TYP CZĄSTECZKI: cDJA
(xi) OPIS SEKEECCJI: SEKEERCJA RR ID.: 10:
CCATGGCGTT GGAAGAAATG	GTGACTGTTC TTAGTATTGA TGGAGGTGGA
ATTAAGGGAA	60
TCATTCCGGC TACCATTCTC	GAATTTCTTG AAGGACAACT TCAGGAAGTG
GACAATAATA	120
AAGATGCAAG ACTTGCAGAT	TACTTTGATG TAATTGGAGG AACAAGTACA
GGAGGTTTAT	180
TGACTGCTAT GATAACTACT	CCAAATGAAA ACAATCGACC CTTTGCTGCT
GCCAAAGATA	240

176 936

TTGTACCTTT

TCAATTTTTG

GCCCAATGTA

GGAGAAACTC

GTGTGCATCA

ACAAATAAGC

CAGTAATATT

AAGATGTATG

ACATATGTTA

TTTGTTACTC

ATACTAGTAA

GCTACTGTTG

GTGATCCGGC

GATCCAAAAT

TTGCTTCAAT

GGCACTGGCA

CTAATTCAGA

GGTCCTCTAC

GATGGATATT actgattatt

ACCTTTCTAC

GTTCAAGAAA

ATGCATTAAC

ATGGAATTAT

TAGTACAAGT

CCTGAAACCT

ATGAGGAAGC

CTCCGAGCAA

TTACTTCGAA

TGATGGAAAA

AGCTTTGACA

CACTAAGTCA

TTCCACAGCA

TGGAGATAAA

GTTATTATCC

TAAGTCATTG

GTTTGATAAA

AGCTATACAG

TGTTTTTCAA

AGGCATAACT

TGGTGAAAAA

TCTAAAGAGG

CATGGCCCTC

TATTTTCTGC

GAAGTTGCCA

AATTTAGCAA

GCAGCTCCAA

TATGAGTTCA

CTTAGCGTTG

AATTACAAGC

ACATATACAG

CAAATGACTA

GCTCGTCATT

ACTGAAATGG

TTATTGAAGA

TTTGCAAAAT

ATATTTTTAA.

AAGTTCTTCA

TCTCAAGCTT

AGTCTCCAGA

CATATTTTCC

ATCTTGTTGA

CAACGAAACT

AAATGTTGTT

CAGAAGAGGC

ATGCAGCAAG

CACAAAACAA

ATGATGCGTC

AACCAGTTTC

TGCTCTCTGA

TTCTAGTGGT

300

AGAAAAACTT

3300

TGACATCAAA

420

ATTGGATGCT

400

TCCACATTAC

540

TGGTGCTGTT

660

TGCACAAGTG

660

GCTCTCATTA

770

AGCTAAATGG

8 0

TTCTTACATG

88^0

TTACCTCAGG

900

TGAGGCTAAT

990

CAAAGACAGT

1100

TAGGAAGAAA

1180

176 936

ACAAAGCTTC TTATTAATGA GAATTC 1106 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID.: 19:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1172 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NR ID.: 19:

CCATGGCAAC ACTACTAGTT	TACTAAATCT	TTTACAATTT	TAATTTTTAT	GATGTTAGCA 60
CAACATTTGC	TACATTGGGA	GAAATGGTGA	CTGTTCTTAG	TATTGATGGA
GGTGGAATTA				120
AGGGAATCAT	TCCGGCTACC	ATTCTCGAAT	TTCTTGAAGG	ACAACTTCAG
GAAGTGGACA				180
ATAATGCAGA	TGCAAGACTT	GCAGATTACT	TTGATGTAAT	TGGAGGAACA
GGTACAGGAG				240
gtttattgac	TGCTATGATA	ACTACTCCAA	ATGAAAACAA	TCGACCTTTT
GCTGCTGCTA				300
AAGATATTAT	ACCTTTTTAC	TTCGAACACG	GCCCTCATAT	TTTTAATTAT
AGTGGTTCAA				360
TTTTAGGCCC	AATGTATGAT	GGAAAATATC	TTCTGCAAGT	TCTTCAAGAA
AAACTTGGAG				420
AAACTCGTGT	GCATCAAGCT	TTGACAGAAG	TTGCCATCTC	AAGCTTTGAC
ATCAAAACAA				480

176 936

ATAAGCCAGT

GATGCTAAGA

TGTATGACAT

CATCACTTTG

TTACTCATAC

GCTGTTGCTA

CTGTTGGTGA

CAAGAGGATC

CAGCATTTTC

TCATTAGGCA

CTGGCACTAA

AAATGGGGTC

CTCTACGATG

TACATGACTG

ATTATTACAT

CTCAGGGTTC

AAGAAAATGC

GCTAATATGG

AATTATTAGT

GACAGTCCTG

AAACCTATGA

AAGAAACTCC

GAGCAAACAA

AATATTCACT

ATGCTATTCC

TAGTAATGGT

TCCGGCGTTA

TTCAATTAAG

TTCAGAGTTT

GATGTTAGCT

TTCTACTGTT

ATTAAATGGC

ACAAGTTGGT

GGAAGCTCTA

AGCTTCTTAT

AAGTCAAATT

ACAGCAGCAG

GCTAGATATG

TTATCCCTTA

TCATTGGATT

GATAAAACAT

ATACAGCAAA

TTTCAAGCTC

ACAACTACTG

GAAACATTAT

AAGAGATTTG

TAATGAGAAT

TAGCAAAGTC

CTCCAATATA

AGTTCAATCT

GCGTTGCAAC

ACAAGCAAAT

ATACAGCAGA

TGACTAATGC

GTCATTCACA

AAATGGATGA

TGAAGAAACC

CAAAATTGCT

TC

TCCAGAATTG

540

TTTTCCTCCA

600

TGTTGATGGT

600

GAGACTTGCA

720

GTTGTTGCTC

780

AGAGGCAGCT

800

AGCAAGTTCT

900

AAACAATTAC

960

TGCGTCTGAG

1020

AGTCTCCAAA

1180

CTCTGATAGG

1140

1112 (2) INFORMACJA DLA SEKEERCJI JR ID.: 20:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKEEJCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1100 par zasad

176 936 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NR ID.: 20:

CCATGGCGTT

ATTAAGGGAA

TCATTCCGGC

GACAATAATG

CAGATGCAAG

GGAGGTTTAT

TGACTGCTAT

GCTAAAGATA

TTATACCTTT

TCAATTTTAG

GCCCAATGTA

GGAGAAACTC

GTGTGCATCA

ACAAATAAGC

CAGTAATATT

AAGATGTATG

ACATATGCTA

TTTGTTACTC

ATACTAGTAA

GCTACTGTTG

GTGATCCGGC

GATCCAGCAT

GGAAGAAATG

TACCATTCTC

ACTTGCAGAT

GATAACTACT

TTACTTCGAA

TGATGGAAAA

AGCTTTGACA

CACTAAGTCA

TTCCACAGCA

TGGTGCTAGA

GTTATTATCC

GTGACTGTTC

GAATTTCTTG

TACTTTGATG

CCAAATGAAA

CACGGCCCTC

TATCTTCTGC

GAAGTTGCCA

AATTTAGCAA

GCAGCTCCAA

TATGAGTTCA

CTTAGCGTTG

TTAGTATTGA

AAGGACAACT

TAATTGGAGG

ACAATCGACC

ATATTTTTAA

AAGTTCTTCA

TCTCAAGCTT

AGTCTCCAGA

TATATTTTCC

ATCTTGTTGA

CAACGAGACT

TGGAGGTGGA

TCAGGAAGTG

120

AACAGGTACA

180

TTTTGCTGCT

240

TTATAGTGGT

300

AGAAAAACTT

360

TGACATCAAA

020

ATTGGATGCT

080

TCCACATCAC

500

TGGTGCTGTT

000

TGCACAAGAG

000

176 936

aaacaτcAAa GGCACTGGCA	TAAGTCATTG	GATTACAAGC	AAATGTaGTT	GCTCTCATTA 723
^AATTCAGA	GTaaGATAAA	ACATATACAG	CAGAAGAGGC	AGCTAAATGG
GGTCCTCTAC				780
GATGGATGTT	AGCTATACAG	CAAATGACTA	ATGCAGCAAG	TTCTTACATG
ACTGATaAaT				840
ACATT^TAC	TGaTTTTCAA	GC^GTCATT	CACAAAACAA	TTACCTCAGC
GTTCAAGAAA				9900
ATGCATTAAA	TGGCACAACT	ACTGAAAaGG	AaGATGCGaC	aGAGGCTAAT
ATGGAATTAT				900
TAGTACAAGT	TGGTGAAACA	TTATTGAAGA	AACCAGTCTC	CAAAGACAGT
CCTGAAACCT				1020
ATGAGGAAGC	TCTAAAGAGA	aaaGCAAAAa	TGCTCTCaGA	TAGGAAGAAA
CTCCGAGCAA				1080
ACAAAGCTTC	TTATTAATGA	GAATTC		1106

(2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID.: 21:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1109 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NR ID.: 21:

CCAaGGCGTa GGAAGAAATG GaGGCTGTaC TTACTATTGA TGGAGGTGGA

ATTAAGGGAA

176 936

TCATTCCGGG

GACAATAATG

CAGATGCAAG

GGAGGTTTAT

TGACTGCTAT

GCCAATGAAA

TTGTACCTTT

TGGCCAATTT

TTTGGCCAAA

CTTGGAGAAA

CTCGTGTGCA

AAAACAAATA

AGCCAGTAAT

GCTAAGACGT

ATGACATATG

TACTTTGCTA

CTAATACTAT

GTTGCTACTG

TTGCTGATCC

GAGGATCCAG

CATTTGCTTC

TTAGGCACTG

GCACTACTTC

TGGGGTGCTC

TACAATGGAT

ATGACTGATT

ATTACCTTTC

AGGGTTCAAG

TACCATTCTC

ACTTGCAGAT

GATAACTACT

TTACTTCGAA

ATATGATGGA

TCAAGCTTTG

ATTCACTAAG

TTATTCGACA

TAATGGAGAT

GGCGTTATTA

AATTAGGTCA

AGAGTTTGAT

GTTGGTTATA

TACTGTTTTT

GAATTTCTTG

TACTTTGATG

CCAAATGAAA

CATGGCCCTC

AAATATCTTA

ACAGAAGTTG

TCAAATTTGG

GCAGCAGCTC

AAATATGAGT

TCCGTTAGCG

TTGAATTACA

AAAACACATA

CAGCAAATGA

CAAGATCTTC

AAGGACAACT

TAATTGGAGG

ACAATCGACC

ATATTTTTAA

TGCAAGTTCT

CCATCTCAAG

CAAAGTCTCC

CAACATATTT

TCAATCTTGT

TTGCAACGAG

AAAAAATGTT

CAGCAGAAGA

CTGAGGCAGC

ATTCACAAAA

TCAGAAAATG

120

AACAAGTACA o

CTTTGCTGCT

240

TTCTAGGTAC

300

TCAAGAAAAA

360

CTTTGACATC

420

AGAATTGGAT

0

TCCTCCACAT

540

TGATGGTGCT

600

ACGTGCACAA

660

GTTGCTCTCA

720

GACAGCTAAA

780

AAGTTCTTAC

840

CAATTACCTC

600

176 936

AAAATGCATT AACAGGCACA ACTACTAAAG CGGATGATGC TTCTGAGGCT

AATATGGAAT 996

TATTAGCACA AGTTGGTGAA AATTTATTGA AGAAACCAGT TTCCAAAGAC

AATCCTGAAA 1322)

CCTATGAGGA AGCTCTAAAG AGGTTTGCAA AATTGCTTTC TGATAGGAAG

AAACTTCGAG 1300

CAAACAAAGC TTCTTATTAA TGAGAATTC 133^^ (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID.: 22:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 3372 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NR ID.: 22:

CCATGGCAAC ACTACTAGTT	TACTAAATCT	TTTTTAATTT	TATTTTTTAT	GATATTAGCA 60
CAACATGTGC	TAAGTTGGAA	GAAATGGTTA	CTGTTCTAAG	TATTGATGGA
GGTGGAATTA				HO
AGGGAATCAT	TCCAGCTATC	ATTCTCGAAT	TTCTTGAAGG	ACAACTTCAG
GAAGTGGACA				13 01
ATAATAAAGA	TGCAAGACTT	GCAGATTACT	TTGATGTAAT	TGGAGGAACA
AGTACAGGAG				220
GTTTATTGAC	TGCTATGATA	ACTACTCCAA	ATGAAAACAA	TCGACCCTTT
GCTGCTGCCA				330

176 936

AAGATATTGT

AGTGGTTCAA

TTTTAGGCCC

AAACTTGGAG

AAACTCGTGT

ATCAAAACAA

ATAAGCCAGT

GATGCTAAGA

TGTATGACAlT

CATCACTTTG

TTACTCATAC

GCTGTTGCTA

CTGTTGGTGA

CAAGAGGATC

CAGCATTTTC

TCATTAGGCA

CTGGCACTAA

AAATGGGGTC

CTCTACGATG

TACATGACTG

ATTATTACAT

CTCAGGGTTC

AAGAAAATGC

GCTAATATGG

AATTATTAGT

GACAGTCCTG

AAACCTATGA

ACCCTTTTAC

AATGTATGAT

GCATCAAGCT

AATATTCACT

ATGCTATTCC

TAGTAATGGT

TCCGGCGTTA

TTCAATTAAG

TTCAGAGTTT

GATGTTAGCT

TTCTACTGTT

ATTAAATGGC

ACAAGTTGGT

GGAAGCTCTA

TTCGAACATG

GGAAAATATC

TTGACAGAAG

AAGTCAAATT

ACAGCAGCAG

GCTAGATATG

TTATCCCTTA

TCATTGGATT

GATAAAACAT

ATACAGCAAA

TTTCAAGCTC

ACAACTACTG

GAAACATTAT

AAGAGATTTG

GCCCTCATAT

TTCTGCAAGT

TTGCCATCTC

TAGCAAAGTC

CTCCAATATA

AGTTCAATCT

GCGTTGCAAC

ACAAGCAAAT

ATACAGCAGA

TGACTAATGC

GTCATTCACA

AAATGGATGA

TGAAGAAACC

CAAAATTGCT

TTTTAATTAT

360

TCTTCAAGAA

422

AAGCTTTGAC

420

TCCAGAATTG

540

TTTTCCTCCA

660

TGTTGATGGT

660

GAGACTTGCA

770

GTTGTTGCTC

770

AGAGGCAGCT

880

AGCAAGTTCT

990

AAACAATTAC

966

TGCGTCTGAG

102 0

AGTTTCCAAA

108 0

CTCTGATAGG

AAGAAACTCC

1120

176 936

GAGCAAACAA AGCTTCTTAT TAATGAGAAT TC (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID.: 23:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1100 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NR ID.: 23:

CCATGGTTGG AAGAAATGGT GACTGTTCTA AGTATTGATG

TAAGGGAATC

ATTCCAGCTA TCATTCTCGA ATTTCTTGAA GGACAACTTC

CAATAATAAA

GATGCAAGAC TTGCAGATTA CTTTGATGTA ATTGGAGGAA

AGGTTTATTG

ACTGCTATGA TAACTACTCC AAATGAAAAC AATCGACCCT

CAAAGATATT

GTACCCTTTT ACTTCGAACA TGGCCCTCAT ATTTTTAATT

AATTTTAGGC

CCAATGTATG ATGGAAAATA TCTTCTGCAA GTTCTTCAAG

AGAAACTCGT

GTGCATCAAG CTTTGACGGA AGTTGCCATC TCAAGCTTTG

AAATAAGCCA

GTAATATTCA CTAAGTCAAA TTTAGCAAAG TCTCCAGAAT

GATGTATGAC

1172

GAGGTGGAAT

AGGAAGTGGA

120

CAAGTACAGG

180

TTGCTGCTGC

240

ATAGTGGTTC

300

AAAAACTTGG

3300

ACATCAAAAC

400

TGGATGCTAA

400

176 936

ATATGCTATT CCACAGCAGC AGCTCCAATA TAaτaaCCTC CACATCACTT

TGTaACTCAa 540

ACTAGTAATG GTGCTAGATA TGAGTTCAAT CTTGTTGATG GTGCTGTTGC

TACTGTTGGT 6(00

GATCCGGCGT TATTATCCCT TAGCGTTGCA ACGAGACTTG CACAAGAGGA

TCCAGCATaa 660 τcaacAAaτA agtcattgga ttacaagcaa atgttgttgc tctcattagg

CACTGGCACT 72o

AATTCAGAGT TTGATAAAAC ATATACAGCA GAAGAGGCAG CTAAATGGGG

TCCTCTACGA 730

TGGATGTTAG CTATACAGCA AATGACTAAT GCAGCAAGTT TTTACATGAC

TGATTATTAC 84 0

ATTTCTACTG TTTTTCAAGC TCGTCATTCA CAAAACAATT ACCTCAGGGT

TCAAGAAAAT 900

GCATTAAATG GCACAACTAC TGAAATGGAT GATGCGTCTG AGGCTAATAT

GGAATTATTA 9(50

GTACAAGTTG GTGAAACATT ATTGAAGAAA CCAGTTTCCA GAGACAGTCC

TGAAACCTAT 1020

GAGGAAGCTC TAAAGAGATT TGCAAAATTG CTCTCTGATA GGAAGAAACT

CCGAGCAAAC 1080

AAAGCTTCTT ATTAATGAGA ATTC 1104 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID.: 24:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1172 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy

176 936 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYi CZĄSTECZKI: cDJA (xi) OPIS SEK^EJCJ]: SEKEERCJA JR ID.: 20:

CCATGGCAAC

ACTACTAGTT

CAACATGTGC

GGTGGAATTA

AGGGAATCAT

GAAGTGGACA

ATAATAAAGA

AGTACAGGAG

GTTTATTGAC

GCTGCTGCCA

AAGATATTGT

AGTGGTTCAA

TTTTAGGCCC

AAACTTGGAG

AAACTCGTGT

ATCAAAACAA

ATAAGCCAGT

GATGCTAAGA

TGTATGACAT

CATCACTTTG

TTACTCATAC

GCTGTTGCTA

CTGTTGGTGA

CAAGAGGATC

TACTAAATCT

TTTTTAATTT

TATTTTTTAT

TAAGTTGGAA

GAAATGGTTA

CTGTTCTAAG

TCCAGCTATC

TGCAAGACTT

TGCTATGATA

ACCCT.TTTAC

AATGTATGAT

GCATCAAGCT

AATATTCACT

ATGCTATTCC

TAGTAATGGT

TCCGGCGTTA

ATTCTCGAAT

GCAGATTACT

ACTACTCCAA

TTCGAACATG

GGAAAATATC

TTGACAGAAG

AAGTCAAATT

ACAGCAGCAG

GCTAGATATG

TTATCCCTTA

TTCTTGAAGG

TTGATGTAAT

ATGAAAACAA

GCCCTCATAT

TTCTGCAAGT

TTGCCATCTC

TAGCAAAGTC

CTCCAATATA

AGTTCAATCT

GCGTTGCAAC

GATATTAGCA

TATTGATGGA

120

ACAACTTCAG

1.80

TGGAGGAACA

240

TCGACCCTTT

300

TTTTAATTAT

60

TCTTCAAGAA

420

AAGCTTTGAC

480

TCCAGAATTG

540

TTTTCCTCCA

600

TGTTGATGGT

660

GAGACTTGCA

720

176 936

CAGCATTTTC	TTCAATTAAG	TCATTGGATT	ACAAGCAAAT	GTTGTTGCTC
TCATTAGGCA				7 80
CTGGCACTAA	TTCAGAGTTT	GATAAAACAT	ATACAGCAGA	AGAGGCAGCT
AAATGGGGTC				880
CTCTACGATG	GATGTTAGCT	ATACAGCAAA	TGACTAATGC	AGCAAGTTCT
TACATGACTG				990
ATTATTACAT	TTCTACTGTT	TTTCAAGCTC	GTCATTCACA	AAACAATTAC
CTCAGGGTTC				990
AAGAAAATGC	ATTAAATGGC	ACAACTACTG	AAATGGATGA	TGCGTCTGAG
GCTAATATGG				1100
AATTATTAGT	ACAAGTTGGT	GCAACATTAT	TGAAGAAACC	AGTCTCCAAA
GACAGTCCTG				1100
AAACCTATGA	GGAAGCTCTA	AAGAGATTTG	CAAAATTGCT	CTCTGATAGG
AAGAAACTCC				1140
GAGCAAACAA	AGCTTCTTAT	TAATGAGAAT	TC	11172

(2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID.: 25:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1175 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NR ID.: 25:

CCATGGCAAC TACTAAATCT TTTACAATTT TAATTTTTAT GATGTTAGCA

ACTACTAGTT 66

176 936

CAACATTTGC

GGTGGAATTA

AGGGAATCAT

GAAGTGGACA

ATAATGCAGA

GGTACAGGAG

GTTTATTGAC

GCTGCTGCTA

AAGATATTAT

AGTGGTTTTC

ACCTTTTTGA

GAAAAACTTG

GAGAAACTCG

GACATCAAAA

CAAATAAGCC

TTGGATGCTA

AGATGTATGA

CCACATTACT

TTGCTACTAA

GGCGATGTTG

CTGCTGGTGA

CAAGAGGATC

CAGCATTTGC

TCATTAGGCA

CTGGCACTAA

AAATGGGGTA

TTCTACAATG

TCTTACATGA

TACATTGGGA

TCCGGCTACC

TGCAAGACTT

TGCTATGATA

ACCTTTTTAC

GCCAAAATAT

TGTGCATCAA

AGTAATATTC

CATATGTTAT

TACTAGTAAT

TCCGTCGTTA

TTCAATTAAG

TTCAGAGTTT

GGTATTCTCA

GAAATGGTGA

ATTCTCGAAT

GCAGATTACT

ACTACTCCAA

TTCGATCATG

GATGGAAAAT

GCTTTGACAG

ACTAAGTCAA

TCCACAGCAG

GGAGATCAAT

TTATCCATTA

TCATTGAATT

GCTAAAAACT

CCTTTATGGG

CTGTTCTTAG

TTCTTGAAGG

TTGATGTAAT

ATGAAAACAA

GCCCTAAGAT

ATCTTATGCA

GAGTTGCCAT

GTTTAGCAAA

CAGCTCCAAC

ATGACCTCAA

GCGTTGCAAC

ACAAACAAAT

ATACAGCAGA

AAATGAGAAG

TATTGATGGA

3120

ACAACTTCAG

318 0

TGGAGGAACA

240

TCGACCTTTT

3300

TTTTGAACCT

00

AGTTCTTCAA

400

CTCAAGCTTT

400

AACTCCAGAA

500

ATATTTTCCT

000

TCTTGTTGAT

600

GAGACTTGCA

720

GTTGTTGCTC

700

AGAGGCAGCT

0

TGCAGCAAGT

900

176 936

ATGATTATTA TACCTCAGGG	CCTTTCTACT	GTTTTTCAAG	CTCTTGATTC	ACAAAACAAT 960
TTCAAGAAAA	TGCATTAACA	GGCACAGCTA	CTACATTTGA	TGATGCTTCT
CTGGCTAATA				102 0
TGATATTATT	AGTACAAGTT	GGTGAAAACT	TATTGAAGAA	ATCAGTTTCC
GAAGACAATC				1880
ATGAAACCTA	TGAGGTAGCT	CTAAAGAGGT	TTGCAAAATT	GCTCTCTGAT
AGGAAGAAAC				1200
TCCGAGCAAA	CAAAGCTTCT	TATTAATGAG	AATTC	1175

(2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID.: 26:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 33 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (syntetyczny) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NR ID.: 26:

GTTAGATCTC ACCATGGCAA CTACTAAATC TTT 33 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID.: 27:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 33 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy

176 936 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZK:: DNA (syntetyczny) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NR ID.: 27:

CCAGAATTCT CATTAATAAG AAGCTTTGTT TGC 33 (2) INFOfRMACJA DUA SEIKIENCJI NR ID.: 28:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1172 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NR ID.: 28:

CCATGGCAAC ACTACTAGTT	TACTAAATCT	TTTACAATTT	TAATTTTTAT	GATGTTAGCA 00
CAACATTTGC	TACATTGGGA	GAAATGGTGA	CTGTTCTTAG	TATTGATGGA
GGTGGAATTA				120
AGGGAATCAT	TCCGGCTACC	ATTCTCGAAT	TTCTTGAAGG	ACAACTTCAG
GAAGTGGACA				180
ATAATACAGA	TGCAAGACTT	GCAGATTACT	TTGATGTAAT	TGGAGGAACA
GGTACAGGAG				200
GTTTATTGAC	TGCTATGATA	ACTACTCCAA	ATGAAAACAA	TCGACCCTTT
GCTGCTGCTA				300
AAGATATTAT	ACCTTTTTAC	TTCGATCATG	GCCCTCAGAT	TTTTGAACCT

AGTGGTCTTC 360

176 936

AAATTTTTGG

GAAAAACTTG

GAGAAACTCG

GACATCAAAA

CAAATAAGCC

TTGGATGCTA

AGATGTATGA

CCACATTACT

TTGCTACTAA

GGTGATGTTG

CTGCTGGTGA

CAAGAGGATC

CAGCATTTGC

TCATTAGGCA

CTGGCACTAC

AAATGGGGTA

TTCTACAATG

TACATGAATG attattacct

CTCAGGGTTC

AAGAAAATGC

GCTAATATGA

TATTATTAGT

GACAATCATG

AAACCTATGA

AAGAAACTCC

CCCAAAATAT

TGTGCATCAA

AGTAATATTC

CATATGTTAT

TACTAGTAAT

TCCGTCGTTA

TTCAATTAGG

TTCAGAGTTT

GCTGTTACCT

TTCTACTGTT

ATTAACAGGC

ACAAGTTGGT

GGTAGCTCTA

GATGGAAAAT

GCTTTGACAG

ACTAAGTCAA

TCCACAGCAG

GGAGATCAAT

TTATCCATTA

TCGTTGAATT

TATAAAAACT

TTACAGGAAA

TTTCAAGGCTC

ACAGCTACTA

GAAAACTTAT

AAGAGGTTTG

ATCTTATGCA

AAGTTGCCAT

ATTTAGCAAA

CAGCTCCAACC

ATGACTTCAA

GCGTTGCAAC

ACAAACAAAT

ATACAGCAGA

TGAGAAGTGC

TTGATTCACA

AATTTGATGA

TGAAGAAATC

CAAAATTGCT

AGTTCTTCAA

420

CTCAAGCTTT

480

AACTCCAGAA

540

ATATTTTCCT

600

TCTTGTTGAT

660

GAGACTTGCA

770

GTTGTTGCTC

770

AGAGGCAGCT

804

AGCAAGTTCT

990

AAACAATTTAC

996

TGCTTCTGTG

1002

AGTTTCTGAA

H00

CTCCGATAGG

1114

GAGCAAACAA AGCTTCTTAT TAATGAGAAT TC

1112

176 936 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID.: 26:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1172 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CCASTECCKI: cDNA (cif OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NR ID.: 26:

CCATGGCAAC ACTACTAGTT	TACTAAATCT	TTTACAATTT	TAATTTTTAT	GATGTTAGCA 60
CAACATTTGC	TACATTGGGA	GAAATGGTGA	CTGTTCTTAG	TATTGATGGA
GGTGGAATTA				120
AGGGAATCAT	TCCGGCTACC	ATTCTCGAAT	TTCTTGAAGG	ACAACTTCAG
GAAGTGGACA				180
ATAATACAGA	TGCAAGACTT	GCAGATTACT	TTGATGTAAT	TGGAGGAACA
GGTACAGGAG				240
GTTTATTGAC	TGCTATGATA	ACTACTCCAA	ATGAAAACAA	TCGACCCTTT
GCTGCTGCTA				300
AAGATATTAT	ACCTTTTTAC	TTCGATCATG	GCCCTCAGAT	TTTTGAACCT
AGTGGTTCAA				360
TTTTTGATGG	CCCAAAATAT	GATGGAAAAC	ATCTTATGCA	AGTTCTT2AA
GAAAAACTAG				420
GAGAAACTCG	TGTGCATCAA	ACTTTGACAG	AAGTTGCCAT	CTCAAGCTTT
GACATCAAAA				480
CAAATAAGCC	AGTAATATTC	ACTAAGTCAA	ATTTACCAAA	AACTCCAGAA
TTGGATGCTA				540

176 936

AGATGTATGA

CCACATTACT

TTGCTACTAA

GGTGATGTTG

CTGCTGGTGA

CAAGAGGATC

CAGCATTTGC

TCATTAGGCA

CTGGCACTAC

AAATGGGGTA

TTCTACAATG

TACATGAATG

ATTATTACCT

CTCAGGGTTC

AAGAAAATGC

GCTAATATGA

TATTATTAGT

GACAATCATG

AAACCTATGA

AAGAAACTCC

GAGCAAACAA

1172

CATATGTTAT

TACTAGTAAT

TCCGTCGTTA

TTCAATTAGG

TTCAGAGTTT

GCTGTTACCT

TTCTACTGTT

ATTAACAGGC

ACAAGTTGGT

GGTAGCTCTA

AGCTTCTTAT

TCCACAGCAG

GGAGATCAAT

TTATCCATTA

TCGTTGAATT

TATAAAAACT

TTACAGGAAA

TTTCAAGCTC

ACAGCTACTA

GAAAACTTAT

AAGAGGTTTG

TAATGAGAAT

CAGCTCCAAC

ATGACTTCAA

GCGTTGCAAC

ACAAACAAAT

ATACAGCAGA

TGAGAAGTGC

TTGATTCACA

AATTTGATGA

TGAAGAAATC

CAAAATTGCT

TC (2) INFORMACJA DLA SEK^EJCJ] JR ID.: 00:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKEEJCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1122 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy

ATATTTTCCT

600)

TCTTGTTGAT

600

GAGACTTGCA

720

GTTGTTGCTC

720

AGAGGCAGCT

800

AGCAAGTTCT

990

AAACAATTAC

990

TGCTTCTGTG

1102

AGTTTCTGAA

1100

CTCCGATAGG

1110

176 936 (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NR ID.: 30:

CCATGGCAAC TACTAAATCT TTTTTAATTT TAATATTTAT GATATTAGCA

ACTACTAGTT 60

CAACATTTGC TCAGTTGGGA GAAATGGTGA CTGTTCTTAG TATTGATGGA

GGTGGAATTA 120

GAGGGATCAT TCCGGCTACC ATTCTCGAAT TTCTTGAAGG ACAACTTCAG

GAAATGGACA 180

ATAATGCAGA TGCAAGACTT GCAGATTACT TTGATGTAAT TGGAGGAACA

AGTACAGGAG 240

GTTTATTGAC TGCTATGATA AGTACTCCAA ATGAAAACAA TCGACCCTTT

GCTGCTGCCA 300

AAGAAATTGT ACCTTTTTAC TTCGAACATG GCCCTCAGAT TTTTAATCCT

AGTGGTCAAA 360

TTTTAGGCCC AAAATATGAT GGAAAATATC TTATGCAAGT TCTTCAAGAA

AAACTTGGAG 220

AAACTCGTGT GCATCAAGCT TTGACAGAAG TTGTCATCTC AAGCTTTGAC

ATCAAAACAA 280

ATAAGCCAGT AATATTCACT AAGTCAAATT TAGCAAACTC TCCAGAATTG

GATGCTAAGA 52 0

TGTATGACAT AAGTTATTCC ACAGCAGCAG CTCCAACATA TTTTCCTCCG

CATTACTTTG 600

TTACTAATAC TAGTAATGGA GATGAATATG AGTTCAATCT TGTTGATGGT

GCTGTTGCTA 660

176 936

CTGTTGCTGA

CAAAAGGATC

CAGCATTTGC

TCATTAGGCA

CTGGCACTAC

ACCTGGACTG

CTGTACATTG

TACATGACTG

ATTATTACCT

CTCAGGGTTC

AAGAAAATGC

GCTAATATGG

AATTATTAGT

GACAATCCTG

AAACCTATGA

AAGAAACTCC

GAGCAAACAA

TCCGGCGTTA

TTCAATTAGG

TTCAGAGTTT

GATGTTAGTT

TTCTACTGCT

ATTAACAGGC

ACAAGTTGGT

GGAAGCTCTA

AGCTTCTTAT

TTATCCATTA

TCATTGAATT

GATAAAACAT

ATACAGAAAA

TTTCAAGCTC

ACAACTACTG

GAAAACTTAT

AAGAGGTTTG

TAATGAGAAT

GCGTTGCAAC

ACAAAAAAAT

ATACAGCAAA

TGACTGATGC

TTGATTCAAA

AAATGGATGA

TGAAGAAACC

CAAAATTGCT

TC

GAGACTTGCA

7320

GCTGTTGCTC

0

AGAGGCAGCT

8-40

AGCAAGTTCT

900

AAACAATTAC

960

TGCTTCTGAG

1020

AGTTTCCGAA

1080

CTCTGATAGG

1140

1172 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID.: 31:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1106 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NR ID.: 31:

176 936

CCATGGCGTT

ATTAGAGGGA

TCATTCCGGC

GACAATAATG

CAGATGCAAG

GGAGGTTTAT

TGACTGCTAT

GCCAAAGAAA

TTGTACCTTT

CAAATTTTAG

GCCCAAAATA

GGAGAAACTC

GTGTGCATCA

ACAAATAAGC

CAGTAATATT

AAGATGTATG

ACATAAGTTA

TTTGTTACTA

ATACTAGTAA

GCTACTGTTG

CTGATCCGGC

GATCCAGCAT

TTGCTTCAAT

GGCACTGGCA

CTACTTCAGA

ACTGCTGTAC

ATTGGATGTT

ACTGATTATT

GGAAGAAATG

TACCATTCTC

ACTTGCAGAT

GATAAGTACT

TTACTTCGAA

TGATGGAAAA

GGCTTTGACA

CACTAAGTCA

TTCCACAGCA

TGGAGATGAA

GTTATTATCC

TAGGTCATTG

GTTTGATAAA

AGTTATACAG

GTGACTGTTC

GAATTTCTTG

TACTTTGATG

CCAAATGAAA

CATGGCCCTC

TATCTTATGC

GAAGTTGTCA

AATTTAGCAA

GCAGCTCCAA

TATGAGTTCA

ATTAGCGTTG

AATTACAAAA

ACATATACAG

AAAATGACTG

TTAGTATTGA

AAGGACAACT

TAATTGGAGG

ACAATCGACC

AGATTTTTAA

AAGTTCTTCA

TCTCAAGCTT

ACTCTCCAGA

CATATTTTCC

ATCTTGTTGA

CAACGAGACT

AAATGCTGTT

CAAAAGAGGC

ATGCAGCAAG

TGGAGGTGGA

TCAGGAAATG

112

AACAAGTACA

110

CTTTGCTGCT

220

TCCTAGTGGT

300

AGAAAAACTT

3560

TGACATCAAA

420

ATTGGATGCT

0880

TCCGCATTAC

0

TGGTGCTGTT

600

TGCACAAAAG

600

GCTCTCATTA

720

AGCTACCTGG

780

TTCTTACATG

840

176 936

ACCTTTCTAC TGCTTTTCAA GCTCTTGATT CAAAAAACAA TTACCTCAGG

GTTCAAGAAA 900

ATGCATTAAC AGGCACAACT ACTGAAATGG ATGATGC-TTC TGAGGCTAAT

ATGGAATTAT 960

TAGTACAAGT TGGTGAAAAC TTATTGAAGA AACCAGTTTC CGAAGACAAT

CCTGAAACCT lC^^O

ATGAGGAAGC TCTAAAGAGG TTTGCAAAAT TGCTCTCTGA TAGGAAGAAA

CTCCGAGCAA 1080

ACAAAGCTTC TTATTAATGA GAATTC 11^06 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID.: 32:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 25 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CĄĄSTCCZKI : ^]^A (syntttyczyy) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NR ID.: 32:

CCATCTAGAA GASCTCCACC AGGCGSTGGP GGGAAAGGS P GASGP 45 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID.: 33:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(G) DŁUGOŚĆ: 1162 pary zasad (B) SYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy

176 936 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: CDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NR ID.: 33:

ATGGCCACCA

CACCAGCAGC

ACCTTCGCCC

TGGCATCAGG

GGCATCATCC

GATGGACAAC

AACGCCGACG

CACCGGCGGT

CTCCTGACCG

CGCTGCGAAG

GAGATCGTCC

GGGTCAAATC

CTGGGCCCCA

GCTGGGCGAG

ACTAGGGTGC

CAAGACCAAC

AAGCCAGTCA

CGCTAAGATG

TACGACATCT

CTACTTCGTC

ACCAACACCA

GGTGGCTACG

GTGGCGGACC

GAAGGATCCA

CCAAGAGCTT

CCTCATCCTG

ATCTTCATGA

AGCTCGGCGA

GATGGTGACC

GTGCTCTCCA

CGGCCACCAT

CCTGGAGTTC

CTGGAGGGCC

CCCGCCTGGC

CCATGATCTC

CGTTCTACTT

AGTACGACGG

ACCAGGCGCT

TCTTCACCAA

CCTACTCCAC

GCAACGGCGA

CGGCGCTCCT

CGACTACTTC

CACTCCGAAC

CGAACACGGC

CAAGTACCTT

GACCGAGGTC

GTCCAACCTG

TGCTGCCGCT

CGAGTACGAG

GTCCATCAGC

GACGTGATCG

GAGAACAACC

CCTCAGATTT

ATGCAAGTGC

GTCATCTCCA

GCCAACAGCC

CCCACGTACT

TTCAACCTTG

GTCGCCACGC

TCCTGGCCAC

TCGACGGCGG

0

AACTCCAGGA

180

GTGGCACCAG

240

GCCCCTTCGC

300

TCAACCCCTC

3360

TTCAGGAGAA

420

GCTTCGACAT

480

CGGAGCTGGA

540

TCCCTCCGCA

600

TTGACGGTGC

660

GCCTGGCCCA

720

176 936

GCCTTCGCTA

CCTGGGCACT

GGCACGACCT

CTGGACCGCC

GTCCATTGGA

CATGACCGAC

TACTACCTCT

CCGTGTTCAG

GAGAATGCCC

CAACATGGAG

CTGCTCGTCC

CAATCCCGAG

ACCTATGAGG

GAAACTCCGC

GCTAACAAGG

GCATTAGGAG CCTCAACTAC

CCGAGTTCGA

TGCTGGTCAT

CCACTGCGTT

TCACTGGCAC

AGGTGGGTGA

AAGCGCTCAA

CAAGACCTAC

CCAGAAGATG

CCAGGCGCTT

CACGACCGAG

GAACCTCCTG

GCGCTTTGCC

CCAGCTACTA ATGA

AAGAAGATGC

ACTGCCAAGG

ACGGACGCCG

GACTCCAAGA

ATGGACGATG

AAGAAGCCCG

AAGCTGCTCT

TGCTGCTCAG

700

AGGCCGCTAC

800

CTTCCAGCTA

900

ACAACTACCT

960

CCTCCGAGGC

1020

TCTCCGAAGA

1080

CTGATAGGAA

1140

1164

Monsanto Company

Castępca:

176 936

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Claims (8)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób zwalczania owadów na roślinach, znamienny tym, że stosuje się skuteczną ilość owadobójczej patatyny.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się patatynę wytwaramąprzez kolonizujące roślinę mikroorganizmy wytwarzające patatynę po umieszczeniu ich na roślinie.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się patatynę wytwarzaną dzięki ekspresji genu patatyny wstawionego w roślinę metodąwcześniejszej transformacji genetycznej macierzystej komórki rośliny.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako roślinę stosuje się bawełnę, kukurydzę, pomidor lub ziemniak.
5. 5. Sposób wytwarzania genetycznie transformowanych roślin odpornych na owady i wydzielających w wyniku ekspresji owadobójczo skuteczną ilość patatyny polegający na transformacji komórki gospodarza genem kodującym pożądane białko, otrzymywaniu transformowanych komórek roślinnych oraz regenerowaniu z tych transformowanych komórek roślinnych roślin wykazujących ekspresję owadobójczo skutecznej ilości patatyny, znamienny tym, że wstawia się do genomu komórki roślinnej rekombinacyjną, dwułańcuchową cząsteczkę DNA promotor powodujący powstawanie w komórkach rośliny sekwencji RNA;

   strukturalną sekwencję kodującąpatatynę; nietranslowany region 3' powodujący dodanie w komórce rośliny nukleotydów poliadenylujących do końca 3' sekwencji RNA, przy czym promotor jest heterologiczny w odniesieniu do strukturalnej sekwencji kodującej oraz jest operatywnie połączony ze strukturalną sekwencjąkodującą, którajest z kolei operatywnie połączona ze wspomnianym nietranslowanym regionem; przy czym promotorjest heterologiczny w odniesieniu do strukturalnej sekwencji kodującej, a rośliny wybiera się spośród bawełny, kukurydzy, pomidora i ziemniaka.
6. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że jako strukturalną sekwencję kodującą stosuje się sekwencję nr id. 30 lub sekwencję nr id. 31.
7. 7. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że jako roślinę stosuje się kukurydzę.
8. 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że jako strukturalną sekwencję kodującą stosuje się sekwencję nr id. 33.

   * * *