PL179275B1 - Sposób wykrywania zwiazków przeciwbakteryjnychi zestaw do wykrywania zwiazków przeciwbakteryjnych PL PL - Google Patents

Abstract

1 . Sposób wykrywania zwiazków przeciwbakteryjnych w testowej próbce, zna mienny tym, ze (a) wprowadza sie testowy organizm, i co najmniej dwa wskazniki re- doks do pozywki agarowej, (b) umozliwia sie testowej próbce wejscie w kontakt z po- zywka agarowa tak, ze zwiazki przeciwbakteryjne w testowej próbce hamuja rozwój te- stowego organizmu w pozywce agarowej, i (c) koreluje sie wzrost testowego organizmu z obecnoscia lub brakiem zwiazku przeciwbakteryjnego w próbce, przy czym testowy or- ganizm stanowia Bacillus stearothermophilus lub Streptococcus thermophilus. 12. Zestaw do wykrywania zwiazków przeciwbakteryjnych, znamienny tym, ze sklada sie z pozywki agarowej zawierajacej testowy organizm, wybrany z grupy obej- mujacej Bacillus stearothermophilus i Streptococcus thermophilus, ewentualnie oddziel- nego zródla skladników odzywczych, i dwóch lub wiekszej liczby wskazników redoks, przy czym kazdy z nich moze byc obecny w pozywce agarowej lub w oddzielnym zródle skladników odzywczych. P L 1 7 9 2 7 5 B 1 PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania związków przeciwbakteryjnych zwłaszcza w testowej próbce oraz zestaw do wykiy wania związków przeciwbakteryjnych.

Podobne próby opisano w brytyjskim opisie zgłoszenia patentowego nr 1467439, w opisie europejskiego zgłoszenia patentowego 0005891 i w niemieckim opisie patentowym nr DE 3613794. Wszystkie te dokumenty dotyczą testów gotowych do użycia w których stosuje się organizm testowy i które zazwyczaj dają wynik po 2,5 do 3,5 godzin, w postaci zmiany koloru wskaźnika kwasowo-zasadowego lub wskaźnika redox, dodanego do układu testującego. Zasada ich działania jest taka, że gdy związek przeciwbakteryjny obecny jest w próbce płynu w stężeniu wystarczającym do zahamowania wzrostu organizmu testowego, to kolor wskaźnika pozostaje taki sam, natomiast gdy hamowanie nie zachodzi, wzrostowi testowego organizmu towarzyszy powstawanie kwasu lub zredukowanych metabolitów, co powoduje zmianę koloru wskaźnika. We wszystkich tych próbach stosuje się pojedynczy wskaźnik do wykrywania powstawania kwasu lub zredukowanych metabolitów.

Zgodnie z wynalazkiem można osiągnąć znaczne skrócenie czasu trwania testu, aż do jednej godziny, stosując kombinacje dwóch lub 'większej liczby wskaźników. Takie skrócenie czasu trwania testu ma duże znaczenie dla użytkowników, gdyż jakość próbki płynu jest znana szybciej, pozwalając w ten sposób np. na jego szybsze dostarczenie lub przetworzenie.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania związków przeciwbakteryjnych w testowej próbce, polegający na tym, że (a) wprowadza się testowy organizm, stanowiący Bacillus Stearothermophilus lub Streptococcus thermophilus i co najmniej dwa wskaźniki redoks do pożywki agarowej, (b) umożliwia się testowej próbce wejście w kontakt z pożywką agarową tak, że związki przeciwbakteryjne w testowej próbce hamują rozwój testowego organizmu w pożywce agarowej i (c) koreluje się wzrost testowego organizmu z obecnością lub brakiem związku przeciwbakteryjnego w próbce, przy czym organizm testowy stanowią Bacillus stearothermophilus lub Streptococcus thermophilus.

W korzystnym wykonaniu sposobu według wynalazku pożywkę agarową można buforować a także można dodawać źródło składników odżywczych. Korzystnie, jako źródło składników odżywczych lub jego część, dodaje się jako oddzielne źródło składników odżywczych, takie jak tabletka lub krążek bibułowy.

Takie źródło składników odżywczych może zawierać dodatkowo co najmniej jeden wskaźnik redoks zmieniający kolor w widzialnej części widma, ewentualnie dwa wskaźniki redoks. Również korzystnie, stosuje się co najmniej jeden ze wskaźników redoks zmieniający kolor w widzialnej części widma.

W sposobie według wynalazku można stosować testowy organizm o dającej się nastawić wrażliwości na związki przeciwbakteryjne. W przypadku gdy stosuje się testowy organizm o takiej cesze, w sposobie według wynalazku do pożywki agarowej korzystnie dodatkowo dodaje się co najmniej jedną substancję zmieniającą wrażliwość testowego organizmu na związki przeciwbakteryjne. Korzystnie jako substancję zmieniającą wrażliwość stosuje się związek hamujący metabolizm kwasu foliowego, a jako związek o takim działaniu jeszcze bardziej korzystnie stosuje się trymetoprym, ormetoprym lub tetroproksym.

179 275

Organizm testowy korzystnie w sposobie według wynalazku stosuje się w ilości 10⁵ do 10⁹ jednostek tworzących kolonie na mililitr pożywki agarowej.

Przedmiotem wynalazku jest także zestaw do wykrywania związków przeciwbakteryjnych, składający się z pożywki agarowej zawierającej testowy organizm, wybrany z grupy obejmującej Bacillus stearothermophilus i Streptococcus thermophilus, ewentualnie oddzielne źródło składników odżywczych oraz dwa lub większą liczbę wskaźników redoks, przy czym każdy z nich może być obecny w pożywce agarowej, lub w oddzielnym źródle składników odżywczych.

W korzystnym wykonaniu zestawu według wynalazku zestaw ten zawiera zbuforowaną pożywkę agarową, a jeszcze bardziej korzystnie pożywka taka może zawierać ponadto co najmniej jeden składnik odżywczy.

W innym korzystnym aspekcie zestawu według wynalazku zestaw ten zawiera oddzielne źródło środków odżywczych, zawierające co najmniej jeden wskaźnik redoks, ewentualnie co najmniej dwa wskaźniki redoks.

Zgodnie z realizacją sposobu według wynalazku, w zestawie według wynalazku można stosować wiele różnych wskaźników redoks. Takie wskaźniki redoks znane są również jako czynniki redoks, katalizatory redoks i nośniki elektronów. Przykładami takich związków są: Brilliant Black, Methylene Blue, Toluidine Blue, Safranine 0, Indigo Carmin, Thionin, Gallocyanine, Nile Blue A, Brilliant Crocein MOO, Acid Yellow 38, Acid Orange 51, Acid Blue 120, Basic Blue 3, Azure A, Azure B, Congo Red, 1-10 Phenanthroline, Janus Green B, Brilliant Cresyl Blue.

Można również stosować inne wskaźniki redoks (czynniki redoks, katalizatory redoks i nośniki elektronów). Związki takie są dostępne w handlu (patrz np. Stains, Dyes and Indicators, Catalog of Aldrich Chemie). Korzystnie jeden ze wskaźników powinien dawać zmianę koloru w widzialnej części widma. Korzystnymi kombinacjami są: Brilliant Black i Methylene Blue, Brilliant Black i Toluidine Blue, Brilliant Black i Nile Blue A.

Składniki odżywcze dodaje się w celu umożliwienia namnażania się organizmów testowych.

Zestaw według wynalazku ewentualnie zawiera co najmniej część składników odżywczych, które nie są włączone do pożywki agarowej i tym samym są dodawane jako odrębne źródło, na przykład jako tabletka lub krążek bibuły. Takie odrębne źródła składników odżywczych można umieszczać na pożywce agarowej przed przeprowadzeniem testu. Substancje odżywcze mogą być obecne zarówno w pożywce agarowej jak i jako źródło odrębne. Co najmniej jeden ze wskaźników redoks można włączyć do odrębnego źródła składników odżywczych.

W skład zestawu można także wprowadzać składniki odżywcze np. w postaci tabletki i jeden lub obydwa wskaźniki redoks, podejmując przedtem kroki, aby zapobiec przenoszeniu wilgoci z pożywki agarowej do tabletki. Można to zrobić np. przez powleczenie tabletek warstwą odporną na wilgoć np. woskiem, która to powłoka musi ulegać degradacji lub topić się w czasie trwania procesu testowania. Odpowiedni jest wosk o temperaturze topnienia od 35°C do 55°C, lub co daje lepsze rezultaty od 40°C do 45°C.

Szczep C 953 Bacillus stearothermophilus var. calidolactis został zdeponowany w Laboratory of Microbiology of the Technical Uniwersity of Delft pod numerem LMD 74.1 w 1974 r. i w Centraal Bureau voor schimmmelcutures (CBS), Baam pod numerem depozytowym VDS 760.83 w 1983, gdzie szczep tej jest dostępny publicznie. Mikroorganizm tej jest bardzo wrażliwy na penicylinę i inne antybiotyki i jest organizmem bardzo szybko wzrastającym. Dodatkową korzyścią jest to, że jego optymalna temperatura wzrostu jest wysoka (pomiędzy 50 a 70°C). Tylko kilka gatunków bakterii jest zdolnych do wzrostu w tej temperaturze. Dlatego też istnieje bardzo mała możliwość, aby organizmy obecne w płynie testowym lub które zostały tam wprowadzone w jakiś inny sposób oddziaływały na wynik testu.

Gdy organizmem testowym jest szczep Bacillus, jest on korzystnie włączony do pożywki agarowej w postaci zawiesiny sporów, którą można sporządzać w znany sposób (opis brytyjskiego zgłoszenia patentowego GB-A-1467439). Zawiesinę sporów wprowadza się do pożywki agarowej w znany sposób (opis brytyjskiego zgłoszenia patentowego 1467439).

179 275

Zgodnie z korzystną postacią wynalazku wrażliwość testowego organizmu daje się nastawiać. Wrażliwość tę można zmieniać różnymi środkami np. przez dodanie pewnych substancji, przez zmianę warunków testu takich jak pH lub stężenie substancji buforujących, agar lub spory, lub przez zmianę stosunków objętości agaru i testowanego płynu. Przykładami substancji, które można dodawać są nukleozydy, takie jak adenozyna lub antyfolaty, czyli związki hamujące metabolizm kwasu foliowego, takie jak trimetoprym (trimethoprim), ormetoprym i tetroproksym (tetroxprim), które poprawiają wrażliwość organizmu testowego wobec związków siarki, sole kwasu szczawiowego lub kwasu fluorowodorowego, które poprawiają wrażliwość na tetracyklinę, i cysteina, zmniejszająca wrażliwość na penicylinę.

Zestaw można stosować do wykrywania związków przeciwbakteryjnych w płynach, takich jak np. mleko, woda, soki mięsne, surowica lub mocz.

Przy wykrywaniu pozostałości związków przeciwbakteryjnych w płynach, na przykład w płynach biologicznych takich jak mleko, woda, sok: mięsny, surowica i mocz, z użyciem opisanych tu zestawów, ustaloną z góry ilość próbki poddawanej badaniu, np. 0,05 ml do 0,5 ml umieszcza się na pożywce agarowej (np. 0,2 ml do 3 ml), i zawartość zestawu inkubuje się w optymalnej temperaturze dla testowego organizmu lub w temperaturze zbliżonej od 63°C do 66°C w ciągu z góry ustalonego czasu, np. od 60 do 120 minut, po czym obserwuje się wskaźnik koloru, wskazujący obecność lub nieobecność związków przeciwbakteryjnych powyżej pewnego minimalnego stężenia. Test jest bardzo prosty do przeprowadzenia tak, że osoba która go przeprowadza nie musi mieć specjalnych kwalifikacji. Test jest zakończony po 1 do 2 godzin od chwili jego rozpoczęcia, co oznacza, że badanie to jest znacząco krótsze niż inne testy mikrobiologiczne, w których używa się tylko jednego wskaźnika.

Zestawami przydatnymi do celów wynalazku są przezroczyste probówki, pojedyncze lub w zestawach lub w kombinacji z bloczkiem półprzezroczystego materiału z pewną liczbą uformowanych w nim otworów.

Wykrywanie związków przeciwbakteryjnych prowadzi się tak aby organizm testowy pozostawał żywy ale nie namnażał się w pożywce agarowej. Osiąga się to zwykle przez pozbawienie organizmu środków odżywczych aż do momentu prowadzenia testu lub/i przez utrzymywanie hodowli w wystarczająco niskiej temperaturze np. poniżej 30°C.

Organizmem testowym korzystnie jest szczep Bacillus lub Streptococcus. Korzystnym szczepem Steptococcus jest Streptococcus thermophilus Tl01 (DSH 4022 zdeponowany 3 marca 1987). Szczep tego gatunku można wprowadzać do pożywki agarowej, korzystnie w stężeniu od 10⁵ do 10⁹ jednostek tworzących kolonie CFU na mililitr pożywki agarowej.

Korzystnym gatunkiem jest Bacillus stearothermophilus, zwłaszcza Bacillus stearothermophilus var. calidolactis C953. Bacillus stearothermophilus można wprowadzać do pożywki agarowej korzystnie w stężeniu od 10⁵ do 10⁹ CFU na 1 ml pożywki agarowej.

Wszystkie zgłoszenia patentowe i patenty wspomniane w tym zgłoszeniu są włączone tutaj jako odnośniki w takim samym stopniu, jak gdyby każde z nich było konkretnie i indywidualnie wskazane jako włączone do opisu jako odnośnik.

Wynalazek zilustrowano następującymi przykładami.

Przykład I. Przygotowywanie probówek testowych do wykrywania antybiotyków.

Sporządzono roztwór z 12 g agaru i 9 g chlorku sodu w 1000 ml wody destylowanej. Do roztworu tego dodano 2,5 ml 0,09 M buforu trójetanolaminowego o pH 8,0. Ostateczny roztwór wyjałowiono w ciągu 20 min. w temperaturze 121°C i ochładzano do temperatury około 60°C. Do takiego sterylnego roztworu dodano zawiesinę zarodników Bacillus stearothermophilus var. calidolactis w wodzie destylowanej w ilości wystarczającej aby stężenie końcowe wynosiło 10⁹ do 10¹⁰ zarodników na litr, i taką ilość jałowego roztworu Brilliant Black, aby osiągnąć końcowe stężenie 80 mg na litr. W wyjałowionych probówkach o średnicy około 9 mm umieszczono w warunkach aspetycznych 0,3 ml roztworu agaru i natychmiast szczelnie zamknięto np. folią aluminiową. Pozwolono na zestalenie się zawartości probówek, utrzymując je w pozycji pionowej. Tak przygotowane probówki przechowywano w temperaturze 5°C do 15°C.

179 275

Przykład II. Przygotowywanie probówek testowych do wykrywania antybiotyków i związków siarki.

Postępowano jak w przykładzie I z tą różnicą że razem z roztworem buforowym dodano taką ilość roztworu trymetoprymu, aby osiągnąć stężenie 60 pg na litr.

Przykład III. Przygotowanie tabletek środka odżywczego

Sporządzono mieszaninę 100 g dekstrozy, 160 g Avicel PH 101, 50 g tryptozy, 10 g peptonu phytone, 15 g precirolu, i 500 g Toluidine Blue rozpuszczonego w 50 ml alkoholu etylowego. Mieszanina ta była wystarczająca do wytworzenia 30 000 tabletek o średnicy 3 mm i grubości 1,2 mm.

Przykład IV. Przeprowadzanie testu.

Probówki testowe, przygotowane zgodnie z przykładem I lub II otwarto przez przekłucie zamknięcia i dodano do nich tabletkę składnika odżywczego przygotowaną zgodnie z przykładem III. Z badanej próbki, np. próbki mleka, 0,1 ml dodano do probówki testowej i probówkę tę umieszczono w inkubatorze (łaźnia wodna lub podgrzewacz blokowy) utrzymywanym w temperaturze 64°C. Obserwacje prowadzono po upływie 1 godziny i 20 minut do godziny i 40 minut. Jeżeli w tym czasie kolor pożywki agarowej był żółty, oznaczało to, że próbka nie zawierała wykrywalnych ilości związku przeciwbakteryjnego (np. 0,003 I.U. lub mniejszej ilości penicyliny G lub 0,1 pg lub mniej sulfametazyny na ml). Jeśli natomiast kolor pożywki agarowej jest niebieski, to oznacza, że próbka zawiera co najmniej wykrywalną ilość związku przeciwbakteryjnego (np. 0,006 LU. lub większą ilość penicyliny G lub 0,2 pg lub większą ilość sulfametazyny na ml).

Stężenia pośrednie, przedstawiające już wykrywalną ilość mogą dawać kolor pożywki agarowej pomiędzy żółtym a niebieskim.

Przykład V. Porównanie zestawu z dwoma wskaźnikami z probówką zawierającą pojedyęczy wskaźnik.

Probówki testowe przygotowano zgodnie z przykładem I lub II. Tabletki środka odżywczego przygotowano zgodnie z przykładem III. Przygotowano też podobne tabletki, ale bez Toluidynę Blue.

Testy prowadzono zgodnie z przykładem IV z zastosowaniem obu rodzajów tabletek środka odżywczego i z próbką mleka wolnego od antybiotyku. Probówki testowe w połączeniu ze środkami odżywczymi nie zawierającymi Toluidine Blue wymagały około jednej godziny dłużej aby zmienić kolor, to znaczy od 2 godzin 20 minut do 2 godzin i 40 minut, w porównaniu z połączeniem probówka testowa + tabletka środka odżywczego zawierająca Toluidine Blue.

Przykład VI. Przygotowanie wariantów testów i przeprowadzanie tych testów.

Probówki testowe przygotowano zgodnie z przykładem I z tą różnicą że zamiast roztworu Brilliant Black stosowano roztwór zawierający podobne stężenie jednego z następujących wskaźników redoks: Brilliant Crocein MOO, Acid Yellow 38, Acid Yellow 51, Acid Blue 120 lub Congo Red. Tabletki środka odżywczego wykonano zgodnie z przykładem II z tą różnicą że zamiast Toluidine Blue stosowano jeden z następujących wskaźników redoks: Safranice O, Indigo Carmine, Thionin, Nile Blue A, Azure A, Azure B Janus Green B, Brilliant Cresyl Blue AZD lub Methylene Blue. Test prowadzono zgodnie z przykładem IV, stosując probówki testowe i tebletki środka odżywczego sporządzone zgodnie z opisem podanym wyżej.

Pojawiające się zmiany koloru wskazują że próbka badanego mleka nie zawiera wykrywalnych ilości antybiotyku i/lub związków siarki. Jeżeli kolor testu nie ulega zmianie, próbka mleka zawiera takie pozostałości. Czas trwania testu różnił się dla różnych wybranych kombinacji wskaźników redoks, ale był znacząco krótszy niż ten w którym stosowano jeden testowy wskaźnik, podobnie jak opisano w przykładzie V.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz.

Cena 2,00 zł.

Claims (21)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wykrywania związków przeciwbakteryjnych w testowej próbce, znamienny tym, że (a) wprowadza się testowy organizm, i co najmniej dwa wskaźniki redoks do pożywki agarowej, (b) umożliwia się testowej próbce wejście w kontakt z pożywką agarową tak, że związki przeciwbakteryjne w testowej próbce hamują rozwój testowego organizmu w pożywce agarowej, i (c) koreluje się wzrost testowego organizmu z obecnością lub brakiem związku przeciwbakteryjnego w próbce, przy czym testowy organizm stanowią Bacillus stearothermophilus lub Streptococcus thermophilus.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że pożywkę agarową buforuje się.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że do pożywki agarowej dodaje się źródło składników odżywczych.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że źródło składników odżywczych lub jego część dodaje się w postaci oddzielnego źródła składników odżywczych takiego jak tabletka lub krążek bibułowy.
5. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że stosuje się oddzielne źródło składników odżywczych zawierające dodatkowo co najmniej jeden wskaźnik redoks, korzystnie co najmniej dwa wskaźniki redoks.
6. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że stosuje się co najmniej jeden ze wskaźników redoks zmieniający kolor w widzialnej części widma.
7. 7. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, znamienny tym, że stosuje się testowy organizm o dającej się nastawiać wrażliwości na związki przeciwbakteryjne.
8. 8. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, znamienny tym, że do pożywki agarowej dodaje się dodatkowo co najmniej jedną substancję zmieniającą wrażliwość testowego organizmu na związki przeciwbakteryjne.
9. 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że jako substancję zmieniającą wrażliwość stosuje się związek hamujący metabolizm kwasu foliowego.
10. 10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że jako substancję zmieniającą wrażliwość stosuje się trymetoprym, ormetoprym lub tetroproksym.
11. 11. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 5, albo 6, albo 9, albo 10, znamienny tym, że stosuje się 10⁵ do 10⁹ jednostek tworzących kolonie testowego organizmu na mililitr pożywki agarowej.
12. 12. Zestaw do wykrywania związków przeciwbakteryjnych, znamienny tym, że składa się z pożywki agarowej zawierającej testowy organizm, wybrany z grupy obejmującej Bacillus stearothermophilus i Streptococcus thermophilus, ewentualnie oddzielnego źródła składników odżywczych, i dwóch lub większej liczby wskaźników redoks, przy czym każdy z nich może być obecny w pożywce agarowej lub w oddzielnym źródle składników odżywczych.
13. 13. Zestaw według zastrz. 12, znamienny tym, że zawiera zbuforowaną pożywkę agarową.
14. 14. Zestaw według zastrz. 12 albo 13, znamienny tym, że zawiera pożywkę agarową zawierającą ponadto co najmniej jeden składnik odżywczy.
15. 15. Zestaw według zastrz. 12, znamienny tym, że zawiera oddzielne źródło środków odżywczych, zawierające co najmniej jeden wskaźnik redoks, korzystnie co najmniej dwa wskaźniki redoks.
16. 16. Zestaw według zastrz. 12 albo 15, znamienny tym, że zawiera co najmniej jeden ze wskaźników redoks zmieniający kolor w widzialnej części widma.
17. 17. Zestaw według zastrz. 12 albo 15, znamienny tym, że zawiera oddzielne źródło środków odżywczych w postaci tabletki lub krążka bibuły.

    179 275
18. 18. Zestaw według zastrz. 12 albo 13, albo 15, znamienny tym, że zawiera organizm testowy o dającej się nastawiać wrażliwości.
19. 19. Zestaw według zastrz. 12 albo 13, albo 15, znamienny tym, że dodatkowo zawiera co najmniej jedną substancję zmieniającą wrażliwość testowego organizmu na związki przeciwbakteryjne.
20. 20. Zestaw według zastrz. 19, znamienny tym, że jako substancję zmieniającą wrażliwość testowego organizmu zawiera związki hamujące metabolizm kwasu foliowego.
21. 21. Zestaw według zastrz. 20, znamienny tym, że jako substancję zmieniającą wrażliwość testowego organizmu zawiera trimetoprym lub tetroproksym.

    * * *