PL179597B1 - Sposób otrzymywania wysokiej czystości octanów peptydów-analogów LHRH - Google Patents

Abstract

1. Sposób otrzymywania wysokiej c^stości octanów peptydów-analogów LHRH o wzorze pGlu-Hit-Trp-Ser-Tyr-Q-Leu-Arg-Pro-X, w którym Q oznacza D-Leu, O-(1,1-dimetyloetylo)-D-Ser, 3-(2-naftylo)-D-Ala, 1-(fenylometylo)-D-Ser, D-Trp, zaś X oznacza Gly, NHC2H5 lub NH-NH-CO-NH2, znamienny tym, że surowy peptyd o wzorze podanym powyżej poddaje się wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) z odwróconymi fazami, stosując jako fazę ruchomą gradientowy układ rozpuszczalników A i B, gdzie rozpuszczalnikiem A jest wolny roztwór kwasu octowego o stężeniu 0,5 do 2% objętościowych, a rozpuszczalnik B składa się z 50 do 100% objętościowychpolarnego rozpuszczalnika organiccnngo miessająccgo sśęz wooa, wybranngo z metanoLi, etanohi, acctonu, acctomtrylu i tetrahydrofuranu, 0 do 49,5% objętościowychwody i 0 do 2% objętościowych kwasu octowego.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania wysokiej czystości octanów peptydów-analogów LHRH o wzorze pGlu—His-Trp-Ser-Tyr-Q-Leu-Arg-Pro-X, w którym Q oznacza D-Leu, O-(1,1-dimetyloetylo)-D-Ser, 3-(2-naftylo)-D-Ala, 1-(fenylometylo)-D-His, D-Trp, zaś X oznacza Gly, NHC2H₅ lub NH-NH-CO-NH2. W szczególności wynalazek dotyczy otrzymywania wysokiej czystości peptydów znanych pod nazwami leuprolid, buserelina, goreselina, nafarelina, histrelina, triptorelina i deslorelina.

Peptydy te należą do grupy superagonistów hormonu uwalniającego hormon luteinizujący (LHRH), stosowanych w praktyce klinicznej głównie w leczeniu nowotworów prostaty. Są one stosowane w lecznictwie w postaci octanów, podawanych w formie iniekcji lub implantów podskórnych, a także w formie sprayów donosowych. Takie formy podawania wymagają bardzo wysokiej czystości peptydu.

Ze stanu techniki znane są sposoby otrzymywania i oczyszczania octanów wymienionych wyżej peptydów. Na przykład z opisu patentowego USA nr 4008209, przykład 1 c , oraz z artykułu T. Fukuda i współpr. w Chem. Pharm. Bull., 30(8), 1982, strona 2829, znany jest sposób otrzymywania octanu leuprolidu (pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHC2H₅), polegający na przekształceniu surowego leuprolidu w octan przez przepuszczenie przez żywicę anionowymienną typu Amberlite w formie octanowej, a następnie oczyszczaniu octanu leuprolidu za pomocą szeregu chromatografii kolumnowych na CM-celulozie, Amberlicie i żelu Sephadex przy użyciu octanu amonu jako eluenta. Taki sposób otrzymywania czystych octanów peptydów jest sposobem bardzo pracochłonnym ze względu na prowadzenie najpierw wymiany jonowej na kolumnie, a następnie kilku operacji oczyszczania chromatograficznego. Wszystkie te operacje sąuciążliwe, długotrwałe i niedogodne, zwłaszcza w większej skali. Nie zapewniają one przy tym odpowiedniego oczyszczenie pożądanego octanu od zanieczyszczeń, które sąskomplikowanąmieszaniną różnej wielkości peptydów. Szczególnie niekorzystny jest etap chromatografii jonowymiennej ze względu na konieczność przeprowadzania żywicy w

179 597 odpowiednią formę, a także późniejszej regeneracji tej żywicy. Procedury te wymagają manipulowania dużymi objętościami roztworów odpowiednich reagentów, a co za tym idzie, generują duże ilości ścieków wymagających zagospodarowania. Ponadto podczas przepuszczania peptydu przez żywicę jonowymienną często następuje wtórne zanieczyszczenie peptydu substancjami obecnymi w żywicy, wprowadzonymi tam w trakcie procesu jej wytwarzania.

Ze stanu techniki wiadomo jest, na przykład z artykułu T.C. Pinkertona i współpr. w J. Chromat., 458 (1988), strony 129-149, że złożone mieszaniny peptydów mogą być efektywnie rozdzielane i oczyszczane za pomocą techniki wysokosprawnej chromatografii cieczowej HPLC z odwróconymi fazami. Typowo jako fazę ruchoma stosuje się układ złożony z wodnego roztworu kwasu trifluorooctowego i acetonitrylu lub metanolu. Roląkwasu trifluorooctowego jest przede wszystkim utrzymanie niskiego pH w celu protonowania grup karboksylowych. Kwas trifluorooctowy działa także jako czynnik dostarczający pary jonowej dla protonowanych amin, zobojętniając w ten sposób ładunek cząsteczki i minimalizując oddziaływania z wypełnieniem kolumny. Zapewnia to zdolność rozdzielczą umożliwiającą rozdział nawet bardzo zbliżonych cząsteczek peptydowych.

Jednakże w przypadku zastosowania takiego sposobu rozdziału, mimo jego wysokiej efektywności, otrzymuje się peptydy w postaci trifluorooctanów. Konieczne zatem byłoby przeprowadzanie trifluorooctanu w octan w dodatkowym etapie procesu.

Okazało się, że możliwe jest uzyskanie czystych octanów peptydów-analogów LHRH w jednym procesie, wychodząc od surowego peptydu, otrzymanego po procesie jego syntezy i usunięcia grup zabezpieczających.

Sposób według wynalazku otrzymywania wysokiej czystości octanów peptydów-analogów LHRH o wzorze: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Q-Leu-Arg-Pro-X, w którym Q oznacza D-Leu, O-(1,1-dimetyloetylo)-D-Ser, 3-(2-naftylo)-D-Ala, 1-(fenylometylo)-D-Ser, D-Trp, zaś X oznacza Gly, NHC2H5 lub NH-NH-CO-NH2, polega na tym, że surowy peptyd o wzorze podanym powyżej poddaje się wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) z odwróconymi fazami, stosując jako fazę ruchomą gradientowy układ rozpuszczalników A i B, gdzie rozpuszczalnikiem A jest wodny roztwór kwasu octowego o stężeniu 0,5 do 2% objętościowych, a rozpuszczalnik B składa się z 50% do 100% objętościowych polarnego rozpuszczalnika organicznego mieszającego się z wodą, wybranego z metanolu, etanolu, acetonu, acetonitrylu i tetrahydrofuranu, 0 do 49,5% objętościowych wody i 0 do 2% objętościowych kwasu octowego.

Korzystnie stosuje się układ gradientowy układ rozpuszczalników A i B, w którym rozpuszczalnikiem A jest wodny roztwór kwasu octowego o stężeniu 1% objętościowy.

Szczególnie korzystnie stosuje się układ rozpuszczalników A i B, w którym rozpuszczalnikiem A jest wodny roztwór kwasu octowego o stężeniu 1% objętościowy, zaś rozpuszczalnik B ma skład 60% objętościowych polarnego rozpuszczalnika organicznego mieszającego się z wodą, 39% objętościowych wody i 1% objętościowy kwasu octowego.

Korzystnie jako polarny rozpuszczalnik organiczny mieszający się z wodą stosuje się metanol lub etanol.

Przebieg gradientu układu rozpuszczalników dobiera się na drodze rutynowej procedury dobrania warunków rozdziału na analitycznych zestawach do HPLC. Zależy on od rodzaju peptydu, jego polarności i rozpuszczalności oraz od danego zastosowanego składu rozpuszczalników.

W sposobie według wynalazku jako wyjściowy surowy peptyd może być użyty peptyd otrzymany dowolną z technik syntezy peptydów, zarówno techniką syntezy w roztworze jak i techniką w fazie stałej (na nośnikach).

Otrzymywanie octanów peptydów sposobem według wynalazku przeprowadza się stosując typowe i znane fazy stacjonarne do wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami. Rodzaj fazy stacjonarnej nie jest w związku z tym istotną cechą wynalazku. Typowym przykładem są kolumny wypełnione żelem krzemionkowym ze związanymi węglowodorami C4, C₈, C₁₈. Średnica ziaren fazy stacjonarnej jest również typowa i może być równa 5-20 pm. Mogą być zwłaszcza stosowane typowe, dostępne w handlu fazy stacjonarne o rozrzu4

179 597 cie wielkości zbliżonym do 1 (o cząsteczkach jednakowej wielkości). Typowo rozdział przeprowadza się w temperaturze pokojowej.

Sposób według wynalazku zapewnia otrzymanie i oczyszczenie octanów peptydów-analogów LHRH w jednym etapie, nie wymagającym dużego nakładu czasu pracy ani stosowania dużych objętości rozpuszczalników. Ponadto, jak się nieoczekiwanie okazało, czystość octanów peptydów jest bardzo wysoka i wynosi co najmniej 95%, mimo zastosowania słabego kwasu o słabszej zdolności protonowania niż kwas trifluorooctowy. Sposobem według wynalazku można otrzymać octany peptydów o czystości nawet około 99%.

Sposób według wynalazku zilustrowano poniżej w przykładzie jego wykonania w odniesieniu do otrzymywania octanu leuprolidu (pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-L-eu-Arg-Pro-NHC₂H₅). Może on być również wykorzystany do otrzymywania octanów następujących peptydów:

buserelina:

(pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(t-Bu)-Leu-Arg-Pro-NHC₂H₅) goserelina:

(pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(t-Bu)-Leu-Arg-Pro-NH-NH-CO-NH2) nafarelina:

(pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Nal(2)-Leu-Arg-Pro-Gly) histrelina:

(pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-His(Bz)-Leu-Arg-Pro-NHC2H5) triptorelina:

(pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly) deslorelina:

(pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-NHC2H₅)

Zastosowane skróty mają następujące znaczenia:

pGlu : kwas L-paraglutaminoowy

His : L-histydyna

Trp : L-tryptofan

Ser : L-se-yna

Tyr : iL-yrozyna

Leu : LL-ucyna

Arg : Ε^^πΟιο

Pro : L-L^lina

Gly : L-LHcjcia

T-But - terl-buty-11,1 -dOmaryioaryl)

Nal(2) : 3-(2-naftylo)almina

His(Bz) : 1 -(1οη>ΊοπιοΜο)Η1

Przykład. Otrzymywanie octanu leuprolidu

Rozdział preparatywny prowadzono na chromatografie Shimadzu, składającym się z dwóch pomp LC-8A, detektora SPD-6AV i integratora C-R4A oraz kolumny areaaratywnęj Merck o wymiarach 50 x 250 mm LiChroprep RP-18 (wielkość ziarna 5-20 -im). Surowy leuprolid otrzymany po reakcji syntezy i usunięciu grup zabezpieczających wprowadzano w postaci roztworu w 1% CHCOOH o stężeniu 1 g/20 ml). Stosowano układ rozpuszczalników: A 1% wodny roztwór kwasu octowego (objętościowo), B - 60% objętościowych metanolu, 39% objętościowych wody i 1% objętościowy CHaCOOH. Parametry rozdziału: przepływ 50 ml/mm, długość fali detektora = 273 nm, wzmocnienie detektora = 7, gradient układu rozpuszczalników: 20% B - > 50% B od 0 do 40 min., 50% B izokratycznie do 70 min., 50% B - > 100%B od 70 do 75 min. Zbierano frakcje schodzące z kolumny w czasie 50 mm. do 70 min., zawierające octan leuprolidu. Frakcje zawierające leuprolid odparowano w celu usunięcia metanolu na wyparce próżniowej w 40°C, rozcieńczono dwukrotnie wodą i lifilizowano. Otrzymano oc179 597 tan leuprolidu o czystości 96,5%, skręcalności [α]²⁴ = -33,5° (c=1, kwas octowy) i zawartości kwasu octowego 3%.

Postępując jak powyżej, ale stosując układ rozpuszczalników A: 1% wodny roztwór kwasu octowego i B: 60% objętościowych etanolu, 39% objętościowych wody i 1% objętościowy CH₃COOH oraz program gradientu 20% B - > 50% B od 0 do 40min., 50% B izokratycznie do 55 min., 50% B - > 100% B do 60 minut, zbierano frakcję zawierającą leuprolid po czasie retencji równym 58 minut. Octan leuprolidu wyodrębniano jak powyżej.

179 597

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz.

Cena 2,00 zł.

Claims (4)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób otrzymywania wysokiej czystości octanów peptydów-analogów LHRH o wzorze pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Q-Leu-Arg-Pro-X, w którym Q oznacza D-Leu, O-(1,1-dimetyloetylo)-D-Ser, 3-(2-naftylo)-D-Ala, 1 -(fenylom etylo)-D-S er, D-Trp, zaś X oznacza Gly, NHC₂H₅ lub NH-NH-CO-NH₂, znamienny tym, że surowy peptyd o wzorze podanym powyżej poddaje się wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) z odwróconymi fazami, stosując jako fazę ruchomą gradientowy układ rozpuszczalników A i B, gdzie rozpuszczalnikiem A jest wolny roztwór kwasu octowego o stężeniu 0,5 do 2% objętościowych, a rozpuszczalnik B składa się z 50 do 100% objętościowych polarnego rozpuszczalnika organicznego mieszającego się z wodą, wybranego z metanolu, etanolu, acetonu, acetonitrylu i tetrahydrofuranu, 0 do 49,5% objętościowych wody i 0 do 2% objętościowych kwasu octowego.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako rozpuszczalnik A stosuje się wodny roztwór kwasu octowego o stężeniu 1% objętościowy.
3. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się rozpuszczalnik B mający skład 60% objętościowych polarnego rozpuszczalnika organicznego mieszającego się z wodą, 39% objętościowych wody i 1% objętościowy kwasu octowego.
4. 4. Sposób według zastrz. 1 albo 2 albo 3, znamienny tym, że jako polarny rozpuszczalnik organiczny mieszający się z wodą stosuje się metanol lub etanol.

   * * *