PL180031B1

PL180031B1 - Kompozycja farmaceutyczna do wywolywania tolerancji limfocytów T na przeszczep tkankowy lub narzadowy PL PL PL PL PL PL PL PL

Info

Publication number: PL180031B1
Application number: PL95317022A
Authority: PL
Inventors: Randolph J Noelle; Fiona H Durie; David C Parker; Michael C Appel; Nancy E Philips; John P Mordes; Dale L Grenier; Aldo A Rossini
Original assignee: Dartmouth College; Trustees Of Dartmouth College; Univ Massachusetts Medical; University Of Massachusetts Medical Center
Priority date: 1994-04-25
Filing date: 1995-04-25
Publication date: 2000-12-29
Also published as: OA10591A; US20050152897A1; EP1530973A2; SK136996A3; DE69533984D1; PL317022A1; ES2237757T3; CZ291266B6; NO20051182L; JP2974415B2; NO319787B1; CZ312596A3; WO1995028957A3; BG62121B1; RO114743B1; UA44892C2; CA2188672A1; FI118792B; IS4378A; AU2358595A

Abstract

1. Kompozycja farmaceutyczna do wywolywania tolerancji limfocytów T na prze- szczep tkankowy lub narzadowy, znamienna tym, ze obejmuje nastepujace skladniki: a) komórki allogeniczne albo ksenogeniczne, wyrazajace przynajmniej jeden antygen dawcy, które posiadaja na swej powierzchni ligand oddzialywujacy z receptorem gp39 na po- wierzchni limfocytów T biorcy, posredniczacym w zaleznych od kontaktu pomocniczych funkcjach efektorowych; i b) antagoniste receptora gp39. PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna do wywoływania tolerancji limfocytów T na przeszczep tkankowy lub narządowy.

Aby wywołać swoistą antygenowo aktywację i proliferację klonalną limfocytów T, do powierzchni spoczynkowych limfocytów T muszą dotrzeć dwa sygnały, dostarczane przez komórki prezentujące antygen (APC) (Jenkins, M. i Schwartz, R. (1987) J. Exp. Med. 165, 302-319; Mueller, D. L., i in., (1990) J. Immunol. 144,3701-3709; Williams, I. R. i Unanue, E. R., (1990) J. Immunol. 145,85-93). Pierwszy sygnał, zapewniający swoistość odpowiedzi odpornościowej, dostarczany jest przez receptor limfocyta T (TCR) po rozpoznaniu obcego peptydu antygenowego, prezentowanego w kontekście głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC). Drugi sygnał, zwany kostymulacją, wywołuje, że limfocyty Tproliferująi stająsię czynne (Schwartz, R. H(1990) Science 248,1349-1356). Kostymulacja nie jest swoista antygenowo, ani rozróżniana w kontekście MHC i, jak się uważa, dostarczana przez jedną lub więcej osobnych cząsteczek powierzchniowych, ulegających ekspresji na APC (Jenkins, M. K., i in., (1988) J. Immunol. 140, 3324-3330; Linsey, P. S., i in., (1991) J. Exp. Med. 173,721-730; Gimmi, C. D., i in., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88,6575-6579; Young, J. W., i in., (1992) J. Clin. Invest. 90,229-237; Koulova, L., i in., (1991) J. Exp. Med. 173, 759-762; Reiser, H., i in., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci.

180 031

USA 89, 271-275; van-Seventer, G. A., i in., (1990) J. Immunol. 144, 4579-4586; LaSalle, J. M., i in., (1991) J. Immunol. 147,774-80; Dustin, M. I., i in., (1989) J. Exp. Med. 169,503; Armitage, R. J., i in., (1992) Nature 357,80-82; Liu, Y., i in., (1992) J. Exp. Med. 175,437-445). Jeden ze szlaków kostymulacji, odpowiadających za aktywację limfocyta T, obejmuje cząsteczkę CD28 na powierzchni limfocyta T. Cząsteczka ta otrzymuje sygnał dostarczany przez ligand na powierzchni limfocyta B albo innej ASP. Ligandy Cd28 obejmują białka rodziny B7 antygenów aktywacji limfocytów B, jak B7-1 czy B7-2 (Freedman, A. S., i in., (1987) J. Immunol. 137, 3260-3267; Freeman, G. J., i in., (1989) J. Immunol. 143,2714-2722; Freeman, G. J., i in., (1991) J. Exp. Med. 174, 625-631; freeman, G. J., i in., (1993) Science 262, 909-911; Azuma, M., i in., (1993) Nature 366,76-79; Freeman, G. J., i in., (1993) J. Exp. Med. 178,2185-2192). B7-1 i B7-2 sąrównież ligandami dla innej cząsteczki, CTLA4, obecnej na powierzchni aktywowanych limfocytów T, jednakże rola CTLA4 w kostymulacji jest niejasna.

Dostarczanie limfocytowi T swoistego antygenowo sygnału prowadzi aktywacji limfocyta T, co może oznaczać proliferację i wydzielanie cytokin. W przeciwieństwie do powyższego, dostarczenie limfocytowi T sygnału swoistego antygenowo pod nieobecność sygnału kostymulującego wywołuje, jak się uważa, stan energii czyli niezdolności do reakcji u limfocytów T, powodując w ten sposób swoistą antygenowo tolerancję limfocytów T.

Oddziaływanie pomiędzy limfocytami T i B, odgrywa kluczową rolę w odpowiedzi odpornościowej. Wywołanie odporności humoralnej na antygeny grasiczozależne wymaga „pomocy” ze strony limfocytów T pomocniczych (Th). O ile pewną pomoc limfocytom B zapewniają cząsteczki rozpuszczalne wydzielone z limfocyta Th (przykładowo IL-4 i IL-5), aktywacja limfocytów B wymaga zależnego od kontaktu oddziaływania pomiędzy limfocytami B i Th (Hirohata i in., J. Immunol. 140: 3736-374 (1988); Barlett i in., J. Immunol. 143: 17-45-1754 (1989). Wskazuje to, że aktywacja limfocyta B wymaga koniecznego kontaktu pomiędzy cząsteczkami powierzchniowymi limfocytów B i Th. Cząsteczka(i) na powierzchni limfocyta T pośredniczą w zależnych od kontaktu funkcjach efektorowych limfocytów T. O zależnym od kontaktu oddziaływaniu pomiędzy cząsteczkami na limfocytach B i T, świadczy obserwacja, że izolowane błony komórkowe aktywowanych limfocytów T mogą dostarczyć funkcji efektorowych niezbędnych do aktywacji limfocyta B (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 564-568 (1988); Hodgkin i in., J. Immunol., 145: 2025-2034 (1990); Noelle i in., 146: 1118-1124 (1991)).

Cząsteczkę CD40 zidentyfikowano na powierzchni niedojrzałych i dojrzałych limfocytów B, gdzie związana przeciwciałami, wywoływała proliferację limfocytów B (Valle i in., Eur. J. Immunol., 19; 1463-1467, (1989); Gordon i in., J. Immunol., 140:1425-1430(1988); Gruber i in., J. Immunol., 142; 4144-4152 (1989)). CD40 sklonowano molekularnie i scharakteryzowano (Stamenkovic i in EMBO J., 8:1403-1410(1989)). Ligand dla CD40, gp39 (zwany również ligandem CD40 albo CD40L) również sklonowano molekularnie i scharakteryzowano (Armitage i in., Nature 357: 80-82 (1992); Lederman i in., J. Exp.Med., 175:1091-1101 (1992); Hollenbaugh i in., EMBO J., 11:4313-4319(1992)). Białko gp39 ulega ekspresji na aktywowanych, ale nie na spoczynkowych limfocytach Th CD40+ (Spriggs i in., J. Exp. Med., 176; 1543-1550 (1993)). Komórki transfekowane genem dla gp39 i wyrażające białko gp39 na swej powierzchni mogą wywoływać proliferację limfocytów B i, wraz z innymi sygnałami pobudzającymi, wywoływać wytwarzanie przeciwciał (Armitage i in., Nature 357:80-82 (1992); Hollenbaugh i in., EMBA J., 11: 4313-4319 (1992)).

Wcześniej postulowano też, iż gp39 odgrywa rolę w indukowaniu humoralnej odpowiedzi odpornościowej limfocytów B (np. Durie i in. FASEB 8(4): 477, skrót 2763).

Cząsteczki powierzchniowe komórek, sprawujące zależne od kontaktu funkcje efektorowe limfocytów T są istotne w wywoływaniu odpowiedzi odpornościowej wymagającej pomocy limfocytów T. Przykładowo, oddziaływania gp39 na limfocytach T z CD40 na limfocytach B, odgrywa kluczową rolę w aktywacji odpowiedzi limfocytów B na antygen. Niniejszy wynalazek opiera się, przynajmniej częściowo, na odkryciu, że cząsteczki powierzchniowe sprawujące zależne od kontaktu pomocnicze funkcje efektorowe limfocytów T odgrywają również kluczową rolę w odpowiedzi limfocytów T na alloantygeny. W szczególności, odkryto, że w odpowiednich

180 031 warunkach zakłócanie oddziaływania gp39 z ligandem na komórkach allogenicznych, prezentujących alloantygeny limfocytom T, może wywołać tolerancję limfocytów T. Korzystnie, komórka allogeniczna, prezentująca alloantygeny limfocytom T, wymaga oddziaływania pomiędzy ligandem gp39 na komórce i gp39 na limfocycie T, aby zapewnić sygnał niezbędny do aktywacji limfocyta T. Zahamowanie oddziaływania liganda gp39 na komórce allogenicznej i gp39 na limfocycie T, zapobiega aktywacji limfocyta T i wywołuje raczej swoistą dla alloantygenu tolerancję limfocyta T. Wywołanie tolerancji limfocyta T na alloantygeny, jak tu opisano, może być zastosowane jako schemat przygotowawczy do przeszczepienia tkanek albo narządów.

Kompozycja farmaceutyczna do wywoływania tolerancji limfocytów T na przeszczep tkankowy lub narządowy według wynalazku obejmuje następujące składniki:

a) komórki allogeniczne albo ksenogeniczne, wyrażające przynajmniej jeden antygen dawcy, które posiadają na swej powierzchni ligand oddziaływujący z receptorem gp39 na powierzchni limfocytów T biorcy, pośredniczącym w zależnych od kontaktu pomocniczych funkcjach efektorowych; i

b) antagonistę receptora gp39.

Antagonista hamuje oddziaływanie pomiędzy cząsteczkąna limfocycie T i jej ligandem na komórce allogenicznej albo ksenogenicznej.

Antagonistą jest cząsteczka hamująca oddziaływanie gp39 na limfocycie T i ligandem gp39 na komórce allogenicznej albo ksenogenicznej. Szczególnie korzystnym antagonistągp39 jest przeciwciało przeciwko gp39. W innym wykonaniu, antagonista gp39 jest rozpuszczalną postacią ligandu gp39, przykładowo rozpuszczalnym CD40. Komórka allogeniczna albo ksenogeniczna, która jest podawana biorcy jest, korzystnie, komórką limfoidalną, przykładowo, limfocytem B. Alternatywnie, komórka allogeniczna albo ksenogeniczna jest małym, spoczynkowym limfocytem B. Komórka allogeniczna albo ksenogeniczną oraz antagonista (np. przeciwciało przeciwko gp39) podawane są zwykle biorcy przed przeszczepieniem tkanki albo narządu. Przykładowo, komórki limfoidalne (np. limfocyty B) dawcy tkanki albo narządu, podawane są biorcy, wraz z antagonistą, przed przeszczepieniem tkanki albo narządu.

Kompozycję według wynalazku można zastosować do wywoływania tolerancji limfocytów T na przeszczepioną tkankę albo narząd, taki jak np. wątroba, nerka, serce, płuca, skóra, mięśnie, tkanka nerwowa, żołądek albo jelita. Kompozycja może służyć np. do leczenia cukrzycy i w takim przypadku osobnikowi wymagającemu leczenia podaje się: 1) komórki allogeniczne albo ksenogeniczne, wyrażające antygeny dawcy; 2) antagonistę receptora gp39 na powierzchni limfocytów T biorcy, pośredniczącego w zależnych od kontaktu pomocniczych funkcjach efektorowych (np. przeciwciało przeciwko gp39) i 3) wysepki trzustkowe dawcy.

Figura 1 jest graficznym przedstawieniem przeżycia przeszczepionych allogenicznych wysepek trzustkowych, u myszy z cukrzycą wywołaną chemicznie, traktowanych uprzednio samym przeciwciałem przeciwko gp39, albo samymi niefrakcjonowanymi albo frakcjonowanymi splenocytami allogenicznymi.

Figury 2A i 2B są graficznym przedstawieniem przeżycia przeszczepionych allogenicznych wysepek trzustkowych, mierzonego spadkiem stężenia glukozy w osoczu, u myszy z cukrzycą wywołaną chemicznie, traktowanych uprzednio pojedynczą dawką frakcjonowanych splenocytów allogenicznych wraz z traktowaniem przez 2 tygodnie przeciwciałem przeciwko gp39 (MR1) (panel A) albo przez 7 tygodni (panel B). Każda krzywa przedstawia dane z poszczególnych myszy. Symbole otwarte oznaczają biorców, u których przeszczep zaginął spontanicznie. Symbole zamknięte oznaczają myszy, których wysepki pozostały czynne do zakończenia doświadczenia.

Figury 3A, 3B i 3C przedstawiają profile z cytometrii przepływowej, pokazujące aktywowane od 6 godzin limfocyty krwi obwodowej, zabarwione CD40Ig (panel A), mAB 4D9-8 (panel B) albo mAb 4D9-9 (panel C).

180 031

Figury 4A, 4B i 4C przedstawiają profile z cytometrii przepływowej, pokazujące aktywowane od 6 godzin limfocyty krwi obwodowej hodowane w obecności cyklosporyny A, zabarwione CD40Ig (panel A), mAB 4D9-8 (panel B) albo mAb 4D9-9 (panel C).

Figury 5A i 5B przedstawiają profile z cytometrii przepływowej, pokazujące aktywowane od 6 godzin limfocyty krwi obwodowej zabarwione CD40Ig w obecności nieznakowanego mAB 4D9-8 (panel-A) albo nieznakowanego mAb 4D9-9 (panel B).

Figura 6 jest graficznym przedstawieniem zahamowania proliferacji ludzkich limfocytów B, wywołanej rozpuszczalną gp3 9 albo IL-4, gdy komórki hodowane były w obecności przeciwciał przeciwko ludzkiej gp39 mAb 4D9-8, 4D9-9, 24-31, 24-43, 89-76 albo 89-79.

Figura 7 jest graficznym przedstawieniem zahamowania alloswoistej mieszanej odpowiedzi limfocytów, gdy komórki hodowane są w obecności przeciwciał przeciwko ludzkiej gp39 mAb 24-31 albo 89-79.

W znaczeniu tu użytym „biorca” dotyczy osobnika, któremu będzie przeszczepiana, jest przeszczepiana albo była przeszczepiana tkanka albo narząd. W znaczeniu tu użytym, komórki „allogeniczne” uzyskiwane są od innego osobnika tego samego gatunku co biorca, i ekspresjonują„alloantygeny”, które różnią się od antygenów wyrażanych na komórkach biorcy. Komórki „ksenogeniczne” uzyskiwane są od innego osobnika innego gatunku niż biorca, i ekspresjonują „ksenoantygeny”, które różnią się od antygenów wyrażanych na komórkach biorcy. W znaczeniu tu użytym, określenie „antygeny dawcy” dotyczą antygenów wyrażanych na tkankach albo narządach dawcy przeszczepu, przeszczepianego biorcy. Antygeny dawcy mogąbyć alloantygenami albo ksenoantygenami, zależnie od źródła przeszczepu. Komórki allogeniczne albo ksenogeniczne podawane biorcy jako część schematu wywołującego tolerancję, ekspresjonują antygeny dawcy, tzn. ekspresjonują niektóre albo wszystkie antygeny, które są obecne na tkance albo narządzie, który ma być przeszczepiony. Komórki allogeniczne albo ksenogeniczne są, korzystnie, uzyskiwane od dawcy tkanki albo narządu, ale mogąbyć uzyskane z jednego lub wielu źródeł posiadających wspólne z dawcą determinanty antygenowe.

Dodatkowo, oprócz komórek allogenicznych albo ksenogenicznych, jako część schematu wywoływania tolerancji, podawany jest antagonista cząsteczki na limfocycie T, pośredniczącej w zależnych od kontaktu, pomocniczych funkcjach efektorowych. W znaczeniu tu użytym, cząsteczka albo receptor pośredniczący w zależnych od kontaktu, pomocniczych funkcjach efektorowych oznacza strukturę ulegającą ekspresji na limfocycie Th i oddziaływującą z ligandem na komórce efektorowej (np. limfocycie B), której oddziaływanie z ligandem jest niezbędne do wywołania odpowiedzi komórki efektorowej (np. aktywacji limfocyta B). Dodatkowo, oprócz związku z odpowiedzią komórki efektorowej, odkryto, że cząsteczka ta albo receptor związany jest z odpowiedzią limfocyta T na antygen. Taką cząsteczką na limfocycie T, pośredniczącą w zależności od kontaktu, pomocniczych funkcjach efektorowych jest gp39. Aktywacja limfocytów T biorcy przez komórki allogeniczne albo ksenogeniczne obejmuje oddziaływanie pomiędzy gp39 limfocytów biorcy oraz ligandem gp39 na komórkach allogenicznych albo ksenogenicznych. Przez zahamowanie tego oddziaływania przez antagonistę gp39, limfocyty T biorcy nie są aktywowane przez antygeny dawcy, wyrażane na komórkach allogenicznych albo ksenogenicznych, ale raczej stają się tolerancyjne na antygeny dawcy. Tak więc, wywołanie tolerancji u biorcy na antygeny dawcy, umożliwia pomyślne przeszczepienie tkanek albo narządów dawcy bez zależnego od układu odpornościowego odrzucenia przeszczepu.

Różne aspekty wynalazku zostały opisane szczegółowo dalej w następujących podrozdziałach.

I. Antagoniści gp39

Antagonista gp39 podawany jest biorcy w celu zakłócania oddziaływania pomiędzy gp39 na limfocytach T biorcy z ligandem gp39 na komórkach allogenicznych albo ksenogenicznych, takich jak np. limfocyty B, podawanych biorcy. Antagonista gp39 jest określony jako cząsteczka

180 031 zakłócająca to oddziaływanie. Antagonistą gp39 może być przeciwciało skierowane przeciwko gp39 (np. przeciwciało monoklonalne przeciwko gp39), fragment albo pochodna przeciwciała skierowanego przeciwko gp39 (np. fragmenty Fab albo F(ab)₂, przeciwciała chimeryczne albo humanizowane), rozpuszczalne postaci ligandu gp39 (np. rozpuszczalny CD40), rozpuszczalne postaci białka fuzyjnego ligandu gp39 (np. rozpuszczalne CD40Ig) albo środki farmaceutyczne niszczące albo zakłócające oddziaływanie pomiędzy gp39 i CD40.

A. Przeciwciała

Ssak (np. mysz, chomik albo królik) może być immunizowany immunogenną postacią białka albo fragmentem białka gp39 (np. fragmentem peptydowym), wywołującym odpowiedź przeciwciał u ssaka. Komórki ekspresjonujące gp39 na swej powierzchni również mogąbyć zastosowane jako immunogen. Alternatywnie immunogeny obejmują oczyszczone białko gp39 albo fragmenty białka. Dodatkowo, cDNA dla gp39 (Armitage i in., Nature 357: 80-82 (1992); Lederman i in., J. Exp. Med., 175: 1091 - 1101 (1992); Hollenbaugh i in., EMBO J., 11: 4313-4319 (1992)) może ulegać ekspresji w komórkach gospodarzy, np. bakterii albo linii komórkowej ssaczej, zaś białko gp39 może być oczyszczane standardowymi technikami. Alternatywnie, peptydy gp39 mogą być syntetyzowane w oparciu o sekwencję aminokwasową gp39 (ujawnionąprzez Armitage i in., Nature 357: 89-82 (1992); Lederman i in., J. Exp. Med., 175: 1091-1101 (1992); Hollenbaugh i in., EMBO J., 11: 4313-4319 (1992)) z zastosowaniem znanych technik (np. syntezy F-moc albo B-boc). Techniki powodowania immunogenności białka obejmująkoniugowanie z nośnikami albo inne techniki dobrze znane w technice. Przykładowo, białko może być podawane w obecności adiuwantu. Postęp immunizacji może być monitorowany przez oznaczanie mian przeciwciał w surowicy albo osoczu. Mogąbyć zastosowane standardowe testy ELISA albo inne testy immunologiczne, z zastosowaniem immunogenu jako antygenu, w celu stwierdzenia poziomu przeciwciał.

Po immunizacji można uzyskać surowice odpornościowe albo jeżeli to konieczne, z surowic mogąbyć uzyskane przeciwciała poliklonalne. W celu uzyskania przeciwciał monoklonalnych, od immunizowanych zwierząt mogą być pozyskiwane komórki wytwarzające przeciwciała (limfocyty) i poddawane fuzji z komórkami szpiczaka standardowymi procedurami tworzenia fuzji komórek somatycznych, unieśmiertelniając w ten sposób te komórki i tworząc komórki hybrydomy. Metody takie są dobrze znane w technice, przykładowo, technika hybrydomy, oryginalnie opisana przez Kohlera i Milsteina (Nature (1975) 256:495-497) jak również inne techniki, takie jak technika hybrydomy ludzkich limfocytów B (Kozbar i in., Immunol. Today (1983)4; 72), technika hybrydomy EBV, stosowana do wytwarzania ludzkich przeciwciał monoklonalnych (Cole i in., Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy (1985) (Allen R. Liss, 77-96) oraz przeszukiwanie bibliotek przeciwciał kombinatoryjnych (Huse i in., Science (1989) 246: 1275). Komórki hybrydoma mogąbyć przeszukiwane immunochemicznie pod kątem produkowania przeciwciał swoiście reagujących z białkiem albo peptydem, a przeciwciało monoklonalne może być izolowane.

Określenie „przeciwciało” w znaczeniu tu zastosowanym, obejmuje jego fragmenty swoiście reagujące z białkiem gp39 albo jego peptydem albo białkiem fuzyjnym gp39. Przeciwciała mogąbyć fragmentowane przez zastosowanie standardowych technik, zaś fragmenty mogąbyć przesiewane pod kątem użyteczności w sposób analogiczny dla całych przeciwciał. Przykładowo, fragmenty F(ab')₂ mogą być wytworzone przez trawienie przeciwciała pepsyną. Powstałe fragmenty F(ab^₂ mogąbyć traktowane w celu redukcji mostków dwusiarczkowych tworząc fragmenty Fab'. Termin „przeciwciało” obejmuje też cząsteczki o podwójnej swoistości albo cząsteczki chimeryczne posiadające część anty-gp39.

Gdy przeciwciała, wytwarzane przez gospodarzy innych niż ludzie, są stosowane terapeutycznie u ludzi, są one w różnym stopniu rozpoznawane jako obce i mogą wywołać odpowiedź odporności owąu pacjentów. Jednym z podejść do minimalizacji albo eliminacji tego problemu,

180 031 które jest korzystniejsze niż ogólna immunosupresja, jest wytworzenie chimerycznych pochodnych przeciwciał, tzn. cząsteczki przeciwciała łączącej zwierzęcy region zmienny z ludzkim regionem stałym. Cząsteczki przeciwciała chimerycznego mogą obejmować, przykładowo, domenę wiążącą antygen z przeciwciała myszy, szczura albo innego gatunku, z ludzkim regionem stałym. Opisano różne podejścia do wytworzenia przeciwciał chimerycznych i mogąbyć one zastosowane do wytworzenia przeciwciał chimerycznych zawierających region zmienny immunoglobuliny rozpoznający gp39. Patrz przykładowo, Morrison i in., Proc. Natl. Acad. Sci. US A 81: 6851 (1985); Takeda i in., Nature 314: 452 (1985); Cabilly i in., patent USA Nr 4,816,567; Boss i in., patent USA Nr 4,816,397; Tanguchi i in., patent europejski Nr EP171496; patent europejski Nr 0173494, patent brytyjski Nr GB2177096B. Oczekuje się, że przeciwciała chimeryczne mogłyby być mniej immunogenne u ludzi, w porównaniu z odpowiednimi przeciwciałami nie chimerycznymi.

Dla celów leczniczych, przeciwciała chimeryczne albo monoklonalne swoiście aktywne wobec białka gp39 albo peptydu, mogąbyć dalej humanizowane przez tworzenie chimer o ludzkim regionie zmiennym, w których części regionu zmiennego, zwłaszcza zakonserwowane regiony zrębowe domeny wiążącej antygen, pochodzą od człowieka i wyłącznie regiony hiperzmienne nie są pochodzenia ludzkiego. Tak zmienione cząsteczki immuglobulin mogąbyć wytworzone dowolną spośród znanych technik (np. Teng i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 7308-7312 (1983); Kozbor i in., Immunol. Today 4: 7279 (1983); Olsson i in., Meth. Enzymol., 92: 3-16 (1982)); i są korzystnie wytwarzane według wskazówek publikacji PCT W092/06193 albo EP 0239400. Przeciwciała humanizowane mogą być wytwarzane na zamówienie przez, przykładowo, Scotgen Ltd, 2 Holly Road, Twickenham, Middlessex, Wielka Brytania.

Innym sposobem wytwarzania przeciwciał albo ich fragmentów, aktywnych wobec białka albo peptydów gp39, jest przesiewanie biblioteki ekspresyjnej kodującej immunoglobuliny albo ich fragmenty, wyrażane w bakteriach, przy użyciu białka gp39 albo peptydu. Przykładowo, kompletne fragmenty Fab, regiony VH i FV, mogąbyć wytwarzane przez ekspresję w bakteriach przez zastosowanie fagowych bibliotek ekspresyjnych. Patrz, przykładowo, Ward i in., Nature, 341: 544-546 (1989); Huse i in., Science 246: 1275-1281 (1989) i McCafferty i in., Nature 348: 552-554 (1990). Przesiewanie takich bibliotek przy użyciu, przykładowo, peptydu gp39, pozwala zidentyfikować fragmenty immunoglobulin aktywne wobec gp39. Alternatywnie, w celu wytwarzania przeciwciał albo ich fragmentów można zastosować mysz SCID-hu (dostępną w Genpharm).

Metodyki wytwarzania przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko gp39, w tym ludzkich gp39 albo mysich gp39, i odpowiednie przeciwciała monoklonalne do zastosowania w kompozycjach według wynalazku, opisano dalej szczegółowo w przykładzie 2.

Przeciwciała monoklonalne przeciwko ludzkiej gp39 są korzystne do zastosowania w wywoływaniu swoistej antygenowo tolerancji limfocytów T. Korzystne przeciwciała obejmują przeciwciała monoklonalne 3E4, 2H5, 4D9-8, 4D9-9, 24-31, 24-43, 89-76 i 89-79, opisane w przykładzie 2. Szczególnie korzystnymi przeciwciałami są przeciwciała monoklonalne 89-76 i 24-31. Przeciwciała 89-76 i 24-31 wytwarzane są, odpowiednio, przez hybrydomy 89-76 i 24-31, które zostały zdeponowane na mocy Traktatu Budapesztańskiego w American Type Culture Collection, Parklawn Drive, Rockville, MD., 2 września 1994. Hybrydomie 89-76 przydzielono numer HB11713 zaś hybrydomie 24-31 HB11712. Przeciwciała 89-76 i 24-31 sąizotypu IgGl.

W innym wykonaniu mAB przeciwko ludzkiej gp39, do zastosowania w kompozycji według wynalazku, wiąże epitop rozpoznawany przez przeciwciało wybrane spośród grupy składającej się z 3E4,2H5,4D9-8,4D9-9,24-3124-43,89-76 i 89-79. Korzystnie, przeciwciało przeciwko ludzkiej gp39 wiąże epitop rozpoznawany przez przeciwciała monoklonalne 89-76 albo 24-31. Zdolność mAb do wiązania epitopu rozpoznawanego przez wspomniane przeciwciała może być stwierdzona przez standardowe testy współzawodnictwa krzyżowego.

180 031

Przykładowo, przeciwciało wiążące ten sam epitop rozpoznawany przez mAb 24-31 będzie współzawodniczyć o wiązanie znakowanego 24-31 z aktywnym limfocytem T, podczas gdy przeciwciało wiążące inny epitop niż rozpoznawany przez mAb 24-31 nie będzie współzawodniczyć o wiązanie znakowanego 24-31 z aktywnym limfocytem.

B. Rozpuszczalne ligandy dla gp39

Inni antagoniści gp39, którzy mogą stanowić składnik kompozycji według wynalazku, obejmują rozpuszczalne postaci ligandu gp39. Jednowartościowy rozpuszczalny ligand gp39, jak np. rozpuszczalny CD40, może wiązać gp39, hamując w ten sposób oddziaływanie pomiędzy gp39 i CD40 na limfocytach B. Określenie „rozpuszczalny” oznacza, że ligand nie jest trwale związany z błoną komórkową. Rozpuszczalny ligand gp39 może być wytwarzany przez syntezę chemiczną albo, korzystnie, techniką rekombinacji DNA, przykładowo, przez ekspresjonowanie wyłącznie domeny zewnątrzkomórkowej (pozbawionej domeny śródbłonowej i cytoplazmatycznej) ligandu. Korzystnym ligandem pg39 jest rozpuszczalny CD40. Alternatywnie, rozpuszczalny ligand pg39 może być w postaci białka fuzyjnego. Takie biało fuzyjne obejmuje przynajmniej część ligandu gp39, związaną z drugą cząsteczką. Przykładowo, CD40 może być wyrażane jako białko fuzyjne z immunoglobuliną (tzn. białko fuzyjne CD40Ig). W jednym wykonaniu, wytwarzane jest białko fuzyjne obejmujące reszty aminokwasowe części domeny zewnątrzkomórkowej CD40 połączonej z resztami aminokwasowymi sekwencji odpowiadającej regionom zawiasowym CH2 i CH3 łańcucha ciężkiego przeciwciała, np. Cyl, tworząc białko fuzyjne CD40Ig (patrz, np. Linsey i in (1991) J. Exp. Med.. 1783: 721-730; Capon i in., (1989) Nature 337:525-531 i Capon, US 5,116,964). Białko fuzyjne może być wytwarzane przez syntezę chemiczną albo, korzystnie, techniką rekombinacji DNA w oparciu o cDNA CD40 (Stamenkovic i in., EMBO J., 8: 1403-1410 (1989)).

II. Komórki do wywoływania tolerancji swoistej antygenowo

Niniejszy wynalazek opiera się, przynajmniej częściowo, na odkryciu, że prezentacja alloantygenów limfocytom T przez komórki allogeniczne w obecności antagonisty gp39 powoduje tolerancję limfocytów T na alloantygeny. Komórki zdolne do wywołania tolerancji w tym mechanizmie, obejmująkomórki prezentujące antygen i aktywujące limfocyty T przez oddziaływanie z gp39 (tzn. oddziaływanie pomiędzy gp39 na limfocycie T i ligandem gp39 na komórce prezentującej antygen jest niezbędne do dostarczenia odpowiedniego sygnału limfocytom T do aktywacji limfocytów T). Zahamowanie oddziaływania ligandu na komórce allogenicznej albo ksenogenicznej z gp39 na limfocytach T biorcy hamuje aktywację limfocytów T przez allo- .albo ksenoantygeny i wywołuje raczej tolerancję na antygen. Zakłócanie aktywacji limfocytów T przez gp39 może zapobiec indukcji cząsteczek kostymulujących na komórce allogenicznej albo ksenogenicznej (np. cząsteczek z rodziny B7 na limfocycie B), w taki sposób, że komórka dostarcza wyłącznie sygnał antygenowy limfocytowi T pod nieobecność sygnału kostymulującego wywołując tym samym tolerancję.

Komórka allogeniczna albo ksenogeniczna jest zdolna do prezentacji antygenu limfocytom T biorcy, i jest, przykładowo, limfocytem B, komórką zajmującą się prezentacją antygenu „zawodowo” (np. monocyt, komórka dendrytyczna, komórka Langerhansa) albo inne komórki prezentujące antygen komórkom odpornościowym (np. keratynocyt, komórka śródbłonka, astrocyt, fibroblast, oligodendrocyt). Ponadto, jest korzystne aby komórka allogeniczna albo ksenogeniczną posiadała zmniejszoną zdolność pobudzania sygnału kostymulującego na limfocytach T biorcy. Przykładowo, komórka allogeniczna albo ksenogeniczną może w ogóle nie wyrażać albo wyrażać tylko niewiele cząsteczek kostymulujących, takich jak białka rodziny B7 (np. B7-1 albo B7-2). Ekspresja cząsteczek kostymulujących na potencjalnych komórkach allogenicznych albo ksenogenicznych zastosowanych w kompozycji według wynalazku, może być oceniana standardowymi technikami, przykładowo, cytometrią przepływową z zastosowaniem przeciwciał skierowanych przeciwko cząsteczce kostymulującej.

180 031

Korzystne komórki allogeniczne albo ksenogeniczne do wywołania tolerancji limfocytów T, to komórki limfoidalne, przykładowo, limfocyty krwi obwodowej albo splenocyty. Korzystnymi komórkami limfoidalnymi do wywołania tolerancji limfocytów T, są limfocyty B. Limfocyty B mogąbyć oczyszczane z populacji mieszanej komórek (np. innych rodzajów komórek w krwi obwodowej albo splenocytów) standardowymi sposobami rozdziału komórek. Przykładowo, komórki przylegające mogąbyć usunięte przez hodowanie splenocytów na płytkach plastikowych i odzyskiwanie populacji komórek nie przylegających. Limfocyty T mogąbyć usuwane z mieszanej populacji przez traktowanie przeciwciałami przeciwko limfocytom T (np. anty-Thy 1.1 albo/i anty-Thl .2) i dopełniaczem. W jednym z wykonań, spoczynkowe komórki limfoidalne, korzystnie spoczynkowe limfocyty B, stosowane sąjako komórki prezentujące antygen. Spoczynkowe komórki limfoidalne, jak spoczynkowe limfocyty B, mogąbyć izolowane znanymi technikami, przykładowo, na podstawie ich małych wymiarów i gęstości. Spoczynkowe komórki limfoidalne mogąbyć izolowane metodąelutriacji przeciwprądowej,jak opisano w przykładzie 1. Sposobem tym można uzyskać populację małych, spoczynkowych komórek bmfoidalnych, pozbawioną komórek mogących aktywować odpowiedź limfocytów T, stosując zbieranie frakcji przy 14-19 ml/min., korzystnie 19 ml/min. (przy 3200 obr/minutę). Alternatywnie, małe, spoczynkowe limfocyty (np. limfocyty B) można uzyskać przez wirowanie na nieciągłym gradiencie gęstości, przykładowo, na gradiencie Ficollu albo Percollu, gdzie po odwirowaniu można uzyskać warstwę zawierającą małe, spoczynkowe limfocyty. Małe, spoczynkowe limfocyty B mogąbyć rozróżnione od aktywowanych limfocytów B przez badanie ich pod kątem ekspresji cząsteczek kostymuluj ących, jak B7-1 i/lub B7-2, na powierzchni aktywowanych limfocytów B, przez zastosowanie technik standardowych (np. immunofluorescencji).

Komórki allogeniczne albo ksenogeniczne podawane biorcy działają, przynajmniej częściowo, prezentując antygeny dawcy limfocytom T biorcy. Tak więc, komórki ekspresjonują antygeny, które również są wyrażane na tkankach i narządach dawcy. Zwykle, może to być osiągnięte przez zastosowanie komórek allogenicznych albo ksenogenicznych uzyskanych od dawcy przeszczepianej tkanki lub narządu. Przykładowo, w kompozycji według wynalazku można zastosować wyizolowane obwodowe komórki limfoidalne, limfocyty B albo splenocyty dawcy tkanki lub narządu. Alternatywnie, komórki allogeniczne albo ksenogeniczne mogą być uzyskane ze źródła innego niż dawca tkanki albo narządu, o ile komórki posiadają determinanty antygenowe wspólne z dawcą tkanki albo narządu. Przykładowo, można zastosować komórki allogeniczne albo ksenogeniczne ekspresjonujące (większość albo wszystkie) antygeny głównego układu zgodności tkankowej tego samego co dawca. Tak więc, mogąbyć zastosowane komórki allogeniczne albo ksenogeniczne ze źródła dobranego pod względem haplotypu MHC z dawcą tkanki albo narządu (np. bliskiego krewnego dawcy przeszczepu).

III. Podawanie komórek i antagonisty gp39

Tolerancja limfocytów T na przeszczep narządowy albo tkankowy może być wywołana przez podawanie biorcy przeszczepu kompozycji według wynalazku obejmującej antagonistę gp39 w skojarzeniu z komórkąallogenicznąalbo ksenogeniczną, ekspresjonującąantygeny dawcy i oddziaływującą z limfocytami T biorcy za pośrednictwem gp39. W korzystnym wykonaniu, komórka allogeniczna albo ksenogeniczną oraz antagonista gp39, podawane są biorcy równocześnie albo w niewielkim odstępie czasu. Alternatywnie, antagonista gp39 może być podany przed podaniem komórek allogenicznych albo ksenogenicznych, przykładowo, gdy przeciwciało wykazuje długi okres półtrwania. W korzystnym wykonaniu, antagonista i komórki allogeniczne albo ksenogeniczne podawane sąbiorcy przed przeszczepieniem narządu albo tkanki (tzn. biorca jest uprzednio traktowany antagonistą i komórkami). Przykładowo, podanie komórek allogenicznych albo ksenogenicznych i antagonisty może być wykonywane przez kilka dni (np. pięć do ośmiu dni) przed przeszczepieniem tkanki albo narządu.

180 031

Podanie pojedynczej dawki komórek allogenicznych (w połączeniu z antagonistą) jestJak stwierdzono, wystarczające do wywołania tolerancji limfocytów T na tkankę albo narząd dawcy (patrz przykład 1). Liczba podawanych komórek może być różna, zależnie od rodzaju zastosowanych komórek, rodzaju przeszczepu tkankowego albo narządowego, stanu ogólnego biorcy i innych zmiennych znanych specjaliście. Odpowiednia liczba komórek może być określona przez specjalistę jedną z konwencjonalnych metod (przykładowo, opisanąw przykładzie 1). Komórki podawane są w postaci i drogą odpowiednią do wywołania tolerancji limfocytów T u biorcy. Komórki mogą być podawane w roztworze dopuszczalnym farmaceutycznie, jak zbuforowany roztwór soli albo podobnym nośniku. Komórki, korzystnie, podawane są dożylnie.

Antagonista, według wynalazku, podawany jest osobnikowi w postaci kompatybilnej biologicznie, farmaceutycznie odpowiedniej do podawania in vivo w celu wywołania tolerancji limfocytów T. Przez „farmaceutycznie odpowiedniej do podawania in vivo rozumie się postać antagonisty w której działanie lecznicze ma istotną przewagę nad skutkami toksycznymi. Określenie „osobnik” obejmuje organizmy żywe, w których można wywołać odpowiedź odpornościową, np. ssaki. Przykłady osobników obejmują ludzi, psy, koty, myszy, szczury i gatunki transgeniczne. Antagonista gp39 może być podawany w dowolnej farmakologicznej postaci, ewentualnie z dopuszczalnym farmaceutycznie nośnikiem. Podawanie aktywnej terapeutycznie ilości antagonisty określa się jako ilość efektywną, w dawkach i okresach czasu odpowiednich do uzyskania pożądanego wyniku (tzn. tolerancji limfocytów T). Przykładowo, ilość aktywna terapeutycznie antagonisty gp39 może być różna zależnie od czynników, takich jak stan choroby, wiek, płeć i ciężar osobnika, oraz zdolność antagonisty do wywołania pożądanej odpowiedzi u osobnika. Schematy dawkowania mogą być dostosowane tak, by zapewnić optymalną odpowiedź na leczenie. Przykładowo, można podawać kilka dawek podzielonych dziennie albo dawka może być proporcjonalnie zmniejszona, w przypadku, gdy wymaga tego sytuacja podczas leczenia. Jak to opisano w przykładzie 1 leczenia przeciwciałem przeciwko gp39, efektywny schemat leczenia może obejmować rozpoczęcie podawania przeciwciała przed przeszczepieniem tkanki albo narządu (np. pięć do ośmiu dni przed przeszczepieniem), następnie ponowne podawanie przeciwciała (np. codziennie) przez kilka tygodni (np. dwa do siedmiu tygodni) po przeszczepieniu.

Składnik aktywny (np. antagonista jak przeciwciało) może być podawany w dogodny sposób jak np. wstrzyknięcie (podskórne, dożylne itp.), doustnie, wziewnie, przeskómie albo doodbytniczo. Zależnie od drogi podania, składnik aktywny może być opłaszczony substancją w · celu ochrony składnika przed działaniem enzymów, kwasów i innych warunków naturalnych, które mogą uczynić go nieaktywnym. Korzystną drogą podawania jest wstrzyknięcie dożylne.

W celu podania antagonisty gp39 drogą inną niż pozajelitowa, może być konieczne opłaszczenie antagonisty albo podanie równoczesne z substancją zapobiegającą inaktywacji. Przykładowo, antagonista może być podawany osobnikowi w odpowiednim nośniku albo rozcieńczalniku, podawany równocześnie z inhibitorami enzymów albo w odpowiednim nośniku jak liposomy. Dopuszczalne farmaceutycznie rozcieńczalniki obejmują roztwór soli oraz wodne roztwory bufora. Inhibitory enzymów obejmują inhibitor trypsyny trzustkowej, diizopropylofluorofosforan (DEP) i trasylol. Liposomy obejmują emulsje typu woda w oleju i olej w wodzie jak również standardowe liposomy (Srejan i in., (1984) J. Neuroimmunol. 7:27).

Składnik aktywny może być podawany pozajelitowo albo dootrzewnowo. Mogą być również przygotowane emulsje w glicerynie, ciekłych glikolach polietylenowych i ich mieszaninach oraz w tłuszczach. W zwykłych warunkach przechowywania i stosowania, preparaty te mogą zawierać środki konserwujące w celu zapobieżenia wzrostowi mikroorganizmów.

Kompozycje farmaceutyczne, odpowiednie do zastosowania we wstrzyknięciach obejmująsterylne roztwory wodne (rozpuszczalne w wodzie) albo emulsje i sterylne proszki do przygotowania ex tempore sterylnych roztworów do wstrzyknięć albo emulsji. We wszystkich

180 031 przypadkach, kompozycja musi być sterylna i płynna w stopniu umożliwiającym zastosowanie strzykawki. Musi być stabilna w warunkach wytwarzania i przechowywania i zabezpieczona przed zanieczyszczającym działaniem drobnoustrojów jak bakterie albo grzyby. Nośnik może być rozpuszczalnikiem albo ośrodkiem dyspersji zawierającym, przykładowo, wodę, etanol, poliol (przykładowo, glicerynę, glikol propylenowy albo ciekły glikol polietylenowy itp.), oraz odpowiednie ich mieszaniny. Odpowiednia płynność może być utrzymana przez, przykładowo, zastosowanie opłaszczania jak np. lecytyną, przez utrzymywanie pożądanej wielkości cząstek w przypadku emulsji oraz zastosowanie surfaktantów. Ochrona przed działaniem drobnoustrojów może być uzyskana przez zastosowanie różnych środków przeciwbakteryjnych oraz przeciwgrzybiczych, przykładowo, parabensu, chlorobutanolu, fenolu, kwasu askorbinowego, tiomersalu itp. W wielu przypadkach, będzie korzystne włączenie do kompozycji czynników izotonicznych jak cukry, polialkohole jak mannitol, sorbitol, chlorek sodu. Przedłużone wchłanianie kompozycji wstrzykiwanych może być spowodowane przez włączenie do kompozycji czynników opóźniających wchłanianie, przykładowo, monostearynian glinu albo żelatyna.

Sterylne roztwory do wstrzyknięć mogą być wykonane przez połączenie czynnika aktywnego (np. antagonisty gp39) w pożądanej ilości w odpowiednim rozpuszczalniku z jednym lub kombinacją składników wymienionych powyżej, o ile to konieczne, i filtrowanie do sterylności. Ogólnie, emulsje przygotowuje się przez włączenie czynnika aktywnego do sterylnego nośnika, zawierającego podstawowy ośrodek dyspersyjny i inne niezbędne składniki spośród wymienionych powyżej. W przypadku sterylnych proszków do przygotowywania sterylnych roztworów do wstrzyknięć, korzystny sposób przygotowania obejmuje suszenie pod zmniejszonym ciśnieniem i suszenie po zamrożeniu co pozwala uzyskać proszek czynnika aktywnego (np. antagonisty) z ewentualnym dodatkiem pożądanych składników z uprzednio filtrowanego do sterylności roztworu.

Gdy składnik aktywny jest odpowiednio zabezpieczony, jak to opisano powyżej, białko może być podawane doustnie, przykładowo z obojętnym rozcieńczalnikiem albo przyswajalnym nośnikiem spożywczym. W znaczeniu tu użytym „dopuszczalny farmaceutycznie nośnik” oznacza dowolny rozpuszczalnik, ośrodek dyspersyjny, powłokę, środki przeciwbakteryjne i przeciwgrzybicze, czynniki izotoniczne i opóźniające wchłanianie itp. Zastosowanie takich ośrodków i czynników do substancji farmaceutycznie czynnych jest dobrze znane. Z wyjątkiem przypadków, gdy standardowe ośrodki albo czynniki nie są kompatybilne ze składnikiem czynnym, rozważa się zastosowanie ich w kompozycji terapeutycznej. Uzupełniające składniki czynne mogą być również włączone do kompozycji.

Szczególnie przydatne jest wytwarzanie kompozycji do stosowania pozajelitowego w postaciach użytkowychjednolicie dawkowanych i łatwych do podawania. Postaci użytkowe w znaczeniu tu użytym dotyczą jednostek fizycznie podzielonych, zamierzonych jako pojedyncze dawki dla osobników ssaczych, którzy mają być leczeni, przy czym każda jednostka zawiera z góry określoną ilość składnika czynnego, obliczoną na wywołanie pożądanego efektu leczniczego, w połączeniu z wymaganym nośnikiem farmaceutycznym. Konkretne postaci użytkowe kompozycji farmaceutycznej według wynalazku podyktowane są i bezpośrednio zależne od a) szczególnej charakterystyki składnika czynnego i efektu leczniczego, który ma być wywołany b) ograniczeń związanych z techniką wytwarzania składnika czynnego do leczenia osobniczej wrażliwości.

Następnie po albo równocześnie ze schematem wywoływania tolerancji opisanym tutaj, tkanka albo narząd dawcy jest przeszczepiany biorcy przeszczepu standardowymi technikami.

IV Zastosowanie kompozycji farmaceutycznej według wynalazku

Kompozycje według wynalazku można zastosować w przypadku wielu przeszczepów tkankowych albo narządowych. Służą one do wywoływania u biorcy tolerancji limfocytów T na przeszczep tkanek albo narządów takich jak wysepki trzustkowe, wątroba, nerka, serce, płuca,

180 031 skóra, mięśnie, tkanka nerwowa, żołądek i jelita. Tak więc, kompozycje według wynalazku są możliwe do zastosowania w leczeniu chorób i stanów wymagających przeszczepienia tkanek albo narządów (np. przeszczepieniu wątroby w leczeniu hipercholesterolemii, przeszczepieniu komórek mięśni w leczeniu dystrofii mięśniowej, przeszczepieniu tkanki nerwowej w leczeniu choroby Huntingtona albo choroby Parkinsona itp). W korzystnym wykonaniu, przeszczepiana tkanka obejmuje wysepki trzustkowe. Kompozycję można zatem stosować do leczenia cukrzycy przez przeszczepienie wysepek trzustkowych. Sposób obejmuje podawanie osobnikowi wymagającemu leczenia: 1) komórek allogenicznych albo ksenogenicznych, ekspresjonujących antygeny dawcy, 2) antagonisty cząsteczki ekspresjonowanej na limfocytach T biorcy, pośredniczącej w zależnych od kontaktu pomocniczych funkcjach efektorowych, jak np. antagonisty gp39 (np. przeciwciała przeciwko gp39) i 3) komórek wysepek trzustkowych dawcy. Korzystnie, komórki allogeniczne albo ksenogeniczne oraz antagonista, podawane są biorcy przed podaniem wysepek trzustkowych.

Wynalazek jest dalej zobrazowany następującymi przykładami, które nie powinny być uważane za ograniczenia. Treść wszystkich odnośników, patentów i opublikowanych zgłoszeń patentowych cytowanych w zgłoszeniu włączono jako odnośniki.

Przykład 1: Wywołanie tolerancji na alloprzeszczep wysepek trzustkowych przez podanie biorcy komórek allogenicznych i przeciwciała przeciwko gp39.

Współczesne badania nad alloprzeszczepianiem opierają się na ogólnej immunosupresji, która nieswoiście niszczy funkcje układu odpornościowego. Jednakże, leki immunosupresyjne mogą spowodować poważne efekty uboczne. Dodatkowo, przeszczepienie allogenicznych wysepek Langerhansa, w celu leczenia cukrzycy, okazało się oporne na takie podejście (patrz, np. Robertson, R. P., (1992) N. Engl. J. Med., 327, 1861). Leczenie przeciwciałami skierowanymi przeciwko limfocytom T umożliwia powodzenie przeszczepienia allogenicznych wysepek u gryzoni, ale powodzenie to jest spowodowane uogólnioną immunosupresją (Carpenter, C. B., (1990) N. Engl. J. Med., 322,1224; Roark, J. H., i in., (1992) Transplantation 54,1098; Kahan, B. D., (1992) Curr. Opin. Immunol. 4,553). W tym przykładzie, tolerancję na allogeniczny przeszczep wysepek wywołano u biorcy przez manipulowanie prezentacją alloantygenu limfocytom T, w sposób zapobiegający ich aktywacji. Przeżycie alloprzeszczepu wysepek u myszy C57BL/6 (H-2^b), z wywołaną chemicznie cukrzycą, badano przy zastosowaniu poniższej metodyki:

Wywołanie cukrzycy

U samców myszy C57BL/6 (H-2b) wywołano cukrzycę przez dożylne podanie streptoztocyny (140 mg/kg). Permanentną cukrzycę potwierdzono przez wykazanie stężenia glukozy w osoczu > 400 mg/dl trzykrotnie w ciągu tygodnia.

Frakcjonowanie splenocytów allogenicznych

Komórki allogeniczne dawcy, do traktowania biorców przeszczepu, uzyskano ze zwierząt (C57xBALB/c) (H-2b^/d)F₁, będących hybrydami, aby uniknąć choroby „przeszczep przeciwko gospodarzowi”. W celu izolowania małych limfocytów, zawiesinę splenocytów z 8 tygodniowych samic myszy (C57xBALB/'c)F₁ pozbawiono erytrocytów a następnie frakcjonowano przez elutriację jak to opisano przez Tony i in., (1985) J. Exp. Med., 161, 223; i Gosselin i in., (1988) J. Immunol. 140, 1408. Pokrótce, małe limfocyty izolowano przez elutriację przeciwprądową, stosując, przykładowo, wirówkę J-6B (Beckman Instruments, Palo Alto, CA). Około l-5xl0⁸ komórek w pożywce hodowlanej albo zbalansowanym roztworze soli z 1,5% płodowej surowicy wołowej traktowano DNAzą, wprowadzono do komory elutriacyjnej o początkowym przepływie przeciwprądowym równym 13,5 ml/min. i odwirowano w 4°C przy stałej prędkości 3200 obr/min. Frakcję zawierającą małe komórki i nieliczne zanieczyszczające duże komórki eluowano zwykle przy przepływie 14-19 ml/min., jednakże dokładna wielkość przepływu może zależeć od pożywki w której zawieszone są komórki. W opisanych tu doświadczeniach, frakcję zawierającą małe komórki uzyskiwano przy przepływie 19 ml/min (3200 obr/min.).

180 031

Frakcja ta była całkowicie pozbawiona opornej na promieniowanie (300 radów) funkcji pomocniczej, w badaniu z linią limfocytów T swoistych w stosunku do króliczych IgG i H2^d (CDC35) albo alloreaktywnych w stosunku do H2^d (D10.G4). Małe komórki i komórki niefrakcjonowane przepłukano dwukrotnie pożywką bezsurowiczą, przed wstrzyknięciem do żyły ogonowej biorcom przeszczepu allogenicznego. Podano około 40-100x10⁶ niefrakcjonowanych splenocytów (C57xBALB/c) (H-2^b/d)F, albo 40-100x106 elutrowanych małych splenocytów (C57xBALB/c) (H-2^b/d)F_P [Wstępne traktowanie biorców przeszczepów

Biorcy przeszczepów byli wstępnie traktowani niefirakcjonowanymi allogenicznymi splenocytami (C57xBALB/c) (H-2^wd)F_b „frakcją 19” elutrowanych splenocytów o małej średnicy pozbawionych aktywności APC (izolowanych w wyżej opisany sposób), przeciwciałem monoklonalnym przeciwko gp39 (MR1, patrz przykład 2, doświadczenie 3), albo połączeniem komórek allogenicznych i przeciwciała przeciwko gp39. Komórki frakcji 19 były badane w dwóch zakresach dawek, w niskiej dawce rzędu 40-44x106 komórek i wysokiej rzędu 77-8x106 komórek. Zwierzęta kontrolne nie otrzymywały ani komórek allogenicznych, ani przeciwciał. Komórki allogeniczne były podawane biorcom przez wstrzyknięcie do żyły ogonowej pięć do ośmiu dni przed przeszczepieniem alloprzeszczepu. Myszy traktowano przeciwciałami MR1 w dawce 250 pg/mysz dwa razy w tygodniu począwszy siedem dni przed przeszczepieniem wysepek i kontynuowano przez 2-7 tygodni albo do odrzucenia przeszczepu. Pierwsze wstrzyknięcie przeciwciał podawane było zwykle tego samego dnia co pierwsze wstrzyknięcie komórek allogenicznych.

Przeszczepienie wysepek allogenicznych

Allogeniczne wysepki BALB/c (H-2d) wyizolowano modyfikowanym sposobem trawienia kolagenazą(Gottlieb i in., (1990) Diabetes 39, 643). Wysepki w dawce rzędu 30 wysepek/g ciężaru ciała wszczepiono pod torebkę nerki biorcom (C57BL/6J) (H-2b), bezpośrednio po izolacji. Przeżycie przeszczepu określono jako utrzymywanie stężenia glukozy w osoczu na poziomie < 200 mg/dl.

Wyniki

W pierwszej serii doświadczeń, biorców przeszczepu allogenicznego wysepek wstępnie traktowano samymi splenocytami allogenicznymi albo samym przeciwciałem przeciwko gp39. Jak pokazano na figurze 1, pod nieobecność wstępnego traktowania splenocytami, wszystkie przeszczepy wysepek zostały odrzucone w ciągu . 13 dni po przeszczepieniu (9 ± 2 dni; zakres 5-13; N=23). Słabe przeżywanie wysepek obserwowano również u zwierząt traktowanych wyłącznie niefrakcjonowanymi splenocytami, wykazującymi normalną aktywność APC (6 ± 3 dni; zakres 4-12, N=16). W przeciwieństwie, wstrzyknięcie wyższej dawki pozbawionych APC małych splenocytów frakcji 19 (75-88χ1θ6 komórek) przedłużało przeżycie przeszczepów allogenicznych (19 ± 10 dni, zakres 7-40; N=16). Ten wpływ na długość przeżycia przeszczepu był istotny statystycznie (F35 ₈ = 17,3 p <0,001 w porównaniu z grupami nie traktowanymi, traktowanymi transfuzją pełnej śledziony albo niższą dawką splenocytów frakcji 19), ale nie był permanentny. Wydłużone, choć ograniczone przeżycie allogenicznych wysepek u biorców pozbawionych APC, małych komórek frakcji 19 wskazuje, że komórki te nie są w stanie same podtrzymać przeżycia przeszczepu allogenicznego. Dodatkową kohorę biorców traktowano dawką 77-88x106 komórek frakcji 20. Frakcja ta składała się również w przeważającej liczbie z małych limfocytów, ale różniła się od frakcji 19 tym, że wykazywała mierzalną funkcję APC. Biorcy tych komórek (N=6) szybko odrzucili przeszczepy (średnio 8,5 dnia, zakres 6-12). Inną grupę biorców traktowano wyłącznie przeciwciałem monoklonalnym przeciwko gp39, MR1. Figura 1 pokazuje, że alloprzeszczep wysepek został odrzucony w ciągu 15 dni przez 7/11 myszy traktowanych wyłącznie przeciwciałem przeciwko gp39. Pozostałe cztery myszy posiadały czynne przeszczepy podczas zakończenia doświadczenia w dniu 48. Wyniki te wskazują, że po14

180 031 danie biorcom samego przeciwciała MR1, przeciwko gp39, może wydłużyć przeżycie przeszczepu allogenicznego wysepek (średnio 20 dni, zakres 9 - oo, N=5). Stopień wydłużenia był statystycznie podobny do uzyskanego z zastosowaniem wyższych dawek samych splenocytów frakcji 19 i znacząco dłuższy od uzyskanego w pozostałych trzech grupach (p <0,05).

Seria doświadczeń opisanych powyżej wskazuje, że wysokie dawki pozbawionych APC splenocytów frakcji 19 albo traktowanie mAb przeciwko gp39, może przedłużyć przeżycie przeszczepów allogenicznych wysepek trzustkowych w porównaniu z nieleczoną kontrolną. Jednakże, żadne z pojedynczych działań nie było efektywne pod względem wywoływania długoterminowej tolerancji biorców na wysepki trzustkowe. W następnej serii doświadczeń, traktowanie splenocytami allogenicznymi skojarzono z traktowaniem biorców przeciwciałami przeciwko gp39. Skojarzone podawanie splenocytów allogenicznych i przeciwciała przeciwko gp39 było, jak stwierdzono, bardziej efektywne niż stosowanie obu osobno. Wyniki pokazano na figurze 2, na której każda krzywa odpowiada jednej myszy. Symbole otwarte oznaczają biorców, u których przeszczep zaginął spontanicznie. Symbole zamknięte oznaczają myszy, których wysepki pozostały czynne do zakończenia doświadczenia. Figura 2 (panel B) pokazuje, że u wszystkich (N=6) zwierząt traktowanych przez 7 tygodni mAb przeciwko gp39 i pojedynczym wstrzyknięciem pozbawionych APC splenocytów frakcji 19, uzyskano nieograniczone przeżycie przeszczepu. Zmiana tego protokołu polegająca na skróceniu okresu podawania mAb przeciwko gp39 osłabiło, ale nie zlikwidowało korzystnego wpływu na przeżycie przeszczepu. Nieograniczone przeżycie przeszczepu uzyskano u 6/8 biorców, gdy przeciwciało przeciwko gp39 było podawane tylko przez 2 tygodnie w skojarzeniu ze splenocytami frakcji 19 (figura 2 panel A). Nieograniczone przeżycie przeszczepu obserwowano również u biorców traktowanych przeciwciałem przeciwko gp39 przez 2 lub 7 tygodni w połączeniu z wstrzyknięciem niefrakcjonowanych splenocytów allogenicznych.

W celu potwierdzenia czynności przeszczepu i braku wydzielania insuliny przez przetrwałe wysepki własne, nie zniszczone działaniem streptozotocyny, pobrano nerki z wszczepionymi podtorebkowo przeszczepami. We wszystkich przypadkach, jednostronna nefrektomia spowodowała nawrót hiperglikemii (> 300 mg/dl) w ciągu trzech dni.

Przeszczepy allogeniczne wysepek i własne trzustki wszystkich zwierząt badano histologicznie, zarówno przeszczepy odrzucone jak i trwale przyjęte. Skrawki histologiczne przeszczepów wysepek w nerkach biorców frakcjonowanych małych limfocytów allogenicznych i ciągle (7 tygodni) traktowanych przeciwciałem MR1, wykazywały liczne wysepki widzialne pod torebką nerki, pozbawioną nacieku komórekjednojądrzastych i zawierające ziarniste komórki pozytywne na insulinę i glukagon. W przeciwieństwie, skrawki histologiczne przeszczepów allogenicznych wysepek w nerkach biorców traktowanych samym przeciwciałem przeciwko gp39 wykazywały charakterystyczny intensywny naciek komórek jednojądrzastych i towarzyszące uszkodzenie komórek wysepek. We wszystkich trzustkach biorców, morfologia była identyczna z cukrzycą wywołaną streptozotocyną.

Przykład 2: Wytwarzanie i charakteryzowanie przeciwciał przeciwko gp39

Do wywołania swoistej antygenowo tolerancji limfocytów T u ludzi, korzystne jest podawanie przeciwciał skierowanych przeciwko ludzkiej gp39. Do wytworzenia mysich przeciwciał monoklonalnych przeciwko ludzkiej gp39 zastosowano poniższą metodykę. Myszy BALB/c immunizowano rozpuszczalnym białkiem fuzyjnym gp39, gp39-CD8, w kompletnym adiuwancie Freunda (CFA). Myszy następnie eksponowano 6 tygodni później rozpuszczalnym gp39-CD8 w niekompletnym adiuwancie Freunda (IFA). Rozpuszczalną gp39-CD8 podano w postaci rozpuszczalnej w 4 tygodnie po immunizacji wtórnej. Myszom podano dawkę przypominającą ludzkich limfocytów krwi obwodowej w 2 tygodnie później, i ostatnią immunizację rozpuszczalną gp39-CD8 po dodatkowych 2 tygodniach. Splenocyty poddano fuzji z komórkami NS-1 dnia 4 po ostatniej immunizacji, według standardowego protokołu.

180 031

Klony wytwarzające przeciwciała przeciwko ludzkiej gp39 wyselekcjonowano w oparciu o liczne procesy przesiewania. Klony początkowo przesiewano w płytkowym teście wiązania z użyciem gp39-CD8. Klony pozytywne w teście z użyciem CD8-CD72 wyeliminowano. Pozostałe klony przesiewano następnie na spoczynkowym i aktywowanych przez 6 godzin ludzkich limfocytach krwi obwodowej (PBL) w cytometrii przepływowej. Hybrydomy zabarwiające aktywowane ale nie spoczynkowe PBL uważano za pozytywne. Na koniec, pozostałe klony badano na ich zdolność do blokowania wiązania CD40Ig ze związaną z płytką gp3 9.

Początkowo około 300 klonów pozytywnych przesiewano pod kątem wiązania gp39-CD8 1CD8-72 w płytkowym teście wiązania. Wśród tych klonów około 30 wiązało się, jak stwierdzono, z gp39 a nie CD8. Klony te przesiewano następnie pod kątem wykrywania gp39 na pobudzonych ludzkich PBL. Około 15 klonów wykrywało cząsteczkę na aktywowanych PBL, ale nie na komórkach spoczynkowych. Swoistość była dalej potwierdzana przez określenie zdolności klonów do zablokowania wykrywania związanej z płytkągp39 przez CD40Ig. 3 spośród 10 klonów w tym badaniu, blokowało wiązanie CD40Ig. Klony te to 3E4,2H5 i 2H8. Klony te sąkorzystne do zastosowania w sposobach opisanych tu. Klony, które były pozytywne w stosunku do aktywowanych, ale nie spoczynkowych PBL były również badane na aktywność wobec aktywowanego klonu komórkowego limfocytów T szczura, POMC8. Klon 2H8 wykazywał aktywność krzyżową z linią limfocytów T szczura.

Doświadczenie 2 - Przeciwciała przeciwko ludzkiej gp39

Podobną procedurę immunizacji co opisana w doświadczeniu 1 została zastosowana do wytworzenia przeciwciał skierowanych przeciwko ludzkiej gp39. Jedną mysz BALB/c immunizowano rozpuszczalną gp-39-CD8 w CFA, po czym eksponowano na aktywowane przez 6 godzin ludzkie limfocyty krwi obwodowej w 4 tygodnie później. Mysz otrzymała następnie dawkę przypominającą rozpuszczalnej gp39-CD8 na 4 dni przed fuzją splenocytów z komórkami NS-1 przy zastosowaniu standardowego protokołu. Przesiewanie klonów hybrydom wykonano przy użyciu cytometrii przepływowej, barwiąc aktywowane od 6 godzin ludzkie PBL. Wyselekcjonowano klony zabarwiające aktywowane, ale nie spoczynkowe ludzkie PBL. Sześć klonów 4D9-8, 4D9-9, 2431, 2443, 89-76 i 8979.

Swoistość selekcjonowanych przeciwciał potwierdzono kilkoma testami. Po pierwsze, analiza cytometriąprzepływową wykazała, że wszystkie sześć mAb zabarwiających aktywowane, ale nie spoczynkowe limfocyty T krwi obwodowej (patrz, przykłady na figurze 3B i 3C, przedstawiające barwienie aktywowanych limfocytów T odpowiednio, 4D9-8 i 4D9-9). Ekspresja cząsteczki rozpoznawanej przez każde z sześciu przeciwciał, jest wykrywalna w ciągu 4 godzin aktywacji, jest maksymalna pomiędzy 6 i 8 godziną po aktywacji, i jest niewykrywalna po 24 godzinach. Wszystkie sześć mAb rozpoznają cząsteczkę ek^^re^_j<^^<^¹^^i^ćąna aktywowanych PBL CD3+, głównie o fenotypie CD4+, ale również część limfocytów T CD8+ również ekspresjonuje tę cząsteczkę. Ekspresja cząsteczki rozpoznawanej przez wszystkie sześć mAb hamowana jest przez obecność cyklosporyny A w pożywce hodowlanej, podobnie jak cząsteczki gp39 (patrz figura 4A i 4B, pokazująca znakowanie limfocytów T traktowanych cyklosporyną A, odpowiednio, 4D9-8 i 4D9-9). Kinetyka i rozmieszczenie ekspresji cząsteczki rozpoznawanej przez przeciwciała jest identyczne jak gp39, co stwierdzono białkiem fuzyjnym ludzkiego CD40Ig. Dodatkowo, wszystkie sześć mAb blokowało znakowanie gp39 przez CD40Ig (patrz, figura 5A i 5B, pokazujące zahamowanie znakowania gp39 przez CD40Ig, w obecności, odpowiednio, 4D9-8 i 4D9-9). W teście ELISA, wszystkie sześć przeciwciał rozpoznawało gp39-CD8, fuzyjną, rozpuszczalną postać cząsteczki gp39. Ponadto, wszystkie sześć przeciwciał immunoprecypitowało cząsteczkę o ciężarze cząsteczkowym około 36 kDa ze znakowanych ³⁵S-metioniną aktywowanych ludzkich PBL. Immunoprecypitowana cząsteczka jest identyczna z precypitowaną przez białko fuzyjne CD40Ig.

180 031

Aktywność funkcjonalną sześciu wybranych przeciwciał (4D9-8, 4D9-9, 24-32, 24-43, 89-76 i 89-79) zbadano w opisany niżej sposób. Po pierwsze zmierzono zdolność przeciwciała do zahamowania proliferacji oczyszczonych ludzkich limfocytów B hodowanych w obecności IL-4 i gp39. Oczyszczone limfocyty B hodowano z gp39 i IL-4 w obecności albo pod nieobecność oczyszczonych przeciwciał monoklonalnych albo CD40Ig w dawkach pomiędzy 0 i 12,5 pg/ml. Proliferację limfocytów B oznaczono po trzech dniach w hodowli, przez wbudowywanie tymidyny. Wyniki (pokazane na figurze 6) pokazują, że wszystkie sześć mAb może zahamować proliferację limfocytów B, wywołaną przez gp39 i IL-4. Przeciwciała 89-76 i 24-31 były najbardziej efektywne w hamowaniu wywołanej proliferacji limfocytów B.

Następnie, badano zdolność mAb do zahamowania różnicowania limfocyta B, mierzoną wytwarzaniem Ig wywołanym przez IL-2 i aktywowane limfocyty T przeciwko CD3. Oczyszczone ludzkie limfocyty B IgD+ przygotowano przez selekcję pozytywną na FACS a następnie hodowano z aktywowanymi limfocytami T skierowanymi przeciwko CD3 (traktowane mitomycynąC) i IL-2 przez 6 dni w obecności albo pod nieobecność oczyszczonych przeciwciał monoklonalnych przeciwko gp39 w dawkach pomiędzy 0 i 10 pg/ml. Wytwarzanie IgM, IgG i IgA badane było ELISA w dniu 6. Wyniki (pokazane w tabeli 1) pokazują, że wszystkie sześć przeciwciał może zahamować zależne od limfocytów T różnicowanie limfocytów B co mierzono wytwarzaniem IgM, IgG i IgA.

Tabela 1

	Wytwarzanie immunoglobulin
mAb	gg/ml	IgM	IgG	IgA
żadne	-	17500	6710	4471
4d9-8	0,1	4813	2130	2819
	1,0	4394	2558	1519
	10,0	1081	389	396
4D9-9	0,1	3594	919	1731
	1,0	2659	1233	1606
	10,0	374	448	266
24-31	0,1	3863	981	344
	1,0	1287	314	165
	10,0	1120	596	23
24-43	0,1	6227	4132	432
	1,0	3193	2130	192
	10,0	7021	1232	1081
89-76	0,1	3783	1069	344
	1,0	2180	352	171
	10,0	818	551	19
89-79	0,1	9763	1924	3021
	1,0	2314	460	156
	10,0	183	135	434

180 031

W celu zbadania wpływu przeciwciał przeciwko gp39 na odpowiedź limfocytów T, przeciwciała włączono do standardowej mieszanej reakcji limfocytów (MLR). 300000 ludzkich limfocytów krwi obwodowej (R=odpowiadające) hodowano ze 100000 napromieniowanych allogenicznych limfocytów krwi obwodowej (S=pobudzające) w obecności albo pod nieobecność przeciwciał przeciwko gp39 (10 pg/ml). Hodowle pulsowano ³H-tymidynądnia 4,5 albo 6 i zbierano w 18 godzin później. Wszystkie sześć przeciwciał przeciwko gp39 hamowało alloswoistą odpowiedź mierzonąMLR (patrz, figura 7, przedstawiająca zahamowanie alloswoistej odpowiedzi gdy R i S inkubowano w obecności 24-31 albo 89-76; białko fuzyjne CTLA4-immunoglobulina oraz przeciwciało przeciwko CD28 służyły jako kontrola pozytywna).

W celu określenia czy sześć przeciwciał rozpoznaje różne epitopy na cząsteczce ludzkiej gp39, wykonano doświadczenie polegające na blokowaniu krzyżowym. Aktywowane ludzkie PBL blokowano jednym z sześciu przeciwciał (25 Jg/ml przeciwciała niekoniugowanego). Komórki płukano i znakowano 10 pg/ml przeciwciała koniugowanego z biotyną, po czym wykonywano reakcję z fikoerytryną sprzęgniętą z awidyną(PE-Av). Znakowanie komórek przez PE-Av analizowano na FACS. Wyniki przedstawiono w tabeli poniżej.

Tabela 2

Przeciwciało blokujące	Przeciwciało znakujące
4D9-8	4D9-9	24-31	24-43	89-76	89-79
żadne	-H-+	+++				++++

4D9-8	ND	-	++++	1 1 -1· 1	+++	+++
4D9-9	+++	ND	+++	1 III	+++	+++
24-31	+	+	ND	+++	++	-H-
24-43	+	+	+++	ND	++	+
89-76	+	+	+++	-H-+	ND	+++
89-79	+	++	+++	+++	+++	ND

Intensywność znakowania i odsetek komórek pozytywnych oznaczono symbolem 4 (+4+4- = MI >200;

+++ = MI >125;

++ = MI >50;

+ = MI >25;

- = znakowanie na poziomie tła),

ND = nie badano.

Wszystkie przeciwciała blokowały wiązanie CD40Ig z aktywowanymi ludzkimi PBL. Jednakże, dane pokazane w tabeli 2 jasno pokazują, że brak blokowania przez niektóre przeciwciała wiązania innych przeciwciał z aktywowanymi ludzkimi PBL, wskazuje, że rozpoznają one różne epitopy na cząsteczce ludzkiej gp39.

Hybrydomy 89-76 i 24-31, wytwarzające, odpowiednio, przeciwciała 89-76 i 24-31, zdeponowano na mocy Traktatu Budapesztańskiego w American Type Culture Collection, Parklawn Drive, Rockville, MD., 2 września 1994. Hybrydomie 89-76 przydzielono numer HB11713 zaś hybrydomie 24-31 HB11712.

Doświadczenie 3 - Przeciwciała skierowane przeciwko mysiej gp39

W j ednym wykonaniu wynalazku, antagoni stą gp3 9 jest przeciwciało monoklonalne MR 1, przeciwko mysiej gp39. Poniższy sposób zastosowano w celu wytworzenia przeciwciała monoklonalnego MR1, i może on być zastosowany do wytworzenia innych przeciwciał przeciwko gp39.

180 031

Chomiki immunizowano dootrzewnowo 5-106 aktywowanych limfocytów T_hl (dl. 6) w tygodniowych odstępach przez sześć tygodni. Gdy miano przeciwciał przeciwko mysim T_hl w surowicy przekroczyło 1:10000, wykonano fuzję komórek z użyciem poliglikolu etylenowego stosując splenocyty chomika i NS-1. Nadsącza ze studzienek zawierających rosnące hybrydomy przesiewano cytometriąprzepływowąna spoczynkowych i aktywowanych T_hl. Pewna hybrydoma, wytwarzająca Mab swoiście rozpoznające aktywowane Th, była dalej badana i klonowana do uzyskania MR1. MR1 wytwarzano w wysięku i oczyszczano przez HPLC jonowymienną. Hybrydomę MR1 zdeponowano w American Type Culture Collection, Parklawn Drive, Rockville, MD., gdzie nadano jej numer HB11048.

180 031

180 031 __ Skumulowany procent

Cumulative Graft Survival (%) przeżycia przeszczepu bez komórek —>— całe splenocyty — — — frakcja 19 splenocytów — --samo przeciwciało przeciwko gp39

figuke i figura 1

180 031

Stężenie glukozy w osoczu

Plasma Glucose Concentration (mg/dl)

Frakcja 19 splenocytów

HR1 Ab x 2 tygodnie <

c do

Frakcja 19 KR1 Ab x 7

F^ splenccytć tygodni

CQ ca

{Ii

Days

Dni

180 031

FIGURA 3A

FIGURA 3B FIGURĘ 3B

256-—X = 433.4 49.1

CV - 19.7 %= 47.6

128' l·—--—1

FLl-Height Wielkość FLI

10° IO¹ io^?- 10³ ttttt

IO⁴

180 031

FIGURA 3C FIG3RE 2C

FL ł-Height Wielkość FLI

FIGURA 4A FIOTKE 4Ά

180 031

FIGURA 4B FIGURĘ 4B

FIGURA 4C •FIGURĘ 4C

FIGURA 5B

Figura 5A FIGtJRE ΞΒ

FIGURĘ 5A

180 031 cpm

FIGURA 6 FIGURĘ 6

ug/ml mAb

180 031

FIGURA 7 FIGURĘ 7

—O—R+R •o~s+s —O R+R+S+mlg -ώ-R+S+CTLA4-Ig -«-R+S+ant^CD28 •-t-R+S+24-3l -<-R+S+89-76

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Kompozycja farmaceutyczna do wywoływania tolerancji limfocytów T na przeszczep tkankowy lub narządowy, znamienna tym, że obejmuje następujące składniki:

a) komórki allogeniczne albo ksenogeniczne, wyrażające przynajmniej jeden antygen dawcy, które posiadająna swej powierzchni ligand oddziaływujący z receptorem gp39 na powierzchni limfocytów T biorcy, pośredniczącym w zależnych od kontaktu pomocniczych funkcjach efektorowych; i

b) antagonistę receptora gp39.
2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że jako antagonistę zawiera przeciwciało przeciwko gp39.
3. Kompozycja według zastrz. 2, znamienna tym, że jako przeciwciało przeciwko gp39 zawiera przeciwciało monoklonalne.
4. Kompozycja według zastrz. 2, znamienna tym, że jako przeciwciało przeciwko gp39 zawiera przeciwciało przeciwko ludzkiemu gp39.
5. Kompozycja według zastrz. 3, znamienna tym, że jako przeciwciało monoklonalne zawiera przeciwciało MR1.
6. Kompozycja według zastrz. 3, znamienna tym, że jako przeciwciało monoklonalne zawiera chimeryczne przeciwciało monoklonalne.
7. Kompozycja według zastrz. 3, znamienna tym, że jako przeciwciało monoklonalne zawiera humanizowane przeciwciało monoklonalne.
8. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że jako komórkę allogenicznąalbo ksenogeniczną zawiera komórkę limfoidalną.
9. Kompozycja według zastrz. 8, znamienna tym, że jako komórkę limfoidalną zawiera limfocyt B.
10. Kompozycja według zastrz. 9, znamienna tym, że jako limfocyt B zawiera spoczynkowy limfocyt B.

* * *