PL180091B1

PL180091B1 - Szczepionka, zwlaszcza do podawania doustnego lub donosowego PL PL

Info

Publication number: PL180091B1
Application number: PL95315670A
Authority: PL
Inventors: Mohammed Anjam Khan; Steven Neville Chatfield; Jingli Li
Original assignee: Medeva Holdings Bv
Priority date: 1994-01-31
Filing date: 1995-01-31
Publication date: 2000-12-29
Also published as: HU9602084D0; EP0742829B1; BR9506666A; DE69532109D1; AU1541595A; ES2210283T3; CZ218296A3; PT742829E; JPH09508276A; SK99696A3; PL315670A1; DK0742829T3; JP3731004B2; WO1995020665A1; CA2182315A1; NZ278930A; ATE254178T1; HUT75734A; FI963016L; DE69532109T2

Abstract

1. Szczepionka, zwlaszcza do podawania doustnego lub donosowego, znamienna tym, ze zawiera atenuowana bakterie oraz farmaceutycznie dopuszczalny nosnik, przy czym bakte- ria posiada konstrukcje DNA zawierajaca sekwencje promotora htrA zwiazana operacyjnie z sekwencja kodujaca bialko heterologiczne. PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest szczepionka zawierająca atenuowaną bakterię posiadającą konstrukcję DNA zawieraąącąsekwencję promotora zwiazanąz sekwencjąkodującąbiałko heterologiczne.

W ostatnich latach pojawiła się nowa generacja doustnych szczepionek żywych bakterii salmonella opartych na szczepach Salmonella, które zostały atenuowane przez wprowadzenie nieodwracalnej mutacji w genie zaangażowanym w szlak biosyntezy aminokwasów aromatycznych w tych bakteriach. Takie szczepy są ujawnione np. w opisie patentowym europejskim, EP-A-0322237. Te doustne szczepionki żywych bakterii salmonella budzą nadzieję jako szczepionki na salmonellozę u ludzi i zwierząt a ponadto, mogą być również skutecznie stosowane jako nośniki do dostarczania heterologicznych antygenów do układu immunologicznego. Kombinowane szczepionki salmonella zastosowano do dostarczania antygenów pochodzących z wirusów, bakterii i pasożytów, wywołując immunologiczne odpowiedzi wydzielnicze, humoralne i komórkowe na te rekombinacyjne antygeny. Kombinowane szczepionki salmonella reprezentuj ą ogromny potencjałjako doustne układy szczepionek wieloważnych podawanych w jednej dawce (C. Hormaeche i wsp., FEMS Symposium nr 63, Plenum, Nowy Jork, str. 71-83, 1992).

W rozwoju kombinowanych szczepionek salmonella istnieją przeszkody, które muszą być przezwyciężone. Główną trudnością jest uzyskanie w takiej szczepionce salmonella wysokiego poziomu ekspresji rekombinacyjnego antygenu, który byłby wystarczający do uwolnienia odpowiedzi immunologicznej. Jednakże, nieregulowany, wysoki poziom ekspresji obcych antyge180 091 nów może być toksyczny i wywierać wpływ na żywotność komórki (I. Charles i G. Dougan, TIBTECH 8, str. 117-21,1990, co powoduje nieskuteczność szczepionki albo utratę rekombinacyjnego DNA. Opisano szereg możliwych rozwiązań tego problemu, polegających między innymi na ekspresji z. plazmidów zawierających podstawowe geny, na użyciu promotorów „on-off ’ albo na wprowadzeniu obcych genów do chromosomu salmonella.

Alternatywnym podejściem do rozwiązania tego problemu byłoby użycie promotora, który byłby indukowalny in vivo. Jednym z takich promotorów jest promotor reduktazy azotynowej z E.coli, nirB. który jest indukowany podczas anaerobiozy. Kompozycje szczepionek zawierających bakterie transformowane konstrukcjami posiadającymi promotor nirB są opisane w publikacji naszego wcześniejszego międzynarodowego zgłoszenia patentowego PCT/GB93/01617.

Przedmiotem wynalazku jest Szczepionka, zwłaszcza do podawania doustnego lub donosowego charakteryzująca się tym, że zawiera atenuowaną bakterię oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, przy czym bakteria posiada konstrukcję DNA zawierającą sekwencję promotora htrA związaną operacyjnie z sekwencjąkodującąbiałko heterologiczne. Korzystnie szczepionka według wynalazku charakteryzuje się tym, że białka tworzące fuzję sąpołączone za pomocą giętkiego regionu „zawiasowego” stanowiącego łańcuch złożony z co najmniej 4, a korzystnie 6 do 14 aminokwasów tworzących sekwencję:

-[X]p-Pro-[Y]q-Pro-[Z]rw której Pro oznacza prolinę, X i Y oznaczają glicynę albo aminokwas posiadający nieobjętościowy łańcuch boczny, Z oznacza dowolny aminokwas, p oznacza dodatnią liczbę całkowitą, q oznacza dodatnią liczbę całkowitą od 1 do 10 a r oznacza zero albo dodatnią liczbę całkowitą większą od zera.

Równie korzystnie szczepionka według wynalazku charakteryzuje się tym, że białko fuzyjne składa się z dwóch heterologicznych białek, przy czym pierwszym heterologicznym białkiem jest sekwencja antygenowa zawierająca fragment C toksyny tężca albo jeden lub większą ilość jego epitopów. Równie korzystnie szczepionka według wynalazku charakteryzuje się tym, że atenuowana bakteria została atenuowana drogą wprowadzenia nieodwracalnej mutacji w genie zaangażowanym w szlaku biosyntezy aminokwasów aromatycznych w tej bakterii. Równie korzystnie szczepionka wynalazku charakteryzuje się tym, że atenuowana bakteria zawiera nieodwracalną mutację w każdym z dwóch dyskretnych genów zaangażowanych w szlaku biosyntezy aminokwasów aromatycznych tej bakterii.

Niniejszy wynalazek ujawnia metodę wytworzenia konstrukcji DNA zawierających inny indukowalny promotor, mianowicie promotor dla genu htrA, kodującego białko indukowane szokiem.

Gen htrA jest opisany przez K. Johnson’a i wsp. w Mol. Microbiol. (5,401 -407, 1991) i w odnośnikach cytowanych w tej pracy. Jest on przykładem genu kodującego białko szoku cieplnego, wytwarzane w odpowiedzi na wzrost temperatury powyżej 42 °C.

Wynalazek ujawnia konstrukcję DNA zawierającą sekwencję promotora htrA związaną operacyjnie z sekwencją DNA kodującą jedno lub większą ilość białek heterologicznych.

W jednym z rozwiązań, przedmiotem ujawnienia jest wyżej zdefiniowana konstrukcja DNA, w której sekwencja promotora htrA jest związana operacyjnie z sekwenccąDNA kodującą białko fuzyjne złożone z dwu lub z większej ilości białek heterologicznych.

Białka tworzące taką fuzję mogąbyć połączone za pomocą giętkiego regionu „zawiasowego”.

W następnym aspekcie, przedmiotem ujawnienia jest konstrukcja DNA zawierająca sekwencję promotora htrA związaną operacyjnie z sekwenecąDNA kodującą pierwsze i drugie heterologiczne białka, przy czym takim pierwszym heterologicznym białkiem jest sekwencja antygenowa zawierająca fragment C toksyny tężca albo jeden lub większąilość jego epitopów.

W następnym aspekcie, wynalazek ujawnia podlegający replikacji czynnik ekspresyjny, nadający się do użycia w bakteriach, zawierający konstrukcję DNA zdefiniowaną powyżej.

W innym aspekcie, wynalazek ujawnia białko fuzyjne, korzystnie w formie zasadniczo oczyszczonej, które to białko fuzyjne jest produktem ekspresji wyżej zdefiniowanej konstrukcji.

180 091

Wynalazek ujawnia także sposób wytwarzania atenuowanej bakterii polegający na transformowaniu atenuowanej bakterii wyżej zdefiniowaną konstrukcją DNA.

Wynalazek ujawnia także komórkę gospodarza, takąjak komórka bakteryjna, zawierająca wyżej zdefiniowaną konstrukcję DNA. Ta konstrukcja DNA może występować w formie poza-chromosomalnej, np. w formie plazmidu, albo może być zintegrowana z chromosomem gospodarza (np. bakteryjnego) sposobami znanymi w stanie techniki.

Wynalazek ujawnia również kompozycję szczepionki zawierającą zdefiniowaną powyżej atenuowaną bakterię albo wytwarzane przez tę bakterię białko fuzyjne oraz nośnik dopuszczalny farmaceutycznie.

Te pierwsze i drugie białka są korzystnie białkami heterologicznymi, a zwłaszcza mogą być polipeptydowymi immunogenami. Przykładowo, mogą to być sekwencje antygenowe pochodzące z wirusów, bakterii, grzybów, drożdży lub pasożytów. Szczególnie korzystne jest ,j eśli to pierwsze białko jest sekwencją antygenową zawierającą fragment C toksyny tężca albo jego epitopy.

Drugim białkiem jest korzystnie determinanta antygenowa organizmu chorobotwórczego. Taką determinantę antygenową może przykładowo stanowić sekwencja antygenowa pochodząca z wirusa, bakterii, grzyba, drożdży lub pasożyta.

Przykładami wirusowych sekwencji antygenowych dla tych pierwszych i/lub drugich białek heterologicznych są sekwencje pochodzące z wirusa nabytego braku odporności immunologicznej (HIV), takiego jak HIV-1 albo HIV-2, miejsca wiązania receptora CD4 z HIV, np. z HIV-1 lub HIV-2, wirusa zapalenia wątroby typu A, B lub C, ludzkiego rynowirusa, takiego jak typ 2 albo typ 14, w.rusa Herpes simplex, poliowirusa typu 2 albo typu 3, wirusa pryszczycy (FMDV), wirusa wścieklizny, rotawirusa, wirusa grypy, wirusa Coxsackie, wirusa brodawek ludzkich (Papillomawirus; HPV), np. wirusa brodawek typu 16, jego białka E7 i fragmentów zawierających białko E7 lub jego epitopów oraz wirusa braku odporności simiana (SIV).

Przykładami antygenów pochodzących z bakterii są antygeny pochodzące z Bordetella pertussis (np. białko P69 i antygeny nitkowatej hemaglutyniny (Fha)), Vibrio cholerae. Bacillus anthracis i E. coli, takie jak podjednostka B toksyny ciepłochwiejnej z E. coli (LTB), antygeny K88 z E. coli i antygeny enterotoksygeniczne z E. coli. Inne przykłady antygenów obejmują komórkowy powierzchniowy antygen CD4, antygeny transferazy glutationu S P28 ze Schistosoma mansoni (antygeny P28) i antygeny przywr, antygeny mikoplasm, obleńców, tasiemców, Chlamydia trachomatis i pasożytów malarii, np. pasożytów z rodzaju plasmodium lub babesia, np. Plasmodium falciparum oraz peptydy kodujące epitopy immunogenne z powyższych antygenów;

Przykłady konkretnych antygenów obejmują antygen P28 o pełnej długości ze Schistosoma mansoni i oligomery (np. 2-, 4- i 8-mery) peptydu aal 15-131 z immunogennego antygenu P28 (który to peptyd zawiera epitop komórek B i komórek T) i białko E7 z wirusa brodawek ludzkich, antygeny wirus i Herpes simplex, antygeny wirusa pryszczycy, antygeny wirusa braku odporności simiana i antygeny toksyny błonicy, np. region wiążący gangliozydy toksyny błonicy.

W niniejszym opisie, termin „promotor htrA” odnosi się do samego promotora, jego części lub pochodnej, zdolnej do zapoczątkowania ekspresji sekwencji kodującej. Korzystną sekwencją, która zawiera promotor htrA jest sekwencja:

AATTCTA^^^t^i^GGAACTTCG^C^TTATAAAATGAATCTGACGTACACAGG^CAAI^TTA (sekwencja SEQ. ID. Nr. 1).

W konstrukcjach ujawnionych w wynalazku, sekwencja DNA może kodować białko fuzyjne złożone z dwu lub większej ilości białek, w którym to białku fuzyjnym sąsiadujące ze sobą białka są rozdzielone regionem zawiasowym. Ten region zawiasowy jest regionem zaprojektowanym w celu umożliwienia niezależnego sfałdowania białek, zarówno pierwszego jak i drugiego poprzez wprowadzenie rozdziału przestrzennego i czasowego pomiędzy domenami.

Tym regionem zawiasowym jest w zasadzie sekwencja kodująca wysoką zawartość aminokwasów proliny i/lub glicyny. Taki region zawiasowy może być całkowicie złożony z proliny

180 091 i/lub glicyny. Region ten może zawierać jedną lub większąilość dwupeptydowych jednostek glicyna-prolina.

Region zawiasowy może przykładowo zawierać do około piętnastu aminokwasów, np. co najmniej 4 a korzystnie 6 do 14 aminokwasów. Ilość aminokwasów powinna być taka, aby zapewnić elastyczność między pierwszym a drugim białkiem.

W jednym rozwiązaniu, region zawiasu może zasadniczo odpowiadać domenie zawiasu przeciwciała immunoglobuliny. Regiony zawiasowe przeciwciał IgG są szczególnie bogate w prolinę [T.E. Michaelsoni wsp., J. Biol. Chem. 252,883-9,1977], która, jak się sądzi, daje giętkie połączenia między wiązaniem antygenowym a domenami ogona.

Bez zagłębiania się w zagadnienia teoretyczne, uważa się że prolina tworzy sztywną część zawiasu, ponieważ struktura pierścieniowa charakterystyczna dla tego aminokwasu przeszkadza w rotacji wokół wiązania peptydowego, które łączy resztę proliny z sąsiadującym aminokwasem. Przyjmuje się, że ta właściwość zapobiega przed przyjęciem przez prolinę i sąsiadujące aminokwasy uporządkowanej struktury heliksu a albo struktury β. Giętkość jest nadawana, jak się sądzi, przez glicynę, najprostszy aminokwas o bardzo ograniczonych wymaganiach sterycznych. Glicyna prawdopodobnie pełni funkcję giętkiego kolanka w tym zawiasie. Glicyna może być zastąpiona innymi aminokwasami, zwłaszcza takimi, które nie mająmasywnych łańcuchów bocznych, takimi jak alanina, seryna, asparagina i treonina.

W korzystnym wykonaniu wynalazku takim regionem zawiasu jest łańcuch złożony z czterech albo większej ilości aminokwasów tworzących sekwencję:

-[X] ;-Pro [Y]q-Pro-[Z]rw której Pro oznacza prolinę, X i Y oznaczają glicynę albo aminokwas posiadający nieobjętościowy łańcuch boczny, Z oznacza dowolny aminokwas, p oznacza dodatnią liczbę całkowitą, q oznacza dodatnią liczbę całkowitą od 1 do 10 a r oznacza zero albo dodatnią liczbę całkowitą większą od zera.

Ten region zawiasowy może być regionem dyskretnym, heterologicznym w stosunku do białka pierwszego i białka drugiego albo może być określony przez część końca karboksylowego białka pierwszego bądź część końca aminowego białka drugiego.

W korzystnym wykonaniu wynalazku cząsteczka DNA zawiera promotor htrA związany operacyjnie z sekwencjąDNA kodującą pierwszy i drugi immunogen polipeptydowy, połączone poprzez region zawiasowy, przy czym ten pierwszy immunogen polipeptydowy zawiera fragment C toksyny tężca albo jego epitopy.

W innym aspekcie, ujawniono podlegający replikacji wektor ekspresyjny, nadający się do użycia w bakteriach, zawierający sekwencję promotora htrA operacyjnie związaną z sekwencją DNA kodującą immunogeny polipeptydowe; pierwszy i drugi, połączone regionem zawiasu, przy czym ten pierwszy immunogen polipeptydowy zawiera fragment C toksyny tężca albo jego epitopy.

W dalszym aspekcie, ujawniona jest konstrukcja DNA zawierająca promotor htrA operacyjnie związany z DNA kodującym pierwsze białko, biegnącym od końca 3 ' tej konstrukcji, sekwencję DNA kodującą region zawiasowy oraz w dół od tego regionu, jedno lub większą ilość miejsc dla endonukleazy restrykcyjnej.

Korzystnie, wspomnianym białkiem jest zdefiniowane powyżej białko antygenowe, a zwłaszcza jest to fragment toksyny tężca, TetC albo jego epitopy.

Trwałą ekspresję tych pierwszego i drugiego heterologicznych białek związanych poprzez region zawiasowy można uzyskać in vivo. Ekspresję tych heterologicznych białek można prowadzić w atenuowanych bakteriach, które można użyć jako szczepionkę.

Taką atenuowaną bakterię można wyselekcjonować z rodzajów Salmonella, Bordetella, Vibrio, Haemophilus, Neisseria i Yersinia. Alternatywnie, taką atenuowaną bakterię może stanowić atenuowany szczep enterotoksygenicznej Escherichia coli. Należy tu wymienić zwłaszcza następujące gatunki: S. typhi - wywokującidur brzuszny u ludzi, S. typhimurium - wywołującą salmonellozę u niektórych gatunków zwierząt, S. enteritidis - przyczynę zatruć pokarmowych u ludzi, S. choleraesuis - wywołującą salmonellozę u świń, Bordetella pertussis - powodującą

180 091 krztusiec, Haemophilus influenzae - przyczynę zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych, Neisseria gonorrhoeae - przyczynę rzeżączki i Yersinia - powodującą zatrucia pokarmowe.

Atenuowanie bakterii może być związane z nieodwracalną mutacją w genie, w szlaku biosyntezy aminokwasu aromatycznego w tej bakterii. Istnieje co najmniej 10 genów zaangażowanych w syntezę chorysmanianu, związku w punkcie rozgałęzienia, w szlaku biosyntezy aminokwasu aromatycznego. Niektóre z nich lokująsię w bardzo różnych miejscach genomu bakteryjnego, np. gen AroA (syntazy 5-enolopirogronianoszikiniano-3-fosforanu), aroC (syntazy chorysmanianu), aroD (dehydratazy 3-dihydrochinianu) i aroE (dehydrogenazy szikimianianu). Mutacja może się zatem pojawić w genie aroA, aroC, aroD albo aroE.

Korzystnie jednak, atenuowana bakteria zawiera nieodwracalną mutację w każdym z dwu dyskretnych genów w szlaku biosyntezy aromatycznych aminokwasów albo zawiera nieodwracalną mutację w szlaku biosyntezy aminokwasów aromatycznych i nieodwracalną mutację w genie regulatorowym, takim jak htrA, OmpR. albo OsmC. Przykłady odpowiednich atenuowanych bakterii sąujawnione np. w opisach patentowych europejskich EP-A-0322237 i EP-A-0400958.

Atenuowaną bakterię zawierającą konstrukcję DNA według wynalazku można użyć jako szczepionkę. Do przygotowania szczepionek można również użyć białka fuzyjne (korzystnie w postaci zasadniczo czystej) wytwarzane przez te bakterie. Przykładowo, okazało się, że samo oczyszczone białko fuzyjne TetC-P28 może jako takie być immunogenne. Tak więc, w dalszym aspekcie, ujawniona jest kompozycja szczepionki zawierająca nośnik albo rozcieńczalnik dopuszczalny farmaceutycznie i atenuowaną bakterię albo białko fuzyjne opisane powyżej jako składnik aktywny.

Taka szczepionka może zawierać jeden lub większą ilość odpowiednich substancji pomocniczych. Korzystną formą użytkową szczepionki jest forma liofilizowana, np. w kapsułce do podawania pacjentowi drogą doustną. Takie kapsułki można powlekać powłoczką dojelitową, zawierającą przykładowo Eudragit „S”, Eudragit ”L”, octan celulozy, octano-ftalan celulozy albo hydroksypropylometylocelulozę. Takie kapsułki można zażywać w tak przygotowanej postaci albo przed użyciem można roztwarzać (rekonstytuować) liofilizowany produkt, uzyskując np. zawiesinę. Rekonstytuowanie przebiega korzystnie w buforze, w odpowiednim pH, dla zapewnienia żywotności mikroorganizmów. W celu ochrony atenuowanych bakterii i szczepionki przed kwasem żołądkowym, wskazane jest przed każdym podaniem szczepionki zażycie preparatu dwuwęglanu sodu. Alternatywnie, szczepionkę można przygotować w postaci dostosowanej do podania parenteralnego, donosowego albo do gruczołu sutkowego.

Korzystnie, kompozycję szczepionki przystosowuje się do dostarczania przez błony śluzowe, np. drogą podania doustnego, donosowego albo dooskrzelowego.

Atenuowane bakterie zawierające konstrukcję DNA według wynalazku można stosować do profilaktyki lub do leczenia organizmu gospodarza, zwłaszcza człowieka, lecz również ewentualnie organizmu zwierzęcego. Tak więc, można zapobiec infekcji wywoływanej przez mikroorganizm, zwłaszcza mikroorganizm patogenny, przez podanie skutecznej dawki atenuowanych bakterii według wynalazku. Takie bakterie wytwarzają następnie heterologiczne białko albo białka zdolne do wywoływania wzrostu ilości przeciwciał przeciw temu mikroorganizmowi. Stosowana dawka będzie zależna od wielu czynników·', włącznie z wielkością i wagą gospodarza, z rodzajem formy dawkowania szczepionki i z rodzajem heterologicznego białka.

Atenuowaną bakterię można przygotować przez transformowanie atenuowanej bakterii zdefmiowanąpowyżej konstrukcją DNA. Do tego celu można użyć dowolną, odpowiednią technikę transformowania, taką jak elektroporacja. W ten sposób można otrzymać atenuowana bakterię zdolną do ekspresji białka lub białek heterologicznych w stosunku do tej bakterii. Hodowlę takich atenuowanych bakterii można prowadzić w warunkach aerobowych. Następnie przygotowuje się ilość tych bakterii wystarczającą do sporządzenia formy szczepionki, z minimalną ekspresją tego białka heterologicznego.

Przygotowuje się również wektor ekspresyjny z odpowiednimi elementami kontroli transkrypcji i translacji, obejmującymi oprócz promotora htrA, miejsce zakańczania transkrypcji i kodony początku i końca translacji oraz odpowiednie miejsce wiązania rybosomu. Ten wektor na

180 091 ogół zawiera źródło replikacji i, o ile to potrzebne, gen będący markerem selekcyjnym, taki jak gen oporności na antybiotyk. Wektorem może być np. plazmid.

Wynalazek jest zilustrowany podanymi poniżej przykładami nie ograniczającymi zakresu tego wynalazku oraz załączonymi rysunkami, na których:

Figura 1 przedstawia schematyczną ilustrację konstrukcji plazmidu pHTRA1 zawierającego promotor htrA. zgodnie z pierwszym aspektem wynalazku.

Figura 2 przedstawia schematyczną ilustrację konstrukcji plazmidu pHTRA2 zawierającego promotor htrA i DNA kodujący fragment C toksyny tężca, połączony z regionem zawiasowym.

Figura 3 przedstawia strukturę plazmidu pTECH2.

Figura 4 przedstawia strukturę pośredniego plazmidu pBD907.

Figura 5 przedstawia strukturę plazmidu pHTRA1 wytworzonego według schematu przedstawionego na fig. 1.

Figura 6 przedstawia strukturę ostatecznego plazmidu pHTRA2 wytworzonego według schematu przedstawionego na fig. 2.

Figura 7A i 7B przedstawiają wpływ przesunięć temperatury na promotory nirB. groE. i htrA.

Figura 8 przedstawia ekspresję genu lacZ z promotorów htrA. nirB i groE w makrofagach.

Przykład I

Przygotowanie konstrukcji htrA - TetC - zawias.

Jak to jest przedstawione na fig. 1, materiałem wyjściowym do wytworzenia wektora posiadającego promotor htrA i geny kodujące fragment C toksyny tężca był plazmid pTETnir 15, którego struktura i sposób wytwarzania zostały ujawnione w naszym wcześniejszym zgłoszeniu patentowym PCT/GB93/01617 (publikacja WO 94/03615) i w cytowanych w nim odnośnikach literaturowych, np. w publikacji zgłoszenia patentowego PCT, WO-A-92159689.

Plazmid pTETnirl 5 zawiera promotor nirB połączony z genem kodującym fragment C toksyny tężca (TetC). Jak to jest przedstawione na fig. 1, plazmid pTETnir 15 trawiono enzymami SacII i BamHI, po czym otrzymane fragmenty o wielkości 2.9 kb i 813 bp oczyszczano w żelu. Fragment o wielkości 2.9 kb poddano ligacji z fragmentem o wielkości 1.74 kb pochodzącym z genu hemaglutyniny nitkowatej (FHA) B. partussis, który to fragment posiada sekwencję przedstawioną na SEQ. ID Nr. 7. Otrzymany plazmid oznaczono symbolem pBD907. Mapa restrykcyjna tego plazmidu jest podana na fig. 5. Celem przygotowania tego pośredniego plazmidu pBD907 było usunięcie miejsca dla EcoRI obecnego we fragmencie TetC, co umożliwiło zamianę sekwencji promotora nirB na sekwencję promotora htrA. Dokonano tego przez trawienie plazmidu pBD907 restryktazami EcoRI i Bg1II. Otrzymany fragment o długości 4535 bp oczyszczono w żelu i poddano ligacji z następującymi oligonukleotydami o długości 55 bp zawierającymi promotor htrA:

Oligo-1 5’ AATTCTATTCCGGAACTTCG^CCiTTATAAAATGAATGTGACGTACACAGCAATTTA (SEQ. ID Nr-. 2)

Oligo-2 3’ GAT.^.^GGCCTTGAAGCCiCAATATTTTACTTACACTGCATGTGTCGTfAAATC-TAG (SEQ . ID. Nr. 3))

Obecność promotora w otrzymanym przejściowym plazmidzie plNT potwierdzono przez sekwencjonowanie DNA. Następnie plazmid pINT trawiono restryktazami SacII i BamHII i poddano ligacji z fragmentem o wielkości 813 bp z plazmidu pTETnirl 5. Otrzymano plazmid pHTRA1. Sekwencja DNA tego plazmidu pHTRA1 jest przedstawiona na SeQ. ID. Nr. 4. Region htrA, zdefiniowany pierwszymi 55 parami zasad posiada sekwencję:

AATTCTATTCCCGAACTTCGCGTTATAAAATCAATCTCACCTACACACCAATTTA (SEQ. ID. Nr. 1)

W odniesieniu do sekwencji SEQ. ID. Nr. 4, GAACTT jest skrzynką -35 a TCTGA jest skrzynką-10. Przy 513 i 2235 parze zasad znajdująsię miejsca restrykcyjne odpowiednio dla SacIi i A1wN 1.

180 091

Plazmid pHTRA 1 użyto do transformowania Salmonella typhimurium, szczepu BRD509 (zdeponowanego pod numerem akcesyjnym NCTC 12716) i uzyskany szczep, oznaczony symbolem BRD935 badano stosując znane techniki, na ekspresję fragmentu TetC. Szczep BRD935 zdeponowano w muzeum National Collection of Type Cultures, Colindale, Wielka Brytania.

Jak podano na fig. 2, plazmid pHTRAl użyto do wytworzenia konstrukcji modyfikowanej t kodującej białko, w którym region zawiasu występuje na C-końcu fragmentu TetC. Sekwencję nukleotydową reprezentującą region zawiasu otrzymano z plazmidu pTECH2, który posiada sekwencję DNA przedstawioną na sekwencji SEQ. ID Nr. 5, a także posiada miejsca restrykcyjne SacII i AlwNI w pozycjach odpowiednio 533 i 2304. Wytwarzanie tego plazmidu jest ujawnione w naszym wcześniejszym zgłoszeniu patentowym PCT/GB93/01617.

Plazmid pTECH2 zawiera region promotora nirB związany z genem dla fragmentu C toksyny tężca, który m swym końcu 3' jest poprzez miejsce restrykcyjne BamHI połączony z regionem zawiasowym, kodującym powtarzalny motyw Gly-Pro-Gly-Pro oraz kilka miejsc restrykcyjnych pozwalających na insercję genów kodujących dalsze polipeptydy. Z plazmidu pTECH2 usunięto fragment o długości 1,7 kb kodujący region zawiasowy i część regionu fragmentu toksyny C tężca na drodze trawienia enzymami SacII i A1wNI i oczyszczono ten fragment. Sekwencja DNA tego fragmentu jest przedstawiona na SEQ. ID. Nr. 6. Plazmid pHTRA1, kodujący promotor htrA i fragment toksyny C tężca ale nie zawierający genu zawiasu, trawiono za pomocą SacII i A1wNI, po czym otrzymany fragment o długości 2 kb oczyszczano w żelu.

Następnie poddano ligacji fragment o długości 1,7 kb (SEQ. ID. Nr. 6) z plazmidu pTECH2 i fragment o długości 2 kb z pHTRA 1, uzyskując plazmid pHTRA2, który zawiera w sobie promotor htrA związany operacyjnie z genem fragmentu toksyny C tężca a na końcu 3' - region zawiasowy.

Atenuowany szczep Salmonella typhimurium transformowano wektorem pHTRA2 i po selekcjonowaniu z użyciem technik standardowych wyizolowano szczep salmonella BRD 1062, zawierający w sobie plazmid pHTRA2.

Plazmid pHTRA2 służy jako produkt pośredni, do wytwarzania konstrukcji kodujących białko fuzyjne związane poprzez region zawiasowy. Tak więc, wykorzystując techniki opisane w naszym wcześniejszym zgłoszeniu patentowym PCT/GB93/01617, na tym regionie zawiasowym można klonować dalsze proteiny do miejsc dla endonukleaz restrykcyjnych.

Szczepy bakteryjne

We wszystkich doświadczeniach stosowano E. Coli HB 101 i BRD509 (atenuowany szczep S. typhimurium aroA aroD, zdeponowany pod numerem akcesyjnym NCTC 12716). Bakterie hodowano na pożywce Luria (LB) albo na pożywce LB zestalanej za pomocą 1,6% agaru (wagowo-objętościowo) z dodatkiem odpowiednich antybiotyków.

Manipulacje na materiale DNA

Plazmidowy DNA oczyszczano metodąlizy alkalicznej (R. Maniatis i wsp., 1982, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nowy Jork). Trawione restryktazami fragmenty DNA oczyszczano z żeli agarowych w sposób opisany przez Tautz’a i Rentz’a (1983, „An optimised freeze-squeeze method for the recovery of DNA fragments from agarose gels”. Analytical Biochem., 132, 14-19). Enzymy restrykcyjne dostarczyły firmy Boehringer Mannheim, Niemcy i New England Biolabs, Stany Zjednoczone. Enzymy te stosowano według instrukcji producentów.

Sekwencjonowanie DNA

DNA do sekwencjonowania podwójnej nici izolowano metodą Stephen’a i wsp. (A Rapid Method for Isolating High Quality Plasmid DNA Suitable for DNA Serquencing, Nucleic Acid Research, 1990, 18, nr. 24, str. 7463). Sekwencjonowanie prowadzono w aparaturze Sequenase Version 2 kit (USB), postępując zgodnie z instrukcją wytwórcy.

Oligonukleotydy

Oligonukleotydy syntetyzowano w syntetyzerze oligonukleotydów SAM 1 (Biolabs, Wielka Brytania).

180 091

Przykład II

Przygotowanie konstrukcji htrA-lacZ

Do właściwości promotora htrA dokomponowano właściwości dwu innych indukowalnych promotorów, a mianowicie promotorów nirB i groE.

Subklonowanie genu lacZ w dół od promotorów nirB. htrA i groE.

Fragment DNA kodujący gen lacZ bez promotora oczyszczono z plazmidu pMAC 1871 (Pharmacia) techniką z użyciem agarozy o niskiej temperaturze topnienia, po czym rozszczepiano plazmid enzymami restrykcyjnymi Sali iBamHI [14]. Plazmidy pTETnir-15 (S.N. Chatfield i wsp., Bio/Technology, 10, 888-892) i pTEThtrA-1 zawierające odpowiednio promotory nirB i htrA trawiono endonukleazami SaII i BamHI i klonowano oczyszczony fragment koduj ący lacZ. w zgodnej ramce odczytu, w dół od promotorów. Plazmid pRZ-PES zastosowano do pomiaru ekspresji β-galaktozydazy (β-gal) z promotora groE. Plazmid pRZ-PES posiada groE-operonpromotor z E.coli w górę od genów groES i lacZ. Skonstruowano go przez subklonowanie fragmentu EcoRI-HindIII o wielkości 2.1 kb zawierającego operon z plazmidu pOF39 (O. Fayet i wsp., J.Bacteriol. 171 1379-1385, 1989) do pUC 19. W ten sposób wprowadzono nowe miejsce Bg1II między genami groES i groEL stosując mutagenezę sterowaną miejscem. Fragment EcoRIBg1II zawierający promotor groE i gen groES klonowano do uprzednio ciętego enzymami EcoRI-BamHI promotora-sondy, plazmidu pRF5255 (P.F.Lambert i wsp., J. Bacteriol, 162, 441-444, 1985), otrzymując plazmid pRZ-PES. Plazmidy przygotowane w S. Typhimurium LB5010 (rm) (L.R. Bullas i wsp., J. Bacteriol. 256, 471-474, 1983) wprowadzono do S. Typhimurium, szczepu BRD915 (S. Typhimurium SL1344 htrA) (S.N. Chatfield i wsp., Microbial Pathog. 12, 145-151, 1992) techniką elektroporacji. Materiał przesiewano na rekombinanty Lac-dodatnie na płytkach z żelem L, z dodatkiem ampicyliny i X-gal.

Wpływ zmian warunków otoczenia na ekspresję genu lacZ.

Szczepy bakteryjne zawierające rekombinantowe plazmidy hodowano przez dobę w pożywce L, wstrząsając w temperaturze 30°C. Hodowle rozcieńczano w stosunku 1:50 i kontynuowano hodowlę przez dodatkowe 3 godziny w temperaturze 30°C, do osiągnięcia gęstości optycznej OD₆qq w zakresie 2,8 - 3,4. Próbki po 0,2 ml każdej hodowli przechowywano w temperaturze 4°C i stosowano do oznaczania podstawowego poziomu aktywności β-galaktozydazy. Pozostałe porcje hodowli poddano innym warunkom wzrostu, opisanym poniżej i o ile nie podano inaczej, pobierano próbki w godzinach 0, 2, 4, 6 i 24. W każdym punkcie czasowym oznaczano wartość OD600 i przed przeprowadzeniem oznaczenia na aktywność β-galaktozydazy bakterie przechowywano w temperaturze 4°C.

Pomiar ekspresji w zakażonych liniach komórkowych mikro fagów HEp-2, Caco-2 i THP 1.

Do 24-dołkowych płytek posiewano komórki w ilości 106 komórek/dołek i hodowano je przez dobę w pożywce Eagles modyfikowanej przez Dolbecco, bez czerwieni fenolowej (ICN Flow), z dodatkiem 10% (objętościowo) płodowej surowicy bydlęcej i 2 mM glutaminy, w temperaturze 37°C, w atmosferze zawierającej 5% CO₂. Do komórek z hodowli tkankowych dodano 10⁸jednostek CFU bakterii z tej rozcieńczonej dobowej hodowli i prowadzono inkubację w temperaturze 30°C. W różnych punktach czasowych pobierano próbki pożywki z tej hodowli tkankowej do pomiaru aktywności β-galaktozydazy w bakteriach pozakomórkowych. Ilość bakterii w każdej próbce oznaczano przez pomiar bakterii żywotnych i oznaczano wartość OD600 stosując krzywą standardową. Zakażone komórki przemyto roztworem soli bufarowanym fosforanem (PBS) i inkubowano przez dodatkowągodzinę wobec gentamycyny w stężeniu 200 mg/ml dodanej w celu zabicia bakterii pozakomórkowych. Następnie dokonywano lizy komórek stosując sterylną wodę destylowaną i energiczne pipetowanie. W każdym lizacie komórkowym oznaczano aktywność β-galaktozydazy. Ilość bakterii w każdym lizacie oznaczano przez pomiar bakterii żywotnych i oznaczano odpowiednie wartości OD600 stosując krzywą standardową.

Ekspresja zachodząca z każdego z wybranych do tego badania promotorów jest wrażliwa na zmiany warunków otoczenia. Poprzednio wykazano, żc nirB reaguje na zmiany w anaerobowości. Początkowe diświadczenia przeprowadzono w celu oznaczenia poziomów ekspresji lacZ z każdego z promotorów zawartych w podobnych plazmidach występujących w wielu kopiach,

180 091 zawartych w szczepionce Salmonella, szczep BRD915. Wpływ zmian temperatury na różne promotoryjest przedstawiony na fig. 7. Przesunięcie temperatury z 30°C na 37°C (fig. 7A) powodowało wzrost ilości jednostek enzymu β-galaktozydazy wówczas, jeśli ekspresja genu lacZ zachodziła spod promotorów nirB i htrA. Nie wykryto znaczącego wzrostu ilości jednostek β-galaktozydazy jeśli ekspresja genu lacZ zachodziła spod promotora groE. Przesunięcie temperatury z 30°C na 42°C powodowało wzrost ilości jednostek enzymu β-galaktozydazy dla wszystkich trzech promotorów. Stopień wzrostu poziomu β-galaktozydazy był szybszy w próbach z promotorami htrA i nirB w porównaniu z promotorem groE (fig. 7B). Przesunięcie temperatury z 37°C na 42°C indukowało obydwa promotory nirB i htrA. przy bardziej wyraźnym wzroście w ilości jednostek β-galaktozydazy w przypadku promotora groE (fig. 7C).

Ekspresję β-galaktozydazy z udziałem różnych promotorów badano również metodą selekcji bakterii wchodzących do komórek eukariotycznych. Linie komórkowe makrofagów, HEp-2, Caco-2 i THP-1 zakażano ilością 10⁸ bakterii i inkubowano w temperaturze 30°C. Ilość jednostek β-galaktozydazy oznaczana po trzech godzinach od infekcji linii HEp-2 wykazała, że ekspresja genu lacZ spod promotorów htrA i nirB znacznie wzrosła (fig. 2). Jednakże nie było wykrywalnego wzrostu ekspresji genu lacZ spod promotora groE. Podobne wyniki uzyskano w doświadczeniach z zakażoną linią komórkową Caco-2 (nie podane). W odróżnieniu od tego, w środowisku wewnątrzkomórkowym makrofagów były indukowane wszystkie trzy promotory (fig. 8). Największemu wpływowi ulegał promotor nirB a najmniejszemu wpływowi ulegał promotor groE (fig. 8). Kiedy oznaczono ilość jednostek β-galaktozydazy w płynie pozakomórkowym w każdej linii komórkowej, nie stwierdzono wzrostu aktywności tego enzymu (nie przedstawiono).

Ponieważ zaobserwowano, że wzrost w makrofagach wpływa na ekspresję ze wszystkich trzech promotorów, monitorowano ich wrażliwość na nadtlenek wodoru, powszechnie stwierdzany w fagosomach makrofagów. Inkubowanie bakterii w temperaturze 30°C wobec 100 μΜ nadtlenku wodoru nie powodowało znaczącego wpływu na promotory groE i nirB. W odróżnieniu od tego, poziom β-galaktozydazy wzrastał przy ekspresji z promotora htrA. osiągając po 4 godzinach 10 jednostek powyżej poziomu podstawowego. Następnie, po 6 godzinach następował szybki spadek do poziomów podstawowych (nie przedstawiony). Konstytucyjna ekspresja genu lacZ z plazmidu pLK (M. Szabo i wsp., J. Bacteriol. 174, 7245-7252) nie podlegała znacząco żadnym wpływom środowiska (nie przestawiono).

W niniejszej pracy użyto trzy promotory regulowane przez środowisko do ekspresji genu lacZ w różnych warunkach wzrostu. Promotory te reprezentują trzy klasy indukowanych promotorów bakteryjnych: anaerobowo indukowany nirB z E.coli, a⁷-zależny htrA i a³²-zależny groE. Ekspresja z udziałem promotora nirB zależy od czynnika transkrypcji FNR, który wiąże się między pozycjami -52 a -30, w górę od startu transkrypcji. W niektórych przypadkach transkrypcja zależna od FNR jest modulowana łącznie drugim czynnikiem transkrypcji, NarL. Jednak użyty tu plazmid pTETnir-15 zawiera tylko miejsce wiązania zależne od FNR.

Bakterie odpowiadają na wstrząsowe warunki środowiska szybką zmianą w szybkości syntezy wielu białek. W wielu przypadkach przejściowa indukcja szybko doprowadza poziom białka do nowego stanu ustalonego. W niniejszym badaniu badaliśmy wpływ warunków środowiska na poziom β-galaktozydazy. Stwierdziliśmy, że przesunięcie temperatury ma większy wpływ na promotory htrA niż na groE. Ten wynikjest zgodny z faktem, że in vivo promotor htrA jest indukowany przed promotorem groE (który jest σ³² - zależny) i razem z σ³², przez polimerazę RNA zawierającą σ7(11, 12). Nieoczekiwanie, promotor nirB był również wzmacniany przez podwyższoną temperaturę. Jakkolwiek jest możliwe, że w wysokiej temperaturze stężenie tlenu w pożywkach rosnących jest zmniejszone, fakt, że przesunięcie temperatury z 30°C do 37°C wywołuje szybki wzrost ilości jednostek β-galaktozydazy wytwarzanych spod promotora nirB może sugerować, iż FNR, podobnie jak inne modulatory białka wstrząsowego, reaguje na wiele bodźców środowiska. Podobnie, był również indukowany htrA w warunkach wzrostu anaerobowego, a zatem, wydaje się, że ten promotor jest albo regulowany przez czynniki inne niż σ⁷ albo, że σ7 jest aktywowany również przy niskim ciśnieniu tlenu.

180 091

Dla zachowania zjadliwości, bakteria S. typhimurium musi mieć zdolność przeżycia w makrofagach. Przeżycie to jest zależne od zdolności tej bakterii do tolerowania szeregu toksycznych mechanizmów zabijania, z produkcją nadtlenku wodoru włącznie. W poprzedniej pracy wykazano, że w odróżnieniu od mutantów htrA E.coli, mutanty htrA S. typhimurium nie są zabijane przez wysoką temperaturę lecz raczej nie mają pełnej zdolności przeżycia w środowisku znaczących poziomów nadtlenku wodoru. Jest interesujące, że promotor htrA był jedynym z badanych promotorów, który zwiększał ekspresję w obecności nadtlenku wodoru.

W celu zbadania wpływu środowiska wewnątrzkomórkowego, monitorowano poziom ekspresji z tych trzech różnych promotorów w warunkach, w których Salmonella zawierająca badane plazmidy docierała do wielu różnych hodowanych eukariotycznych linii komórkowych. Bakterie hodowano in vitro i stosowano je do zakażania komórek eukariotycznych w temperaturze 30°C, gdyż przesunięcie z temperatury 30°C do temperatury 37°C gwałtownie indukowało zarówno promotor htrA jak i promotor nirB. Wykryliśmy, że podczas gdy poziom ekspresji β-galaktozydazy z promotorów nirB i htrA zwiększał się we wszystkich testowanych liniach komórkowych to promotor groE był indukowany tylko w zakażonych makrofagach.

WYKAZ SEKWENCJI (i) INFORMACJA OGÓLNA (1) ZGŁASZAJĄCY:

(A) NAZWA: MEDEVA HOLDINGS BV (B) ULICA: CHURCHILL-LAAN 223 (C) MIASTO: AMSTERDAM (E) KRAJ: HOLANDIA (F) KOD POCZTOWY (ZIIP): 1078 ED (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: SZCZEPIONKI (iii) ILOŚĆ SEKWENCJI: 7 (iv) FORMA KOMPUTEROWA:

(A) TYP NOŚNIKA: dyskietka (B) KOMPUTER: kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (d) OPROGRAMOWANIE: PatentIn Release # 1.0, wersja # 1.25 (EPO) (vi) DANE O WCZEŚNIEJSZYM ZGŁOSZENIU:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: GB 9401795.1 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 31 styczeń 1994 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NR: 1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 55 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iii) ANTYSENSOWNA: nie (vi) ORYGINALNE ŹRÓDŁO:

(A) ORGANIZM: SaImonella lyphimuriutn (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: promotor (B) LOKALIZACJA: 1 . . 55

180 091 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR: 1:

AATTCTATTC CGGAACTTCG CGTTATAAAA TGAATCTGAC GTACACAGCA ATTTA 55 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NR: 2:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 55 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA; nie (iii) ANTYSENSOWNA: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR: 2:

AATrcTATrc CGGAACTTCG CGTEATAAAA TGAATCTGAC GTACACAGCA ATTTA 55 (2) INFOMACJA O SEKWENCJI ID NR: 3:

(1) CHARA KTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 55 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iii) ANTYSENSOWNA: TAK (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR: 3:

GATAAGGCCT TGAAGCGCAA TATTIIACTI ACACTGCATG TGTCGTTAAA TCTAG (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NR: 4:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 3712 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: kolista (u) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iii) ANTYSENSOWNA: nie (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: promotor htrA (B) LOKALIZACJA: 1 . . 55 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: miejsce restrykcyjne dla SaclI (B) LOKALIZACJA: 513 (ix) CECHA:

(A) \AZWA/KIU;CZ: miejsce restrykcyjne dla A1wN (b) LOKALIZACJA: 2235 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR: 4:

AATICTAITC CGGAACTTCG CGHATAAAA TGAATCTGAC TGACACAGCA ATTIAGAICT 60

180 091

TAATCATCCA CACGAGACTT tctgatgaaa aaccttgatt gttgggtcga caacgaagaa	120
GACaTCGATC TTATCCTGAA AAAGTC7A.CC ATCTGAAACT GGACATCAAa AAACGA7AT7	180
atctccgaca tctctggttt caactcctct gttatcacat atccagatgc tcaattggtg	240
ccgggcatca acggcaaagc tatccacctg gttaacaacg aatcttctga agttatcgtg	300
cacaaggcca tggacatcga atacaacgac atgttcaaca acttcaccgt tagcttctgg	360
ctgcgcgttc cgaaaagtttc tgcttcccac ctggaacagt acggcactaa cgagtactcc	420
atcatcagct ctatcaacaa acactccctg tccatcggct ctggttggtc tctttccctg	480
aaggctaaca acctgatctg gactctgaaa gactccgcgg gcgaagttcg tcagatcact	540
ttccgcgacc tgccggacaa gttcaacgcg tacctggcta acaaatgggt TTTcATCACT	600
atcactaacg atcctctctc ttctgctaac ctgtacatca acggcgttct gatgggctcc	660
gctgaaatca ctggtctggg cgctatccgt gaggacaaca acatcactct taagctcgac	720
cgttccaaca acaacaacca gtacgtatcc atcgacaagt tccgtatctt CTCCAAAGCA	730
ctgaacccga aagagatcga aaaaactgtat accagctacc tgtctatcac cttcctgcgt	840
gacttctggg gtaacccgct gcgttacgac accgaatatt acctgatccc ggtagcttct	900
agctctaaag acgttcagct gaaaaaacatc actgactaca tgtacctgac caacgcgccg	960
tcctacacta acggtaaact gaacatctac taccgacgtc tgtacaaccc cctgaaattc	1020
atcatcaaac gctacactcc gaacaacgaa atcgattctt tcgttaaatc tggtgacttc	1080
atcaaactgt acctttctta caacaacaac gaacacatcg ttggttaccc gaaagacggt	1140
aacgctttca acaacctgga cagaattctg cgtgttggtt acaacgctcc gggtatcccg	1200
ctgtacaaaa aaatggaagc tgttaaactg cgtgacctga aaacctactc tcttcagctg	1260
aaactgtacg acgacaaaaa cggttctctg ggtctggttg gtacccacaa cggtcagatc	1320
ggtaacgacc cgaaccctga catcctc-atc gcttctaact ggtacttcaa CCACCTGAAA	1380
ga.caaaa.tcc tgggttccca ctggtacttc cttcccaccg atgaaggttg ga.ccaacgac	1440
taa.ggatccc ctagcccgcc taatgagcgg cctttttttt ctcgggcagc c-ttgggtcct	1500
cgccacgggt gcgcatgatc gtgctcctgt ccttgaggac ccggctagcc tc-gcggggtt	1560
gccttactgg ttagcacaat gaaltcaccga tacgccaccc aacgtgaa.gc c-actcctgct	1620

180 091

CCAAAACCTC GCAŁC-AACAT CAATCGCCTT €£^0^	1630
C€CCAAGT€A GCTrCC-rCGC T€ACTCACT€ C€TCCCCT€C	1740
CTCCTTCCCC CCTATCAC€T CACTCAAACC CCCTAATACC GTTATCCACA	1800
CAATCACCCC ATAACCCACC AAAGAACATG TCAC€AAAAC CCCACCAAAA CC:CACCAA€	1860
€CTAAAAACC CCC€CTTCCT CATACC€TC€ C€CC€€€TCA CCACCAT€A€	1920
AAAAATCGAC C-CTCAACT€A CACGT<cC:CA AA-C€€CACAC CACTATAAAC ATACCACCCC	1980
TTTCCCCCTC GAAC^CZTCCCT CCTCCCCTCT €€TCTT€CCA €CCTC€CC€T TACCGGATAC	2040
€TCTCCCCCT TTCTCCCTTC CC0AAGCC?C CCcC7TTCT€ ŁAT^TC^ CTCTACCTAT	2100
€T€ACTTCCC TCTACCT€cT TCC€TCCAAC CTCCC€TCTC TCCACCAA€c CCCCGTTCAC	2160
CC€CAC€CCT GCGl^CTTATC €CCTAACTAT CCT€TTCACT CCAAC€€CCT AACACACCA€ '	2220
TTATCGCCAC TCC€AC€ACC CACTCCTAAC A^ATTA^ CACCCACCTA TCTACCCCCT	2280
C€TACACACT TCTTG-AATTG TACcC€TACA €TACAACCAC ACTATTTCCT	2340
TC€TCAACC€ AGTTACCTTC CCAAAAACAC TTCCTACCTC TTCAT€CCC€	2400
AAACAAACCA C€CCTCCTAC €CGτGGT7^,TT^, TTGe-TTGe-CA ACCACCACAT TA€C€CCACA	2460
AAAAAACCAT CTCAACAACA TC·€TTTCATC TT^TAC^ CCT€TCACCC T€ACTCCAAC	2520
GASAACTCAC CTTAACCCAT TTTCCTCATC AGATT-ATC-AA AAAGdTCTT CACCTAGATC	2580
CTTTTAAATT AAAAAT0AAC TTTTAAATCA ATCTAAAGTA TATATGACTA AAC·^^	2640
GACAGTTACC AATGCTTAAT CAGTCACC€A CCTATCTCAG CCATCTCTCT ATTTCGrTCA	2700
TCCATACTTC CCTCACTCCC CCTCCTcTAC ATAACTACGA TA€CCCACCC CTTACCATCT	2760
CCCCC€ACTC CTCCAATCAT ACCCCCACAC CCACC€TCA€ CCCCTC€ACA TTTATCAGCA	2820
ATAŁACCAGC CAC€CCCAAC CCCCCACCCC ACAACTCcTC €TCCAAC'TTT ATCCGCCTCC	2S80
ATCCAGTCTA TTA·^?^ €€CCCAACCT ACAcTAACTA CTTCCCCACT TASTAGITTG	2940
CCCAA€GTTC TTCCCATTCC TCCACCCATC CTCCTCTC:AC CCTCGTCCTT TCCTATCc€T	3000
TCATTCAGCT CCCCTTC€CA ACCATCA.ACC CCACTTACAT G-ATCCCCCAT C-TTCTCcAAA	3060
AAAC€CCTTA GCTCC·^^ TCCT€€CATC CTTGTCACAA CTAAGTTCCc CCCAGTCTTA	3120
TCA^Ci·^ TTATCCCAC€ A€TCCATAAT TCTCTTACTG -TCATGCCATC CC-TAACATCC	3180

180 091

TiTiCiGiGa	/** T/-p· m·/- » /»·»»* C i CC C GCG i C	CTCTACCAAG	ticttctgag		GOGGCGACCG	3240
ACCGCCCCCG	GCCCGGCGTC	AAAACGCGCA	AACTCCGCCC	CiGCATGGCAG	aacccgaaaa	3300
GCCCCCACCG	mm/· »· ’ w *»<·/“ T T CCAAGgC C	TTCTTCCGGG	CCCGAAAACT	CAAGGATCTT	CCCGCGGCGG	31360
GGACCCACCC	φγ·* Cgat g Taa.Cc	CACACGTGCA	CCCCACCTCCAC	CTTCAGCATC	gcccaccccc	3420
ACCACCGCTC	CGCCcTCGCc	AAAAACAGGA	AGCCAAACCG	CCCCCCAAAA	GCG-GAAAAAC	3440
CCCGCACCCG	« * mrmmrη * m AC tctt gCA t	ACCCACACCC	CCCCTCCTTC	AAAGACGACG	AAACCACGGC	3540
CAGCGTCACG	CTCTCAGCGC	CggaTaCata	CCCCGAGCTA	TTTAGAAAA TTAAGCAATA	3300
/**<· z»r»fłł z r· <· Ccccc TCCgc	GCACGTGGCC	CCGAAAAGCG	CCACCTCGCC	TCCGAACAAA CCCGGCGGAC	3360
CTGCCCTTCC	CCGGGAAGAG	CAGGCGCACC	ACGAGCCCCT	TTCGTCTTCA	AG	3712

(2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NR: 5:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 3769 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NCII: dwie (D) TOPOLOGIA: koiisaa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iii) ANTYSENSOWNA: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR: 5:

CCCAGCCAGG	cggccgcgic	AGCAAACCCT	ACCCCTTCCT	GACGACCCCG. GGGCCGCGGG	66
ACCCCCCGGG	TCGGAAGCAG	CCGCAcggCg	CTCCCGGACC	AJAAAAACCG GTGCCCCGGG	120
CGACAACGAA	GAACACACCC	cCCCCACCCG	GAAAGACTCT	ACAACACTGA acgc&ccaa	1331
CAACAACGAC	* mm \ mm GT TAiCi CcC	GCATCTCCGC	CCCCAACCCC	TCTGTTATCA CATATCCAGA	240
TGCTCGACCC	CCCcccggCA	GCAACGCCC-A	AGCCATCCAC	CTGGTTA.AG-. GCGCC.TATTC	300
'Τ’Λ’ r* «rpr zn <· i Caac i TG- C	CGCCACAACC	CCACCCACAG	CCAACACCAC	GGCGACCACCGA AOCAACTCAC	3(50
CGGCAGCGGc	GCCCGCCGCC	GCCCCAAACC	CCCCCCCCCC	CACCTCCGGC AC-TAACCGAC	420
CGGCCGCGAC	T c tG-cG i CG	/» P-«R <· PR * R m * « C\-GC TA i CCGC	GccaaaA t cC	CCG-CCCCACG GCTCTCGTTC	480
>** ·«·/m m <· «r> m mz·· CiCiCiii Cc	Γ··’/·” , C - CAACCC i A	ACGAAACGAT	gtggatcctg	AGAGCCCCCC CGGGCGAAGT	540
CCCGCACAGC	M mmmmmpr^'* AC ii-ccCcg	ACCCGCCCCGA	CCAACTCCGCC	GCGCACCTGC CTAGCAGGGC	600

CCCGTCCGCC GCGGTCGCCG G-CGCAAGACC GGCCCTCTCGZT JCCCTGTAACC CCAGCCGCGT

650

180 091

TCTGATGCCC TCCGCTCAAA TCACTGGTCT GGGCGGTATC CGTCACCACA ACAACATCAC 720

TCTTAAGCTC GACCGTTGCA ACAACAACAA CCAGTACGTA TCCATCGACA ACTTCCCTAT 780

CTTCTGCAAA GCACTGAACC CCAAACACAT CCAAAAACTC TATACCAGCT ACCTGTCTAT 840

CACCTTCCTG CCTGACTTCT GCGGTAACCC GCTGCGTTAC CACACCCAAT ATTACCTCAT 900

CCCGGTACCT TCTAGCTCTA AAGACG7TCA CCTCAAAAAC ATCACTGACT ACATGTACCT 960

GACCAACGCG CCGTCCTACA CTAACCGTAA ACTCAACATC TACTACCGAC GTCTGTACAA 1020

CGGCCTGAAA TTCATCATCA AACCCTACAC TCCGAACAAC GAAATCGATT CTTTCGTTAA 1080

ATCTCGTGAC TTCATCAAAC TCTACCTTTC TTACAACAAC AACGAACACA TCCTTCCTTA 1140

CCCGAAAGAC CGTAACGCTT TCAACAACCT GCACAGAATT CTCCGTCTTC CTTACAACGC 1200

TCCCCCTATC CCGCTCTACA. AAAAAATGGA AGCTCTTAAA CTCCCTCACC TGAAAACCTA 1260

CTCTGTTCAC CTGAAACTGT ACGACGACAA AAACCCTTCT CTCCCTCTGC TTGCTACCCA. 1320

CAACGCTCAG ATCCGTAACG ACCCGAACCG TCACATCCTC ATCGCTTCTA ACTGCTACTT 1380

CAACCACCTC AAAGACAAAA TCCTCCGTTC CGACTGGTAC TTCGTTCCGA CCGATCAACC 1440

TTGGACCAAC CACCGCCCCC CCCCCTCTAC AGGATCCGAT ATCAACCTTA CTACTTAATG 1500

ATCCGCTAGC CCGCCTAATC ACCGCGCTTT TTTTTCTCGG CCAGCGTTCC G7CCTGCCCA 1560

CCCGTCCGCA TGATCCTGCT CCTCTCCTTC ACGACCCCGC TACGCTC5CC GCCTTCCCT7 1620

ACTGCTTAGC	Λ A * * rp«“^ n ΦΓ AGA.A 7 GAA 7 C	ACCGATACGC	CACCC-AACCT	CAAcCCACTG	CTCCTGCAAA	1680
ACCTCTGCCA	CCTGAGCAAC	aacatgaatg	A ΦΓΆΦ <“ A r* *Ti rp GtCTtCcGT 7	TCCCTCTTTC	GTAAACTCTG	1740
CAAACGCGCA	AGTCAGCGCT	CTTCCGCTTC	CTCCCTCACT	CACTCGCTGC	CCTCGCTCCT	1800
TCCGCTGCGG	CGAGCGGTAT	CAC-CTCACTC	AAACCCGGTA	ATACGGTTAT	CCA-CAC-AATC	1860
AGGCGATAAC	GCAGGAAAGA	acatgtgagc	AAAACCCCAC	CAAAAGCCCA	GGAACCGTAA	1S2C
AAA GcCCcC C	TTGCTGGCGT	TTTTCCATAG	CCTCCCCCCC	CCTCACGAGC	AT CACAAAAA.	1980
7 cgaCgct Ca	AGTCAGAGGT	GCCCAAACCC	GACAGGACTA	rp* i r ' τ» rr 7 AAAGAiACC	AGCCGTTTCC	2040
CCCTCGAACC	TCCCTCGTCC	gctctcctgt	TCCGACCCTC	CCCCTTACCC	CATACCTCTC	2100
CGCC777C7C	CCTTCGCCAA	Gcc 7 CcccC 7	TTCTCAATGC	TCACGCTGTA	CCTATCTCAG	2160

180 091

TTCGGTGTAG GTCGTTCGCT CCAAGCTGGG CTGTGTGCAC GA.CCCCCCG TTCAGCCCGA 2220

CCGCTGCGCC TTATCCGGTA ACTATCGTCT TGAGTCCAAC CCGGTA_AGAC ACG.ACTTATC 2230

GCCACTGGCA GCAGCCACTG GTAACAGGAT TAGCAGAGCG AGGTATGTAG GCGGTGCTAC 2340

AGAGTTCTTG AAGTGGTGGC CTAACTACGG CTACACTAGA AGGACAGTAT TTGGTATCTG 2400

CGCTCTGCTG AAGCCAGTTA CCTTCGGAAA AAGAGTTGGT AGCTCTTGAT CCGGCAAACA 2460

AACCACCGCT GGTAGCGGTG GT'^'T'^TTTGT TTGCAAGCAG CAGATTACGC GCAGAAAAAA 2520

AGGATCTCAA GAAGATCCTT TGATCTTTTC TACGGGGTCT GACGCTCAGT GGAACGAAAA 2580

CTCACGTTAA GGGATTTTGG TCATGAGATT ATCAAAAAGG ATCTTCACCT AGATCCTTTT 2640

AAATTAAAAA TGAAGTTTTA. AATCAATCTA AAGTATATAT GAGTAAACTT GGTCTGACAG 2700

TTACCAATGC TTAATCAGTG AGGCACCTAT CTCAGCGATC TGTCTATTTC GTTCA.TCCAT 2760

AGTTGCCTGA CTCCCCGTCG TGTAGATA-AC TACGATACGG GAGGGCTTAC CATCTGGCCC 2820

CAGTGCTGCA ATGATACCGC GAGACCCACG CTCACCGGCT CCAGATTTAT CAGCAATAAA	2880
CCAGCCAGCC GGAAGGGCCG AGCGCAGAAG TGGTCCTGCA ACTTTATCCG CCTCCATCCA	2940
GTCTATTAAT TGTTGCCGGG AAGCTAGAGT AAGTAGTTCG CCAGTTAATA GTTTGCGCAA	3000
CGTTGTTGCC ATTGCTGCAG GCATCGTGGT GTCACGCTCG TCGTTTGGTA TGGCTTCATT	3060
CAGCTCCGGT TCCCAACGAT CAAGGCGAGT TACATGATCC CCCATGTTGT GCAAAAAAGC	3120
GGTTAGCTCC TTCGGTCCTC CGATCGTTGT CAGAAGTAAG TTGGCCGCAG TGTTATCACT	3180
catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc	3240
TGTGACTGGT GAGTACTCA-A CCAAGTCATT CTGAGAATAG TGTATGCGGC GACCGAGTTG	3300
CTCTTGCCCG GCGTCAACAC GGGATAATAC CGCGCCACAT AGCAGAACTT TAAAAGTGCT	3360
CATCATTGGA AAACGTTCTT CGGGGCGAAA ACTCTCAA.GG ATCTTACCGC TGTTGAGATC	3420
CAGTTCGATG TAACCCACTC GTGCACCCAA CTGATCTTCA GCATCTTTTA CTTTCACCAG	3480
CGTTTCTGGG TGAGCAAAAA CAGGAAGGCA AAAATGCCGCA AAAAAGGGAA TAAGGGCGAC	3540

ACGGAAATGT TGAATACTCA TACTCTTCCT TTTTCAATAT TATTGAAGCA TTTATCAGGG 3600

TTATTGTCTC ATGAGCGGAT ACATATTTGA ATGTATTTAG AAAAATAAAC AAATAGGGGT 3660

TCCGCGCACA TTTCCCCGAA AAGTGCCACC TGACGTCTAA GAAACCATTA TTATCATGAC 3720

ATTAACCTAT AAAAATAGGC GTATCACGAG GCCCTTTCGT CTTCAAGAA 3769

180 091 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NR: 6:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1766 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iii) ANTYSENSOWNA: nie (v) TYP FRAGMENTU: wewnętrzny (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: rejon „zawiasowy” (B) LOKALIZACJA: 923 . . 934 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR: 6:

al	CGTCAGATCA	CGTTTGGGGG		TA^GGA CCH	CGGλC!O^,ίGGI	66
TCdACATGC	GTTTTCATCA	CTATCACTAA	ccgcccgctg	TCTTCTGGTA	ACCGGTTCGI-C	120
CAACGGCGTT	UGATGGGCT	CGGGGTGACC	OCCTCGTCTG	(GGGG..IΛU^II,	GTGAGGACA	180
CAACATCACT	GTTC.CCCAGG	Α^ΑΤζα.	CCACACCCAC	ClCC^GTCGłlTT	CGGCTGCCGC	240
GTTCCGTATC	TTGTGGCCAG		/·* * a /* * c* ^mr· GcC-CGcbiC A C	GGICCAJCC^Gt:	ACACCACCA	300
CCTGTCTATC	ACCTTUTGC	GTG.CCTTGAG	GGGTCACCCG	CCTGGGTACG	ACCCGGC.ACA	360
TTACCTGATC	HGGTAGCTT	CTCCCACTCC	CGCGGTΊ'GAG	CGTCAAACcG.	TίCC:TGλCGA	420
CATGTACCTG	AHAACCCC-C	GCTGGTAGAG	TACCGGACAA	CGTGACGCTG	ACTACCGACG	480
TCTGTACAAC	GGCCTGAAAT	TGATGATGC.C	CCGCACCCCA	CdCACAACG	ACC^CT^ć^^CTC	540
TTTCGTTAAA	^Τζ^ζ^Α		GTCGGTATGT	ΤΑυΊΟίΑΑΑ	AdGA.!.!.	600
CGTTGGTTAC		GTCACGCTTT	CCCCCCCCAC	GACC^C^C^CCC		660
TTACfiACGCT		CGGTGAAGAA	CACCCTGGCC	οοήτπαααα:	ttgzgtgacct	720
GAAAAHTAC	TGTCTTGAGG	TGACCCTGAC	GGCGGCCACC	aac^chtc	TGCCGTCTCGCT	7S0
TGGTAIIIAC	AACCcTCACA	ACCCAAACCC	CGGGCACGGT	GAIAClCCTCTG	TCiGCTACTAA	840
	ACGGAGGAGC	ACGCCCACAT	CIAcGcAAGC	UAL A ctt gcT. a	TCCTTCCGAC	9(00
CGATGAAGGT	ΤΟζΑΧΑβί	ACGGGCCGGG		GGCTCCGATA	TCGCTTCC	960
TAGTTAATGA	TGGGGTCGGG	CGCHA-TGC	GCGGCCTTTA	TTTTTCTG^	dCCC GT T GGG	1020
TCUGGCCAC	GCGTcCGCAT		GTGTGCTTGC	gggccckgct	AGidTGGCCG	1080

180 091

GGTTCCCTTA	CTGGTTAGCA	GAATGAATCA	CCGATACGCG	AGGGAACGTG	AAGCGACTGC	1140
TCCTGCAAAA	CCTCTGCGAC	CTGAGCAACA	acaigaatgg	TCTTCGGTTT	CCGTGTTTCG	1200
TAAACTCTGG	AAACGCGGAA	GTCAGCGCTC	TTCCGCTTCC	TCGCTCACTG	ACTCGCTGCG	1260
CTCCGTCCTT	CGGCTGCGCC	GAGCGC-TATC	AGCTCACTCA	AAGGCGGTAA	TACGGTTATC	1320
CACAGAATCA	GGGGATAACC	CAGGAAAGAA	CATGTGAGCA	AAAGGCCAGC	AAAACCCCAG	TL380
CAACCG7AAA	aaggccgcgt	TGCTGGCGTI GTCAGAGGTG	TTTCCATA.GG GCGAAACCCG	CTCCGCCCCC	CTGACGAGCA	1440
TCACAAAAAT	CGACGCTCAA	ACACCACTAT	AAAGATACCA	1500
CGCGTTTCCC	CCTGGAAGCT	CCCTCGTGCG	CTCTCCTGTT	CCGACCCTGC	CGCTTACCGG	1550
ATACCTGTCC	GCCTTTCTCC	CTTCGGGAAG	CGTGGCGCTT	TCTCAATGCT	CACGCTCTAC	1620
GTA-TCTCAGT	TCGCTCTACG	TCGTTCGCTC	caagctgggc	TGTGTGCACG	AACCCCCCGT	1680
TCAGCCCGAC	CGCIGCGCCT	TATCCGGTAA	CTATCGTCTT	GAGTCCAACC	CGGTAAGACA	1740
CCACTTATCG	CCACTGCCAC	CAGCCA				1766

(2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NR: 7:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1736 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (v) TYP FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR: 7:

GGCGGCCTAC	GCGA.TTGACG	GCACcCCGgc		TACGCCAAGC	ACATCACGCT	60
GGTGTCCAGC	CATTCAGGCC	TGGGCC-TGCG	CCAGCTCGCC	AGCCTGTCCT	CCCCATCGCC	120
CATCACCGTG	TCGTCGCAGG		GCTGCGCCAC	GCCACGCTCC	ACCCCGCCCC	130
GCTCAGCCTC	AAGGGCGCGG	GGGTCGTGTC	GGCCCGCAAA	CTGGCCTCCG	CGGGCCCCGC	240
cgtgaacctc	GCGGGCGGCG	GGGCGGTGAA	GATCGCGTCG	GCCAGCAGCG	TTGCAAACCT	300
CGCGGTGCAA	GGCGGCGGCA	AGGTACAGCC	CACGCTGTTC	AATCCCCGGG	CGACGTTGCT	360
GGTGTCGGGC	CGCCAGGCCG	TCCACCTTGG	CGCCCCGACC	AGCCGTCAGG	CGCTCTCCGT	420
CAACCCGCGC	GGCGCCCTCA	AGGCGGACAA	CCTCTCGCCG	ACGCGA.CCGG	TCGACCTGCA	480
TGGCAAGCAG	GCCGTCGCGC	TGCGCTCGCC	CAGCACCAAT	CCGCTCTCGC	TCCCTGCCGG	540
CGGCGCCCTC	AAGGCGGGCA	AGCTGTCGGC	CACCGcGCCA	CTGCACGTCC	ACGCCAACCA	600
GGCCCTCACG	CTGGGTTCGG	TTCCGAGCGA	CGGTGCGCTG	TCGGTAAGCC	CTGGCGGAAA	660
CCTGCGGGCG	AACGAATTGG	TCTCCAGTGC	CCAACTTCTC	GTGCCTGCGC	AGCGCCACGT	720

180 091

cgcsctggat	gacgcttcca	GCGCACGCCG	CATGACCGTG	GTTGCCGCAG	CAGCGCTGGC	780
ggcccgcaac	ctccagtcca	AGGGCGCCAT	CGGCGTA.CAG	GGTGGAGAGG	CGGTCAGCCT	840
ggccaacgcc	AACACCGACC	CGGAATTGCG	r··^ <· C ** Uu 1	CGCCGCCA.GC	TCGATCTCCA	900
ccacctgagc	gcagcccgcc	GCCCGGATAT	CTCCGGCGAG	GGCGCGCGTCA	ATATCGGCCG	960
tccccgcagc	GATAGCGATC	TCAAGGTCTC	CGGGCACGGC	GCCTTGTCGA	TCGATAGCAT	1020
gaccgccctc	C GT-CCGATcG	GCCTCCAC-G-C	AGGCGGCAGC	GTCTCCGCCA	AGGATATGCG	1060
cagccgtggc	GCCGTCACCC	tcagcggcgg	ccgcgccgtc	AACCTGCGCC	ATCTCCACTC	1140
gcatggccac	GTCCGCGCCA	CCAGCGCGGG	cgccatcacg	GTGCGAGACC	TCCCCCCTCC	1200
ccccgacctt	CCCCTCCACG	CGGGCGACGC	gttccaggcc	GC-GTTCCTCA	AATCCGCCCC	1260
tgccatgacc	CTCAACGCCC	GCGATGCCGT	ccgactcgat	GGCCCCCACC	CCGGCCCGCA	1320
attccgggtt	TCCACCGACG	GGCAGGCTGC	gttgggcact	CTCGCGGCCA	AGGGCCAGCT	1380
cacggtatcg	GCCCCGCGCG	CGGCGACCGT	ggccgacttc	AAGTCCCTGG	ACAACATCTC	1440
cctcaccggc	GCCGAACGCG	TGTCGGTTCA	gagcctcaac	AGCGCCTCCA	GGGTCGCCAT	1500
ttccccccac	GGCCCGCTGG	ATGTAGGCAA	GGTTTCCGCC	AACAGCGGTA	TCGGGCTCCA	1560
aggctggggc	GCGGTCCGAG	CGGACTCCCT	cgcttcccac	GCCGCGATCA	GCGTGTCCGG	1620
gcgcgatgcg	GTCAGGCTCG	ATCAAGCCCG	CAGTCTTGCC	GACATTTCGC	TGGGGGCGGA	1680

aggcggcgcc acgctgggcg cggtggaggc cgccggttcg atcgacgtcc gcggcg

1736

180 091

1-74kb

B.pertussis FHA fragScicII/Bam HI do Fig.lb

Fig. la

180 091 z Fig.la

Fig.1b

180 091

Fig. 2

180 091

Fig. 3

180 091

Fig. 4

180 091

Fig. 6

180 091 jednostki B-gal jednostki b-gal

\^x

H htrA nirB groE

Fig 7a

Czas (godziny)

SSS *8

85:

wi

Λν »&♦;

VA

555

Wr ►5SJ .«Ri?

wJ >*Λ’

555 w

-SASlr

ϋ hrrA nirB

H gr°E

Fig 7b

180 091 jednostki B-gal

Fig.7c htrA nirB aroE

ω hrr nir groE

Promotory

Fig. 8

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Szczepionka, zwłaszcza do podawania doustnego lub donosowego, znamienna tym, że zawiera atenuowanąbakterię oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, przy czym bakteria posiada konstrukcję DNA zawierającą sekwencję promotora htrA związaną operacyjnie z sekwencją kodującą białko heterologiczne.
2. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że białko heterologiczne jest białkiem fuzyjnym, a białka tworzące fuzję są połączone za pomocą giętkiego regionu „zawiasowego” stanowiącego łańcuch złożony z co najmniej 4, a korzystnie 6 do 14 aminokwasów tworzących sekwencję:

-[X]p-Pro-[Y]q-Pro-[Z]rw której Pro oznacza prolinę, X i Y oznaczają glicynę albo aminokwas posiadający nieobjętościowy łańcuch boczny, Z oznacza dowolny aminokwas, p oznacza dodatnią liczbę całkowitą, q oznacza dodatnią liczbę całkowitą od 1 do 10 a r oznacza zero albo dodatnią liczbę całkowitą większą od zera.
3. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że białko heterologiczne jest białkiem fuzyjnym składającym się z dwóch heterologicznych białek, przy czym pierwszym heterologicznym białkiem jest sekwencja antygenowa zawierająca fragment C toksyny tężca albo jeden lub większą ilość jego epitopów.
4. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że atenuowana bakteria została atenuowana drogą wprowadzenia nieodwracalnej mutacji w genie zaangażowanym w szlaku biosyntezy aminokwasów aromatycznych w tej bakterii.
5. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że atenuowana bakteria zawiera nieodwracalną mutację w każdym z dwóch dyskretnych genów zaangażowanych w szlaku biosyntezy aminokwasów aromatycznych tej bakterii.