PL180543B1 - Zrekombinowany konstrukt DNA, sposób wytwarzania fruktanui sposób zwiekszania poziomu fruktanu w roslinach PL PL - Google Patents

Abstract

1. Zrekombinowany konstrukt DNA zawierajacy promotor specyficzny wzgledem tkanki wybrany z gru- py obejmujacej SEQ ID NO: 2, 3, 14 i 15, operacyjnie polaczony z sekwencja ukierunkowujaca na wakuole wybrana z grupy obejmujacej SEQ ID NO: 6,7,9 i 10, operacyjnie polaczona z sekwencja kodujaca bakteryjny gen lewanosukrazy wybrana z grupy obejmujacej SEQ ID NO: 1,4 i 5. 2. Zrekombinowany konstrukt DNA zawierajacy promotor specyficzny wzgledem tkanki wybrany z grupy obejmujacej SEQ ID NO: 2,3,14 i 15, operacyjnie polaczony z sekwencja ukierunkowujaca na wakuole wybrana z grupy obejmujacej SEQ ID NO: 6,7,9 i 10, operacyjnie polaczona z sekwencja kodujaca gen lewa- nosukrazy EC 2.4.1.10. 3. Sposób wytwarzania fruktanu, zgodnie z którym hoduje sie rosliny wybrane z grupy obejmujacej kukurydze, ziemniaki i tyton, zbiera sie te rosliny i ekstrahuje sie fruktan z zebranych roslin, znamienny tym, ze hoduje sie, zbiera i poddaje ekstrakcji rosliny stransformowane zrekombinowanym konstruktem DNA za- wierajacym promotor specyficzny wzgledem tkanki wybrany z grupy obejmujacej SEQ ID NO: 2, 3, 14 i 15, operacyjnie polaczony z sekwencja ukierunkowujaca na wakuole wybrana z grupy obejmujacej SEQ ID NO: 6 , 7, 9 i 10, operacyjnie polaczona z sekwencja kodujaca bakteryjny gen lewanosukrazy wybrana z grupy obej- mujacej SEQ ID NO: 1,4 i 5. 4. Sposób zwiekszania poziomu fruktanu w roslinach, znamienny tym, ze komórki rosliny transformuje sie zrekombinowanym konstruktem DNA zawierajacym promotor specyficzny wzgledem tkanki wybrany z gru- py obejmujacej SEQ ID NO: 2,3,14 i 15, operacyjnie polaczony z sekwencja ukierunkowujaca na wakuole wy- brana z grupy obejmujacej SEQ ID NO: 6,7,9 i 10, operacyjnie polaczona z sekwencja kodujaca bakteryjny gen lewanosukrazy wybrana z grupy obejmujacej SEQ ID NO: 1,4 i 5, po czym z tej stransformowanej komórki ho- duje sie plodna, dojrzala plciowo stransformowana rosline. PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku sązrekombinowany konstrukt DNA, sposób wytwarzania fruktanu i sposób zwiększania poziomu fruktanu w roślinach. Konstrukt i sposoby według wynalazku umożliwiajągromadzenie polimerów fruktozy w traisgenicznych. roślinach na drodze selektywnej ekspresji genów.

Podstawowe zasoby węglowodanów znajdujących się w roślinach naczyniowych stanowi sacharoza, skrobia i fruktan (nieredukujący polimer fruktozy połączony z końcowymi resztami glukozy). Pomimo licznych barier agronomicznych i technicznych rośliny uprawiane są na całym świecie, zwłaszcza jako źródło sacharozy lub skrobi do stosowania w produkcji słodzików.

Ekonomicznie opłacalna uprawa buraka cukrowego i trzciny cukrowej oraz ich przeróbka na sacharozę musi przezwyciężyć bariery, do których należy, ale nie wyłącznie, ograniczenie odnośnie regionów upraw, pracochłonność zbiorów, krytyczny moment zbioru, gdy poziom sacharozy osiąga maksimum, niepożądane zmiany w składzie i jakości spowodowane opóźnieniem w transporcie lub przeróbce oraz straty wydajności na skutek niewłaściwego lub długotrwałego przechowywania (Salunkhe i Desai, Postharvest Technol. of Sugar Crops, CRC Press, Boca Raton, Florida(1988); Stout, J. Am. Soc. Sugar Beet Technol., 9:350 (1957); Bames, The Sugarcane, 2 wyd., Leonard Hill Books, London (1994)). Przykładowo przetwórstwo trzciny cukrowej

180 543 zaledwie w 9 dni po ścięciu staje się przedsięwzięciem nieopłacalnym z uwagi na znaczący spadek zawartości sacharozy w wyniku degradacji enzymatycznej (Alexander, Sugarcane Physiology, Elsevier, Amsterdam (1973); Gulibeaui inni, Sugar J. 18:30 (1955). Z uwagi na stosunkowo krótki okres, w którymjest to opłacalne, czas zbioru i przetwórstwa należy ściśle planować. Nieoczekiwane opóźnienia, związane np. z wyjątkowymi warunkami atmosferycznymi, mogą doprowadzić do utraty znacznej ilości produktu. Optymalny okres zbioru buraka cukrowego jest również komplikowany przez upływ czasu. Rafinoza, podstawowe zanieczyszczenie soku buraczanego, hamuje krystalizację sacharozy i stwarza poważny problem dla wydajnego przetwórstwa buraka cukrowego. Wykazano, że zawartość rafmozy zwiększa się zdecydowanie w tym samym okresie, gdy poziom sacharozy osiąga szczyt i w dalszym ciągu wzrasta w czasie przechowywania buraków w temperaturach niezbędnych dla zapobiegania degradacji sacharozy (Finkler i inni, J. Am. Soc. Sugar Beet Technol., 10: 459 (1959); Brown, Anal. Chem., 24: 384 (1952)). Uprawa buraka cukrowego na sacharozę jest zatem skomplikowana, gdyż poziom sacharozy i zawartość rafmozy decydują o jakości, a tym samym i o wydajności przetwórstwa buraka cukrowego.

Środki słodzące oparte na skrobi, wytwarzane głównie z kukurydzy, opracowano w części z uwagi na liczne ograniczenia związane z trzciną cukrową i burakiem cukrowym. Kukurydziane środki słodzące łagodzą również uzależnienie od importu sacharozy. Podaż historycznie związana jest ze światowym deficytem cukru i huśtawką cen, co spowodowane było szeregiem zjawisk politycznych i naturalną diastazą.

Zmniejszenie zbiorów upraw cukrowych w Stanach Zjednoczonych nastąpiło stosunkowo szybko, prawdopodobnie ze względu na liczne zalety charókterytyczne dla produkcji środków słodzących ze skrobi. Jedną z zalet stanowi np. to, że zbiory i warunki przechowywania kukurydzy sąznacznie korzystniejsze w porównaniu z uprawami roślin cukrowych, takichjak burak cukrowy i trzcina cukrowa. Pozwala to na jej znacznie dłuższe przechowywanie bez utraty jakości w czasie oczekiwania na zwolnienie się urządzeń produkcyjnych. Opłacalne wytwarzanie sacharozy z trzciny cukrowej wymagaj ego realizacji w ciągu kilku dni po zbiorze, aby zapobiec pogorszeniu jakości cukru, natomiast kukurydzę w odpowiednich warunkach można przechowywać przez rok przed wyodrębnieniem z niej skrobi do produkcji środka słodzącego, bez znaczącej utraty lub pogorszeniaj akości produktu. Innązaletąkukurydzy w porównaniu z takimi uprawami jak trzcina cukrowajest możliwość jej uprawy w różnych warunkach. Zastosowanie kukurydzy spowodowało znaczny wzrost obszarów w Stanach Zjednoczonych przeznaczanych pod uprawę roślin dla przemysłu cukrowego. Ponadto fruktoza, produkt końcowy środków słodzących opartych na skrobi,jest uważana przez wielu konsumentów za korzystnieesząod sacharozy z uwagi na jej większą względną słodycz. W warunkach kwaśnych fruktoza może być do 1,8 razy słodsza niż sacharoza. Powoduje to oszczędności dla konsumenta, gdyż może on użyć mniej produktu w celu uzyskania takiego samego efektu.

Pomimo znacznego sukcesu handlowego przemysłu produkującego frulktozowy syrop kukurydziany, istnieje w dalszym ciągu szerokie pole dla dokonywania usprawnień. Techniczne przeszkody, które należy pokonać przy przekształcaniu skrobi, polimeru glukozy, we fruktozę, znacząco podwyższają koszty produkcji. Stosowana obecnie technologia produkcji syropu fruktozowego rozpoczyna się zasadniczo od hydrolizy skrobi na poszczególne reszty glukozowe. Prowadzi się jąenzymatycznie, aby zmniejszyć ilość produkówbarwnych i zapachowych oraz z uwagi na niską wydajność spowodowaną powstawaniem bezużytecznych oligomerów, gdy hydrolizę skrobi prowadzi się na drodze łagodnej obróbki kwasem. Enzymatyczna hydroliza skrobi, nawet prowadzona w sposób jak najwydajniejszy, powoduje znaczące straty finansowe z uwagi na masową skalę produkcji syropu fruktozowego. Konwersja skrobi do glukozy w 96% powoduje znaczne straty potencjalnego produktu, jeśli uwzględni się, że rocznie hydrolizuje się kilkaset milionów funtów skrobi. W wyniku zaledwie 4% strat spowodowanych niepełną hydrolizą skrobi stracić można dziesiątki milionów funtów potencjalnej glukozy, którą można by sprzedaćjako gotowy produkt. Oznacza to stratę milionów dolarów dochodzi każdego roku.

180 543

Łączna wydajność procesu zmniejsza się jeszcze bardziej w etapie izomeryzacji. Enzymatyczna konwersja glukozy do fruktozy osiąga stan równowagi zaledwie przy 42% fruktozy. Taka mieszanina fruktozy i glukozy nie jest produktem akceptowalnym. Wzorcem przemysłowym jest sacharoza, a 42% roztwór fruktozy nie jest porównywalny pod względem słodkości z odpowiednim roztworem sacharozy. W związku z tym 42% roztwór musi być wzbogacony we fruktozę na drodze chromatografii jonowymiennej, co znacznie podraża koszt produkcji. 90% roztwór fruktozy eluowany z kolumny jonitowej miesza się z częścią42% roztworu fruktozy, tak aby uzyskać 55% produkt. 55% roztwór fruktozy jest pod względem poziomu słodkości porównywalny z sacharozą.

Spośród fndktoaowych środków słodzących naj szybciej rośnie zapotrzebowanie na krystaliczną fruktozę. Produkt ten stosowany jest w coraz większej liczbie wyrobów wypiekanych i suchych mieszanek. Produkcja krystalicznej fruktozy wymaga prowadzenia dodatkowej obróbki 90% syrop fruktozowego uzyskanego z kolumnyjonitowej, co podrażajej cenę. Taka dodatkowa obróbka jest niezbędna, gdyż aby krystalizacja fruktozy była możliwa, należy usunąć zanieczyszczenia w postaci glukozy. Należy zastosować mieszankę zawierającą około 97% fruktozy, aby uzyskać zyskowny handlowy produkt.

Konwersja polimeru glukozy (skrobi) do fruktozy zapewnia szereg korzyści przemysłowi środków słodzących, ale jej kosztjest znaczący. Koszty te można by zmniejszyć stosując fruktan jako materiał wyjściowy do produkcji syropu fruktozowego. Fruktany będące trzecim źródłem rezerw węglowodanów przechowywanych przez rośliny sąznane od ponad 150 lat. Fruktany zawierająmery fruktozy połączone wiązaniami 02-1 i (326. W wyniku prostej hydrolizy tego polimeru na drodze enzymatycznej lub obróbki łagodnym kwasem uzyskuje się zasadniczo czystą fruktozę. Z tego względu unikalną zaletą fruktanów w porównaniu ze skrobiąjest wysoka czystość i zawartość produktu, jaką można osiągnąć przy wyeliminowaniu etapów scukrzania, izomeryzacji i obróbki najonitach, prowadzonych obecnie przy wytwarzaniu syropu fruktozowego. Uproszczenie przetwórstwa powodujące zmniejszenie kosztów oraz wyższa względna słodkość fruktozy w porównaniu z sacharozą to j edynie dwa powody, dla których fruktany uważane są za doskonałe surowce dla przemysłu środków słodzących.

Jednakże problemy związane z uprawą roślin zawierających fruktan są porównywalne z występującymi w przypadku upraw roślin, z których uzyskuje się sacharozę. Jakkolwiek stwierdzono, że 23 odrębne rodziny roślin gromadzą fruktany (Hendry, New Phytol., 106: 201-216 (1987); Nelson i Spollen, Physiol. Plant, 71:512-516 (1987)), tylko dwa gatunki uważa się za potencjalne rośliny do upraw przemysłowych. Karczoch jerozolimski (Helianthus tuberosus) i cykoria (Cichorium intybus) są znanymi tradycyjnymi roślinami uprawnymi gromadzącymi węglowodan w ilościach porównywalnych do buraka cukrowego i ziemniaka (Fuchs, Strach 39: 335-43 (1987).

Jednakże karczoch jerozolimski i cykoria sąroślinami sezonowymi. Synteza fruktanu spada szybko po ustaniu rozwoju bulw. Zdolność do degradacji w bulwie wzrasta w czasie dojrzewania i utrzymuje się na wysokim poziomie w okresie uśpienia (Fuchs, Starch 39:3335-43 (1987)). Okres zbioru jest szczególnie krytyczny w przypadku karczocha jerozolimskiego. Pożądane polimery o wyższym ciężarze cząsteczkowym przeważają w młodych bulwach, w których nagromadziła się stosunkowo niewielka potencjalna ilość fruktanu. Dojrzałe bulwy zawierają do 80% suchej masy w postaci fruktanu, z tym że przeważają składniki o niższym ciężarze cząsteczkowym (Haunold i inni, J. Plant Physiol. 134:218-223 (1989). Z uwagi na to, że wszystkie fruktany zawierają na końcach reszty glukozy pochodzące od wyjściowej cząsteczki sacharozy, im większajest zawartość merów fruktozy, tym bardziej czystyjest polimer. W związku z tym w przypadku większych fruktanów znacznie prostsze jest oczyszczanie fruktozy z glukozy. Intensywne przetwórstwo fruktanów w krótkim, krytycznym okresie roku może spowodować zmniejszenie strat spowodowanych degradacją z tym że zależy to od zdolności produkcyjnej. Zdolność produkcyjna jest z kolei ograniczana kosztami potrzebnymi na wykonanie specjalistycznych urządzeń i instalacji przemysłowych zdolnych do przetwórstwa rośliny korzeniowej w krótkotrwałym okresie zbiorów.

180 543

Znacznąwadąprzy przemysłowej uprawie karczochajerozolimskiego na fruktanjest cienka i delikatna skórka jego bulw. Uszkodzenie skórki następuje często w czasie zbioru, co zwiększa oddychanie i powoduje utratę dużej ilości wody oraz zwiększoną degradację fruktanu w czasie przechowywania. Przechowywanie w warunkach otoczenia ograniczone jest jedynie do kilku tygodni, w najlepszym wypadku zanim znacząca degradacja fruktanów spowoduje zmniejszenie zysków. Roślinę można również przechowywać w warunkach stałej temperatury i wilgotności przed przeróbką. Może to zapobiec utracie produktu (Dykins i inni, Industrial and Engineering Chemistry 25: 937-940 (1933), z tym że koszty związane z przechowywaniem na wielką skalę powodują, że jest to nieopłacalne.

Nagromadzanie się fruktanu w roślinach uprawianych na polach jest wyjątkowo wrażliwe na zmiany w środowisku. Susza lub mrozy zdecydowanie pogarszają jakość nagromadzonego fruktanu (Praznik i Beck, Agr. Biol. Chem., 51:1593-1599 (1987)). Tradycyjne programy hodowli mogłyby w teorii doprowadzić do uzyskania odmian, w przypadku których zmiany środowiska mniej wpływałyby na pogorszenie jakości, jednakże programy tego typu, zazwyczaj bardzo czasochłonne, nie są obecnie prowadzone i mogłyby zostać uruchomione tylko wtedy, gdyby przemysł fruktanów był zdolny do przetrwania.

Inżynieria genetyczna upraw zawierających fruktany mogłaby również wyeliminować te bariery. Nadekspresja genu lub genów biosyntezy fruktanu może doprowadzić do wzrostu wydajności, syntezy fruktanów o wyższej masie cząsteczkowej oraz zmniejszenia stratjakości spowodowanych przez suszę lub mróz. Podejście takie mogłoby potencjalnie wyeliminować konieczność przechowywania w specjalnych warunkach. Powodzenie takiego programu genetycznego mogłoby w znacznym stopniu zależeć od szczegółowego poznania biochemii syntezy fruktanu, kinetyki biosyntezy białek oraz w efekcie, poznania działania regulacyjnego genów biorących udział w syntezie fruktanu. Jak dotychczas wiedzy takiej brakuje. Obecnie obowiązujący model dla wszystkich roślin gromadzących fruktan, zaproponowany w 1968 roku (Eddleman i Jefford, New Phytol. 67:517-531 (1968)) zakłada, że synteza i magazynowanie polimeru jest wynikiem kolejnego działania dwóch odrębnych białek. Model, który został nieznacznie zmodyfikowany (Wagner i inni, Zeitschigt fur Pflanzen physiologie 112: 359-372 (1983); Frehner i inni, 1984, New Phytol. 116:197-208) musi jeszcze rozwiązać kluczowe zagadnienie dotyczące odwracalnej aktywności fruktozylotransferazy (zwanej w skrócie FTF);jest onjednak w dalszym ciągu przyjmowany krytycznie (Housley i inni, New Phytol. 119: 491-97 (1991); Cairns A.J., New Phytol. 120: 463-73 (1992)). Enzymy odgrywające rolę w biosyntezie nie zostały oczyszczone w stopniu zapewniającym ich jednorodność. Z tego względu próby pełnego zrozumienia metabolizmu fruktanu, a następnie zmodyfikowaniajego syntezy oraz zmniejszenia strat spowodowanych przez degradację i zwiększenia masy cząsteczkowej fruktanów nagromadzonych w transgenicznej roślinie z wykorzystaniem klonowanego genu lub genów roślinnych, mogą trwać jeszcze lata.

Znane są również drobnoustroje wytwarzające fruktany. W przeciwieństwie do układów roślinnych synteza fruktanów w drobnoustrojach została poznana (przegląd w: Hehre, Adv. in Enzymol., 11: 297 (1951); Hestrin: The Bacteria: ATreatise on Structure and Function, Academic Press, NY, Gunsalas i Stanier (red.), Vol. 3, rozdz. 8 (1962)). FTF pochodzące ze źródeł bakteryjnych katalizują polimeryzację liniowych lub rozgałęzionych polimerów zawierających mery fruktozy w połączeniach β2-1, β2-6, albo w kombinacji β2-1 i β2-6. Łańcuchy fruktanu, podobnie jak w przypadku skrobi i dekstranu, powiększają się w wyniku stopniowej addycji pojedynczych reszt fruktofuranozylu przy C-6-hydroksylowym końcu końcowego nieredukującego meru fulkozy na końcu rosnącego łańcucha. W łańcuchu mogą również tworzyć się rozgałęzienia, gdy addycja meru fruktozy nastąpi przy grupie C-1 hydroksylowej. Rozgałęzienie może stanowić do 12% polimeru (Hestrin, Ann. N.Y. Acad. Sci., 66:401 (1956); Hehre, Methods Enzymol. 1:178-192 (1955); Han, Adv. Appl. Mi(^i^c^t^iol. 171-194 (1990)). Prowadząc najobszerniej badania nad Bacillus subtilis zidentyfikowano wiele gatunków wykazujących aktywność polimeryzowania fruktozy (Evans i Hibbert. Adv. Carbohydr. Chem., 2: 253-277 (1946); Mantsala i Puntala, FEMS Microbio. Lett., 13: 395-399 (1982); Kleczowski i Wierechowski,

180 543

Soil Sci., 41: 285-300 (1940)). Białka bakteryjne zostały oczyszczone do stanu jednorodności (Chambert i inni, Eur. J. Biochem. 41:285-300 (1974)) oraz wykrystalizowane (Berthou i inni, J. Mol.Biol., 82:111-113 (1974)). Wyczerpujące badania oczyszczonej bakteryjnej aktywności FTF doprowadziły do stwierdzenia, że polimery są syntetyzowane przez pojedyncze białko działające na sacharozę, jedyny substrat. Łańcuch fruktozy rośnie w wyniku powtarzanego przenoszenia fruk^^ozy z donorowej sacharozy do akceptora, polimeru fruktaiowego. Stwierdzono, że synteza nie jest zależna od kofaktorów lub starterów. Oczyszczone białko · umożliwiło identyfikację i klonowanie bakteryjnego genu FTF z różnych gatunków (A. Fouet, M. Amaud, A. Klier i G. Rappaport, Biochem, Biophys. Res. Commun. 119,795-800 (1984); T. Shiroza i H.K. Kuramitsu, J. Bacteriol, 170, 810-816 (1988); L.B. Tang, R. Lenstra, R.V. Borchert- i V. Nagarajan, Gene 96, 89-93 (1990). Klonowane geny i ukierunkowana mutageneza dostarczyły dodatkowych informacji odnośnie obszarów wiązania, kinetyki i pośrednich kompleksów białko-cukier (R. Chambert i M.F. Petit-Glatron, Biochem. J., 279, 35-41 (1991)).

Dobrze poznana biosynteza fruktanu w drobnoustrojach umożliwia regulację nagromadzania fruktanu w roślinach na drodze inżynierii genetycznej. Klonowane geny bakteryjne stwarzająmożliwość modyfikacji gatunków roślin zawierających fruktan, albo gromadzenie fruktanów w traasgemcznych roślinach, w których w przyrodzie fruktany zazwyczaj nie występują. Jednakże w związku z wykorzystaniem sacharozy jako jedynego substratu należy uwzględnić szereg potencjalnych barier, jeśli pragnie się uzyskać zadowalającą ekspresję w roślinie transgenicznej. Przy ekspresji genu bakteryjnego o zdolności metabolizowania sacharozy w roślinie transgenicznej należy uwzględnić decydującą rolę, jaką sacharoza odgrywa we wzroście i rozwoju wyższych roślin. Większość związków powstałych w tkankach rośliny, w których nie zachodzi fotosynteza, pochodzi od sacharozy. Stwierdzono, że stężenie sacharozy reguluje ekspresję genów (Visser i inni, Plant Mol. Biol., 17: 691-699 (1991); Wentzler i inni, Plant Mol. Biol., 12:41-50 (1989)), a ponadto wykazano jej rolę w regulowaniu szybkości fotosyntezy (Stitt i inni, Planta, 1813:40-50 (1990); Krapp i inni, The Plant J., 3: 817-828 (1993)). Znaczenia tego oczywiście nie można pominąć. Nieograniczona ekspresja genu, mogąca wpływać na stężenie sacharozy w roślinie transgenicznej, może pozbawić tkankę, w której nie zachodzi fotosynteza, podstawowego metabolitu, gdzie jest on najpotrzebniejszy, co z kolei mogłoby wywrzeć poważny wpływ na rozwój takiej tkanki. Zmiana stężenia mogłaby również wpłynąć na ekspresję genów powiązaną z poziomem sacharozy w komórce, co doprowadziłoby do nieznanych, ale z pewnością poważnych niekorzystnych wyników.

W wyższych roślinach znajdują się wyspecjalizowane struktury przenoszące, zbierające i zatężąjące sacharozę. W związku z tym poziomy cukru wykazują znaczne różnice w roślinie, w organellach komórkowych oraz między różnymi gatunkami roślin. Jakkolwiek sacharoza stanowi dominującą postać węglowodanu transportowanego z tkanki netto eksportującej węgiel (źródła) do tkanki netto importującej węgiel (docelowej), to wiele roślin przenosi alternatywne formy sacharozy (np. rafinozę) lub nawet alternatywne węglowodany (np. mannitol lub sorbitol). Prowadzenie ekspresji enzymu metabolizującego sacharozę w zmiennej populacji gatunków roślin bez wpływania na sygnały regulacyjne i subkomórkowe sekwencje ekspresji jest w związku z tym wysoce nieprawdopodobne. Ekspresja musi uwzględniać rozliczne mechanizmy, które zapewniają transport i zatężanie sacharozy, zmieniają formy sacharozy występujące w wyższych roślinach, a także decydującą rolę, jaką odgrywa sacharoza w różnych tkankach roślin.

Nagromadzanie bakteryjnych fruktanów w roślinach transgenicznych stwarza wiele korzyści w porównaniu z fruktanami roślinnymi. Wielkość fruktanu stanowi najbardziej zauważalną różnicę między fruktanami ze źródeł roślinnych i drobnoustrojowych. Polimery roślinne mają niską masę cząsteczkową, średnio z 10-30 merami fruktozy w cząsteczce. Natomiast fruktany drobnoustrój owe mogązawieraćponad 100000 merów fruktozy, a ich masa cząsteczkowa może dochodzić do 10⁶ -10⁸. Zwiększenie wielkości cząsteczki fruktanujest znacząco korzystne, gdyż im większa jest cząsteczka polimeru, tym wyższy jest stosunek fruktozy do glukozy oraz tym prostszą obróbkę oczyszczającą należy przeprowadzić w celu usunięcia zanieczyszczającej glukozy po hydrolizie. Wzrost wielkościjest również korzystny z tego względu, że większe

180 543 fruktany są mniej rozpuszczalne w wodzie niż mniejsze polimery roślinne. Różnica w rozpuszczalności może stanowić zaletę przy przeróbce tkanek. Oddzielanie fruktanów od lepiej rozpuszczalnego materiału komórkowego, takiego jak sacharoza, glukoza i inne cukry, może stwarzać mniej trudności technicznych, gdy wydzielane polimery są większe. Większe fruktany stwarzają także możliwość magazynowania większej ilości fruktozy w komórce bez wpływania na wewnętrzne ciśnienie osmotyczne, w porównaniu z taką samą ilością fruktozy w mniejszych polimerach. W związku z tym, że modyfikacja ciśnienia osmotycznego w tkance docelowej wywiera decydujący wpływ na import węgla, zaleta ta może okazać się najważniejsza.

W wyniku transformowania roślin za pomocą FTF można by osiągnąć wprowadzenie genu, którego nie można by wprowadzić na drodze tradycyjnego krzyżowania i który umożliwiałby uzyskanie wsobnych lub wyjątkowych linii dobrze dopasowanych do konkretnych obszarów upraw. W wyniku transformowania genem bakteryjnym FTF uzyskano by odnawialne źródło cennego polimeru bez utraty cennych produktów ubocznych takich jak olej, pasza glutenowa i mąka, w przypadku kukurydzy. Techniki transgeniczne umożliwiłyby ponadto nagromadzanie fruktanu w roślinie, która nie jest zdolna do jego degradacji. Oznacza to, że zmiany w środowisku nie wpływałyby najakość lub ilość polimeru, co obserwuje się w przypadku roślin takich jak karczoch jerozolimski i cykoria. Przy przechowywaniu takiej transgenicznej tkanki mniejsze byłoby prawdopodobieństwo jej degradacji. Długoterminowe przechowywanie w zwykłych pojemnikach spowodowałoby obniżenie lub wyeliminowanie kosztów i środków technicznych związanych ze zbiorem i wydzielaniem z istniejących upraw fruktanowych.

Powodzenie ekspresji genu o właściwościach metabolizowania węglowodanu w transgenicznej roślinie wymagajednak uwzględnienia następujących czynników: (1) transformowanego gatunku; (2) konkretnej tkanki, w której ma zajść ekspresja; (3) momentu ekspresji; oraz (4) subkomórkowej lokalizacji ekspresji genu. Wszystkie te czynniki muszą zostać dokładnie rozważone, aby produkcja fruktanu wystąpiła w transgenicznej komórce bez niekorzystnych efektów.

Ekspresja genu o aktywności metabolizowania sacharozy, takiego jak bakteryjne białko FTF, w jednym określonym gatunku transgenicznym nie musi prowadzić do takiego samego pożądanego efektu w przypadku ekspresji w innym gatunku. Różnice w profilach węglowodanów między gatunkami sugerują, że enzym specyficzny względem sacharozy nie zawsze znajdzie wystarczającą ilość substratu dostępnego do uzyskania takiego samego rezultatu w przypadku ekspresji w różnych gatunkach. Dostępność sacharozy jako substratu nie tylko znacznie zmienia się między gatunkami, ale również wśród mutantów tego samego gatunku (Lampe, Bot., Gaz., 91:337-380 (1930)). Jakkolwiek większość roślin syntetyzuje i przemieszcza sacharozę, nie wszystkie rośliny postępują zgodnie ze strategią przemieszczania węgla do tkanek, w których nie zachodzi fotosynteza. Przykładowo wiele roślin syntetyzuje i przemieszcza alditole. Mannitol jest syntetyzowany w liściach selera, Apium graveolens, i ulega translokacji przez łyko, w którym przechowywany jest w ogonkach (Rumpho i inni, Plant Phys., 73:869-873 (1983)). Inny przykład stanowią dyniowate, w którym sacharydy rafinozy stanowią przeważający transportowany cukier (Hendrix, Plant Sci. Lett., 25: 1-7 (1982); Webb i Gorham, Plant Physiol., 39:663-672 (1964)). Z tego względu na ilość fruktanu wytworzonego przez bakteryjny FTF wpływać będzie poziom innych obecnych węglowodanów, a także poziom sacharozy, który wykazuje znaczne różnice między gatunkami.

Mechanizmy transportu i nagromadzania sacharozy w tkance docelowej również są różne w różnych gatunkach. Hydroliza sacharozy stanowi integralnączęść mechanizmu importu w rozwijającym się ziarnie kukurydzy (Porter i inni, Plant Phys., 77: 524-531 (1985), natomiast nie wydaje się, aby było to wymagane w przypadku transportu do nasion soi (Thome, Plant Phys., 70:953-958 (1982)) lub do bielma pszenicy (Jenner, Aust. J. Plant Phys., 1: 39-329 (1974)). Ekspresja FTF w nasieniu jednego z gatunków może doprowadzić do tego, że białko będzie miało dostęp do bardzo dużej ilości sacharozy, a synteza fruktanu w nasieniu innego gatunku może zostać zahamowana przez obecność głównie cukrów heksozowych.

180 543

Inną ilustracją roli, jaką gatunek roślin odgrywa w profilu nagromadzania węglowodanu może stanowić porównanie cukrów znalezionych w tkance docelowej takich roślin jak owoc pomidora i bulwa ziemniaka. Tkanka owocu udomowionego pomidora gromadzi głównie heksozę z uwagi na działanie trzech rożnych enzymów inwertazowych. Rozpuszczalna inwertaza kwasowa zlokalizowana w wakuoli owocu pomidora oraz inwertaza związana ze ścianką komórki są głównie odpowiedzialne za gromadzenie się heksozy w tej tkance. W pomidorach znaleziono również cyt^^of^^znąinwertazę alkaliczną (Yelle i inni, Plant Phys., 95: 1026-103 (1991)). Natomiast podstawowa tkanka docelowa ziemniaka, rozwijające się bulwy, pozbawione są aktywności inwertazowej. Sacharoza jest transportowana do bulw ziemniaka w stanie nienaruszonym (jak w przypadku owoców pomidora), jednak hydroliza utoymywanaj est na minimalnym poziomie na skutek ekspresji nieodwracalnego białkowego inhibitora inwertazy w bulwach (Pressey, Arch. Biochem. Biophys., 113: 667-674 (1966)). Hydroliza sacharozy w komórkach bulwy jest jeszcze bardziej ograniczana na skutek niskiej aktywności cytozolicznych metabolicznych enzymów sacharozy. W związku z tym znaczna ilość sacharozy przechowywanaj est w wakuolach i pozostaje w stanie niezhydrolizowanym aż do metabolizy prowadzącej do syntezy skrobi (Oparka i inni, Planta, 18^.’ 113-117(1990)).

von Schaewen i inni (EMBO J. 9:3033-3044 (1990) donieśli, że ekspresja genu inwertazy drożdżowej pod kontrolą konstytutywnego promotora roślinnego, promotora CaMV 35S, prowadzi do odmiennego fenotypu, gdy jest transformowana w tytoniu, w porównaniu z transgenicznym Arabidopsis thaliana. Kasetę zastosowaną do wywołania ekspresji inwertazy w tytoniu (von Schaewen i inni (EMBO J. 9: 3033-3044 (1990)) zastosowano także do transformowania ziemniaka. Liście transgemcznego ziemniaka również reagowały odmiennie niż poprzednie przykłady, być może z uwagi na różnice w docelowej pojemności w porównaniu z tytoniem i Arabidopsis (Heineke i inni, Plant Phys. 100:300-308 (1992)). Ponieważ wiadomo, że zależności między źródłem i tkankądocelową sąróżne w różnych gatunkach, można sądzić, że zniszczenie tej zależności może wywierać różny wpływ w zależności od gatunku rośliny, w której przeprowadzono ekspresję chimerycznego genu inwertazy.

Jeśli gatunek roślinny wpływa na powodzenie ekspresji białka FTF, to także rodzaj tkanki dla danego gatunku również wywiera znaczący wpływ na wytwarzanie fruktanu oraz ostatecznie na to, jak roślina będzie reagować na nagromadzanie się tego polimeru. Wzrost i rozwój rośliny jest zdecydowanie zależny od energii zyskanej przy wiązaniu ditłenku węgla w węglowodan w czasie fotosyntezy. W wyższych roślinach liście oraz w pewnym stopniu łodyga, stano wiąpodstawowe miejsca fotosyntezy. Natomiast inne części rośliny (np. korzenie, nasiona, bulwy) nie uczestniczą w znaczącym stopniu w syntezie węglowodanu, ale raczej są w znacznym stopniu zależne od ditlenku węgla związanego w tkankach, w których zachodzi fotosynteza. W związku z tym zachodzi przepływ energii od tkanek będących netto eksporterami (źródeł) do tkanek, które nie są netto eksporterami (docelowych). W przypadku większości roślin sacharoza jest korzystnym węglowodanem do transportu fotoasymilatów ze źródła do tkanki docelowej. Transport sacharozy do obszarów docelowych w wielu roślinach obejmuje etap transportu aktywnego (Daie, Plant Mol. Biol. Rep., 7: 106-115 (1989)). Taki układ transportu jest specyficzny dla sacharozy i z tego względu cukry heksozowe nie przemieszczają się wydajnie, ale sąreabsorbowane przez komórki mezofilu otaczające łyko (Maynard i Lucas, Plant Phys., 70: 1436-1443 (1982)). Hydroliza sacharozy zakłóca rozprowadzenie węglowodanu w roślinie, wywierając ujemny wpływ przede wszystkim na tkanki najbardziej uzależnione od importu energii. Oddziaływanie tej zależności źródło-tkanka docelowa ma nie tylko kluczowe znaczenie dla rozwoju rośliny, ale również wywiera decydujący wpływ na plon uprawy (Turgeon, Ann. Tev. Plant Physio. Plant Mol. Bio. 40: 119-138 (1989)).

Doniesiono o przykładach niekorzystnego wpływu ekspresji drożdżowego genu inwertazy (hydrolizującego sacharozę) w tkance źródłowej roślin transgenicznych (Dickinson i inni, Plant Physiol 95:420-425 (1991); Ding i inni, The Plant J., 4:179-189 (1993); Stitt i inni, Planta 183: 40-50 (1990); von Schaewen i inni (EMBO J. 9: 3033-3044 (1990). Ekspresja inwertazy drożdżowej w apoplaście stwarza wyjątkową okazję do zakłócenia i scharakteryzowania zależności

180 543 źródło-tkanka docelowa. Konstytutywna ekspresja w tkance źródłowej genu inwertazy złączonego z sekwencją ukierunkowującą na apoplast prowadzi do silnego karłowacenia, zwiększania nagromadzania się skrobi, glukozy i fruktozy w liściach, zmniejszenia aktywności fotosyntetycznej i zahamowania rozwoju korzeni w trarsgenicznym tytoniu (von Schaewen i inni (EMO J. 9: 3033-3044 (1990)) oraz w pomidorze Dickinson i inni, Plant Physiol 95: 420-425 (1991)). W przypadku ziemniaków gen inwertazy drożdżowej spowodował rozkład transportu sacharozy, co doprowadziło do objawów bardzo podobnych do stresu wodnego, a w efekcie do znaczącego zmniejszenia plonu bulw (Heineke i inni, Plant Phys. 100: 300-308 (1992)). Każdy przypadek wykazuje, że zapobieganie transportowi węgla w roślinie przez ekspresję enzymu hydrolizującego sacharozę w tkance źródłowej prowadzi do ograniczeń w rozwoju tkanki docelowej. Stitt i inni, Planta, 183:40-50 (1990) również wykazali, że zakłócenie transporty sacharozy w liściach tytoniu prowadzi do nagromadzania się węglowodanów w tej tkance, co z kolei powoduje osłabienie aktywności fotosyntezy.

Przy doborze momentu ekspresji białek metabolizujących sacharozę należy także uwzględnić zmiany stężenia sacharozy zachodzące w czasie rozwoju rośliny. Znaczenie sacharozy w tkankach również zmienia się w czasie. Przykładowo rola sacharozy w liściach docelowych jest zupełnie inna niż w liściach źródłowych. Sacharoza jest metabolizowana w liściach docelowych, aby podtrzymać wzrost. Jednakże w miarę jak liść dojrzewa, staje się netto eksporterem sacharozy. Mniej ważna dla utrzymania liścia sacharoza jest przejściowo magazynowana w wakuoli, a następnie transportowana do obszarów docelowych przez łyko. W tkankach docelowych również zachodzą zmiany w stężeniach sacharozy w czasie rozwoju. Tak np. stężenie sacharozy w słodkich melonach zmienia się w miarę jak owoc dojrzewa. We wczesnym stadium rozwoju gromadzą się cukry heksozowe, w późniejszych stadiach zwiększa się poziom sacharozy (Schaffer i inni, Phytochemistry, 26: 1883-1887 (1987)). Natomiast zawartość sacharozy spada gwałtownie w nasionach grochu wraz z postępującym rozwojem (Holi i Vose, Can. J. Plant Sci., 60: 110-1114 (1980). Stężenie sacharozy w rozwijającym się bielmie kukurydzy zwiększa się przez 8-12 do po zapyleniu, a następnie spada bardziej niż 10-krotnie w 28 dniu po zapyleniu (Tsai i inni, Plant Phys., 46: 299-306 (1970)). Stężenie sacharozy w nasionach soi zmienia się znacząco w czasie ich rozwoju, w miarę jak zdecydowanie wzrasta stężenie sacharydów rafmozowych, 53 dni po antezie (Amuti, Phytochemistry, 16:529-532 (1977)). Zmiana profilu węglowodanu w czasie rozwoju, co wykazują podane wyżej przykłady, ilustruje znaczenie doboru promotora dla specyficznej ekspresji genu w wymaganej tkance i w czasie, tak aby wykorzystać zmieniające się zasoby sacharozy.

Subkomórkowa lokalizacja ekspresji genu metabolizującego sacharozę, takiego jak inwertaza lub białko FTF, może również wywrzeć zdecydowany wpływ na linię transgeniczną. Rośliny, w których ekspresja inwertazy drożdżowej zachodzi w cytozolu, wakuoli lub w apoplaście, wykazują znaczące różnice fenotypowe w odniesieniu do subkomórkowej lokalizacji ekspresji. Transgeniczny tytońjest o wiele bardziej wrażliwy na ekspresję inwertazy w cytozolu niż w apoplaście. Wynik ten sugeruje, że ekspresja enzymów metabolizujących sacharozę w cytozolu zakłóca syntezę sacharozy (Sonnewald i inni, The Plant Journal, 1:95-106 (1991)). Doniesienia o fenotypach tytoniu, w którym ekspresja inwertazy drożdżowej zachodzi w wakuoli liści, sąmniej dramatyczne, co sugeruje, że sacharoza magazynowana przejściowo w wakuoli liści jest mniej aktywna metabolicznie niż w zasobach cytozolicznych.

Rozdział produktów asymilacji między różne przedziały komórkowe w komórce jest jednym z podstawowych czynników decydujących o wzroście i rozwoju rośliny. Wyniki uzyskane przy ekspresji enzymu metabolizującego sacharozę w różnych przedziałach transgenicznej rośliny wyraźnie wskazują na znaczenie rozdziału sacharozy między różne przedziały oraz ukierunkowania białek na rozwój i metabolizm roślin. Fenotypowe różnice, które mogąstanowić odbicie odmiennej roli spełnianej przez sacharozę w różnych przedziałach komórkowych zostały zauważone przez Sonnewalda i innych (J. Exp. Bot., 44:293-296 (1993)). Badania te wykazały także fenotypowe i biochemiczne różnice, jakie pojawiająsię w transgenicznych roślinach, w których

180 543 ekspresja inwertazy pochodzenia drożdżowego zachodzi w cytozolu, apoplaście lub w wakuoli. Różnice te zmieniają się w zależności przedziału, w którym zachodzi ekspresja inwertazy.

W wyniku cytozolicznej ekspresji inwertazy w tytoniu uzyskuje się grube, poskręcane liście, prawdopodobnie na skutek szybszego powiększania się górnej powierzchni liścia niż powierzchni dolnej. Jeśli ten sam promotor i gen skieruje się do wakuoli lub apoplastu, objawy takie wystąpiąjedynie w starszych liściach, gdzie pojawiająsię obszary zbielałe i martwicowe. Ponadto nie widać zauważalnych objawów fenotypowych różnic w młodszych liściach transgenicznych roślin z ukierunkowaniem na wakuolę, mimo iż fotosynteza jest nieznacznie intensywniejsza niż w przypadku dzikich roślin kontrolnych. Szybkość fotosyntezy w roślinach z cytozolicznie ukierunkowaną inwertaząjest niższa niż u roślin kontrolnych. Rośliny transgeniczne sąbardzo wrażliwe na inwertazę w cytozolu w porównaniu z przypadkiem ekspresji inwertazy w ściance komórki. Cytozoliczna inwertaza w komórce źródłowej bezpośrednio 'zakłóca syntezę sacharozy, podczas gdy inwertaza apoplastyczna będzie zapobiegać transportowi sacharozy. Ekspresja inwertazy w wakuoli może, ewentualnie zakłócać transport sacharozy, gdyż wykazano, że wymiana sacharozy między wakuoląi cytozolem w ilościach może być stosunkowo intensywna. Z uwagi na rolę w przemieszczaniu węgla w roślinie obecność sacharozy stwierdzono w większości tkanek oraz w wielu przedziałach subkomórkowych. Znaczenie odgrywane przez sacharozę w różnych miejscach nie zawsze jest identyczne. Przedziałowość może odgrywać rolę w sekwestracji sacharozy z enzymów metabolicznych przed transportem, a ponadto przedziały mogą służyć jako miejsca przejściowego przechowywania sacharozy, gdy zapotrzebowanie na nią maleje, albo trwałego przechowywania w pewnych gatunkach takich jak trzcina cukrowa lub burak cukrowy.

Wyraźnie widać, że uogólnione stwierdzenie odnośnie skuteczności transformowanego białka metabolizującego sacharozę, takiego jak bakteryjny FTF, w dowolnych roślinach, w dowolnych tkankach w roślinie, bez uwzględnienia etapu rozwoju, w którym zachodzi ekspresja oraz bez uwzględniania subkomórkowej lokalizacji ekspresji, może być wysoce niekorzystne. W szczególności ekspresja białka metabolizującego sacharozę w roślinie, z udziałem konstytutywnego promotora może być szkodliwa, co wykazano w przypadku pomidora (Dickinson i inni, Plant Physiol 95:420-425 (1991)). Zapobieganie transportowi produktów asymilacji w pomidorze prowadzi do deformacji liści i silnego zahamowania wzrostu. Zapewniająca powodzenie ekspresja enzymów metabolicznych tego typu musi być kontrolowana przez odpowiednie promotory specyficzne względem tkanki, z uwzględnieniem etapu rozwoju, tak aby zapewnić dostęp do odpowiednich zasobów sacharozy. Z tych samych względów istotną rolę odgrywają również sygnały ukierunkowujące na poziomie subkomórkowym. Odpowiednia kombinacja promotorów, sygnałów ukierunkowujących i transformowanych gatunków zapewniłaby właściwe nagromadzenie pożądanego produktu bez poważnych uszkodzeń rośliny. Opisano co prawda zadowalającą ekspresję heterologicznego enzymu metabolizującego sacharozę, takiego jak bakteryjny fTf, jednak z powyższej dyskusji wyjątkowo wyraźnie wynika, że ekspresja takiego białka bez narzucenia ograniczeń nie będzie gwarantować uzyskania pożądanej rośliny.

Doniesiono o przeniesieniu bakteryjnego genu FTF ze Streptococcus mutans do pomidora (zgłoszenie patentowe PCT nr WO 89/123486). Stosowana w tym badaniu kaseta ekspresji zawierała promotor syntazy mannopinowej. Syntaza mannopinowa z Agrobacterium tumefaciens jest wytwarzana w wyniku konstytutywnej ekspresji w wielu różnych roślinach (Barker i inni, Plant Mol. Biol. 2: 335-350 (1983)). Nic nie wskazuje, że promotor ten był regulowany w sposób specyficzny względem tkanki w jakiejkolwiek tkance roślinnej lub gatunku roślin. Spośród 19 transformowanych roślin zawierających kasetę bakteryjnego FTF w omawianym zgłoszeniu patentowym, w przypadku wszystkich transformantów, z wyjątkiem jednego, nastąpił rozpad genu w wyniku integracji. Spowodowało to wytworzenie obciętych transkryptów RNA, tak że nie należy oczekiwać, aby można było uzyskać białko o trwałej aktywności FTF. Jedna linia wyraźnie wytworzyła RNA o pełnej długości, z tym że nie przedstawiono danych wykazujących aktywność FTF. Jest prawdopodobne, że ekspresja FTF w cytozolu komórek w całej transgenicznej roślinie pomidora będzie niekorzystnie wpływać na wzrost i rozwój tkanki, jak to wykazano

180 543 w przypadku genu inwertazy drożdżowej w tytoniu Sonnewald i inni, The Plant Journal, 1: 95-106 (1991). Zapobieganie transportowi produktu asymilacji do komórek docelowych może przyczyniać się do niskiego stopnia powodzenia transformacji. Negatywną selekcją aktywnej ekspresji można wyjaśnić pozorne przegrupowanie genowe wykazane w tej pracy. Punktowa mutacja lub delecja jedynie kilku zasad, co nie jest niezwykłe w sytuacjach, gdy ekspresja genu wywiera niekorzystny wpływ na tkankę, może prowadzić do powstania transformantu, który wytwarza pozornie pełnej długości RNA, ale z którego w wyniku translacji nie uzyska się funkcyjnego białka FTF.

Ekspresję GTF w apoplaście pomidora przedstawiono również w zgłoszeniu patentowym PCT nr WO89/12386. Jakkolwiek rośliny wyrosły, brak jest informacji o aktywności białka w transgenicznej tkance. Może to być spowodowane niekorzystnym wpływem syntezy polimeru węglowodanowego w apoplaście komórki pomidora. Wykazano, że ekspresja inwertazy drożdżowej w apoplaście liści i łodygi wywiera niekorzystny wpływ na przepływ węgla i rozwój tkanki pomidora i tytoniu (Dickinson i inni, Plant Physiol 95: 420-425 (1991); von Schaewen i inni (EMBO J. 9: 3033-3044 (1990)). Wyjaśnienie, że niekorzystny wpływ spowodowany jest zniszczeniem transportu węgla na skutek ekspresji GTF lub FTF w tkance źródłowej pomidora, nie powinno się różnić od podanego dla inwertazy drożdżowej.

Gdyby ekspresja sukraz w opisany sposób była możliwa, nie byłoby powodów oczekiwać, że wyniki będą takie same w przypadku ekspresji w innych gatunkach. Można oczekiwać, że apoplastyczna ekspresja enzymu metabolizującego sacharozę w różnych tkankach, takich jak bielmo kukurydzy, będzie wywierać niewielki wpływ z uwagi na minimalną zawartość sacharozy w tym przedziale (Shannon, Plant Phys., 49: 203-206 (1972); Shannon, Plant Phys., 49: 198-202 (1972); Felker i Shannon, Plant Phys., 65: 864-868 (1980)). W wyniku ekspresji w apoplaście bulwy ziemniaka FTF będzie miał dostęp do sacharozy, ale równocześnie należy oczekiwać, że spowoduje to zdecydowane zahamowanie rozwoju tej tkanki. Oparka i Wright, Planta 175:520-526 (1988) wykazali, że sacharozajest przemieszczana do komórek bulwy w taktach, oraz że zmiana potencjału osmotycznego, np. na skutek hydrolizy sacharozy wywiera bardzo silny wpływ, uniemożliwiając dotarcie sacharozy do rozwijającej się bulwy (Oparka i Prior, Plant Celi. Env., 10: 667-675 (1987); Oparka i Wright, Planta, 174: 123-126 (1988)).

W W089/12386 opisano n^^eż sposób wytwarzania polimerów glukozy i fruktozy w traisgemcznych roślinach pomidora. Opisano tam ekspozycję w cytozolu, co prowadzi do destrukcji transformowanych komórek. W W098/12386 nie ujawniono insercji do wakuoli.

Nagromadzanie fruktanu w roślinie transgenicznej może stanowić atrakcyjną alternatywę w stosunku do obecnej technologii fruktozowych środków słodzących. Dotyczy to w szczególności kukurydzy, gdy polimer fruktozy nie będzie niwelować zalet uzyskiwanych w przypadku roślin zawierających sacharozę, ale raczej będzie je zwiększać. Przykładowo wytwarzanie fruktanu w kukurydzy umożliwia wykorzystanie produktów ubocznych (oleju, mąki i paszy glutenowej) przy równoczesnym zmniejszeniu olbrzymich kosztów związanych z przekształcaniem glukozy we fruktozę. W wyniku hydrolizy fruktanu na poszczególne mer^’ fruktozy można by uzyskać produkt zawierający co najmniej 99% fruktozy. Taki bardzo czysty produkt stanowi alternatywę dla niewydajnego etapu izomeryzacji i eliminuje konieczność wzbogacania fruktozy na drodze chromatografii jonowymiennej. Krystalizacja fruktozyjest znacznie uproszczona, gdy wychodzi się z materiału zawierającego ponad 99% fruktozy.

Zmniejszenie kosztów produkcji ma znaczenie nie tylko dla przemysłu środków słodzących, gdyż zastosowanie fruktozy jako surowca chemicznegojest zależne odjej dostępności, czystości i konkurencyjności cenowej. Obecnie przemysł frulktozowy może spełnić jedynie wymagania odnośnie czystości. Stany Zjednoczone są największym producentem syropów fruktozowych, ale przy tym są importerem fruktozy, bo zużycie fruktozy w produktach spożywczychjest obecnie większe niżjej produkcja. Dostępność po konkurencyjnej cenie umożliwiłaby wykorzystanie fruktozy, która łatwo ulega odwodnieniu do 5-hydroksymetylofurfuralu (HMF), jako surowca dla środków farmaceutycznych, takichjak ranitydyna lub Zantac™, obecnie najlepiej sprzedające się leki przeciwwrzodowe. HMF można także wykorzystać jako materiał

180 543 wyjściowy do wytwarzania polimerów, takich jak Kevlar™ i Nomex™, a ewentualnie również w urządzeniach optoelektronicznych z uwagi na specjalne właściwości optyczne pierścienia furanowego (Schiweck i inni, w Carbohydrates as Organie Raw Materials, Lichtenhalter (red.), VCH Press, NY, 72-82 (1992)). HMF można przekształcić w związki karbocykliczne i heterocykliczne odgrywające rolę prawie w każdej dziedzinie chemii organicznej, jeśli tylko jego lepszą czystość można będzie połączyć ze zwiększeniem produkcji i obniżeniem ceny.

Ostatnio stwierdzono, że dodatek bardzo małych ilości fruktanów do preparatów paszowych wprowadza szereg dodatnich zmian metabolicznych i fizjologicznych u zwierząt jednożołądkowych (Hashimoto i inni, patent USA nr 4 734 402 (1988); Nakamura i inni, patent USA nr 4 788 065 (1988); Fainworth i inni, Inulin and Inulin Containing Crops, Fuchs (red.), Elsevier, Amsterdam, 385-389 (1993)). Probiotyczne działanie fruktanów w paszy może być przypisane zwiększeniu populacji korzystnej mikroflory w jelicie. Zmniejszenie ilości przypadków ostrej biegunki u zwierząt oraz wzrost wydajności paszy wywiera oczywisty korzystny wpływ na produkcję zwierząt domowych. Nagromadzanie się fruktanu w ziarnie jest korzystne nie tylko z uwagi na jego wartość jako probiotyku, ale umożliwia także jego bezpośrednie użycie w gospodarstwie rolnym bez potrzeby stosowania drogich urządzeń do rozdrabniania i mieszania pasz.

Istnieje zatem zapotrzebowanie na opracowanie sposobów umożliwiających przemysłową produkcję polimerów fruktozowych, a także polimerów glukozy. FTF należą do grupy podobnych białek zwanych sukrazami, które wykazują zdolność polimeryzowania węglowodanu z wykorzystaniem sacharozy jako jedynego substratu. Białka z grupy sukraz są podobne pod wieloma względami, np. sąone katalitycznie akty wnejako monomery i nie wymagaj ądo syntezy kofaktorów lub starterów. Z uwagi na znaczne podobieństwa w tej grupie oczekuje się, że grupa białek mogłaby funkcjonować wpodobny sposóbjak chimeryczna FTF w transgenicznych roślinach. Produkt końcowy może zawierać spolimeryzowaną fruktozę w przypadku katalizowania przez FTF, przy czym glukoza może być także polimeryzowana przez sukrazy zwane glikozylotransferazami (GTF). Poszczególne GTF różnią się źródłem i działaniem, dlatego też w wyniku ich działania katalitycznego uzyskuje się różne polimery. Zidentyfikowano szereg GTF (np. alternanosukrazę, GTF-I, GTF-S i GTF-SI (Cote, Carbo. Polym., 19:249-252 (1992); Giffard i inni, J.Gen. Micro., 139:1511-1522(1993)), przy czym każdaznich katalizuje nieznacznie różniący się od innych polimer. Polimery mogą różnić się wielkością cząsteczek, typem wiązań lub układem wiązań. Podobnie jak w przypadku skrobi, także w przypadku polimeru glukozy różnice w wielkości, typie wiązań i układzie wiązań decydują o właściwościach, które wpływają na jego zastosowanie techniczne. GTF, takie jak pewne dekstranosukrazy, mogą polimeryzować glukozę z utworzeniem unikalnych wiązań, z wytworzeniem polimeru o właściwościach znacznie odmiennych od właściwości skrobi. GTF są obecnie stosowane do wytwarzania polimeru glukozy, dekstranu, bardzo cennego z uwagi na zastosowania w badaniach oraz jako objętościowy wypełniacz plazmy krwi. Produkcja na dużą skalę takich polimerów otwiera możliwości podobne do opisanych w odniesieniu do fruktanów, takie jak dostarczenie odnawialnego źródła unikalnych polimerów, zmniejszenie kosztów produkcji polimerów o znanych zastosowaniach oraz stworzenie nowych zastosowań, które w innych przypadkach nie byłyby opłacalne.

Nieoczekiwanie okazało się, iż istnieje możliwość przemysłowej realizacji w skali przemysłowej syntezy i nagromadzania polimerów fruktozy w transgenicznej roślinie, w której polimer taki w normalnych warunkach nie występuje, oraz w gatunkach roślin niezdolnych do hydrolizowania lub zmieniania jakości nagromadzonego polimeru.

Stwierdzono mianowicie, że aby zapewnić nagromadzanie się polimerów fruktozy w komórce rośliny, której komórki rodzime nie syntetyzują polimerów tego typu, oraz aby ekspresja nie spowodowała znaczących uszkodzeń tkanki, kaseta ekspresji powinna zawierać region transkrypcyjnego i translacyjnego inicjowania, działający w określonych komórkach rośliny; sekwencję kodującą gen FTF, korzystnie obejmującą sekwencje ukierunkowujące w prawidłowej ramce odczytu przy końcu 5' lub 3', które to sekwencje ukierunkowujące kierują białko FTF do siateczki śródcytoplazmatycznej, do aparatu Goldiego, a następnie do wakuoli komórki; a także obszar terminacji transkrypcyjnej. To właśnie odkrycie stanowi podstawę wynalazku.

Tak więc zakresem wynalazku jest objęty zrekombinowany konstrukt DNA zawierający promotor specyficzny względem tkanki wybrany z grupy obejmującej SEQ ID NO: 2,3,14 i 15, operacyjnie połączony z sekwencją ukierunkowującą na wakuolę wybranąz grupy obejmującej SEQ ID NO: 6,7,9 i 10, operacyjnie połączonąz sekwencjąkodującąbakteryjny gen lewanosukrazy wybraną z grupy obejmującej SEQ ID NO: 1, 4 i 5, a także zrekombinowany konstrukt DNA zawierający promotor specyficzny względem tkanki wybrany z grupy obejmującej SEQ ID NO: 2, 3, 14 i 15, operacyjnie połączony z sekwencją ukierunkowującą na wakuolę wybraną z grupy obejmującej SEQ ID NO: 6,7,9 i 10, operacyjnie połączonąz sekwencją kodującą gen lewanosukrazy EC 2.4.1.10.

Ponadto zakresem wynalazku objęty jest sposób wytwarzania fruktanu, zgodnie z którym hoduje się rośliny wybrane z grupy obejmującej kukurydzę, ziemniaki i tytoń, zbiera się te rośliny i ekstrahuje się fruktan z zebranych roślin, charakteryzujący się tym, że hoduje się, zbiera i poddaje ekstrakcji rośliny stransformowane zrekombinowanym konstruktem DNA zawierającym promotor specyficzny względem tkanki wybrany w grupy obejmującej SEQ ID NO: 2, 3,14 i 15, operacyjnie połączony z sekwencją ukierunkowującą na wakuolę wybranąz grupy obejmującej SEQ ID NO: 6,7,9 i 10, operacyjnie połączonąz sekwencjąkodującą bakteryjny gen lewanosukrazy wybranąz grupy obejmującej SEQ ID NO: 14 i 5.

Zakresem wynalazku objęty jest także sposób zwiększania poziomu fruktanu w roślinach, charakteryzujący się tym, że komórki rośliny transformuje się zrekombinowanym konstruktem DNA zawierającym promotor specyficzny względem tkanki wybrany z grupy obejmującej SEQ ID NO: 2,3,14 i 15, operacyjnie połączony z sekwenjjąukierunkowującąna wakuolę wybranąz grupy obejmującej SEQ ID NO: 6,7,9 i 10, operacyjnie połączonąz sekwencją kodującą bakteryjny gen lewanosukrazy wybranąz grupy obejmującej SEQ ID NO: 14 i 5, po czym z tej stransformowanej komórki hoduje się płodną, dojrzałą płciowo stransformowaną roślinę.

Tym sposobem korzystnie transformuje się komórki kukurydzy.

Konstrukty i sposoby według wynalazku umożliwiająnagromadzanie polimerów fruktozy w transgemcznych roślinach poprzez specyficzną względem tkanek i subkomórkową ekspresję genu lewanosukrazy wykorzystującego sacharozę jako jedyny substrat oraz nie wymagającego kofaktorów lub dostarczanych z zewnątrz starterów. Pozwalaj ąone na uzyskanie pożądanego poziomu sacharozy w konkretnej komórce, odpowiedni czas ekspresji genu, specyficzną względem tkanek ekspresję w gatunkach roślin oraz subkomórkową lokalizację ekspresji. Te cechy, decydujące o korzyściach płynących z wynalazku, nie były dotychczas ani opisane, ani nawet rozważane w znanych publikacjach.

Zgodna z wynalazkiem kombinacja promotorów specyficznych względem tkanek, sekwencji ukierunkowującej na wakuolę, sekwencji kodującej gen lawanosukrazy umożliwiła opracowanie sposobu wytwarzania i nagromadzania polimerów fruktozy, który można wykorzystać również w odniesieniu do innych polimerów syntetyzowanych przez białka z rodziny enzymów sukrazowych. Opisany sposób można zastosować do modyfikacji roślin uprawnych, które gromadzą znaczne ilości sacharozy, takich jak burak cukrowy i trzcina cukrowa. Ponadto sposobem według wynalazku można ulepszyć rośliny uprawne zawierające fruktan, takie jak cykoria i karczochjerozolimski. Dzięki wynalazkowi można na masową skalę i po zmniejszonych kosztach produkować fruktany, które znajdujązastosowanie jako środki słodzące, sąpolimerami korzystnie wpływającymi na ludzkie zdrowie (Hidaka i Hirayama, Biochem. Soc. Trans., 19: 561-565 (1991)), probiotykami stosowanymi w przemyśle paszowym (patent Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4734402; patent Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4788065; i surowcami chemicznymi do stosowania w nowych dziedzinach, których nie można by inaczej w sposób opłacalny rozwijać (Fuchs, Starkę, 39:335-342 (1981); Fuchs, Biochem, Soc. Trans., 19: 555-560 (1991)). Wykazano przy tym, że gromadzenie fruktanów nie jest szkodliwe dla wzrostu i rozwoju roślin transgemcznych ofaz ich zdolności do rozmnażania.

Poniżej wyjaśniono znaczenia stosowanych w opisie określeń.

W użytym w opisie znaczeniu określenia „promotor” i „obszar promotora” dotyczą sekwencji DNA, zazwyczaj w górę (5') względem sekwencji kodującej genu strukturalnego, która

180 543 reguluje ekspresję obszaru kodującego poprzez zapewnienie rozpoznawania polimerazy RNA i/lub innych czynników niezbędnych do zainicjowania transkrypcji we właściwym miejscu. Sekwencje promotora są niezbędne, ale nie zawsze wystarczają do uruchomienia ekspresji genu. „Fragment promotora” stanowi frakcję sekwencji dNa obszaru promotora. „Obszar końcowy 3 (lub „koniec 3'”) oznacza tą część sekwencji DNA obejmującej gen z wyłączeniem sekwencji 5', która uruchamia zainicjowanie transkrypcji, oraz strukturalnej części genu, która zawiera sygnał poliadenylowania i dowolnych innych sygnałów regulacyjnych.zdolnych do wpływania na przetwarzanie informacyjnego RNA (mRNA) lub na ekspresję genu. Sygnał poliadenylowania zazwyczaj charakteryzuje się tym, że wpływa na addycję ścieżek polikwasu adenylowego do końca 3' prekursora mRNA. Sygnały poliadenylowania są zazwyczaj rozpoznawane dzięki obecności homologii względem postaci kanonicznej 5'-AATAA-3', choć 'różne warianty nie należą do rzadkości.

„Kwas nukleinowy” oznacza dużą cząsteczkę, która może być 'jedno- lub dwuniciową, złożoną z monomerów (nukleotydów) zawierających cukier, fosforan i purynę lub pirymidynę. W wyższych roślinach kwas dezoksyrybonukleinowy (DNA) stanowi materiał genetyczny, podczas, gdy kwas rybonukeinowy (RNA) pośredniczy w przekazywaniu informacji z DNA do białka. Określenie „sekwencja nukleotydów” oznacza polimer DNA lub RNA, który może być jedno lub dwuniciowy, ewentualnie zawierający syntetyczne, nienaturalne lub zmodyfikowane zasady nukleotydowe, które mogą wbudowywać się do polimerów DNA lub RNA.

„Transkrypt RNA” oznacza produkt uzyskany w wyniku katalizowanej przez polimerazę RNA transkrypcji sekwencji DNA. Transkrypt RNA może być idealną komplementarną kopią sekwencji DNA (jest wówczas określany jako transkrypt pierwotny), albo może stanowić sekwencję RNA pochodzącą z potranskrypcyjnej obróbki transkryptu pierwotnego (jest wówczas określany jako dojrzały RNA).

W użytym w opisie znaczeniu „gen” oznacza sekwencję DNA, która koduje określone białko. Gen „natywny” oznacza gen występujący w przyrodzie. Gen „chimeryczny” oznacza gen · zawierający heterologiczne sekwencje regulacyjne i/lub kodujące. Gen „mutantowy” oznacza gen ze zmianami w sekwencji nukleotydów, która różni się od sekwencji występującej w przyrodzie. Mogą one być zamierzone lub przypadkowe i powodują zmianę aktywności, z tym że nie muszą zmieniać produktu genu.

W użytym w opisie znaczeniu „odpowiednia” lub „przydatna” sekwencja regulacyjna oznacza sekwencję nukleotydów zlokalizowaną w górę (5₃, wewnątrz lub w dół (3) względem sekwencji DNA dla produktu wybranego genu, którego transkrypcja i ekspresjajest kontrolowana przez sekwencję regulacyjną, potencjalnie w połączeniu z aparatem biosyntezy białka w komórce. „Regulacja” lub „regulowanie” odnosi się do modulowania ekspresji genu zainicjowanej przez elementy sekwencji DNA zlokalizowane przede wszystkim, ale nie wyłącznie w górę (5') startu transkrypcji genu. Wynikiem regulacji może być pełna reakcja na pobudzanie lub jej brak, albo też może ona powodować zmiany w poziomie ekspresji genu. „Ekspresja konstytutywna” oznacza ciągłą ekspresję bez względu na zmiany w bodźcu inne niż wymagane do jej regulowania.

„Reagujący” lub „reakcja” w użytym w opisie znaczeniu odnosi się do zmiany w poziomie ekspresji regulowanego promotora lub genu po zastosowaniu bodźca środowiskowego.

Określenie „sekwencja kodująca” odnosi się do tej części genu, która koduje białko, polipeptyd lub jego część, z wyłączeniem sekwencji regulacyjnych, które uruchamiają inicjowanie transkrypcji. Sekwencję kodującąmoże stanowić sekwencja normalnie występująca w komórce, albo też może to być sekwencja nie występująca normalnie w danym miejscu komórki; w takim przypadku jest ona określana jako „gen heterologiczny”. Gen heterologiczny może pochodzić w całości lub w części z dowolnego znanego źródła, takiego jak genom łub episom bakteryjny, eukariotyczny jądrowy lub plazmidowy DNA, cDNA lub chemicznie syntetyzowany DNA. Gen strukturalny może stanowić nieprzerwany obszar kodujący, albo też może obejmować jeden lub więcej intronów połączonych odpowiednimi rozszczepialnymi połączeniami. Gen strukturalny

180 543 może stanowić kompozyt segmentów pochodzących z różnych źródeł, występujących w naturze lub syntetycznych.

Określenie „rekombinantowy konstrukt DNA” lub po prostu „konstrukt” dotyczy sekwencji plazmidowej, wirusowej lub ulegającej automatycznej replikacji, sekwencji fagowej lub nukleotydowej, liniowej lub kolistej, jedno- albo dwuniciowego DNA lub RNA, pochodzącej z dowolnego źródła, w której szereg sekwencji nukleotydów została połączona lub zrekombinowana w unikatowąkonstrukcję zdolnądo wprowadzania fragmentu promotora i sekwencji DNA dla produktu wybranego genu, wraz z odpowiednią sekwencją 3', która nie uległa translacji, do komórki rośliny.

W użytym w opisie znaczeniu określenie „roślina” odnosi się do całej rośliny oraz do tkanek pochodzenia roślinnego. „Tkanki pochodzenia roślinnego” oznaczają zróżnicowane i niezróżnicowane tkanki roślin, obejmujące, ale nie wyłącznie, korzenie, pędy, liście, pyłki, zalążki, bulwy, nasiona oraz różne formy komórek w hodowli takie jak komórki nienaruszone, protoplasty, zarodki i tkanki twardziny. Tkanki pochodzenia roślinnego mogą znajdować się w roślinie, w organie, w tkance lub w hodowli komórek. „Roślina jednoliścienna” oznacza roślinę, której nasiona zawierają tylko jeden liścień, albo organ lub zarodek, który przechowuje i wchłania pokarm. „Roślina dwuliścienna:” oznacza roślinę, której nasiona zawierajądwa liścienie. W użytym w opisie znaczeniu określenie transformacja dotyczy procesów, w których komórki, tkanki lub rośliny nabywająwłaściwości kodowanych przez cząsteczkę kwasu nukleinowego, która została przeniesiona do komórki, tkanki lub rośliny. „Przenoszenie” dotyczy sposobów przenoszenia DNA do komórek, obejmujących, ale nie wyłącznie, mikroiniekcję oraz zapewnianie przepuszczalności błony komórkowej w wyniku różnych obróbek fizycznych (np. elektroporacja) lub chemicznych (np. zastosowanie glikolu polietylenowego, PEG).

Określenie „operacyjnie połączony” dotyczy chemicznej fuzji dwóch lub więcej fragmentów DNA przy zachowaniu odpowiedniej orientacji, tak że fuzja zachowuje lub stwarza właściwą ramkę odczytu, albo umożliwia właściwą regulację ekspresji sekwencji DNA po przeniesieniu do komórek roślinnych.

Określenie „ekspresja” oznacza transkrypcję i/lub translację na produkt genu z genu kodującego sekwencję produktu genu. W ekspresji łańcuch DNA kodujący sekwencję produktu genu jest najpierw traiskiybowany. na komplementarny RNA, którym jest często mRNA, a następnie z tak transkrybowanego mRNA uzyskuje się w wyniku translacji wyżej wspomniany produkt genu, jeśli produktem genu jest białko. Ekspresja konstytutywna, która jest dodatkowo wzmocniona przez kontrolowany z zewnątrz fragment promotora, tak że powstaje szereg kopii mRNA i duże ilości produktu wybranego genu, określana jest jako „nadprodukcja”. W użytym w opisie znaczeniu określenie „kaseta ekspresji” oznacza konstrukt DNA zawierający obszar promotora operacyjnie połączony z sekwencjąkodującą, którajest .operacyjnie połączona z końcem 3', tak że całość może ukierunkowywać mRNA obszaru kodującego, w wyniku czego zachodzi synteza produktu białkowego w tkance roślinnej.

„Kodon startu translacji” lub „kodon inicjacyjny” oznacza jednostkę złożoną z trzech nukleotydów (kodon) w sekwencji kwasu nukleinowego, która określa inicjowanie syntezy białka.

Określenie „peptyd sygnałowy” dotyczy N-końcowego fragmentu polipeptydu, który ulega translacji w połączeniu z polipeptydem tworzącym białko prekursora i który jest niezbędny dla jego wejścia na drogę wydzielniczą. Peptyd sygnałowy może być rozpoznawany przez mechanizmy wewnątrz tego samego gatunku lub w nie spokrewnionych gatunkach roślin, niezbędne do skierowania peptydu na drogę wydzielniczą. Peptyd sygnałowy może być aktywny w nasionach, liściach, bulwach lub innych tkankach komórki. Określenie „sekwencja sygnałowa” odnosi się do sekwencji nukleotydów kodującej peptyd sygnałowy. Określenie „sygnał ukierunkowujący na wakuolę” odnosi się do N-końcowego fragmentu polipeptydu, który ulega translacji w połączeniu z polipeptydem tworzącym białko prekursora i który jest niezbędny dla jego ostatecznego wejścia do wakuoli komórki. Sygnał ukierunkowujący na wakuolę może być rozpoznawany przez mechanizmy wewnątrz tego samego gatunku lub w nie spokrewnionych gatunkach roślin, niezbędne do skierowania peptydu do wakuoli komórki. Sygnał ukierunko16

180 543 wujący na wakuolę może być aktywny w nasionach, liściach, bulwach lub innych tkankach komórki. Określenie „sekwencja ukierunkowująca na wakuolę” odnosi się do sekwencji nukleotydów kodującej sygnał ukierunkowujący na wakuolę. „Wakuola” oznacza otoczony błonąprzedział komórki roślinnej o zmiennej wielkości, działaniu i zawartości. Wakuola może zawierać metabolity komórkowe, a liczba wakuoli może być różna w różnych komórkach lub w komórkach różnych tkanek.

„Promotor specyficzny względem tkanki” oznacza sekwencję DNA zawierającą sygnały rozpoznawania dla polimerazy RNA i/lub inne czynniki niezbędne do uruchomienia transkrypcji, kontrolujący ekspresję sekwencji kodującej dokładnie w pewnych tkankach lub wpewnych komórkach tkanki. Ekspresja w sposób specyficzny względem tkanki może zajść tylko w określonych tkankach lub komórkach w tkankach albo w kombinacjach tkanek. Przykładowo, ale nie wyłącznie, wymienić można ekspresję organiczną do tkanek w liściach, a nie w innych tkankach rośliny, albo w jedynie w płatkach, zalążkach i pręciku, a nie w innych tkankach rośliny.

„Dziedziczność” odnosi się do zdolności rośliny do dojrzewania, płciowo lub bezpłciowo, wytworzenia nasion lub innych elementów zdolnych do przekazaniajej zawartości genetycznej, w całości lub w części, na potomstwo. Zawartość genetyczna potomstwa jest odpowiedzialna za wzrost i rozwój nowej rośliny o właściwościach lub cechach podobnych lub takich samych jak w przypadku rośliny macierzystej.

„Lewanosukraza” oznacza białko kodowane przez jeden lub więcej organizmów, wykazujące zdolność syntetyzowania polimeru węglowodanowego zawierającego mery fruktozy, z wykorzystaniem sacharozy jako substratu. Mery fruktozy mogą być połączone wiązaniami β2-1 lub β2-6, albo z wykorzystaniem kombinacji obydwu typów połączeń. Białko to może być również określane jako „fruktozylotransferaza” (FTF) lub białko o aktywności FTF. Polimer z merami fruktozy może zawierać jednąresztę końcową glukozy, pochodzącąod cząsteczki sacharozy, oraz co najmniej dwie reszty fruktozy. Polimer z merami fruktozy, w dowolnej formie, z dowolną kombinacją wiązań oraz o dowolnej liczbie merów fruktozy, określany jest ogólnie jako fruktan. „Gen lewanosukrazy” oznacza sekwencję DNA kodującą białko lewanosukrazy.

„Dekstranosukraza” oznacza białko kodowane przezjeden lub więcej organizmów, wykazuj ące zdolność katalizowania polimeryzacji prowadzącej do polimeru węglowodanowego zawierającego mery glukozy, połączone wyłącznie wiązaniami α1-6 lub α1-3, albo z wykorzystaniem kombinacji obydwu typów połączeń. Białko to może być również określanejako „glukozylotransferaza” (GTF) lub białko o aktywności GTF. Polimer może zawierać co najmniej dwie reszty glukozy i określany jestjako dekstran. „Gen dekstranosukrazy” oznacza sekwencję DNA kodującą białko dekstranosukrazy.

„Polimer węglowodanowy” różniący się od właściwych dekstranów tym, że zawiera mery glukozy połączone na przemian wiązania α1-6 i α1-3, określany jest jako „alteman”. Produkt białkowy zdolny do katalizowania reakcji, w wyniku której następuje synteza altemanu, określany jest jako „altemanosukraza”. „Gen altemanosukrazy” oznacza sekwencję DNA kodującą białko altemanosukrazy.

Określenie „niekorzystny wpływ” oznacza bezpośrednie lub pośrednie działanie uszkadzające roślinę w wyniku nagromadzania fruktanu, tak że roślina lub komórka roślinna nie może spełniać pewnych funkcji obejmujących, ale nie wyłącznie syntezę i transport węglowodanów w komórce i przez roślinę, odtwarzanie transgemcznych roślin lub tkanki, rozwój rośliny lub komórki roślinnej do stanu dojrzałego, albo zdolność do przenoszeniajednej lub więcej pożądanych cech na potomstwo.

„Selektywna ekspresja” dotyczy ekspresji zachodzącej prawie wyłącznie w określonych organach rośliny obejmujących, ale nie wyłącznie, liście, bulwy lub nasiona. Określenie może również dotyczyć ekspresji w określonych stadiach rozwoju organu, takich jak wczesna lub późna embriogeneza. Ponadto „selektywna ekspresja” może dotyczyć ekspresji w określonych subkomórkowych miejscach w komórce, takich jak cytozol lub wakuola.

Określenie „poziom sacharozy wyższy od naturalnego” odnosi się do komórki o zwiększonej zawartości sacharozy w odniesieniu naturalnego zakresu występującego w komórkach dzi180 543 kich roślin tego samego gatunku. Zwiększona zawartość sacharozy może wystąpić w dowolnym stadium rozwoju komórki na skutek naturalnej mutacji lub manipulacji transgenicznej genu lub genów w komórce. Zwiększona ilość sacharozy może gromadzić się w całej komórce lub w określonych przedziałach subkomórkowych. Przykład rośliny o zwiększonej, w porównaniu z naturalną, wielkości sacharozy stanowi, ale nie wyłącznie, endosperma standardowych słodkich lub supersłodkich linii kukurydzy, w porównaniu z kukurydzą naturalną czyli „końskim zębem”. Stężenie sacharozy w liniach kukurydzy określanych jako „koński ząb” osiąga maksimum w 15-18 dni po zapyleniu i dochodzi do 4-8% suchej masy jądra nasiona. Zawartość sacharozy spada do ostatecznego stężenia wynoszącego w dojrzałych jądrach nasion 0,5 - 1,5% suchej masy. Do linii o wyższej zawartości należy, ale nie wyłącznie, zwykła słodka kukurydza (su) oraz odmiany supersłodkie (sh2, bt2, su/se itp.). Zawartość sacharozy w zwykłej słodkiej odmianie osiąga poziom dwukrotnie większy niż w końskim zębie na tym samym stadium rozwoju. Linie supersłodkie wykazują 3-4 wyższy poziom sacharozy niż koński ząb na tym samym stadium dojrzałości.

Techniki rekombinancji DNA wykorzystywane w wynalazku są znane specjalistom i ogólnie opisane w pracy Maniatisa i innych, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982).

Enzymatyczna obróbka DNA

Bufory do trawienia enzymami resttykcyjnymi stosowano w warunkach podanych przez producentów poszczególnych enzymów. Enzymu dodawano w ilości 5-10 jednostek/pg DNA i mieszaninę reakcyjną, doprowadzano do ostatecznej objętości wodą. Mieszaninę reakcyjnąinkubowano w odpowiedniej temperaturze przez około 2 godziny. Ligowanie DNA z odpowiednimi ilościami wektora i insertu prowadzono w sposób zaproponowany w pracy Maniatisa i innych, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982). Zastosowano warunki reakcji ligowania DNA podane przez producenta ligazy T4 DNA (Bethesda Research Laboratory, Gaithersburg, MD).

Elektroforeza żelowa DNA

Elektroforezę DNA na żelu agarozowym prowadzono w 0,7% żelach agarozowych stosując bufor Tris-boran-EDTA (TBE) o składzie 89 mM Tris, 89 mM boran (pH 8,3) i 2,5 mM EDTA. Elektroforezę prowadzono pod napięciem 50 lub 150 V, zależnie od ilości DNA/ścieżkę i wymaganego czasu trwania próby. Po elektroforezie żel barwiono dodając 1 pg/ml bromku etydiowego i DNA wizualizowano za pomocą transluminatora w nadfiolecie. DNA wydzielano z żeli stosując materiały i sposoby dostarczone wraz z zestawem Gene Clean, produkowanym przez BIO-1-1.

Wydzielanie i oczyszczanie plazmidów

Komórki E. coli (zamrożone komórki kompetencyjne HB101, dostarczone z BRL), zawierające transformowane plazmidy hodowano przez noc w 37°C w 500 ml ośrodka LB (10 g baktotryptonu, 5 g ekstraktu drożdżowego i 10 g chlorku sodowego) zawieraj ącego 100 pg/ml ampicyliny. Plazmid wydzielano i oczyszczano z wykorzystaniem procedur opisanych przez producenta, stosując układ oczyszczania Promega Maxi-Prep DNA.

Opisy sekwencji mogą zawierać jednoliterowe kody aminokwasów określone w 37 C.F.R. 1.822, który wprowadza się jako źródło literaturowe.

Sekwencja SEQ ID NO: 1 stanowi częściową sekwencję nukleotydów genu SacB FTF Bacilius amyloliąuifaciens. Ta sekwencja o 31 bp obejmuje obszar miejsca prokariotycznego rozszczepienia sygnału. Sekwencję SEQ ID NO.: 1 zmodyfikowano tak, że zawiera ona miej sce rozpoznawania sekwencji dla enzymu restrykcyjnego E-CoRV, zaczynające się od nukleotydu 13. Zaprojektowana w celu wykorzystania w ukierunkowanej mutagenezie DNA taka sekwencja nukleotydów będzie dodawać unikatowe miejsce EcoRV, jeden kodon 3' od sygnału rozczepiania.

Sekwencja SEQ ID NO: 2 stanowi częściową sekwencję nukleotydów tytoniowego obszaru promotora SSU. Nukleotyd o 21 bp jest w położeniu 5' względem unikatowego miejsca BglIII

180 543 w obszarze promotora i jest przydatny jako starter 5'-3' w subklonowaniu części obszaru promotora metodą PCR.

Sekwencja SEQ ID NO: 3 stanowi częściową sekwencję nukleotydów tytoniowego obszaru promotora SSU. Sekwencja ta stanowi uzupełnienie 3-5' obszaru promotora SSU i została zmodyfikowana tak, że zawiera miejsca rozpoznawania sekwencji dla enzymów restrykcyjnych EcoRV iNcol zaczynające się odpowiednio przy nukleotydów7 i 12. Kodon ATG miejscaNvcoI w tej sekwencji o 32 bp jest kodonem inicjacyjnym dla natywnego genu SSU. Sekwencja oligonukleotydowa została zaprojektowana w celu subklonowania części promotora SSU w reakcji PCR, gdy stosuje sięją w kombinacji ze starterem wymienionymjako sekwencja SEQ ID NO: 2.

Sekwencja SEQ ID NO: 4 jest częściową sekwencjąDNA genu SacB FTF Bacilius amyloliguifaciens. Sekwencja oligonukłeotydowa odpowiada obszarami genu SacB o 31 bp, 3' od sygnału rozszczepienia prokariotycznego ij est przydatnaj ako starter PCR w wykrywaniu obecności genu (genów) SacB zintegrowanych w genomowym DNA.

Sekwencja SEQIDNO: 5 jest częściową sekwencjąDNA genu SacB FTF Bacilius amyloliąuifaciens. Sekwencja ta stanowi uzupełnienie 3-5' zwykłej sekwencji DNA SacB. W sekwencji.tej o 23 bp od nukleotydu 1 znajduje się miejsce rozpoznawania dla enzymu restrykcyjnego Sali. Natywna sekwencja SacB rozpoczyna się od nukleotydu 6. Oligonukleotyd ten zaprojektowano w tym celu, aby zastosować w reakcji PCR z sekwencją SEQ ID NO: 4.

Sekwencja SEQ ID NO: 6 stanowi częściową sekwencję DNA genu sporaminy (gromadzonego białka słodkiego ziemniaka). Ta sekwencja o 142 bp stanowi N-końcowy prepro- i pro-peptyd sygnału ukierunkowującego na wakuolę. Sekwencję zmodyfikowano tak, że kodon inicjacyjny znajduje się w miejscu rozpoznawanym przez enzym restrykcyjny BspHI, rozpoczynającym się od nukleotydu 14. Miej sce dla enzymu restrykcyjnego Spel jest kodowane przez nukleotydy od 1 do 6, a miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne Ncol i XhoI są zlokalizowane odpowiednio przy nukleotydach 130-136 i 137-142.

Sekwencja SEQ ID NO: 7 stanowi częściową sekwencję genu sporaminy. Sekwencja ta jest w orientacji 3'-5' względem zwykłej sekwencji DNA i stanowi idealne uzupełnienie sekwenęj i SEQ ID NO: 6. Taki nukleotyd o 142 bp zaprojektowano w celu przeprowadzenia hybrydyzacji z sekwencją SEQ ID NO.: 6 z utworzeniem kasety syntetycznego DNA, sekwencji DNA sporaminy. Sekwencja SEQ ID NO: 6 stanowi częściową sekwencję DNA sporaminy, ukierunkowującej na wakuolę, z miejscami rozpoznawanymi przez enzymy restrykcyjne wymienionymi w opisie sekwencji SEQ ID NO: 6. Miejsca dla enzymów są przydatne przy subklonowaniu.

Sekwencja SEQ ID NO: 8 stanowi sekwencję aminokwasów ukierunkowującego na wakuolę peptydu sporaminy słodkiego ziemniaka, kodowaną przez oligonukleotydy wymienione w sekwencji SEQ IDNO: 6 i sekwencji SEQ IDNO: 7. Prepro-peptyd rozpoczyna się od aminokwasu 1 i rozciąga się do aminokwasu 21. Prop-peptyd reprezentują aminokwasy 22-37. Pełny prepropeptyd, operacyjnie połączony z natywnym lub obcym białkiem, będzie kierować białko do wakuoli komórki roślinnej.

Sekwencja SEQ ID NO: 9 stanowi częściową sekwencję nukleotydowagenu lektyny jęczmienia (Bednarak i Raikhel, The Plant Celi, 3:1195-1206 (1992); Dombrowski i iiini, The Plant Celi, 5:587-596 (1993)). Ta sekwencja o 56 bp zawiera informację kodującą dla C-końcowej sekwencji lektyny jęczmienia, ukierunkowującej na wakuolę. Sekwencję DNA zmodyfikowano tak, że miejsca rozpoznawania dla enzymów restrykcyjnych HincII i B-glIII są kodowane odpowiednio przez nukleotydy 4-9 i 51 -56.

Sekwencja SEQ ID NO: 10 sta^^^,wi częściową sekwencję nułdeotydowągenu lektyny jęczmienia. 56 nukleotydów tej sekwencji stanowi idealne uzupełnienie sekwencji SEQ IDNO: 9, tak że w wyniku ich .hybrydyzacji powstaje fragment DNA, który może być trawiony enzymami restrykcyjnymi po subklonowaniu w odpowiednich wektorach ekspresji.

Sekwencja SEQ ID NO: 11 stanowi, sekwencję 15 aminokwasów C-końcowego ukierunkowującego na wakuolę peptydu lektyny jęczmienia. Sekwencja ta kodowanajest przez oligonukleotydy wymienione w sekwencji SEQ ID NO: 9 i sekwencji SEQ ID NO.: 10. Peptyd ten,

180 543 operacyjnie połączony z natywnym lub obcym białkiem, będzie kierować sortowaniem tego białka z ER do wakuoli komórki roślinnej.

Sekwencja SEQ ID NO: 12 stanowi częściową sekwencję nukleotydowągenu laktyny jęczmienia (Bednarak i Raikhel, The Plant Celi, 3: 1195-1206 (1992); Dombrowski i inni, The Plant Celi, 5:587-596 (1993). Ta sekwencja o 38 bp jest przydatnajako starter PCR w uzyskiwaniu N-końcowego sygnału wydzielniczego genu lektyny jęczmienia. Starter ten hybrydyzuje z końcem 5' sekwencji sygnałowej i zawiera miejsce rozpoznawane przez enzym restrykcyjny EcoRI, zaczynające się od nukleotydu 7. Miejsce EcoRl jest przydatne przy subklonowaniu. Sekwencja zawiera ponadto miejsce rozpoznawane przez BspHI przy nukleotydach 14-19. Miejsce to jest przydatne przy subklonowaniu fragmentów DNA w ramce kodonem inicjacyjnym zlokalizowanym przy nukleotydach 16-18.

Sekwencja SEQ ID NO: 13 stanowi częściową sekwencję nukleotydowągenu lektyny jęczmienia. Ta sekwencja o 38 bp jest przydatna jako starter PCT w uzyskiwaniu N-końcowego sygnału wydzielniczego genu lektyny jęczmienia. Sekwencje rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne SaII i NcoI są kodowane odpowiednio przez nukleotydy 1-6 i 6-11. Ta sekwencja DNA stanowi odwrotne uzupełnienie DNA lektyny jęczmienia i jest przeznaczona do stosowania w reakcji PCR ze starterem wymienionym jako sekwencja SEQ ID NO: 12. Fragment DNA odzyskany z reakcji PCR przy stosowaniu starterów z sekwencji nr 12 i sekwencji nr 13 wystarcza do skierowania natywnego lub operacyjnie połączonego obcego białka do układu wydzielniczego komórek roślinnych.

Sekwencja SEQ Id NO: 14 stanowi częściową sekwencję DNA specyficznego dla bulw ziemniaka białka patatyny. Sekwencja o 20 bp odpowiada obszarami promotora 1,0 kb, 5' od kodonu inicjacyjnego.

Sekwencja SEQ ID NO: 15 stanowi częściową sekwencję DNA specyficznego dla bulw ziemniaka białka patatyny. Sekwencja o 22 bp stanowi odwrotne uzupełnienie sekwencji DNA patatyny, tak że po jej zastosowaniu w reakcji PCR wraz ze starterem wymienionym jako sekwencja SEQ ID NO: 14 uzyskać można fragment DNA o 1,0 kb, zawierający niezbędne sekwencje regulacyjne dla ekspresji genu specyficznego dla bulwy. Sekwencja zawiera miejsce rozpoznawane przez enzym restrykcyjny Ncol obejmujące natywny kodon inicjacyjny (nukleotydy 1-6).

Sekwencja SEQ ID NO: 16 stanowi częściową sekwencję DNA magazynowanego wysokosiarkowego białka, zeiny (Kirihara i inni, Gene, 71: 359-370 (1988)). SekwencjaDNA o 25 bp zawiera miejsce rozpoznawane przez enzym restrykcyjny EcoRV, rozpoczynające się nukleotydem 20.

Sekwencja SEQ ID NO: 17 stanowi częściową sekwencję DNA magazynowanego wysokosiarkowego białka, zeiny. Ta sekwencja o 30 bp zawiera miejsce rozpoznawane przez enzym restrykcyjny XbaI, zlokalizowane przy nukleotydach 6-11. Sekwencja SEQIDNO: 16i sekwencja SEQ ID NO: 17 przeznaczone są do równoczesnego stosowania w reakcji PCR, z której fragment DNA o 1,4 Kb, zawierający część obszaru promotora zeiny o 10 kd i sekwencję kodującą można wydzielić i subklonować w odpowiednim wektorze, wykorzystując miejsca restrykcyjny EcoRV i XbaI.

Sekwencja SEQ ID NO: 18 stanowi częściową sekwencję DNA magazynowanego wysokosiarkowego białka, zeiny. Ta sekwencja DNA o 30 bp przeznaczona jest do stosowania w reakcji PCR, w której uzyskać można część genu zeiny o 10 Kd.

Sekwencja SEQ ID NO: 19 stanowi częściową sekwencję DNA magazynowanego wysokosiarkowego białka, zeiny. Ta sekwencjaDNA o 32 bp zawiera miejsce rozpoznawane przezenzym restrykcyjny BamHI zlokalizowane przy nukleotydach 6-11. Sekwencja SEQ ID NO: 19 i sekwencja SEQ ID NO: 18 są przeznaczone do stosowania jako zestaw starterów PCR, dzięki czemu uzyskać można fragment DNA o 1,39 Kb, zawierający część genu zeiny. Fragment DNA można subklonować w odpowiednim wektorze przy wykorzystaniu tępego miejsca enzymu restrykcyjnego i miejsca BamHI.

180 543

Sekwencja SEQ ID NO: 20 stanowi częściową sekwencję DNA magazynowanego wysokosiarkowego białka, zeiny. Ta sekwencja dNa zawiera 13 bp i jest stosowana jako adaptor, tak że unikatowe miejsce rozpoznawane przez enzym restrykcyjny Smal można wprowadzić do genu zeiny o 10 Kd. Miejsce rozpoznawane przez Smal rozpoczyna się od nukleotydu 5 tej sekwencji DNA.

Sekwencja SEQ ID NO: 21 stanowi częściową sekwencję DNA magazynowanego wysokosiarkowego białka, zeiny. 13 bp tej sekwencji DNA stanowi częściowe uzupełnienie sekwencji DNA przedstawionej jako sekwencja SEQ iD NO: 20. Dwie sekwencje dNa po hybrydyzacji tworzą unikatowe miejsce rozpoznawane przez enzym restrykcyjny Smal, przydatne przy subklonowaniu.

Stosowany w wykazie sekwencji skrót „Sekw. ID nr” jest równoważny skrótowi SEQ ID NO. i tak jak on oznacza „sekwencję o numerze identyfikacyjnym”.

W sposobie według wynalazku komórki roślinne sątransformowe kasetą ekspresji zawierająca odpowiednie sekwencje regulacyjne i ukierunkowujące, w wyniku czego następuje gromadzenie fruktanu w wakuoli nasion lub bulw dorosłej rośliny. Kaseta ekspresji zawiera obszar promotora. Do korzystnych obszarów promotora należy specyficzny względem tkanki promotor zeiny o 10 kD i specyficzny względem tkanki obszar promotora patatyny. Obszar promotora jest funkcyjnie połączony z obszarem kodującym chimerycznego białka obejmującym sekwencję ukierunkowującą na wakuolę oraz enzym zdolny do polimeryzowania fruktozy. Korzystny sygnał ukierunkowujący na wakuolę pochodzi od pierwszych 30 aminokwasów od końca NH gromadzonego białka słodkiego ziemniaka, sporaminy, oraz od N-końcowych i C-końcowych sekwencji niezbędnych do ukierunkowania białka, lektyny jęczmienia, do przedziału wakuolarnego. Ukierunkowujące na wakuolę sekwencje sporaminy lub lektyny jęczmienia wystarczają do skierowania białka do siateczki śródcytoplazmatycznej (ER), posortowanie go w ER i przeniesienie do wakuoli przez aparat Golgiego. Sekwencje ukierunkowujące na wakuolę ulegają fuzji w ramce z dojrzałym kodującym obszarem białka FTF Bacilius amyloliquefaciens.

Chimeryczny gen obejmujący sekwencje regulujące specyficzne względem tkanki, sekwencje ukierunkowujące na wakuolę i sekwencje kodujące bakteryjny FTF zdolny jest do syntetyzowania polimeru fruktozy z wykorzystaniem sacharozy jako substratu, gdy ulegnie ekspresji w roślinie jedno- lub dwuliściennej. Trrnsgeniczna roślina kukurydzy (Zea mays), ziemniaka (Solanum tuberosum) lub tytoniu (Nicotiana tabacum) prawidłowo wytwarzająca w wyniku ekspresji gen FTF różni się od rośliny genetycznej tego samego gatunku obecnością fruktanu nagromadzonego w dojrzałych nasionach, bulwach lub liściach.

Przenoszenie fragmentów kwasów nukleinowych do rośliny kieruje ekspresją białka w taki sposób, że następuje nagromadzanie tego użytecznego polimeru bez obawy o utratę lub modyfikację polimeru pod wpływem degradujących enzymów roślinnych w czasie zbioru, transportu lub przechowywania, a także bez utraty cennych produktów ubocznych uzyskiwanych z konkretnych gatunków. Trrnsgeniczne rośliny uprawne zawierające chimeryczne geny obejmujące sekwencje regulujące specyficzne względem tkanki, sekwencje ukierunkowujące na wakuolę i sekwencje kodujące bakteryjny FTF, będą stanowić odnawialne źródło polimerów fruktozy o wysokiej masie cząsteczkowej. Stopień nagromadzenia fruktanu będzie częściowo zależy od poziomu ekspresji chimerycznego genu w transformowanych komórkach. Poziom ekspresji częściowo zależy od sygnałów ekspresji specyficznych względem tkanki, od liczby kopii genu zintegrowanych w genomie rośliny oraz od umiejscowienia integracji genu. Na nagromadzanie fruktanu może również wpływać ilość dostępnego substratu. Ilość substratu dostępnego dla enzymu zależy od gatunku (z uwzględnieniem mutantów w ramach gatunku), od rodzaju tkanki, w której zachodzi ekspresja, od subkomórkowej lokalizacji ekspresji i od stadium rozwoju konkretnej rośliny. Trwałość wprowadzonego białka może także wpływać na nagromadzanie się fruktanu, przy czym zależy ona w części od właściwej obróbki, ukierunkowania wewnątrzkomórkowego oraz· od jego zdolności od działania w obcym środowisku.

Podstawowym celem realizacji sposobów według wynalazku jest wykorzystanie sacharozy wytwarzanej w wyniku fotosyntezy i przechowywanej w wakuoli komórek roślinnych, do na180 543 gromadzania fruktanów w transgenicznych nasionach Zea Mays, bulwach Solanum tuberosum lub liściach Nicotiana tabacum poprzez wprowadzenie bakteryjnego genu FTF z odpowiednimi sekwencjami regulującymi, specyficznymi względem tkanki i wewnątrzkomórkowej lokalizacji (względem wakuoli).

FTF oznacza enzym o aktywności polimerazy fruktozowej. Korzystny jest pozakomórkowy FTF, lewanosukraza EC 2.4.1.10. Gen FTF może pochodzić ze źródeł drobnoustrojowych. Tak np. geny lewanosukrazy, które polimeryzująresztę fruktozy z sacharozy z wytworzeniem lewanu, uzyskać można z różnych gatunków obejmujących, ale nie wyłącznie, Aerobacter levanicum (Evans i Hibbert, Adv. Carbohydr. Chem., 2:253-277 (1946)); Bacillus subtilis (Dedonder, Methods Enzymol., 8: 500-505 (1966); Bacillus polymyxa (Hestrin i inni, Biochem. J., 37: 450-456 (1943)); Streptococcus salicarius (Fuchs, Nature, 178:921 (1956)); lub Microbacterium levaniformus (Fuchs i inni, Antonie van Leeuwenhoek 51:333-351 (1985)). Korzystna sekwencja kodująca FTF pochodzi z Bacilius amyloliquifaciens (Mantsala i Puntala, FEMs Microbiol. Lett., 13: 395-399 (1982); Tang i inni, Gene 96: 89-93 (1990)).

Osiągnięcie odpowiednich poziomów ekspresji genu FTF lub dowolnego z genów sukrazowych może wymagać stosowania różnych chimerycznych kaset ekspresji zawierających różne promotory. Ekspresja obcych genów w tr^^i^j^^^i^^;znych roślinach jest dobrze poznana (De Blaere i inni, Meth. Enzymol., 143:227-291 (1987). Według wynalazku, korzystnajest ekspresja genu FTF w nasionach, bulwach i liściach pochodzących odpowiednio z kukurydzy, ziemniaka i tytoniu. Można także transformować tkanki takie jak nasiona i bulwy roślin obejmujących, ale nie wyłącznie, burak cukrowy, trzcinę cukrową, karczochjerozolimski, cykorię i kanolę, tak że będą one gromadzić ten polimer węglowodanowy lub polimery pokrewne (np. dekstrany i altemany).

Dobór gatunku jako źródła dla promotora niezbędnego do regulowania ekspresji FTF nie ma większego znaczenia, o ile promotor wykazuje odpowiedniąakty wność transkrypcyjnąumożliwiającą realizację wynalazku na drodze ekspresji genu FTF w pożądanym typie gospodarza tkanki. Do korzystnych należą te promotory, które umożliwiają ekspresję białka specyficznie w nasieniu, bulwie lub liściu. Do przykładowych promotorów specyficznych względem nasion należą, ale nie wyłącznie, promotory białek magazynowanych w ziarnach. Takie magazynowane białka są ściśle regulowane, toteż ekspresja następuje wyłącznie w tkance nasienia. Dokładna regulacja może mieć decydujący wpływ na osiągnięcie optymalnej ekspresji lub w przypadku, gdy pożądane jest oddziaływanie na zasób określonego substratu. Ekspresja białek magazynowanych w ziarnach jest wysoce specyficzna względem organu oraz specyficzna względem stadium (Higgins i inni, Ann. Rev. Plant Physiol., 35:191-221 (1984); Golberg i inni, Celi, 56:149-160 (1989); Thompson i inni, Bioessays, 10:108-113 (1989)). Różne białka magazynowane w nasionach mogąbyć wytwarzane w wyniku ekspresji w różnych stadiach rozwoju. Znane sąobecne liczne przykłady specyficznej względem nasiona ekspresji magazynowanych białek w transgenicznych roślinach dwuliściennych. Należą do nich geny lektyny sojowej (Okamura i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 8240-8244 (1986), leguminy grochowej (Schirsat i inni, Mol. Gen. Genet., 215: 326 (1989) i napiny rzepakowej (Radke i inni, Theor. Appl. Genet., 75: 685-694(1988)).

Stwierdzono, że specyficzne względem nasion promotory, operacyjne połączone z heterologicznymi sekwencjami kodującymi w chimerycznych konstruktach genowych, zachowują czasowy Ί przestrzenny charakter ekspresji w roślinach transgenicznych. Przykład stanowi promotor białka magazynowanego w nasionach Arabidopsis thalina 2S stosowany do przeprowadzenia ekspresji peptydów enkefalinowych w nasionach transgenicznych gatunków Arabidopsis i B. napus (Vanderkerckhove i inni, Biotechnology, 7:929-923 (1989)). Wykazano, że promotory lektyny fasolowej i β-faseoliny fasolowej wytwarzające w wyniku ekspresji gen lucyferazy, działają prawidłowo po transformowaniu w transgenicznych liniach tytoniu (Riggs i inni, Plant Sei., 63:47-57(1989)).

Podstawowe białka magazynowane w nasionach kukurydzy stanowi grupa polipeptydów rozpuszczalnych w alkoholach, określanajako zeiny. Obejmują one szereg odrębnych klas roz22

180 543 różnianych na podstawie wielkości przy wykonywaniu analizy na żelu SDE-poliakryloamidowym. Geny z rodziny zein syntetyzowane są specyficznie na surowej siateczce środcytoplazmatycznej w komórkach bielma kukurydzy w okresie między 12 i 50 dniem po zapyleniu (Larkin i Hurkman, Plant Phys., 62: 256-263 (1978)). Na skutek wysoce uregulowanej, specyficznej względem tkanek ekspresji i stosunkowo wysokiego poziomu transkrypcji RNA promotory zeinowe stanowią wysoce atrakcyjne w prowadzeniu ekspresji heterologicznych genów w transgenicznych komórkach bielma kukurydzy. Zidentyfikowano szereg białek zeinowych (Pederson i inni, J. Biol. Chem., 261: 6279-6284 (1986); Das i Messing, Mol. Cell Biol., 7: 4490-4497 (19987); Hiffman i inni, EMBO, 6: 3213-3221 (1987)). Korzystnym promotorem do specyficznej względem nasion ekspresji fragmentu kwasu nukleinowego według wynalazkujest promotor z magazynowanego w nasionach białka zeinowego o 10 kD (Kirihara i inni, Mol. Gen. Genet., 211: 477-484 (1988); Kirihara i inni, Gene, 71: 359-370 (1988)).

Do korzystnych promotorów dla transgenicznego ziemniaka należą te, które umożliwiają specyficzną względem tkanki ekspresję genu FTF w bulwie. Do przykładowych promotorów specyficznych względem bulwy należą, ale nie wyłącznie, promotory genów skrobi związanej w granulki (Visser i inni, Plant Mol. Bio., 17: 691-699 (1991)), enzymu rozgałęziającego skrobię (Kossmann i inni, Mol. Gen. Genet., 230: 39-44 (1991)) i magazynowanego białka, patatyny (Rocha-Sosa i inni, EMBO J., 8:23-31 (1991)). Wykazano, że promotory specyficzne względem bulw, operacyjnie połączone z heterologicznymi sekwencjami kodującymi zachowują czasowy i przestrzenny charakter ekspresji w roślinach transgemcznych. Przykłady stanowi promotor syntezy skrobi związanej w granulki zastosowany do kierowania ekspresją genu markerowego GUS (Visser i inni, Plant Mol. Bio., 17: 691-699 (1991); van der Steege i inni, Plant Mol. Biol., 20: 19-30 (1992)) oraz promotor patatyny zastosowany do kierowania ekspresją genu markerowego CAT (Twell i inni, Plant Mol. Biol., 9:345-375 (1987) obok genu GUS (Wenzler i inni, Plant Mol. Biol., 12:41-59(1989)).

Szczególnie przydatny w specyficznej względem bulwy ekspresji genujest promotor patatyny, który został dobrze scharakteryzowany pod względem określeniem sekwencji regulacyjnych odgrywających rolę w przekazywaniu ekspresji specyficznej względem tkanki i stadium rozwoju (Mignery i inni, Nuc. Acids Res., 12: 7987-8000 (1984); Jefferson i inni, Plant Mol. Biol., 14:995-1006 (1990); (Twell i inni, Plant Mol. Biol., 9: 345-375 (1987)). Szczególnie, korzystny do kierowania ekspresjągenu w ziemniaku jest promotor patatyny klasy I. Promotor ten został dokładnie scharakteryzowany w odniesieniu do ekspresji specyficznej względem tkanki i stadium rozwoju. Dokładna regulacja ekspresji genu jest pożądana, z tego względu, aby wykorzystać sacharozę tylko w tkance magazynującej takiej jak bulwa; dlatego też promotory patatyny klasy I wywołujące ekspresję w bulwach są szczególnie przydatne, gdyż promotory klasy II wywołujące również ekspresję w korzeniach byłyby mniej pożądane (Pikaard i inni, Nuci. Acids Res., 15:1979-199-4(1987)). Szczególnie korzystnajest ucięta wersja poromotora patatyny klasy I, obejmująca 1,0 Kb w górę od miejsca inicjowania transkrypcji. W tym fragmencie promotora patatyny zidentyfikowano dwa elementy specyficzne względem tkanki, jeden między -40 i -400 bp, a drugi między -400 i -957 bp, od miejsca inicjowania transkrypcji. Te dwa elementy wystarczają do przeprowadzenia specyficznej względem bulwy ekspresji chimerycznego genu zawierającego obcięty promotor patatyny połączony w wyniku fuzji z genem markera GUS (Jefferson i inni, Plant Mol. Biol., 14: 995-1006 (1990)). Wykazano, że ucięta wersja promotora patatyny obejmująca fragment od -40 do -959 bp od miejsca inicjowania transkrypcji zapewnia specyficzną względem bulwy ekspresję uciętej wersji promotora wirusa mozaiki kalafiorowej, przy czym stwierdzono, że promotor ulega ekspresji w roślinie w swoim stanie rodzimym (Jefferson i inni, Plant Mol. Biol., 14: 995-1006 (1990)).

Zidentyfikowano promotory zdolne do ogólnej ekspresji w liściach tytoniu. Jeden z przykładów stanowi promotor małej podjednostki genu karboksylazy bisfosforanu rybulozy (SSU) (Mazur i Chui,Nuc. AcidsRes., 13:2373-2386 (1985)). Do ekspresji w tytoniu, zwłaszcza w liściach tytoniu, korzystnie zastosować można również promotor 35S wirusa mozaiki kalafiorowej (CaMV). Ustalono sekwencje niezbędne do zajścia ogólnej ekspresji promotora CaMV S35 w tkance

180 543 tytoniowej (Odell i inni,Nature, 313:810-812 (1985)). Wykazano, żepromotoiyCaMV35Si SSU skutecznie kierują ekspresją heterologicznych genów nie tylko wtedy, gdy są transformowane w gatunkach rodzimych, ale w większej liczbie gatunków roślin niżj akikolwiek z innych przebadanych promotorów.

Sacharoza jest syntetyzowana, a następnie ulega metabolizie, w cytozolu komórek roślinnych. Sacharoza stanowi cegiełkę wykorzystywaną w budowie wielkiej liczby struktur i produktów komórkowych. Osadzając się w wakuoli może ona tam przebywać tylko przejściowo w czasie ogólnego rozwoju komórki, albo może być magazynowana, czasami przez dłuższy okres czasu, jak to jest w przypadku buraka cukrowego. Sacharoza wakuolama nie jest metabolicznie aktywna (nie jest wykorzystywana w wakuoli jako metabolit do produkcji jakiegokolwiek produktu komórkowego) i z tego względu wykorzystanie jej do syntezy fruktanu może być o wiele mniej szkodliwe dla rośliny, niż gdyby powodowało to zubożenie cytozolicznego zasobu sacharozy. Sacharozę wakuolarnąmożna wykorzystać kierując gen FTF do wakuoli komórki transgenicznej.

Wakuola komórki roślinnej, część układu wydzielniczego, spełnia różne funkcje istotne dla wzrostu i rozwoju komórki, takie jak gromadzenie aminokwasów, jonów nieorganicznych przejściowych produktów metabolizy, np. glukozy, fruktozy i sacharozy. Wiele z tych związków przedostaje się do wakuoli poprzez kanały białkowe lub na drodze aktywnego transportu Przegląd - Matile, Ann. Rev. Plant Physiol., 29: 193-213 (1978); oraz Wink, J. Exp. Bot., 44: 231 -246 (1993)). Białka przeznaczone do wakuoli nie wchodzą do niej na drodze prostej dyfuzji, ani też na drodze prostego transportu przez tonoplast. N-końcowy sygnał kodowany dla białek specyficznych względem wakuoli najpierw kieruje je na powierzchnię siateczki śródcytoplazmatycznej (ER). Sygnał jest rozszczepiany w ER, po czym następuje fuzja ER z aparatem Golgiego, gdzie białko poddawane jest dalszej obróbce. Ukierunkowanie białek na wakuolę jest zdeterminowane drugorzędową sekwencją aminokwasów zlokalizowaną na końcu N lub C białka (Chrispeels, Ann. Rev. Plant Phys. and Plant Mol. Biol. 42:21 -53 (1991); Chrispeels i Rahikael, Celi 68:613-616 (1992)). Sekwencja ta umożliwia sortowanie białka w aparacie Golgiego. Zawierające białko pęcherzyki pochodzące z aparatu Golgiego wykrywają tonoplast i zlewają się z nim, osadzając białko w wakuoli (Neuhaus i inni, Proc. Natl. Acad. Sei., 88: 10362-10366 (1991); Bednarek i Raikhel, The Plant Celi, 3: 1195-1206 (1991); (Chrispeels, Ann. Rev. Plant Phys. and Plant Mol. Biol., 42:21-53 (1991).

Zidentyfikowano wiele sekwencji ukierunkowujących na wakuolę, do których należą, ale nie wyłącznie, chitynaza tytoniowa A (Neuhaus i inni, Proc. Natl. Acad. Sei., 88: 10362-10366 (1991)), aluerainajęczmienia(Holwerdai inni, Plant Celi, 4:307-318 (1992), glukanaza tytoniowa β-1-3 (Melchers i inni, Plant Mol. Biol., 21:583-593 (1993)) orazpatatyna (Sonnewald i inni, The Plant Journal, 1: 95-106 (1991).

Według wynalazku, korzystne sekwencje ukierunkowujące na wakuolę pochodzą od białka magazynowanego w korzeniu słodkiego ziemniaka, sporaminy, oraz od genu jęczmienia, lektyny. Białko sporaninajest syntetyzowane jako pre-propeptyd zawierający jedynie sekwencję N-końcową. N-końcowa sekwencja obejmuje pre-peptyd sygnałowy o 21 aminokwasach oraz dodatkowy propeptyd o 16 aminokwasach, odpowiedzialny za wprowadzanie do ER i sortowanie do wakuoli (Matsuoka i Nakamura Proc. Natl. Acad. Sei., 88:834-838 (1991)). Genlektyny jęczmienia obejmuje odrębne sygnały przy końcach N i C, odpowiednio kierujące do ER i sortujące w aparacie Golgiego do wakuoli (Bednarak i Raikhel, The Plant Celi, 3: 1195-1206 (1992); Dombrowski i inni, The Plant Celi, 5: 587-596 (1993)).

Wykazano, że specyficzne względem wakuoli białka są prawidłowo ukierunkowane na wakuolę w heterologicznych roślinach transgenicznych (Bednarak i inni, Plant Celi,2:1145-1155 (1990); (Matsuoka i Nakamura, Proc. Natl. Acad. Sei., 88: 834-838 (1991); (Holwerda i inni, Plant Celi, 4:307-318 (1992)). Potwierdzenie prawidłowego zestawu, obróbki i ukierunkowania specyficznego względem wakuoli białka, lektyny jęczmienia, w tytoniu, oznacza, że mechanizmy sortowania w roślinachjedno- i dwuliściennych sąbardzo podobne (Wilkins i inni, Plant Celi 2:301-313(1992)). Ponadto sekwencje ukierunkowujące z genów specyficznych względem wa24

180 543 kuoli, operacyjnie połączone z heterologicznymi sekwencjami kodującymi w chimerycznych konstruktach genowych również zapewniają specyficzną względem wakuoli ekspresję w roślinach transgenicznych. Przykłady stanowi sekwencja patatyny ukierunkowująca na wakuolę, połączona z drożdżowym genem inwertazy Suc2, która, jak to stwierdzono, jest prawidłowo ukierunkowana na wakuolę transgenicznych komórek tytoniu (Sonnewald i inni, The Plant Journal, 1:95-106 (1991)), gdzie ukierunkowujące na wakuolę C-końcowe sekwencje tytoniowej chitynazy A lub, w innym eksperymencie, C-końcowa sekwencja z lektyny jęczmienia, połączono z wydzielnicząpostaciąchitynazy ogórka. Chimeryczna chitynaza ogórka była prawidłowo ukierunkowana na wakuolę komórek tytoniu w obydwu doświadczeniach (Neuhaus i inni, Proc. Natl. Acad. Scii. 88: 10362-10366(1991); Bednarek i Raikhel,The Plant Celi, 3:1195-1206(1991)). Źródło sekwencji ukierunkowującej na wakuolę wybranej do operacyjnego połączenia z białkiem FTF nie ma istotnego znaczenia, o ile spełnia ono cele wynalazku prawidłowo ukierunkowując funkcyjne białko FTF do wakuoli korzystnych komórek roślin transgenicznych.

Według wynalazku zastosować można dowolny 3'-nie kodujący obszar zapewniający uzyskanie sygnału poliadenylowania i inne sekwencje regulujące, które mogą być niezbędne do zapewnienia prawidłowej ekspresji obszaru kodującego FTF. Może on obejmować 3'-końcowy obszar genu syntezy nopalinowej, 3'-końcowy obszar genów wirusów roślinnych, takich jak geny 35S lub 19S CaMV, 3'-końcowy obszar genu CI kukurydzy lub 3'-końcowe sekwencje z dowolnego źródła, tak aby zastosowana sekwencja dostarczała niezbędnej informacji w tej sekwencji kwasu nukleinowego, zapewniającej prawidłową ekspresję kombinacji promotor/obszar kodujący FTF, z którą została ona operacyjnie połączona. W literaturze podano liczne przykłady różnych przydatnych 3'-niekodującyjh obszarów (patrz np. Inglebrecht i inni, Plant Celi, 1:671-680)).

Na podstawie powyższego opisu i poniższych przykładów specjalista będzie mógł zmodyfikować opisane chimeryczne konstrukty na drodze delecji promotora, sekwencji ukierunkowującej na wakuolę, sekwencji kodującej gen FTF lub obszaru 3' transkrypcyjnej terminacji, oraz zastąpienia ich podobnymi fragmentami DNA ze źródeł drobnoustrojowych, roślinnych lub innych, uzyskując sposób i rośliny transgeniczne niezbyt różniące się od sposobu i roślin ujawnionych w wynalazku. Opisany sposób można wykorzystać w odniesieniu do obszaru kodującego ze źródła drobnoustrojowego lub roślinnego, który nie musi wykazywać aktywności FTF, ale dowolny inny gen wykorzystujący sacharozę jako substrat w celu syntetyzowania polimeru węglowodanowego, taki jak altemanosukraza, dekstranosukraza, glukozylotransferaza lub dowolna z sukraz.

Różne sposoby wprowadzania (czyli transformowania) sekwencji DNA do komórek wyższych roślin są dostępne specjalistom (patrz publikacje EPO 0 295 959 A2 i 0 138 341 A1). Sposoby obejmujązastosowanie wektorów transformacji opartych na plazmidach Ti i Ri z Agrobacterium spp. Szczególnie korzystne jest użycie binarnego typu tych wektorów. Wektory pochodzące z Ti transformują szereg wyższych roślin takich jak tytoń, ziemniak i kanola.

W celu wprowadzenia do tytoniu i ziemniaka chimeryczne geny według wynalazku można wstawić do binarnych wektorów w sposób opisany w przykładzie I. Wektory stanowią część binarnego układu plazmidowego wektora Ti (Bevan, Nuc. Acids Res., 12: 8711-8720 (1984)), z Agrobacterium tumefaciens. W celu wprowadzenia do kukurydzy zrekombinowane konstrukty DNA (chimeryczne geny) według wynalazku transformuje się z wykorzystaniem balistycznego bombardowania z wysoką za pomocą metalowych cząstek pokrytych konstruktami kwasów nukleinowych lub fragmentami konstruktów wystarczającymi do zrealizowania wynalazku (Klein i inni, Naturę (Londyn), 327:70 (1987)); Klein, patent US nr 4 945 050). Wprowadzenie DNA do komórek roślinnych nie ma decydującego znaczenia, o ile cel wynalazku osiągnie się ^na drodze przeniesienia DNA lub fragment DNA tak, by polimery fruktanowe były syntetyzowane i gromadziły się w tkankowo i subkomórkowo specyficzny sposób.

Aby ocenić ekspresję chimerycznych genów w liściach, nasionach lub bulwach transformowanych roślin, białko FTF można wyekstrahować, wykryć i ilościowo oznaczyć immunologicznie sposobami znanymi specjalistom. Alternatywnie tkanki liści, nasion lub bulw można

180 543 rozdrobnić i wyekstrahować polarnym roztworem wydzielając i zatężając polisacharydy o wysokiej masie cząsteczkowej (w tym fruktany), które można następnie wykryć przeprowadzając hydrolizę, a następnie ilościową analizę enzymatyczną lub jakościową analizę TLC z barwieniem specyficznym dla kestozy (Wise i inni, Anal. Chem., 27: 33-36 (1955)).

Źródło genu FTF nie ma większego znaczenia, o ile spełnia ono cele wynalazku, syntetyzowanie i gromadzenie polimerów fruktozy o wysokiej masie cząsteczkowej w komórkach roślin transgenicznych. Białko FTF wykorzystuje sacharozę, główny metabolit uzyskany w wyniku fotosyntezy w większości roślin. Biorąc to pod uwagę specjalista może zastępczo zastosować białko, które wykorzystuje sacharozę w katalizowaniu syntezy polimeru węglowodanowego. Grupa takich białek, określanych jako sukrazy, obejmuje, ale nie wyłącznie, lewanosukrazę, altemanosukrazę i dowolnąz wielu sekstranosukraz (Abo i inni, J. Bact., 173: 989-996 (1991); Gilmore i inni, Infec. and Immun., 58: 2452-2458 (1990); Core, Carbo. Poly., 19: 249-252 (1992); Giffard i inni, J. Gen. Micro., 139:1511-1522 (1993)). Należy oczekiwać, że białka zbliżone właściwościami do FTF, takie jak dekstranosukrazy i altemanosukraza, będą zachowywać się podobnie po ekspresji w roślinach transgenicznych. Sukrazy można uważać za zestaw białek podobnych pod tym względem, że każda z nich działa jako monomer, wykorzystuje sacharozę jako jedyny substrat, nie wymaga żadnych dodatkowych kofaktorów i katalizuje polimeryzację reszty heksozowej.

Białka dekstranosukraowe katalizują powstawanie polimerów glukozy zawierających mery glukozy z połączeniami α 1 -3, α 1 -6 lub kombinacjami α 1-3 i 1 -6. Geny dekstranosukrazy z różnych źródeł lub różne, ale zbliżone geny z tego samego mikroorganizmu decydują o typie połączeń i rozkładzie rozgałęzień w polimerze. Typ połączenia glukozy i rozkład rozgałęzień wywierają bezpośredni wpływ na właściwości polimeru. Tak np. polimery zawierające przede wszystkim mery glukozy z połączeniami α 1-3 są nierozpuszczalne w wodzie, podczas gdy polimery zawierające przede wszystkim połączenia α 1-6 są bardzo dobrze rozpuszczalne (Walker, Int. Rev. in Biochem., 16:75-126 (1978); Rolla i inni, Special Supp. to Chem. Sei., 21-29, Dotlę i Ciardi (red.) (1983). Alternany są unikatowymi dekstranami zawierającymi glukozę z występującymi na przemian połączeniami α 1-3 i 1-6 (Miasaki i inni, carbo. Res., 84:273-285 (1990). Alternany wykazują bardzo niską lepkość istotną, bardzo zbliżoną do lepkości gumy arabskiej; istnieje wielkie zapotrzebowanie na ich wykorzystanie jako niekalorycznych wypełniaczy pokarmów. Wysoka cena i ograniczone dostawy gumy arabskiej doprowadziły do poszukiwania jej zamiennika. Altemany produkowane po konkurencyjnej cenie mogłyby stanowić doskonały zamiennik gumy ar^b^^iej, a ponadto mogłyby znaleźć dodatkowe zastosowanie, gdyby pozwoliła na to ich cena i dostępność.

Dekstrany są obecnie produkowane w skali przemysłowej na drodze fermentacji, wyłącznie do bardzo ważnych zastosowań takich jak badania naukowe oraz jako wypełniacz plazmy krwi. Nagromadzenie w roślinach transgenicznych mogłoby zwiększyć dostępność i obniżyć cenę istniejących produktów, a obniżka ceny mogłaby potencjalnie otworzyć nowe rynki zbytu na te nowe polimery. Zastosowania mogłyby być związane z ich unikatowymi właściwościami. Charakter połączeń glukozy i liczba rozgałęzień decyduje o działaniu skrobi, a ostatecznie ojej zastosowaniu. Dekstrany i alternany zawierają unikatowe połączenia glukozy, nie występujące w cząsteczkach skrobi i z tego względu mogłyby znaleźć zastosowanie w produktach, w których nie można zastosować naturalnych lub modyfikowanych skrobi.

Wynalazek ilustrują poniższe przykłady, w których wszystkie części i procenty podano wagowe, a wartości temperatury w stopniach Celsjusza, o ile nie zaznaczono inaczej.

Przykład I. Charakterystyka aktywności SacB FTF

Ekspresja geny SacB FTF w Bacillus

Bakteryjny gen FTF (SacB) według wynalazku uzyskano przez selekcjonowanie genomowej biblioteki DNA Bacilius amyloliquifaciens z oligonukleotydami opartymi na opublikowanej sekwencji genu FTF (Steinmetz i inni, Mol. Gen. Genet. 200:220-228 (1985)). Procedurę klonowania opisali Tang i inni (Gene, 96: 89-93 (1990); Nagarajan i inni, patent USA nr 5 162 207. Źródło DNA, z którego można wydzielić gen FTF, może pochodzić np., z dowolnego Bacillus

180 543 amyloliquifaciens. Komórki te są dostępne z American Type Culture Collection (Rockville, MD). Sekwencję kodującą gen FTF z Bacillus zmodyfikowano wprowadzając miejsce rozpoznawane przez enzym restrykcyjny EcoRV przy końcu 3' miejsca rozszczepiania 29-aminokwasowego sygnału wydzielania prokariotycznego (zaczynającego się od 894 bp). Miejsce rozpoznawane przez enzym EcoRV wprowadzono na drodze ukierunkowanej mutagenezy stosując zestaw do mutagenezy in vitro Muta-gene™ (Bio-Rad, Richmond, CA). Oligonukleotyd zsyntetyzowany do stosowania w zestawie Muta-gene™, zawierający miejsce EcoRV, przedstawionojako sekwencję ID nr 1. Obecność miejsca EcoRV potwierdzono na podstawie enzymatycznej analizy restrykcyjnej, a następnie potwierdzono przez sekwencjonowanie DNA. Uzyskany plazmid zawierający zmodyfikowany gen FTF oznaczonojako pB311. Plazmid pB311 jest przydatny w prowadzonych następnie manipulacjach DNA, gdyż umożliwia on wyodrębnienie fragmentu DNA zawierającego dojrzały obszar kodujący genu FTF od sygnału wydalania prokariotycznego.

Ocena aktywności pB311 FTF

Analizę zmodyfikowanego genu FTF przeprowadzono wykonując najpierw transformację Bacillus subtilis (szczep BE1500) DNA plazmidu pB311. Przeprowadzono to zaszczepiając 250-ml kolbę zawierającą 10 ml ośrodka SPI hodowląBacillus subtilis do uzyskania gęstości optycznej 0,15 przy 600 nm. Kolbę inkubowano w 37°C przez 3 godziny lub do osiągnięcia gęstości optycznej 1,0 przy 600 nm. Komórki rozcieńczono następnie dodając 100 ml ośrodka SPII i prowadzono inkubację w tej samej temperaturze przez 90 minut. Komórki oddzielono następnie od ośrodka przez wirowanie przy 8000 x g przez 10 minut w temperaturze pokoj owej. Komórki zawieszono następnie w 10 ml supematantu (10-krotne zatężenie). Komórki po takiej obróbce transformowano umieszczając 50 pl SPII-EGTA w sterylnej probówce z 1-5 pg plazmidowego DNA. 2 ml SPH-EGTA dodano do 1 ml komórek po obróbce opisanej powyżej i 300 pl mieszaniny wprowadzono do probówki zawierającej plazmidowy DNA. Mieszaninę inkubowano w 37°C z łagodnym wytrząsaniem przez 20-30 minut. Po inkubowaniu do probówki dodawano 100 pl ośrodka LB i inkubację w tej samej temperaturze kontynuowano przez 30 minut. Porcje (po 100 pl) tego roztworu rozprowadzono na płytkach agarowych LB, zawierających 5 pg/ml chloramfenikolu w celu przeprowadzenia selekcji komórek zawierających plazmid pB311.

Tbase (1 X) (NH₄)₂S0₄ 1 g

K₂HPO₄ 7 g

KH₂OPO4 3 g

Cytrynian Na 0,5 g

MgSO4 0,1 g woda destylowana do 500 ml

SPI

Do 100 ml 1 X Tbase dodać ml guukozy' ml 10%ekstrkt:tu drożeżoowego (DIFCO) ml 1 %i Iwaasó w kazmmoYycch ml 2% MgSO₄

SPII

Jest to ośrodek taki sam jak SPI, ale zawiera dodatkowo 0,5 ml 0,1 M CaCl₂. SPII-EGTA

Jest to ośrodek taki sam jak SPI, ale zawiera dodatkowo 0,2 ml 0,1 M EGTA

Płytki agarowe LB g rypttonu (DIFCO) g ekstrkttu drożdżowego g cMorku sodowego

0,7% agrrn woda destylowana do 1 litra

180 543

Wytwarzanie ekstraktów surowych białek bakteryjnych

Surowe ekstrakty z linii Bacillus, zawierające plazmid pB311 otrzymano prowadząc przez noc hodowlę 2 ml, w 30°C w pożywce (LB) zawierającej 5 pg/ml chloramfenikolu i 2% sacharozy. Komórki oddzielono od ośrodka przez wirowanie przy 8000 x g przez 20 minut. Rozpuszczalne cukry usunięto z supematantu wprowadzając 1 ml do kolumny Sephadex G-25M (Pharmacia Ab, Uppsala, Szwecja) i odwirowując przez 1 minutę przy 1500 x g. Roztwór zawierający wydzielone białko zatężono 10-krotnie (objętościowo) w koncentratorze Centricon-30 (Amicon Co., Beverly, MA), w sposób podany przez producenta.

Ośrodek LB g tryptonu (DIFCO) g ektrrrkinr drożdżowego g NaCl woda destylowana do 1 litra

Ocena aktywności FTF w surowych ekstraktach białkowych

Aktywność FTF oznaczono kilkoma sposobami, obejmującymi:

1) Analiza aktywnotci FTF z \TFzrw/stoniem okeydoty ylukozowej

Aktywność FTF analizowano prowadząc inkubację ekstraktów białkowych w 37°C przez 30 minut w roztworze w postaci 2% sacharozy w 50 mM buforze (fosforan potasu, pH 6,0). Reakcję kończono ogrzewając mieszaninę w 100°C przez 10 minut. Ujemne próbki kontrolne otrzymano ogrzewając surowy ekstrakt białkowy w 100°C przez 10 minut przed dodaniem roztworu sacharozy buforowanego fosforanem. Aktywność FTF została zniszczona w wyniku takiej obróbki, co umożliwiło wyznaczenie podstawowego stężenia glukozy w ekstrakcie. Aktywność FTF określano oznaczając glukozę uwolnioną z sacharozy. Osiągnięto to przeprowadzając inkubację mieszanin po zakończonych reakcjach z oksydazą glukozową i peroksydaząw sposób opisany w zestawie Glucose Trident™ (Sigma Chemicals Co., St. Louis, MO) i oznaczając spektrofotometrycznie ilość powstałego barwnika chinonoiminowego (pomiar gęstości optycznej przy 340 nm), względem ujemnych próbek kontrolnych i wzorców glukozy.

Wyniki testów surowych ekstraktów białkowych z Bacillus, zawierających zmodyfikowane białko FTF, z wykorzystaniem testu z oksydazą glukozową, przedstawiono w tabeli 1.

Tabela 1

	(Gęstość optyczna przy A34)
(+) sacharoza	(-) sacharoza
bez ekstraktu	0,18	0,18
pB311	2,97	0,17
pB311 (po dezaktywacji cieplnej)

Wyniki w tabeli 1 wskazują, że surowe ekstrakty białkowe z Bacillus, zawierające plazmid pB311 zachowują aktywność hydrolizy sacharozowej.

2) Test enzymatycznej aktywności FTF

Surowe ekstrakty białkowe inkubowano w 37°C przez 30 minut w roztworze w postaci 2% sacharozy w 50 mM buforze (fosforan potasu, pH 6,0). Reakcję kończono ogrzewając mieszaninę w 100°C przez 10 minut. Ujemne próbki kontrolne (zdezaktywowane białko) otrzymano ogrzewając surowy ekstrakt białkowy w 100°C przez 10 minut przed dodaniem roztworu sacharozy buforowego fosforanem. Obróbka taka wystarcza do rozłożenia aktywności enzymatycznej i umożliwia wyznaczenie udziału glukozy (aktywność podstawowa) q roztworze, niezależnie od aktywności FTF. Aktywność FTF oznaczano uwalniając glukozę z sacharozy przez inkubowanie mieszanin po zakończonej reakcji z testową mieszanką glukozy w 30°C przez 20 minut. Reakcje przerywano umieszczając probówki we wrzącej łaźni wodnej na 10 minut, a aktyw28

180 543 ność określano ilościowo przez pomiar konwersji NAD do NADH przy 340 nm. Aktywność porównywano z ujemnymi próbkami kontrolnymi i wzorcami glukozy.

Dodatkowo informacje odnośnie aktywności FTF uzyskano mierząc ilość wolnej fruktozy uwolnionej z sacharozy w wyniku inkubacj i ekstraktów białkowych z sacharozą w sposób opisany powyżej. Aktywność oceniano w reakcji enzymatycznej prowadząc inkubację mieszanin po przerwaniu reakcji w roztworze zawierającym testową mieszankę heksozową w 30°C przez 20 minut, po czym reakcję przerywano umieszczając probówki we wrzącej łaźni wodnej na 10 minut. W reakcji tej izomeraza fosfoglukozowa przekształca wolną fruktozę w glukozę, dodając ją do NAD przekształconego w NADH. Spektrofotometryczny odczyt przy 340 nm reprezentuje sumaryczne stężenie glukozy i wolnej fruktozy. Porównując wyniki analizy spektrofotometrycznej ekstraktów białkowych inkubowanychztestowąmieszankąglukozowąi ekstraktów inkubowanych z testową mieszanką heksozową można wyznaczyć poziom wolnej fruktozy w roztworze.

Testowa mieszanka glukozowa

0,2 HEPES/NaOH (pH 8,0)

M

MgCl_? mM

2mM NAD nMI AfP

DTT mM

2.5 jednostek/ml heksokinazy

2.5 jednostek/ml dehydrogenazy 6-fosforanu glukozy

Testowa mieszanka heksozowa

Testowa mieszanka glukozowa + 4 jednostki/ml dehydrogenazy fosfoglukozowej

Wyniki analizy enzymatycznej ekstraktów białkowych Bacillus (zawierającej plazmid pB311) zestawiono w tabeli 2.

Tabela 2

	(Gęstość optyczna przy A340)
Testowa mieszanka glukozowa
	(+) sacharoza	(-) sacharoza
bez ekstraktu	0,09	0,10
pB311 (po dezaktywacji cieplnej)	0,07	0,09
pB311	1,17	0,36
Testowa mieszanka heksozowa
bez ekstraktu	0,10	0,18
pB311	1,21	0,33

Wyniki w tabeli 2 potwierdzaj ą wyniki testu z oksydazą glukozową (patrz tabela 1, powyżej), że białko FTF z modyfikacją EcoRV zachowuje aktywność hydrolizowania sacharozy. Tabela 2 wykazuje również, że fruktoza nie występuje w stosunku 1:1, czego można by oczekiwać, gdyby hydroliza sacharozy stanowiłajedyną aktywność występującąw surowych ekstraktach białkowych. Spolimeryzowana fruktoza nie reaguje z izomerazą fosfoglukozową w testowej mieszance heksozowej. Dlatego też niższy poziom fruktozy sugeruje, że białko w surowych ekstraktach nie tylko wykorzystuje sacharozę z uwalnianiem glukozy, ale również wiąże glukozę, najprawdopodobniej przez jej polimeryzację.

180 543

3) Test aktywności FTF metodą HPLC

Ilościową analizę aktywności FTF przeprowadzono oznaczając obecność polimerów węglowodanowych o wysokim ciężarze cząsteczkowym powstałych po inkubacji surowych ekstraktów białkowych w 37° przez 30 minut -1 godzinę ^w roztworze w postaci 2% sacharozy w 50 mM buforze (fosforan potasu, pH 6,0). Ujemne próbki kontrolne otrzymano ogrzewając surowy ekstrakt białkowy w 100°C przez 10 minut przed dodaniem roztworu sacharozy buforowanego fosforanem. Po inkubacji powstały fruktan analizowano metodą wysokosprawnej chromatografii anionowymiennej stosując gradient 0-100 mMNaOH w kolumnie Dionex PA-100 z detektorem Dionex PAD (Dionex Sunnyvale, CA). Porównano profile chromatograficzne mieszanin reakcyjnych i autentycznych wzorców lewanu (Sigma Chemicals Co., St. Louis, MO).

4) Oznaczanie polimerów fruktozy metodą chromatografii cienkowarstwowej

Przeprowadzono również jakościową analizę aktywności FTF po inkubacji surowych ekstraktów białkowych w 37°C przez 30 minut -1 godzinę ^w roztworze w postaci 2% sacharozy w 50 mM buforze (fosforan potasu, pH 6,0). Ujemne próbki kontrolne otrzymano ogrzewając surowy ekstrakt białkowy w 100°C przez 10 minut przed dodaniem roztworu sacharozy buforowanego fosforanem. Po inkubacji 5-10 pl mieszaniny reakcyjnej nakraplano na płytkę Fisher Redi/plate™ 20 x 20 cm (Fisher Scientific, Pittsburg, PA) wraz z dodatnimi próbkami kontrolnymi (fruktoza, glukoza, sacharoza, skrobia i inulina z cykorii otrzymana z Sigma Chemicals Co., St. Louis, MO). Płytkę umieszczono w komorze TLC zawierającej układ rozpuszczalników woda/n-butanol/2-propanol w stosunku 4:3:12. Gdy front, rozpuszczalnika doszedł do poziomu 1 cm od góry, płytkę wyjmowano z komory i suszono na powietrzu. Następnie na płytkę natryśnięto preparat barwiący specyficzny względem kestozy (Wise i inni, Anal. Chem., 27: 33-36 (1955). Preparat otrzymywano rozcieńczając kwas fosforowy do stężenia 1 M w n-butanolu nasyconym wodą. Następnie dodawano 3 g mocznika, a potem 5 ml alkoholu etylowego.

Płytkę TLC z preparatem barwiącym specyficznym względem kestozy pozostawiono do wyschnięcia na powietrzu. Fruktozę i polimery fruktozy powstałe z sacharozy w wyniku działania FTF wizualizowano umieszczaj ąc płytkę ^na 5 -10 minut w 100°C. Glukoza daje w tym teście bardzo słabe sygnały, a skrobia nie daje wykrywalnych sygnałów. Sygnały fruktozy i glukozy występują prawie przy froncie rozpuszczalnika, a wzorce inulinowe tworzą, sygnały nie migrujące znacząco od linii podstawowej.

5) Ilościowe oznaczanie fruktanu metodą analizy antronowej

Ekstrakty poddano obróbce ucierając je w 80% etanolu i prowadząc inkubację w 70°C przez 10-15 minut. Materiał nierozpuszczalny w etanolu usunięto przez odwirowanie (13000 x g) przez 5 minut. Grudkę ponownie zawieszono w 80% etanolu, ogrzano do 70°C na 10-15 minut i ponownie odwirowano. Etap ten powtórzono trzeci raz, po czym ostateczną grudkę zawieszono w wodzie. Roztwór inkubowano w 70°C przez 10-20 minut, po czym odwirowano przez 5 minut przy 13000 x g. Supernatant usunięto i zastosowano do oznaczania stężenia fruktanu.

Stężenie fruktanu oznaczano inkubując ekstrakty nierozpuszczalne w etanolu w 100°C ze stężonym HCl przez 10 minut. Mieszaninę schłodzono i zobojętniono NaOH. Próbki po obróbce HCl dodawano do 1 ml roztworu antronu w40°C na 20 minut, chłodzono i zawartość fruktozy oznaczano spektrofotometrycznie przy A₆20 w porównaniu do znanych wzorców fruktozy. W związku z tym, że frakcja oznaczana antronem była nierozpuszczalna w etanolu, uznano że węglowodan w wyjściowym stanie jest materiałem o wysokim ciężarze cząsteczkowym (czyli fruktanem). Rozpuszczalny węglowodan, który mógłby wypłynąć na odczyt spektrofotometryczny, został usunięty w etapach inkubacji w 80% etanolu. Stwierdzono, że ekstrakty nie zawierały rozpuszczalnego węglowodanu, który mógłby zakłócić dokładność oceny w analizie TLC. Z tego względu analiza antronowa opisana powyżej pozwala wiarygodnie ocenić ilość obecnego fruktanu.

Roztwór antronu ml stężonego kwasu siarkowego dodano do 20 ml wody. Do uzyskanego roztworu dodano 0,15 g antronu (Sigma Chemicals Co., St. Louis, MO).

180 543

Przykład 2. Konstrukty chimerycznego genu do ekspresji genu SacB FTF w Nicotiana tabacum.

Konstytutywna ekspresja FTF wNicotiana tabacum

Kasetę przeznaczoną do konstytutywnej, cytolitycznej ekspresji genu Bacillus FTF w liściach i łodydze Nicotiana tabacum skonstruowano wprowadzając najpierw miejsce Ncol przy kodonie inicjowania genu SSU, aby ułatwić subklonowanie fragmentów DNA. Osiągnięto to przez strawienie plazmidu pNtSS23 (Mazur i .Chui, Nuc. Acids Res., 13: 2373-2386 (1985)) za pomocą SphI i delecję 3'-przeeweszonych nukleotydów przez inkubowanie z polimeraząDNA E. coli w roztworze zawierającym 40 mM fosforan potasu (pH 7,5) 6,6 mM chlorek magnezu i 1 mM 2-metkapSoeSrnol w 37°C przez 10 minut. LinkerNcol (New England Biolabs) zligowano i plazmid poddano sekwencjonowaniu w celu określenia, czy ATG nowego miejsca Ncol był w tej samej pozycji co w wyjściowym kodonie inicjowania. Plazmid ten oznaczono jako p338.

We fragmencie HindIII-Bcol o 1,0 Kb z plazmidu p338 w znany sposób wypełniono tępe końce stosując dNTPs i enzym Kłenowa. Sekwencja fragmentu HindIII-Ncol zawiera sekwencje regulujące SSU nizbędne do zajścia wywołanej przez światło ekspresji genu w łodydze i liściach roślin dwuliściennych (Mazur i Chui, Nuc. Acids Res., 13: 2373-23 86(1985)). Fragment ten zligowano z pDH51 (Pietrzak i inni, Nuc. Acids Res., 14:5857-5868 (1986)), który uprzednio strawiono EcoRI, wypełniono tępe końce, po czym strawiono SmaI zastępując promotor CaMV 35S. Mieszanki po ligowaniu zastosowano do transformowania szczepu E. coli DH5a [supE44 del lacU169(phi 80lacZdelM15)hsdR17recA1 endAl gyr96 thi1 relAlji wybrano kolonie odporne na ampicylinę. Klony poddano selekcjonowaniu na drodze analizy trawienia endonuelerzami restrykcyjnymi wydzielonych plazmidowych DNA.

Miejsce Ncol w kodonie inicjowania uzyskanego plazmidu, oznaczonego jako pSSUDH51, odtworzono, dodając również miejsce EcoRV w ramce z kodonem inicjowania, w wyniku reakcji PCR z zastosowaniem oligonukleotydów zsyntetyzowanych w syntetyzatorze Applied Biosystems. Oligonukleotydy zastosowanejako startery przedsta^onojako sekwencję ID nr 2 sekwencję ID nr 3. Sekwencja ID nr 3 zawiera również miejsce Xbal umożliwiające subklonowanie.

Mieszaniny reakcyjne PCR zawierały po 0,1 -0,3 każdego ze starterów, do 1 pg matrycowego DNA, 4 pl 2,5 mM dNTPS, 5 pl buforu reakcyjnego 10X (800 mM Tris (pH 9,0), 200 mM (NH^SO.},1 pl Perfect Match™ (Stratagene, La Jolla, CA) i H2 O do ostatecznej objętości 49 pl. Po wstępnej denaturacj w 95°C przez 5 minut dodawano 1 pl polimerazy TAQ™ do każdej mieszaniny reakcyjnej i wykonywano program według następującego cyklu: 1 minuta w 95°C, minuty w 42°C i 3 minuty w 72°C, 42 cykle. Uzyskane w PCR fragmenty DNA rozdzielono na 1,2% żelach agarozowych z wizualizajcę bromkiem etydiowym.

Wydzielone fragmenty PCR strawiono BgIII i Xbal, po czym zligowano z pSSUDH51 również strawionym tymi samymi enzymami restrykcyjnymi, uzyskując plazmid pSSU/P. Sekwencję kodującą gen FTF Bacilius amyloliquifaciens bez bakteryjnego sygnału wydzielania dodano do pSSU/P przez strawienie pB311 za pomocąEcoRV i Xbal. Fragment 1,3 Kb, zawierający obszar kodujący dojrzały FTF zligowano z pSSU/P również strawionym za pomocą EcoRV i Xbal, uzyskując plazmid pSSU-SacB. Promotor SSU rozpoczynający się od pary zasad 365 (miejsce BgIII, patrz Mazur i Chui, Nuc. Acids Res., 13:2373-2386 (1985)), pełną sekwencję kodującą gen FTF i sekwencję teminacji transkrypcyjnej CaMV wydzielono z pSSU-SacB przez trawienie BgIII-KpnI odzyskując fragment DNA, który wstawiono do wektora pZS97 opartego na binarnym plazmidzie Ti z Agrobacterium tumefaciens.

Binarne wektory pZS97 lub pZS97K zastosowano do wprowadzenia chimerycznych genów do roślin. Obydwa binarne wektory, pZS97 i pZS97K, stanowią część układu wektora binarnego plazmidu TI (Bevan, Nuc. Acids Res., 12:8711 -8720 (1984)) z Agrobacterium tumefaciens. Wektory zawierają: (1) chimeryczny gen syntezy nopalinowej: :fosfotransferazy neomycynowej (nos::NPTII) jako selekcjonujący marker dla transformowanych komórek roślinnych (Bevan i inni, Nature 304: 184-186 (1983)), (2) lewąi prawagranicę T-DNA plazmid Ti (Bevan, Nuc. Acids Res., 12: 8711-8720 (1984)), (3) α-dopełniający segment lacZzE. coli (Yiering i inni,

180 543

Gene 19:259-267 (1982) oraz unikatowe miejsca Sali, BamHI i KpnI (pSK97K) lub unikatowe miejsca HindIII, BamHI i KpnI (pSK97) w obszarze polilinkera, (4) bakteryjną replikację pochodzącą z plazmidu Pseudomonas pVSl ' (Itoh i inni, Plasmid 11: 206-220 (1984)) oraz (5) bakteryjny gen fosfotransferazy neomycynowej z Tn5 (Berg i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72: 3628-3632 (1975) (pZS97K) lub bakteryjny gen β-laktamazy (pZS97) jako selekcjonujące markery do transformowania Agrobacterium. Binarne wektory zawierające chimeryczne geny przeniesiono metodą koniugowania trój-rodzicielskiego (Ruvkn i inni, Naturę 289: 85-88 (1981)) do szczepu Agrobacterium LBA4404/pAL4404 (Hockema i inni, Naturę 303: 179-180 (1983)) przeprowadzając selekcję odporności na ampicylinę (pZS97) lub odporności na kanamycynę (pZS97K).

Transformowanie krążków liści tytoniu przez zainfekowanie Agrobacterium

Hodowle Agrobacterium zawierające binarny wektor zastosowano do transformowania płatków liści tyoniu (Horsch i inni, Science 227: 1229-1231 (1985). Liście wyjałowiono przemywając je przez 30 minut w 900 ml wody, 100 ml środka bielącego Chlorox i 10 ml 10% SDS. Liście przemyto 3 razy sterylną wodą, po czym przygotowano płatki wycinając 1-cm kwadraty lub wyciskając krążki sterylnym korkoborem. Płatki zaszczepiono Agrobacterium zawierającym odpowiednie binarne wektory zanurzając kawałki liścia do ośrodka LB zawierającego bakterie. Zaszczepione płatki przeniesiono do ośrodka CN i inkubowano na świetle w temperaturze pokojowej przez 3 dni. Po 3-dniowej inkubacji płatki liści przeniesiono do ośrodka CN zawierającego 500 mg/litr Claforanu (cefotaksymu) i 300 mg/litr kanamycyny ' i inkubację kontunuowano przez 4-6 tygodni. Po tym czasie rozwinięte odroślą odcięto od płatków i umieszczono w ośrodku ukorzeniania zawierającym 500 mg/litr Claforanu (cefotaksymu) i 300 mg/litr kanamycyny. W ośrodku tym na około 40-50% odrośli korzenie pojawiły się po 2-4 tygodniach. Ukorzenione odroślą przeniesiono do wilgotnej mieszanki metromix w 8-calowej doniczce i zbadano na obecność przeniesionego genu.

Ośrodek CN

Jedno opakowanie minimalnego ośrodka organicznego Murishage-Skoog (MS) z sacharozą (KC Biochemicals lub GIBCO)

1% BAP

0,1 pg/litr kwasu naladyksynowego g agaru

500 ml wody (pH 5,8)

Ośrodek ukorzeniający

Jedno opakowanie minimalnego ośrodka organicznego Muris-hage-Skoog (MS) z sacharozą (KC Biochemicals lub GIBCO) g sacharozy g agaru

500 ml wody (pH 5,8)

Ekspresja pSSU-SacB uniemożliwia odtwarzanie tytoniu

Hodowle Agrobacterium zawierające binarny wektor zdolny do przenoszenia kasety ekspresji pSSU-SacB do genomu tytoniu zastosowano do zaszczepiania płatków z liści tytoniu na drodze współhodowli (patrz powyżej oraz Horsch i inni, Science 227: i229-1231 (1985)). Próby odtwarzania transgenicznych roślin w selektywnym ośrodku zawierającym kanamycynę doprowadziły do uzyskania jedynie 3 żywych ' odrośli. Odrośla odcięto i umieszcz.ono na ośrodku ukorzeniania, jednak korzenie nie utworzyły się nawet po czasie dłuższym od wystarczającego do zajścia ukorzenienia (3-5 tygodni). Kontrolne płatki liści inkubowane z Agrobacterium tumefaciens zawierającym jedynie wektor binarny pZS97 dały co najmniej 10 razy więcej odrośli przy takiej samej liczbie zaszczepionych płatków liści. Kontrolne odroślą utworzyły korzenie na ośrodku ukorzeniania zawierającym kanamycynę w ciągu 2-4 tygodni. Ta!kie pełne doświadczenia od subklonowania fragmentu genu FTF z pB311, opisanego powyżej, poprzez przenoszenie do binarnego wektora, koniugowanie trój-rodzicielskie i inkubowanie z płatkami liści tytoniu przeprowadzono po raz drugi, aby zregenerować żywe rośliny tytoniu

180 543 zawierające kasetę ekspresji SSU-SacB. W drugim doświadczeniu uzyskano jedynie 4 zregenerowane odroślą tytoniu na selektywnym ośrodku.

Badanie odporności na kanamycynę potencjalnych transformantów przez hodowlę na ośrodku twardzinowym

Sterylne krążki liści z 4 zregenerowanych odrośli opisanych powyżej oraz dodatnie tkanki kontrolne (transformowane jedynie binarnym wektorem) umieszczono na ośrodku twardzinowym zawierającym środek selekcjonujący, 50 pg/ml kanamycyny. Twardzina pojawiła się wokół krawędzi krążków dodatnich kontrolnych przenoszących tylko gen NPT II po inkubowaniu przez 4-6 tygodni w temperaturze pokoj owej. Tkanka twardziny nie powstała na krążkach wyciętych z 4 odrośli uzyskanych w doświadczeniu opisanym powyżej. Wydaje się, że odroślą uzyskane w tym doświadczeniu nie były rzeczywistymi transformantami, ale „uciekły” z selekcji kanamycynowej w ośrodku CN. Wyniki uzyskane w tych dwóch doświadczeniach wskazują, że ekspresja genu FTF w komórkach tytoniu z takim promotorem wywiera wyj ątkowo niekorzystny wpływ na wzrost, rozwój i odtwarzanie roślin tytoniu.

Ośrodek twardzinowy

Jedno opakowanie minimalnego ośrodka organicznego Muris-hage-Skoog (MS) z sacharozą (KC Biochemicals) g sacharozy g agaru

500 ml wody (pH 5,8)

Przykład 3. Indukcyjna ekspresja bakteryjnego FTF w tytoniu

Konstrukcja indukcyjnej kasety ekspresji FTF

Próby zrozumienia niekorzystnego wpływu aktywności FTF po ekspresji w cytozolu komórki liścia tytoniu były możliwe po skonstruowaniu indukcyjnej kasety ekspresji. Transformowanie tytoniu genem FTF, który nie został transkiybowany do mRNA i z tego względu nie zaszła translacja do funkcyjnego białka przez indukowaniem, umożliwia odtwarzanie bez obawy o zahamowanie wzrostu i rozwoju pod wpływem aktywności FTF w komórce. Gen można następnie uaktywnić w celu wykonania analizy jego wpływu na różnych stadiach rozwoju tytoniu.

Konstrukcja chemicznie indukowanej kasety ekspresji FTF

Promotor SacB i obszar kodujący obejmujący bakteryjny sygnał wydalania, usunięto z plazmidu pB311 (Tang i inni., Gene 96:89-93 (1990); Nagarajan i inni, patent USA nr 05 162 207) przez rozcinanie enzymami restrykcyjnymi KpnI i XbaI. Fragment KpnI-XbaI zligowano do pUClB (New England Biolabs. Beverly, MA), rozciętego tymi samymi enzymami restrykcyjnymi. Uzyskany plazmid nazwano p3114. Plazmid p3114 strawiono EcoRV i HincII, a następnie obszary kodujące dojrzały FTF oddzielono od promotora i sygnału wydalania we fragmencie DNA o 1,3 Kb. Fragment 1,3 Kb wstawiono do wektora klonującego Bluescript SK(+) (Stratagene, La Jolla, CA), strawiono EcoRV i Smal. Linker BglII dodano w miejscu XhoI plazmidu Bluescript SK(+) zawierającego fragment EcoRyriHinicn p3114, około 48 zasad, 3' od sygnału terminacji translacji. Uzyskany plazmid nazwano SacB-BgIII. Obszar terminacji transkiypcyjnej dodano do SacB-BgIII przez ligowanie fragmentu 503 bp BgIII/KpnI z genu 2-1.12 (Hershey i Stoner, Plant Mol. Biol. 17:679-690 (1991); Hershey, Patent USA nr 07 327 205) do plazmidu strawionego tymi samymi enzymami restrykcyjnymi. Uzyskany plazmid, zawierający dojrzały obszar kodujący genu SacB FTF i obszar terminacji transkrypcyjnej 2-1.12 nazwano SacB:2-1.

Skonstruowano indukowalną kasetę ekspresji zawierającą obszar promotora 2-2.3 (Hershey i Stoner, Plant Mol. Biol., 17:679-690 (1991)), lider translacji z genu białka wiążącego chlorofil a/b (Cab) (Dunsmuir, Nuc. Acids Res., 13:2503-2518 (1985)), i 3' obszar terminacji transkrypcyjnej z genu syntazy nopalinowej (Nos) (Depicker i inni, J. Mol. Appl. Genet., 1:.562-570 (1982)). Kodon inicjacyjny (ATG) jest zlokalizowany w miejscu enzymu restrykcyjnego NcoI (dodanego przez zligowanie linkera NcoI) na połączeniu promotora 2-1.3 i lidera translacji Cab. Indukowalny wektor nazwano TD5136.

Plazmid TD5136 strawiono NcoI i zwisający koniec 5' wypełniono dNTPs i enzymem Klenowa. Tępo zakończony plazmid NcoI następnie strawiono BamHI i wydzielono fragment

180 543

1.0 Kb zawierający promotor 2-2. Fragment ten zligowano z SacB:2-1 strawionym BamHI i EcoRV. Uzyskany plazmid, CIP:SacB:2-1, zawierający kodon inicjacyjny (ATG) w ramce z sekwencją kodującą dojrzały FTF obszarem 2-1 3' region. Plazmid ten strawiono BamHI i KpnI, po czym fragment 2,8 Kb wydzielono i zligowano z binarnym plazmidem pZS97K. Binarny wektor zawierający sekwencje promotora i terminacji transkrypcji połączony funkcyjnie z genem FTF umieszczono w Agrobacterium na drodze koniugacji trójro<dzłcielskiej, wykorzystując techniki opisane w przykładzie 2. Binarny wektor zawierający indukowalny wektor ekspresji wprowadzono do tytoniu metodami transformacji również opisanymi w przykładzie 2.

Ekstrakcja DNA z liści tytoniu

Liście ze zregenerowanych roślin tytoniu zastosowano do wytwarzania ekstraktów DNA. Ekstrakty zastosowano w analizie PCR w celu stwierdzenia, czy linia tytoniu zawiera kasetę ekspresji CIP: SacB :2-1.2 g tkanki listnej pochodzącej z liści o długości 10 cm umieszczono w moździerzu zawierającym ciekły azot, na suchym lodzie. Tkankę rozdrobniono na drobny proszek. Proszek ten dodano do 10 ml buforu ekstrakcyjnego (50 mM Tris (pH 9,0), 10 mM EDTA, 2% SDS) w 50°C w sterylnej 50-ml polietylenowej probówce do wirówki. Dodano 5 mg proteinazy K i mieszaninę inkubowano w 50°C przez 10 minut z okresowym mieszaniem. Roztwór wyekstrahowano dwukrotnie mieszaniną fenol:chloroform:ałkohol izoamylowy [25:24:1) i dwukrotnie mieszaninąchłoroform:alkohol izoamylowy [24:1]. Warstwę wodną doprowadzono do uzyskania 0.3 M roztworu octanu sodowego i wytrącono 2,5 objętościami zimnego etanolu. Roztwór odwirowano przy 8000 x g i grudkę zawierającąkwasy nukleinowe przemyto 70% etanolem, a następnie wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem. Osad zawieszono w 10,0 ml wody, wymieszano z równą objętością 4M LiCl₂ i wstawiono do lodu na 1 godzinę w celu wytrącenia. Roztwór odwirowano przy 12 000 x g w 4°C przez 25 minut. Na tym etapie RNA przeszedł do osadu, a DNA pozostał w roztworze. Supematant zawierający DNA wytrącono 1 objętością zimnego 2-propanolu, odwirowano, przemyto 70% etanolem i ponownie zawieszono w wodzie do zastosowania w analizie PCR.

Powodzenie transformacji stwierdzono na podstawie reakcjji PCR (sposób opisany w przykładzie 2), stosując DNA wydzielony z liści jako matrycę oraz startery PCR wymienionejako sekwencja Id nr 4 i sekwencja ID nr 5. Startery były specyficzne względem obszarów FTF oddalonych o około 1,3 Kb. Tylko te rośliny, które produkują oczekiwany fragment PCR DNA o 1,3 Kb uznano za dodatnie względem transgenu.

Indukcja promotora In2-2 i genów chimerycznych w transgenicznych roślinach

Indukcję wektora ekspresji CIP:SacB:In2-1 przeprowadzono przecinając liść transgenicznego tytoniu i natychmiast zanurzając jego koniec w roztworze Hoaglanda 0,5X (KC Biologicals) zawierającym 200 mg/litr N-(aminokarbonylo)-2-chlorobenzenosulfonamidu (2-CBSU). Indukcja RNA zachodzi w tkance listnej w ciągu 1-2 godzin, przy czym maksymalna indukcja występuje w 24 godziny po obróbce inicjującej (Hershey i Stoner, Plant Mol. Biol., 17:679-690 (1991)). Tkankę kontrolną otrzymano przez zanurzenie transgenicznych liści w roztworze Hoagland'a X0,5, bez dodawania 2-CBSU.

Analiza ekspresji FTF w liściach tr;a^.si^i^^i^znego tytoniu, zainicjonowanej przez2-CBSU

Po 6-8 godzinnej indukcji w transformowanych liściach rozwinął się przesiąknięty wodą fenotyp, a ponadto były one znacząco zwiędnięte. Dłuższa indukcja spowodowała całkowite zniszczenie transformowanych liści. Przy oglądaniu cienkich sekcji transformowanych liści indukowanych przez 6-8 godzin (pociętych żyletką) pod mikroskopem optycznym okazało się, że wewnętrzna struktura komórki zapadła się. Chloroplasty nie były już zorganizowane, ale skupiły się w środku komórki, którą zazwyczaj zajmuje wakuola. Liście kontrolne (nieindukowane, tytoń zawierający wektor ekspresji CIP:SacB:Ih2-1) pozostały sztywne i zielone nawet po 12-14 godzinnej indukcji.

Wydzielanie fruktanu z transgenicznej tkanki roślinnej

Wydzielanie fruktanu z liści transformowanych CIP:SacB:ł]n2-1 indukowanych przez 12-14 godzin przeprowadzono na drodze ekstrakcji i rozdzielania rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych węglowodanów. Tkankę (200-400 mg) z traisgemcznych liści rozdrobniono w 500 pl

180 543

80% etanolu w probówce mi0rowirów0i za pomocą plastikowego tłuczka i ogrzano do 80°C na 10 minut. Ogrzaną mieszaninę odwirowano przy 10000 x g przez 10-15 minut w temperaturze pokojowej. Supematant odrzucono, a osad ponownie zawieszono w 500 pl 80% etanolu, dokładnie wymieszano, ogrzano do 80°C na 10 minut i odwirowano. Etap ten powtórzono trzeci raz i ostateczny osad zawieszono w 200-400 pl sterylnej wody. Roztwór dokładnie wymieszano, ogrzano do 100°C na 10-20 minut i odwirowano przy 10000 x g przez 10 minut. Supematant z tego etapu zawierał węglowodan o wysokim ciężarze cząsteczkowym obejmujący fruktany i był zasadniczo wolny od rozpuszczalnych cukrów. Obecność fruktanów w supematancie można wykryć dowolnym ze sposobów podanych w przykładzie 1. Fruktany nagromadzone w transgenicznej tkance w tym doświadczeniu wykrywano metodą testu enzymatycznego, opisanego w przykładzie 1. Dodatek stężonego HCl do ostatecznego supematantu i inkubowanie w 70°C przez 10 minut, a następnie zobojętnianie NaOH wystarczyło do całkowitego zhydrolizowania obecnego fruktanu na poszczególne mery fruktozy. Stężenie fruktozy po takiej obróbce porównano ze znanymi wzorcami fruktozy i kontrolnymi ekstraktami z roślin dzikich, które nie zawierały fruktozy.

Analizy obecności fruktanu dla liści indukowanych CIP:SacB:In2-1 dała wynik pozytywny: poziom wolnej fruktozy w supematancie był wyższy niż u dzikich roślin kontrolnych. Wyniki te sugerują, że aktywność FTF i nagromadzenie fruktanu prowadzi do zniszczenia liści indukowanych przez 2-CBSU. Wyniki przedstawione powyżej oraz w przykładzie 2 wykazują, że uzyskany w wyniku konstytutywnej ekspresji cotozollczno FTF jest szkodliwy dla normalnego funkcjonowania komórek. Destrukcja liści tytoniu zawierających kasetę CIP:SacB:In2-1 po indukcji wyraźnie wskazuje na aktywność białka jako przyczynę obumierania, gdy ekspresja wystąpi w cytozolu komórek roślinnych.

Ten fakt wyraźnie sugeruje, że enzymy o aktywności takiej jak gen Bacillus lub podobne geny o aktywności metabolizowania sacharozy powstałe w wyniku ekspresji w cytozolu zakłócają syntezę sacharozy, transport sacharozy do tkanek docelowych i/lub zmieniają potencjał osmotyczny w komórce. Wynikiemjest poważny niekorzystny wpływ na komórki rośliny i z tego względu, w oparciu o uzyskane wyniki, należy stwierdzić, że dla zapewnienia' powodzenia transformacji roślin białkiem o aktywności FTF lub podobnej musi się wziąć pod uwagę właściwe specyficzne względem tkanki lub elementów subkomórkowych sygnały regulujące.

Przykład 4. Ekspresja genu Bacillus FTF w wakuoli komórki roślinnej

Gen FTF w wakuoli komórki roślinnej

Konstytutywna ekspresja bakteryjnego genu FTF w cytozolu komórek liści nie zakończyła się powodzeniem. Fakt ten, w połączeniu z wiedzą, że fruktany syntetyzowane w roślinach takich jak karczoch jerozolimski i cykoria, gromadzą się w wakuolach komórek magazynujących, sugeruje, że ukierunkowanie FTF na wakuolę z wykorzystaniem sacharozy w tym przedziale komórki, może doprowadzić do gromadzenia się fruktanu w transgenicznej roślinie bez znaczącego niepożądanego efektu.

Konstrukcja chemicznie indukowanej kasety ekspresji FTF ukierunkowanej na wakuolę

Addycja ukierunkowującej na wakuolę sekwencji sporaminy dwuliściennego słodkiego ziemniaka do FTF

Sporaminę ukierunkowującą na wakuolę, opartą na opublikowanej sekwencji DNA (Matsuoka i inni, J. Biol. Chem., 32:19750-19757 (1990)) zsyntetyzowano w postaci dwóch odrębnych oligonukleotydów. Oligonukleotydy sekwencja ID nr 6 i sekwencja ID nr 7 zawierają informację kodującą dla prepro- i pro-peptydu 'o 37 aminokwasach, wystarczającą do skierowania operacyjnie połączonych chimerycznych białek do wakuoli komórek roślinnych. Sekwencję aminokwasów kodowaną przez te oligonukleotydc przedstawiono jako sekwencja ID nr 8.

Oligonukleotydy sekwencja ID nr 6 i sekwencja ID nr 7 zawierają również miejsca rozpoznawania dla enzymów' restrykcyjnych Spel, BspHI, Ncol i XhoI, przydatne w subklonowaniu fragmentów w funkcyjnych kasetach ekspresji. Oligonukleotydc kodujące s^^^ii^iową sekwencję Oierującąfosforclowano w mieszaninie reakcyjnej zawierającej 50 mM Tris-HCl (pH 7,5),

180 543 mM MgCl, 10 mM 2-merkaptoetanol, 1 pmol 5'-końców i 1 jednostkę polinukleotydowej kinazy T4 w 25 pl, inkubowano w 37°C przez 30 minut. Fosforylowane oligonukleotydy wytrącono w 2 objętościach etanolu przez wirowanie przy 1000 x g praez 20 minut, po czym ponownie zawieszono w wodzie. Po zawieszeniu250 ng każdego z oligomerów zmieszano, całość ogrzano do 100°C na 5 minut i pozostawiono do hybrydyzacji przez schłodzenie do temperatury pokojowej na 30 minut.

Zhybrydyzowane oligonukleotydy strawiono i zligowano z Bluescript SK(+), uprzednio pociętymi enzymami restrykcyjnymi Spel i XhoI. Sekwencje zweryfikowano na drodze sekwencjonowania terminacyjnego łańcucha di-dezoksy i porównano z sekwencjami opisanymi przez Matsuokę i innych, J. Biol. Chem., 32:19750-19757 (1990). Następnie sporamnowąsekwencję kierującąwydzielono z wektora klonującego Bluescript SK(+) przez trawienie BspHI i Xhol i zligowano do TDS-136, (uprzednio strawionego Ncol i XhoI). Uzyskany plazmid 136-Spor zawierał chemicznie indukowany obszar promotora (2-2) i sporamnowąsekwencję ukierunkowującą na wakuolę, funkcyjnie połączoną tak, że sekwencja kierunkowa może ulec translacji od natywnego kodonu inicjacyjnego CIP. Plazmid 136-Spor strawiono następnie Ncol, tępy koniec wypełniono enzymem Klenowa i ponownie strawiono Xbal. Fragment 1,2 Kb fragment zawierający promotor CI i sekwencję ukierunkowującą na wakuolę wydzielono i zligowano z SacB:In 2-1, który uprzednio strawiono Xbal i EcoRV. Uzyskano w ten sposób pełną kasetę ekspresj i zawierającą promotor CI funkcyjnie połączony ze sporamnową sekwencją ukierunkowującą na wakuolę, która była funkcyjnie połączona z genem Bacillus FTF i sekwencjąterminacji transkrypcji In 2-1. Plazmid nazwany CIP-Spor-SacB strawiono BamHI i KpnI. Gen FTF i odpowiednie sekwencje regulujące i kierujące wydzielono na pojedynczym fragmencie DNA i zligowano do wektora binarnego pZS97K, rozciętego tymi samymi enzymami restrykcyjnymi. Przeniesienie kasety ekspresji do Agrobacterium metodą koniugacji trójrodzicielskiej i transformację do tytoniu opisano w przykładzie 2. Test obecności kasety ekspresji CIP-Spor-SacB w t^an^ifo^i^^anych liniach tytoniu wykonano metodą analizy PCR (przykład 2) stosując startery specyficzne dla genu FTF, opisane w przykładzie 3 (sekwencje ID nr 4 i 5).

Indukowanie kasety ekspresji CIP-Spor-SacB w tytoniu

W pełni rozwinięte dorosłe liście i niedojrzałe, 8-10 cm liście z roślin tytoniu dodatnich względem PCR, zawierających kasetę ekspresji CIP-Spor-SacB zaindukowano w sposób opisany w przykładzie 3. Indukcja kasety CIP:SacB:In2-1 (nieukierunkowany FTF, przykład 3), spowodowała znaczące uszkodzenie liści tytoniu w bardzo krótkim okresie czasu. Dodanie funkcyjnej sekwencji ukierunkowującą na wakuolę w tym doświadczeniu wywarło znaczący wpływ na fenotyp liści indukowanych 2-CBSU przy zbliżonym okresie indukowania. Prowadzona przez 8-10 godzin indukcja liści tytoniu zawierających CIP-Spor-SacB (FTF ukierunkowujący na wakuolę), nie wykazała różnic fenotypowych w porównaniu do dodatnich liści kontrolnych (tytoń dziki). Ujemne liście kontrolne bez sygnału ukierunkowującego na wakuolę (CIP:SacB:Irn2-1) ponownie okazały się napęczniałe wodą i zaczęły więdnąć. Linie tytoniu CIP-Spor-SacB również wykazały fenotyp więdnięcia, ale dopiero po 24-36 godzinach indukcji. Dzikie liście kontrolne także wykazały nieznacznie więdnący fenotyp po 36 godzinach, z tym że liście CIP:SacB:lIn2-1 w tym czasie były brązowe, suche i całkowicie rozpadły się.

Wydzielanie pełnego komórkowego RNA z indukowanej tkanki listnej

Liście CIP-Spor-SacB dzikie liście kontrolne po indukowaniu przez 12-14 godzin wyj ęto z roztworu Hoagland'a a zawierającego 2-CBSU lub z samego roztworu Hoagland'a i przemyto sterylnąwodą. Pełny RNA wydzielono z indukowanych i nieindukowanych liści z wykorzystaniem odczynnika w postaci tiocyjanianu guanidyny.

Tiocyjanian guanidyny przygotowano rozpuszczając zawartość 100-g butelki (Kodak Laboratory and Specialty Chemicals) w 80 ml wody i dodając 1066 ml 1 M Tris-HCl (pH 7.6) i 10,6 ml 200 mM Na2 EDTA. Roztwór mieszano aż do rozpuszczenia zawartości butelki, po czym dodano 4,24 g laurylosarkozynianu sodowego i 2,1 ml 2 -merkaptoetanolu. Objętość roztworu doprowadzono do 212 ml sterylną wodą. Roztwór przed użyciem przechowywano w ciemności w 4°C.

180 543

Próbki liści s2ybko zamrożono przez zanurzenie w ciekłym azocie. Po schłodzeniu 10-15 g tkanki przeniesiono do moździerza i roztarto na drobny proszek. Sproszkowaną tkankę umieszczono w 150-ml butelce do wirówki Corex™ zawierającej 5 części (objętościowo/wagowych) schłodzonego w wodzie odczynnika, tiocyjanianu guanidyny, 0,5 ml chloroformu, 0,2 ml n-oktanolu i 2,5 ml wanadylowego kompleksu rybonukleozydu (Bethesda Research Laboratories, Gairsburg, MD). Tkankę dokładniej rozdrobniono w aparacie Brinkman polytron PT-10/35 przy maksymalnej szybkości przez 1 minutę. Surowy ekstrakt tkankowy odwirowano przez 10 minut przy 27 000 x g w 4°C. Supematant zdekantowano do cylindra miarowego i na każde 2,5 ml roztworu dodano 1 g CsCl. Mieszaninę odwirowano przy 36 000 x g przez 10 minut w 4°C wylano w warstwach na 2-ml wkłady z 5,7 M CsCl w probówkach do ultrawirówki z poliallomeru, o wymiarach 9/16 calax 3-1/2 cala. Układ gradientowy wirowano przy 28 000 x g w 10°C przez 15-20 godzin stosuj ąc wirówkę Beckman 5 W41Ti. Po wirowaniu probówki dokładnie odciągnięto i ich ścianki wytarto do sucha. Osad rozpuszczono w 0,2 ml buforu TES (10 mM TRIS-HC1 (pH 7,4), 5 mM EDTA i 1% SDS) i przeniesiono do 15-ml probówk do ultrawirówki. RNA połączono z równąobjętościąmieszaniny chloroform:n-butanol i krótko zmiksowano. Uzyskaną emulsję wirowano przy 8 000 x 5 przez 5 minut w 20°C. Warstwę wodnąprzeniesiono do świeżej 15-ml probówki do wirówki, a fazę organiczną wyekstrahowano równą objętością TES i połączono z poprzednią fazą wodną RNA wytrącił się w -20°C po co najmniej 2 godzinach, po dodaniu 10 objętości 3,0 M octanu sodowego (pH 6,0) i 2 objętości etanolu. RNA oddzielono przez wirowanie przy 10 000 x g przez 20 minut w 4°C. Warstwę supematantu ostrożnie odciągnięto i RNA rozpuszczono w 0,5 ml sterylnej wody. Niewielką próbkę rozcieńczono 100-krotnie wodą i zmierzono przy takim rozcieńczeniu Α_2ω w celu oznaczenia stężenia RNA.

Analiza pełnego RNA metodą blottingu szczelinowego

Filtr nitrocelidozowy (Schleicher and Schuell BA- 85) zwilżono przez dwukrotne namoczenie przez 10 minut w wodzie, a następnie przez 10 minut w 1M octanie amonu. Filtr umieszczono następnie w aparacie do blottingu szczelinowego (Schleicher i Schuell, Kheene, NH). Szereg próbek po 2,5 pi RNA z liści nie poddanych obróbce oraz z liści indukowanych 2-CBSU rozcieńczano do ostatecznej obj^tości 80 pl sterylnąwodą. Po rozcieńczeniu do każdej próbki dodano 40 pl buforu denaturacyjnego (30% formaldehyd, 100 mM fosforan sodowy (pH 6,8)) i wszystkie próbki inkubowano w 65 °C przez 10-20 minut, a następnie szybko schłodzono w lodzie przez 5 minut. Po schłodzeniu do każdej próbki dodano 30 pl 4 M octanu amonu i próbki po 150 pl wprowadzono do szczelin komórki blottingowej przy wykorzystaniu podciśnienia 10-15 mm Hg. Filtr wyjęto z komórki blottingowej, wysuszono na powietrzu i wygrzewano przez 2 godziny w 70°C pod zmniejszonym ciśnieniem. Filtr inkubowano w 10 ml wstępnie hybrydyzowanego buforu (50% dejonizowany formamid, 5X SSC, 5X Denhardfs, 100 p/ml denaturowanego DNA z grasicy bydlęcej, 40 mM fosforan sodowy (pH 6,8) i 0.5% albuminy z surowicy bydlęcej) w zgrzanej na ciepło torebce, przez 6 godzin w 42°C, z okresowym mieszaniem. Filtr hybrydyzowano z poddaną nick-translacji (oznaczoną ³²P w zestawie BRL do nick-translacji) sondą genu FTF (1,3 Kb, fragment DNA EcoRV-XbaI, wydzielony z plazmidu pB311 i homologiczny jedynie z obszarem kodującym FTF). Przeprowadzono to odrzucając roztwór prehybrydyzacyjny z torebki i zastępując go 2,5 ml buforu hybrydyzacyjnego (50% dejonizowany formamid, 5X SSC, 100 p/ml denaturowanego DNA z grasicy bydlęcej, 40 mM fosforan sodowy (pH 6,8)) zawierającego 1,25 x 10⁷ cpm opisanej powyżej sondy genu FTF po nick-translacji. DNA po nicktranslacji denaturowano przez 10-minutowe gotowanie, a następnie szybkie schłodzenie w lodzie. Filtr hybrydyzowano przez noc w 42°C z okresowym mieszaniem.

Następnego dnia filtr wyjęto z torebki i przemyto dwukrotnie w temperaturze pokojowej przez 10-15 minut w wytrząsarce mieszaniną 2X SSC, 1 mM EDTA, 20 mM fosforan sodowy (pH 6.8), 1 mMpirofosforan sodowyi0.5% SDS. Następnie filtr przemyto dwa razy przez 30 minut w 65°C zapomocąO. 1X SSC i 0.5% SDS. Filtr szybko wysuszono na powietrzu, owinięto w polistyrenowe opakowanie do żywności i poddano przez noc autoradiografii stosując film Kodak XAR-5 film i pojedynczy ekran intensyfikujący DuPont Lightning Plus.

180 543

Dziki tytoń nie dawał sygnału na błonie rentgenowskiej eksponowanej przez okres do 48 godzin na działanie filtru z blottingu szczelinowego. Natomiast 15 spośród 22 transgenicznych linii CIP-Spor-SacB zawierających RNA, który hybrydyzuje specyficznie z sondą geny FTF dawało dodatni sygnał na błonie rentgenowskiej tylko dla linii zawierających RNA z indukowanych liści. Ilość indukowanego RNA zmieniała się znacznie pomiędzy liniami

Kierowanie FTF do wakuoli komórek tytoniu w wyniku zastosowania ukierunkowującąna wakuolę sekwencji jednoliściennej lektyny jęczmienia

Konstrukcja CIP-Blec-SacB

Kasetę ekspresji zawierającą gen FTF funkcyjnie połączony z N i C-końcowąlektynąjęczmienia ER i sekwencjami ukierunkowującymi na wakuolę, połączony z chemicznie indukowanymi sygnałami regulującymi, skonstruowano syntetyzując najpierw dwa komplementarne oligonukleotydy wymienione jako sekwencja ID nr 9 i sekwencja ID nr 10. Oligonukleotydy, sekwencja ID nr 9 i sekwencja ID nr 10, oparte są na publikowanej sekwencji DNA, odnośnie której stwierdzono, że jest niezbędna wystarczająca do kierowania obcych białek, które weszły do układu wydzielniczego, do wakuoli tytoniu, jak to opisali Bednarek i inni, (Plant Celi, 2:1145-1155 (1990); Dombrowski i inni, Plant Celi, 5:587-596 (1993). Oligonukleotydy fosforylowano i hybrydyzowano w sposób opisany powyżej. Zhybtydyzowane oligonukleotydy strawiono BglII i HincII miejsca enzymów restrykcyjnych zawarte w oligonukleotydowych sekwencjach DNA) i zligowano z plazmidem SacB:In2-1, który został uprzednio strawiony tymi samymi enzymami restrykcyjnymi. Uzyskano w ten sposób plazmid SacB:CTPP:In2-1.

C-końcowa ukierunkowująca na wakuolę sekwencja lektyny jęczmienia (zawarta w sekwencji ID nr 9 i w sekwencji ID nr 10) wystarcza do skierowania białka do wakuoli komórki roślinnej tylko po wejściu do układu wydzielniczego. Sekwencję aminokwasów C-końcowego genu lektyny jęczmienia, kodowaną przez oligomd<l(^<n;yyd^u, przedstawia sekwencja ID nr 11. Białko lektyny jęczmienia również zawiera N-końcowy sygnał kierujący białka do układu wydzielniczego. N-końcowy sygnał wydzielniczy został sklonowany z DNA jęczmienia w reakcji PCR.

Dwa startery oligonukleotydowe, które flankują każdy koniec sygnału wydzielniczego lektyny jęczmienia, zsyntetyzowano i zastosowano w reakcji PCR. Sekwencję nukleotydu startera 5' przedstawiono j ako sekwencj ę ID nr 12, a sekwencj ę nukleotydową odwrotnego uzupełnienia, startera 3' przedstawiono jako sekwencję ID nr 13. Oligonukleotydy z sekwencji ID nr 12 zawierająrównież miejsce rozpoznawania sekwencji przez enzymy restrykcyjne EcoRI i BspHI. Starter oligonukleotydowy z sekwencji ID nr 13 zawiera sekwencję odpowiadającą miejscu rozpoznawanemu przez enzymy restrykcyjne Ncol i Sali. Startery (sekwencja ID nr 12 i sekwencja ID nr 13) oparte sąna opublikowanym N-końcowym wydzielniczym (ER) sygnale genu lektyny jęczmienia (Lemer i Raikel, Plant Phys., 91:124-129 (1989)). Oligonukleotydy zhybtydyzowano z genomowym DNA jęczmienia, zastosowanojako matrycę i przeprowadzono reakcję PCR (w sposób opisany w przykładzie 2). Z reakcji PCR wydzielono fragment o około 100 bp, strawiono go EcoRI i SaII i zligowano z wektorem klonującym, Bluescript SK(+) (Stratagene, La Jolla, CA). Uzyskany klon nazwano SK-5' BLEC. Wstawiony fragment DNA poddano sekwencjonowaniu w celu potwierdzenia, że nukleotydy takie samejak opublikowanej sekwencji sygnału 5' ER jęczmienia.

Sygnał 5' ER jęczmienia operacyjnie połączono z kodonem inicjacyjnym promotora CI przez trawienie SK-5'Blec za pomocąBspHI i SaII. Fragment PCR zligowano z TDS-136, uprzednio strawionym NcoI i SaII, uzyskując plazmid 136-BLEC. ClP:Blec:SacB:Blec:In2-1 uzupełniono przez trawienie 136-Blec Ncol i wypełnienie tępego końca enzymem Klenowa, po czym DNA wytrącono i strawiono enzymem restrykcyjnym Xbal. Wydzielony fragment DNA zawierający promotor CI i funkcyjnie połączoną kierującą sekwencję 5' lektyny jęczmienia ER zligowano z plazmidem SacB:CTPP:In2-1 strawionym Xbal i EcoRV. Pełną kasetę ekspresji, CIP:Blec:SacB:Blec:In2-1, zawierającą sygnały od genu lektyny jęczmienia wystarczające do skierowania białka do wakuoli komórki, strawiono BamHI i KpnI, zligowano z wektorem binarnym pZS97K i uzyskany plazmid przeniesiono do Agrobacterium na drodze koniugacji trójrodzicielskej w sposób opisany w przykładzie 2. Tytoń transformowano kasetą ekspresji

180 543

CIPŁlemSaoBŁlecd^-1 kasetę ekspresji wstawioną do wektora binarnego w sposób opisany w przykładzie 2. Ustalenie dodatniej transgeniczności roślin zawierających wektor ekspresji wykonano sposobami opisanymi uprzednio (reakcja PCR opisana w przykładzie 2, a startery specyficzne dla bakteryjnego genu FTF opisano w przykładzie 3). Indukcję promotora CI i ekspresję ukierunkowanego genu FTF wykonano metodami indukcji opisanymi w przykładzie 3. Ekstrakcję pełnego RNA i analizę RNA metodąblottingu szczelinowego wykonano w sposób opisany powyżej.

Dziki tytoń nie dawał sygnału na błonie rentgenowskiej eksponowanej na działanie filtru z blottingu szczelinowego przez okres do 48 godzin. Natomiast 16 spośród transgenicznych zbadanych linii CIP-Blec-SacB-Blec dało wynik pozytywny przy blottingu szczelinowym, ale tylko w przypadku liści indukowanych 2-CBSU, jak to opisano powyżej. Również w tym przypadku ilość rNa znacznie różniła się między limami.

Znaczne różnice fenotypowe wykazane w roślinach CIP-SacB w porównaniu z liniami CIP-Spor-SacB lub CIP-Blec-SacB-Blec (nieueietunkowrna ekspresja FTF w porównaniu z ekspresjąukietunkowutącąna wakuolę) sugeruje, że sygnał ukierunkowujący na wakuolę z rośliny jedno- lub dwuliściennej może kierować białko FTF do wakuoli komórki tytoniu. Wykazanie gromadzenia się fruktanu w uszkodzonych liściach linii z nieukierunkowanym FTF jeszcze bardziej wzmacnia stwierdzenie, że ekspresja tego enzymu lub enzymów o podobnej aktywności w cytozolu komórki działa bardzo destrukcyjnie i prowadzi do zaniku rozwoju rośliny.

Konstytutywna ekspresja genu FTF ukierunkowanego na wakuolę

Konstrukcja wektora ekspresji 35S:Spor:SacB:Im2-1

Skonstruowano kasetę ekspresji w liściach, zawierającą obszar promotora 35S CaMV (Odell i inni, Nature 313:810-812 (1985); Hull i inni, Virology 86:482-493 (1987)), sekwencję lidera translacji z genu białka wiążącego chlorofil a/b (Cab) (Dunsmuir, Nuc. Acids Res., 13 :2203-2518 (1985) i obszar 3'Serminrcji tanskrypcji z genu syntezy nopalinowej (Nos) (Depicker i inni, J. Mol. Appl. Genet., 1:561-570 (1982)).

Kasetę nazwano pMH40.

Sporaminową sekwencję ukierunkowującą na wakuolę wydzielono jako fragment DNA HspHI-Ncol o 114 bp z plazmidu SK(+)Spor opisanego powyżej. Ten fragment o 114 bp zligowano z pMH40, który uprzednio strawiono Ncol. W związku z tym, że sporaminowa sekwencja ukierunkowująca na wakuolę może wstawiać się w dwóch różnych orientacjach, szereg klonów poddano sekwencjonowaniu i jeden z klonów zawierający orientację od 5' do 3', występujący w natywnym białku sporaminowym, oznaczono jako pMH40:Spor. Plazmid SacB:In2-1 strawiono BamHI i EcoRV i zligowano z fragmentem DNA zawierającym promotor CaMV 35S, połączono z sekwencją ukierunkowującą na wakuolę, wydzielono z pMH40:Spor strawiono Ncol, tępy koniec wypełniono enzymem Kłenowa i na koniec strawiono BamHI. Pełny konstrukt nazwano 3 SS:Spor:SacB:In2-1. Fragment DNA zawierający ekspresję rośliimą35S:Spor:SacB:IiL2-1 wydzielono przez trawienie BamHI i KpnI i zligowano z binarnym wektorem pZS97K. Wektor ten przeniesiono do Agrobacterium, którą następnie przeniesiono do tytoniu metodą infekcji krążków liści, opisaną w przykładzie 2. Rośliny zawierające kasetę ekspresji 35S:Spor:SacB:In2-1 zidentyfikowano przez wytworzenie w reakcji PCR fragmentu DNA o oczekiwanej wielkości, w sposób również opisany w przykładzie 2. Startery PCR specyficzne dla genu FTF opisane są w przykładzie 2. 15 dodatnich transgenicznie linii tytoniu umieszczono w glebie i hodowano do dojrzałości.

Analiza obecności fruktanu w roślinach transformowanych 35S:Spor:SacB:Iri2-1

Polimery węglowodanowe o wysokim ciężarze cząsteczkowym wydzielono z liści roślin transformowanych 35S:SponSacB:In2-J przez strącanie etanolem, w sposób opisany w przykładzie 3. Ekstrakt nierozpuszczalny w etanolu podzielono na 2 frakcj e; j edną hydrolizowano 1M kwasem solnym w 100°C przez 10 minut, po czym zobojętniono 1 M NaOH. Drugą frakcję oceniano w stanie wydzielonym. Obydwie frakcje analizowano metodami TLC opisanymi w przykładzie 1.

Dzikie liście nie dają sygnału zarówno w przypadku ekstraktów poddanych, jak i nie poddanych obróbce kwasem. Wyniki te wskazują, że tytoń nie gromadzi endogennych fruktanów.

180 543

Natomiast 2 z 4 zbadanych transformowanych roślin dały dodatni sygnał, który nie migruje od miejsca startu na płytce TLC, co sugeruje, ze ciężar cząsteczkowy polimeruj est duży. Ekstrakty z dodatnich roślin również dały dodatnie sygnały na ścieżkach po trawieniu kwasem, ciągnące się na taką samą odległość od startu jak fruktoza kontrolna. Dodatkowe próbki kontrolne, sama glukoza lub skrobia, nie dały na płytce TLC dodatniego sygnału. Fruktan z cykorii po obróbce HCl lub bez obróbki dawał wynik identycznyjak ekstrakty z transgenicznego tytoniu (to znaczy ścieżki dla ekstraktu bez obróbki dawały dodatni sygnał, który nie migrował od startu, a próbki po obróbce HCl dały dodatnie sygnały ciągnące się na taką samą odległość od startu jak fruktoza). Łącznie wyniki te wskazują, że polimer węglowodanowy o wysokim ciężarze cząsteczkowym gromadzi się tylko w roślinach transformowanych 35S:Spor:SacB:In2-1 oraz że polimer ten zawiera reszty fruktozy uwalniane przy obróbce kwasem.

Analiza antronowa ekstraktów nierozpuszczalnych w etanolu.

Ekstrakty z roślin transformowanych 35S:Spor:SacB:In2-1, otrzymane w sposób opisany powyżej, inkubowano w 100°C ze stężonym HCl przez 10 minut, schłodzono i zobojętniono NaOH. Obróbka taka wystarcza do zhydrolizowania polimerów frukba^«^ⁱwy^ch na poszczególne reszty fruktozy. W próbkach po obróbce HCl oznaczano ilościowo fruktozę wykonując analizę antronową w sposób opisany w przykładzie 1. W związku z tym, że frakcja oceniana metodą antronową jest nierozpuszczalna w etanolu, stwierdzono, że ciężar cząsteczkowy węglowodanujest wysoki. Wyniki analizy antronowej wskazują, że najwyższy poziom fruktanu nagromadzonego w tytoniu przy zastosowaniu takiego wektora ekspresji wynosi około 1-2% suchej wagi liścia.

Wszystkie rośliny transformowane 35S:Spor:SacB:In2-1 z wyjątkiem jednej osiągnęły dojrzałość i wydały nasiona. Zaobserwowano pewne skarłowacenie wzrostu, z tym że obecność fruktanu w normalnych pod innymi względami roślinach wykazuje, że stosowanie genu FTF ukierunkowującego na wakuolę stanowi dopuszczalny sposób syntezy i gromadzenia polimeru fruktozy o wysokim ciężarze cząsteczkowym w roślinie transgenicznej.

Przykład 5. Ekspresja FTF w transgenicznym ziemniaku

Konstrukcja cytozolicznej kasety ekspresji, specyficznej względem bulwy ziemniaka

Białko magazynowe, promotor patatyny, wydzielono w reakcji PCR (sposób opisany w przykładzie 2) stosując startery oligonukleotydowe oznaczone jako sekwencja ID nr 14 i sekwencja ID nr 15. Startery oparte były na opublikowanej sekwencji patatyny klasy I (Rocha-Sosa i inni, ENBO J., 8:23-31 (1989). Sekwencja ID nr 15 zawiera również miejsce rozpoznawane przez enzym Ncol w kodonie inicjacyjnym.

Fragment DNA o 1,0 Kb, wydzielony w reakcji PCR (z zastosowaniem genomowego DNA ziemniakajako matrycy) zligowano z wektorem klonującym pUClB (New Engli Biolabs, Beverly, MA), strawionym Smal. Plazmid ten nazwano pPPR001. Plazmid pPPR001 zawierający obszar promotora patatyny, wystarczający do specyficznej względem tkanki ekspresji w bulwach ziemniaka, strawiono HindIII i HincII. Fragment 1,0 Kb wydzielono i zligowano zBluescript SK(+) i (-) (Stratagene, La Jolla, CA) które strawiono HindIII i SmaI. Odzyskano fragment promotora o dwóch orientacjach. Plazmid wykazujący odpowiednią orientację do zajścia właściwej ekspresji oznaczono jako PatB.

Plazmid PatB strawiono Ncol i 5' zwisające nukleotydy wypełniono na tępych końcach enzymem Klenowa. Drugie trawienie BamHI doprowadziło do wydzielenia fragmentu 1,0 Kb zawierającego promotor papatyny z nienaruszonym kodonem inicjacyjnym. Fragment ten zligowano z plazmidem SacB:2-1 i rozcięto BamHI i EcoRV uzyskując kasetę ekspresji PatB:SacB:2-1. Trawienie PatB:SacB:2-1 za pomocąBamHI i KpnI, wydzielenie fragmentu o 2,8 Kb fragment i ligowanie z pZS97K doprowadziło do binarnego wektora zawierającego kasetę ekspresji zdolną do specyficznej względem tkanki ekspresji genu FTF w bulwach transgenicznego ziemniaka. Binarny wektor przeniesiono do Agrobacterium w sposób opisany w przykładzie 2.

180 543

Transformacja ziemniaka

Transformację binarnego wektora do ziemniaka przeprowadzono w sposób następujący: Do transformacji ziemniaka wykorzystano sposób z krążkami liści, stosując genNPT II jako selekcyjny marker. Sterylne krążki liści ziemniaka (cultivar Desiree) współhodowano ze szczepem Agrobacterium tumefaciens LBA4404 zawierającym specyficzną dla bulwy kasetę ekspresji wstawioną do binarnego wektora pZS97K. Współhodowlę prowadzono przez 48 godzin w obecności światła, w pożywce S2. Po współhodowli z Agrobacterium liście przemyto pożywką S2 zawierającą 1 g/litr karbanicyliny, wysuszono i umieszczono na pożywce S3 zawierającej 50 mg/litr kanamycyny. Po tygodniu w warunkach silnego naświetlania krążki liści przeniesiono na świeżą pożywkę S3 zawierającą 50 mg/litr kanamycyny. Niewielkie twardziny, które pojawiły się po 2 tygodniach w tej pożywce, przeniesiono na pożywkę S5 zawierającą 50 mg/litr kanamycyny na kolejne 2-3 tygodnie. W tym czasie twardziny rozwinęły się jeszcze bardziej; przeniesiono je na pożywkę S7 zawierająca 50 mg/litr kanamycyny. Podczas 2 tygodni na pożywce S7 twardziny wypuściły małe odroślą (o wysokości około 0,5 cm). Odroślą wycięto i umieszczono na pożywce ukorzeniającej, zawierającej 100 pg/litr kanamycyny. W 2 tygodnie po tych przenosinach odroślą rozwinęły się tak, że można było wyekstrahować DNA z liści i zanalizować je metodą PCR w celu sprawdzenia obecności genu FTF, jak to opisano uprzednio (przykład 2). Startery zastosowane w reakcji PCR były specyficzne dla genu FTF (sekwencja ID nr 4 i sekwencja ID nr 5). Dodane linie wsadzono do gleby w celu wykonania późniejszej analizy.

Pożywka S2 g/litr sacharozy

0,5 g/litr MES pH 5,5 g/litr mannitolu Pożywka S3

200 mg/litr glutaminy

0,5 g/litr kwasu 2-(N-morfolino) etanelosulfonowego (MES) (pH 5,7)

0,5 g/litr poliwinylopirolidonu g/litr mannitolu g/litr glukozy mg/litr siarczanu adeniny

0,5% agarozy mg/litr trans-zeatyny

0,1 pg/litr kwasu naladiksowego g/litr karbamcyliny Pożywka S5

200 mg/litr glutaminy

0,5 g/litr MES (pH 5,7)

0,5 g/litr poliwinylopirolidonu g/litr mannitolu g/litr glukozy mg/litr siarczanu adeniny

0,5% agarozy mg/litr trans-zeatyny g/litr karbaucyliny Pożywka S7

200 mg/litr glutaminy

0,5 g/litr MES (pH 5,7)

0,5 g/litr poliwinylopirolidonu g/litr mannitolu g/litr glukozy mg/litr siarczanu adeniny

180 543

0,5% agarozy mg/litr trąns-zeatyny

0,01 pg/litr kwasu giberylinowego g/litr karbanicyliny Pożywka ukorzeniająca

200 mg/litr glutaminy

0,5 g/litr MES (pH 5,7)

0,5 g/litr poliwinylopirolidonu g/litr sacharozy g/litr mannitolu g/litr glukozy mg/litr siarczanu adeniny

150 mg/litr CaCl2

0,4% agarozy mg/litr trans-zeatyny

100 mg/litr karbanicyliny

Analiza traugenicznych roślin ziemniaka

Traugeniczne linie ziemniaka i nietransfomowane, ujemne kontrolne rośliny hodowano w glebie do stanu dojrzałości i wytworzenia bulw, w chłodnym, słabo oświetlonym pomieszczeniu (12 godzin światło dzienne w 22°C, 12 godzin noc, 20°C).

Analiza fenotypowa transgenicznych roślin ziemniaka

Dodatnie PatB:SacB:2-1, transgeniczne linie ziemniaka porównano z dzikim typem oraz transformowanymi roślinami kontrolnymi (transformowanymi tylko binarnym wektorem pZS97K) wykazują zdecydowanie różne fenotypy. Młode rośliny przeniesione do gleby były tej samej wielkości co rośliny kontrolne. Jednakże w miarę dojrzewania roślin linie traugeniczne znacznie opóźniły się w stosunku do dzikich. Karłowacenie było zmienne, choć silne w przypadku pewnych linii trmsgenicznych. W około 6-8 tygodni po wsadzeniu do gleby dzikie i transformowane ujemnie rośliny kontrolne wydały szereg bulw, które dla tej samej rośliny różniły się wielkością. Liście na liniach traugenicznych coraz bardziej ulegały degeneracji, pojawiły się coraz większe obszary martwicowe. Dwie spośród 6 t^ju^fon^i^-^-a^^ch roślin nie wydały bulw, a w pozostałych liniach były one odbarwione i wyjątkowo małe. Większość transgenicznych linii PatB-SacB (nieukierunkowane ekspresory FTF) wytworzyła liczne małe zielone bulwy, zwane bulwami napowietrznymi, u podstawy rośliny. Bulwy napowietrzne nie są prawdziwymi bulwami, ale stanowią zbiorniki na sacharozę, gdy transport węgla do bulwy jest utrudniony. Stan taki nie występuje w roślinach kontrolnych. Próby odtworzenia roślin z niewielkich transformowanych bulw zakończyły się niepowodzeniem. W przypadku linii kontrolnych zgodnie z oczekiwaniem z bulw wyrosły rośliny.

Analiza bulw napowietrznych na obecność fruktiaiów

Małe zielone bulwy napowietrzne rozdrobniono w etanolu w sposób opisany przy ekstrakcji liści w przykładzie 3 i poddano lub nie poddano je obróbce HCl, jak w przykładzie 4. Wykonano test na fruktany metodą TLC (opisaną w przykładzie 1). Bulwy właściwe z dzikich i transformowanych ujemnych kontrolnych linii nie wytworzyły wykrywalnego sygnału na płytkach TLC, co świadczy, ze bulwy właściwe ziemniaka nie zawierają, ani nie gromadzą endogennego frukSrnu. Żadna z traugemcznych linii zawierających konstrukt PafB-SacB nie dała pozytywnego sygnału na płytkach TLC.

Wyjątkowe karłowacenie, tworzenie bulw napowietrznych i brak ftuksanu dobitnie sugeruje, że ekspresja genu FTF w cytozolu komórek rozwijających się bulw działa niekorzystnie na rozwój komórek. Może to uniemożliwić przemieszczanie się sacharozy do niedojrzałych bulw. Zahamowanie komórek bulw w tym doświadczeniu jest podobne do wyników uzyskanych w przykładzie 3, gdzie rozwój komórek liści tytoniu również został zahamowany przez białko FTF powstające w wyniku ekspresji w cytozolu. Szereg badań (Oparka i Wright, Planta, 175:520-526 (1988), i Oparka i Wright, Planta, 174:123-126 (1988)) wykazało, że potencjał osmotyczny ma

180 543 decydujące znaczenie dla rozwoju bulw i że jego zaburzenie może opóźnić lub zahamować rozwój bulwy przez uniemożliwienie przemieszczania się sacharozy do bulw. Uzyskane wyniku potwierdza zahamowany rozwój bulw na skutek zniszczenia możliwości przemieszczania się sacharozy na skutek aktywności FTF w cytozolu komórek niedojrzałych bulw.

Konstrukcja specyficznego względem bulw genu FTF ukierunkowującym. na wakuolę

Plazmid PatB strawiono Ncol i wypełniono na tępych końcach enzymu Klenowa, po czym wykonano trawienie XhoI. Z plazmidem tym zligowano sekwencję sporaminy ukierunkowującą na wakuolę po wydzieleniu fragmentu z wektora subklonującego Bluescript (+) zawierającego sekwencję sporaminy (przykład 4), strawionego BspHI i XhoI. Uzyskany plazmid nazwano Pat: B:Spor. PatB:Spor strawiono następnie Ncol, wypełniono na tępych końcach enzymem Klenowa i strawiono drugim enzymem restrykcyjnym, Spel. Zligowano z nim fragment wydzielony z SacB:In2-1. Fragment o 1,8 Kb wydzielono po trawieniu eznymami restrykcyjnymi Spel i EcoRV. Uzyskany plazmid was nazwano PatB: Spor:SacB:In2-1. Pełny plazmid (PatB:Spor:SacB:In2-1), zawierał promotor specyficzny względem bulwy, sygnał ukierunkowujący na wakuolę operacyjnie połączony z obszarem kodującym FTF i obszarem terminacji transkrypcji. Strawiono go BamHI i KpnI, Fragmenty odpowiedzialne za ekspresję wydzielono i zligowano z binarnym wektorem pZS97K w celu przeniesienia do Agrobacterium. Transformację w Agrobacterium przeprowadzono na drodze koniugacji trójro<dzicielskiej w sposób opisany w przykładzie 2. Transformowanie ziemniaka tym wektorem wykonano w sposób opisany powyżej. Dodatnio transformowane linie ziemniaka zidentyfikowano na podstawie reakcji PCR, jak to opisano w przykładzie 2, stosując startery specyficzne dla FTF, opisane w przykładzie 3. Linie ziemniaka dzikiego typu hodowano do stanu dojrzałości wraz z transgenicznymi liniami PatB:Spor:SacB:In2-1 w warunkach opisanych powyżej.

Analiza RNA transgenicznych linii ziemniaka PatB: Spor: SacB:Iri2-1

Pełny RNA wyekstrahowano w rozwijających się bulw w sposób opisany przy wydzielaniu RNA z liści tytoniu w przykładzie 4. Wydzielone RNA rozdzielono na 1% żelu agarozowym zawierającym 3% formaldehydu w 5 mM tetraboranie sodowym, 0,17 mm soli disodowej EDTA. Rozdzielone RNA przeniesiono na membranę Zetaprobe™ stosując 20 x SSC, przeprowadzono hybrydyzację blottingową z odpowiednim ³²P-znaczonym fragmentem sondy DNA (fragment DNA pB311 EcoRV-XbaI, 1,3 Kb DNA fragment, homologiczny względem obszaru kodującego FTF) w45°C, przemyto 3 razy 2X SSC, 0,1% SDS w25°C, potem 3X 0,1X SSC i 0,1% SDS w 55°C, Transkrypty RNA z transformowanego genu wizualizowano wystawiając błonę rentgentowskąna działanie filtru przez 12-48 godzin.

Analiza Northema bulw transformowanych konstruktem PatB-Spor-SacB (ekspresory FTF ukierunkowujące na wakuolę), dała sygnał po hybrydyzacji z sondąpB311. Nie stwierdzono sygnału w bulwach typu dzikiego lub w bulwach zawierających tylko wektor binarny pZS97K. Poziomy transkrypcji RNA znacznie różniły się między liniami.

Analiza fruktanów w bulwach, w których zachodzi ekspresja genu Spor-SacB

Bulwy roztarto w etanolu w sposób opisany przy ekstrakcji węglowodanu o wysokim ciężarze cząsteczkowym z liści w przykładzie 3. Ekstrakty zadano HCl w sposób opisany w przykładzie 4, a test na fruktan wykonano metodąTLC w sposób opisany w przykładzie 1. Bulwy typu dzikiego i transformowane linie kontrolne (zawierające tylko binarny wektor) nie dały wykrywalnego sygnału na płytkach TLC, co ponownie wykazało, że bulwy ziemniaka nie gromadzą endogennego fruktanu. Dwie z 5 dodatnich w PCR bulw dały widzialny sygnał na płytce TLC, który nie migruje od linii startu w przypadku ścieżek z próbkami bez obróbki kwasem, oraz sygnał przesunięty na taką samą odległość od startu jak kontrolna fruktoza, w przypadku próbek po hydrolizie kwasem. Próbki skrobi nie poddane lub poddane obróbce kwasem nie dały dodatniego sygnału na płytkach TLC. Wyniki te wskazują na syntezę i gromadzenie fruktanów o wysokim ciężarze cząsteczkowym w wakuoli komórek transgenicznych bulw. Obecność fruktanu w bulwach, w których zachodzi ekspresja genu Sac FTF ukierunkowanego na wakuolę, oraz destrukcja roślin i zahamowanie wzrosty bulw przy transformowaniu ziemniaka nieukierunkowanymi wektorami FTF wyraźnie wskazuje, że ekspresja cytozoliczna tego genu metabolizującego sa180 543 charozę jest szkodliwa dla komórek roślinnych. W przeciwieństwie do bulw transformowanych nieukierunkowanym FTF bulwy z tego doświadczenia umieszczone w glebie kiełkują, dorastająi również tworzą bulwy.

Przykład 6. Specyficzna względem tkanki, ukierunkowana na wakuolę ekspresja genu FTF w kukurydzy

Opis sekwencji nukleotydowej genu zeiny i 10 kD, obejmującej sekwencję promotora można znaleźć w pracy Kirihary i innych, Gene, 71:359-370 (1988). Konstrukcja specyficznego względem bielma kukurydzy wektora ekspresji, wykorzystywanego w wynalazku, rozpoczyna się od wydzielenia końca 5' genu zeiny o 10 kD, obejmującego obszar promotora i część sekwencji kodującej. Osiągnięto to stosując opublikowaną sekwencję do stworzenia oligonukleotydów wykorzystywanych w reakcji PCR. Oligonulkeotydy wymienionejako sekwencja ID nr 16 i sekwencja ID nr 17, również zawierają sekwencje rozpoznawania enzymów restrykcyjnych w celu przeprowadzenia klonowania fragmentu DNA z PCR do klonującego wektora pTZ18 (Pharmacia, New Brunswick, JN). Oligonukleotyd o sekwencji ID nr 16 zawiera miejsce rozpoznawane przez enzym EcoRV, a o sekwencji ID nr 17 zawiera miejsce rozpoznawane przez Xbal.

Fragment DNA i 1,4 Kb z reakcji PCR wydzielono, strawiono ECoRV i Xbal i sublkonowano w pTZIB, strawionym uprzednio Smal i Xbal. Uzyskany plazmid nazwany p 10K1, zawierał sekwencje nukleotydu zeiny od -950 do 450 (przy uwzględnieniu nukleotydu adenozyny w inicjacyjnym kodonie translacji jako zasady 1 (Kirihara i inni, Gene, 71:359-370 (1988)).

W drugiej reakcji PCR z zastosowaniem oligonukleotydów o sekwencji ID nr 18 i sekwencji ID nr 19 uzyskano fragment DNA o 1,39 Kb, zawierający nukleotydy od 1 do 1395. Sekwencję ID nr 19 zawierającą miejsce rozpoznawane przez endonukleazę BamHI i fragment PCR strawiono BamHI i zligowano w miejsca BamHI i Smal w pTZ18. Wektor ten nazwano p10K3. Pełny gen zeiny zawierający obszar promotora i sekwencje kodujące zrekonstruowano z dwóch plazmidów, p10Kl i p10K3 wykorzystując obecne w każdym z nich unikatowe miejsce enzymu restrykcyjnego Spel. p10Kl strawiono EcoRI i Spel i wydzielono fragment DNA o 994 bp. Fragment ten zligowano z p10K3 strawionym tymi samymi dwoma enzymami uzyskując pełny gen zeiny w wektorze nazwanym pCC3.

Miejsca enzymów restrykcyjnych dalej zmodyfikowano, aby ułatwić subklonowanie fragmentów do lub z tego wektora. Unikatowe miejsce enzymu restrykcyjnego dodano na końcu 5' obszaru kodującego (1590 bp) przez strawienie Xbal i dodanie sekwencji oligonukleotydów wymiennych jako sekwencja ID nr 20 i sekwencja ID nr 21. Oligonukleotydy zsyntetyzowano, fosforylowano, zhybrydyzowano i zligowano z pCC3 standardowymi technikami manipulacji DNA.

kD obszar promotora zeiny według wynalazku wydzielono z plazmidu pCC3. Osiągnięto to przez trawienie pCC3 za pomocą EcoRI, a następnie wypełnienie tępych końców enzymem Klenowa. Plazmid wypełniony EcoRI strawiono następnie Smal i fragment DNA o 923bp, zawierający obszar promotora genu zeiny o 10 kD wydzielono i zligowano z plazmidem Bluescript SK(+) (StraUgene, La Jolla, CA) który uprzednio strawiono HincII. Uzyskany plazmid, nazwany SK(+)10 kD strawiono Ncol i XhoI. Fragment strawiony BspHI i XhoI, zawierający sekwencję sporaminy ukierunkowującą na wakuolę, wydzielony z plazmidu SK-Spor, opisanego powyżej, zligowano z plazmidem SK(+) 10 kD strawionym NcoI-XhoI, uzyskując konstrukt o nazwie 10kD-Spor. Plazmid ten strawiono Ncol, tępe końce wypełnione enzymem Klenowa i wykonano drugie trawienie enzymem restrykcyjnym Spel. Fragment DNA zawierający specyficzny względem ziarna kukurydzy promotor operacyjnie połączony z sekwencją sporaminy ze słodkiego ziemniaka, ukierunkowującą na wakuolę, wydzielono i zligowano z plazmidem SacB:In2-1, strawionym uprzednio Spel i EcoRV, uzyskując ostateczną kasetę ekspresji 10kD-Spor: SacB :In2-1. Kasetę zastosowano bezpośrednio do transformowania kukurydzy metodą bombardowania cząstkami.

Transformowanie kukurydzy bakteryjnym genem FTF

Hodowle twardzinowe zainicjowano z niedojrzałych zarodków (około 1,5-2,0 mm) wyciętych zjąder pochodzących z krzyżówek genotypów A188 i B73,10-12 dni po zapyleniu. Zarodki

180 543 umieszczono osią do dołu w kontakcie z pożywką N6 zestaloną agarozą. Zarodki utrzymywano w ciemności w temperaturze 27°C. Krucha zarodkowa twardzina składająca się z nierozróżnionych mas komórek z somatycznymi proembrioidami i embrioidami wyrośniętymi na wieszadełkowych strukturach rozprzestrzeniała się od tarczki tych niedojrzałych zarodków. Zarodkową twardzinę oddzielono od pierwotnego eksplantu hodowano na pożywce N6, przeprowadzając hodowlę pochodną co 2-3 tygodnie.

Do przeniesienia genów do hodowli komórek twardziny wykorzystano metodę bombardowania cząstkami. W doświadczeniach zastosowano Biolistic™ ^pDS-1000/He (DuPont Medical Products). Wektor plazmidowy zawierający selekcyjny gen markerowy zastosowano w transformacjach. Plazmid, pALSLUC (Fromm i inni Biotechnology, 8:833-839 (1990), zawierał cDNA genu syntazy dehydrogenazy acetolaktanowej (ALS). cDNA w ALS zmutowano in vitro, tak aby enzym kodowany przez gen był odporny na chlorosulfuron. Zmiana obejmowała mutowanie kodonu tryptofanu w pozycji 1626 cDNA na kodon leucyny. Gen ALS jest pod kontro ląpromotora CaMV 35S (Odell i inni, Nature 313:810-812 (1985)) i obszaru 3' genu syntazy nopalinowej z T-DNA plazmidu Ti Agrobacterium tumefaciens.

Plazmid pALSLUC was wytrącono na powierzchni cząstek złota. W tym celu 5 pg pALSLUC w buforze Tris-EDTA w stężeniu około 1 pg/pl dodano do 50 pl cząstek złota (przeciętna średnica 1 pm) zawieszonych w wodzie (60 mg złota/ml). Do zawiesiny złota i DNA w czasie miksowania zawartości probówki dodano chlorek wapnia (50 pl 2,5 M roztworu) i spermidynę (20 p l 1,0 M roztworu). Cząstek odwirowano następnie wmikrowirówce przez 10 s i supernatant odrzucono. Cząstki zawieszono następnie w 200 pl absolutnego etanolu. Cząstki odwirowano ponownie i supernatant odrzucono. Cząstki zawieszono w 30 pl etanolu. Po 5 pl cząstek złota pokrytych DNA umieszczono na każdym makrokrążku nośnika.

Małe grudki (2-3 mm średnicy) embriogenicznej twardziny umieszczono na powierzchni pożywki N6 zestalonej agarozą, w szalce Petriego o średnicy 12 cm. Tkankę przykryto krążkiem o średnicy około 6 cm. Szalki Petriego z tkanką umieszczono w komorze PDS-1000/He. Powietrze usunięto z komory do osiągnięcia podciśnienia 711 mm Hg. Makronośnik przyspieszono falą szokową helu stosując pękającą membranę, która rozrywa się gdy ciśnienie helu w rurze szkowej dojdzie do 1000 funtów/cal. Tkanka umieszczona była około 8 cm od ekranu zatrzymującego. 10 szalek z tkanką bombardowano cząstkami złota pokrytymi DNA.

W 7 dni po bombardowaniu tkankę przeniesiono na pożywkę N6 zawierającą 50 mM chlorosulfuronu oraz niedobór kazeiny lub proliny. Tkanka powoli rosła na tej pożywce. Po kolejnych 2 tygodniach tkankę przeniesiono na świeżą pożywkę N6 zawierającą chlorosulfuron. Po 8 tygodniach zidentyfikowano obszar aktywnie rosnącej twardziny o średnicy około 1 cm najednej z płytek zawierających pożywkę uzupełnionąchlorosulfuronem. Twardzina ta dalej rosła przy wykonywaniu hodowli pochodnych. Część tej twardziny przeniesiono na pożywkę umożliwiającą odtworzenie rośliny.

Pożywka N6 Składnik	Ilość/litr
Roztwór I	10,0 ιώ
CaCL2(1M)	1,25 ml
Roztwór III	11),0 ml
MgSO4 (1M)	0,75 ml
Roztwór V	1,0 r!
Koncentrat witamin	1,0 ml
Hydrolizat kazeiny	0,1 1
Sacharoza	60,0 0
Mioinozytol	041
2,4-D (2 mg/ml koncentratu)	0,5 ml
pH to	5,8
Dodać 6 g agarozy/płytkę

180 543

Roztwór I (NH₄)₂SO₄

KNO3

KH₂PO4

H₂0

Roztwór III

Na2EDTA FeSO₄ 7H2O H2O

Roztwór V

323 'gg 441,5 g rOg

500,0 ml

L55g

Wg

500,0 ml

H3BO3 0,16 g

MnSO4 · H2O 0,33 g

ZnSO4 · 7H2O 0,15 g

KI 0,08 g

Na2MoO4-2H2O 0,025 g

CuSO4 -5H2O 0,0025 g

CoCl2· 2H2O 0,002' g

H2O 100,0 ml

Koncentrat witamin niacyna 0,1' g tiamina 0,02' g pirydoksyna 0,025 g pantotenian wapnia 0,025 g

H2O 100,0 ml

Analiza Southema transformowanej twardziny

Wykonano analizę Southema twardziny, aby wykryć wprowadzenie chimerycznego genu FTF. Analizę Southema przeprowadzono wydzielając genomowy DNA z tkanki twardziny metodami ekstrakcji DNA opisanymi w przykładzie 2. W celach kontrolnych stosowano DNA wydzielony z linii transformowanej twardziny lub z twardziny pochodzącej z tego samego genotypu, ale nie transformowanej. Genomowy DNA strawiono BgIII. Strawiony DNA rozfrakcjonowano metodą elektroforezy żelowej w agarozie i przeniesiono znanymi sposobami na nylonową membranę. Blot na nylonie zhybrydyzowano z nick-translatowanym fragmentem DNA EcoRV-XbaI, wydzielonym z plazmidu pB311. Sonda zawierała jedynie sekwencję kodującąz genu FTF. Twardzina transformowana FTF wykazywałajedno dominujące pasmo odpowiadające genowi chimerycznemu. Dodatkowe pasma o zmiennych ciężarach cząsteczkowych uznano za przegrupowane kopie kasety ekspresji.

Analiza Southema transgenicznych roślin kukurydzy

DNA wyekstrahowano z dojrzałych liści kukurydzy metodą ekstrakcji opisaną w przykładzie 2. W DNA z nie transformowanych ujemnych kontrolnych roślin oraz z linii transgenicznych oceniano pod względem obecności kasety ekspresji 10 kD-Spor:SacB:Iin2-1 przeprowadzając analizę PCR wykorzystując sposób i startery opisane w przykładzie 2 oraz startery specyficzne względem FTF opisane w przykładzie 3.

Dodatkowo genomowy DNA strawiono do pełna za pomocą BgIII, rozdzielono fragmenty na 0,1% żelu agarozowym, przeniesiono DNA na membranę Hybond M stosując 20X SSC i hybrydyzowano biot z fragmentem DNA znaczonym dlgo0scgeniną. Znaczony fragment DNA wydzielono z plazmidu pB311 przez trawienie enzymami restrykcyjnymi EcoRV i Xbal. Fragment ten zawierałjedynie sekwencję kodującąz bakteryjnego genu FTF. Zastosowano procedury blottingu, znakowanie digoksygeninąfragmentu sondy, hybrydyzację oraz warunki przemywania wizualizacji sygnałów przeciwciałami opisane w zestawie blottingu Genius™ (USB, Cleveland, OH). Analizy metodą blottingu Southema transgenicznych roślin wykazały obecność szeregu wstawionych kopii nienaruszonych i kopii przegrupowanych kasety 10 kD-Spor:SacB:In2-1. Tylko te trćansgeniczne linie, które zawierały nienaruszoną kasetę, uznano za linie dodatnie.

180 543

Analiza obecności fruktanu w transgenicznych nasionach kukurydzy metodą TLC

Linie transformowane 10 kD-Spor: SacB :In2-1 hodowano w szklarni i poszczególne nasiona oceniano pod względem obecności fruktanu w 30-35 dni po zapyleniu lub w stanie dojrzałym. Szereg zestawów poszczególnych nasion z tej samej transgenicznej rośliny rozdrobniono w 80% etanolu metodą ekstrakcji węglowodanów opisaną w przykładzie 3. Ekstrakty zadano HCl w sposób opisany w przykładzie 5 i w próbkach oznaczano obecność fruktanu wykonując analizę na płytkach TLC w sposób opisany w przykładzie 1. Nietransformowane linie kontrolne nie dają dodatniego sygnału dla fruktanu na płytkach TLC, co oznacza, że kukurydza nie syntetyzuje ani nie gromadzi endogennego fruktanu w nasionach. 8 spośród 15 zbadanych linii dało dodatni sygnał fruktanu w analizie TLC. Wszystkie te linie PCR i transformowane, które są dodatnie według analizy Southema, dająrównież dodatni sygnał w TLC. Sygnał fruktanu nie migruje znacząco od startu na ścieżkach próbek nie poddanych obróbce oraz przemieszcza się na taką samą odległość co fruktoza na ścieżce kontrolnej, gdy ekstrakty ogrzewano z kwasem przed nakropleniem na płytkę TLC. Wyniki te wskazują że polimer fruktozy o wysokim ciężarze cząsteczkowym jest syntetyzowany i gromadzony tylko w nasionach kukurydzy transformowanych kasetą ekspresji 10 kD-Spor:SacB:Iń2-1.

Analiza metodą testu antronowego

Dojrzale, suche ziarna rozdrobniono i ekstrakty nierozpuszczalne w etanolu przygotowano w sposób opisany w przykładzie 3. Ekstrakty z dodatnio transformowanych linii oraz ujemnych linii kontrolnych (kukurydza typu dzikiego) oznaczano metodą antronową w sposób opisany w przykładzie 5; wyniki zestawiono poniżej w tabeli 3.

Tabela 3

Poziom nagromadzenia fruktanu w komórkach bielma transgenicznej kukurydzy, oznaczony w próbie antronowej

Fruktoza (mg/g świeżej wagi)

LH 195
(kontrolna)	0,0
1033.8.5	2,2
1033.6.1	2,7

Wyniki w tabeli 3 wykazują że fruktan gromadzi się w nierozpuszczalnej w etanolu frakcji nasion kukurydzy transformowanych 10 Kd-Spor-SacB (FTF ukie^j^t^-wującym na wakuolę), wektorem ekspresji, oraz że gromadzenie fruktanu w tych liniach nie utrudnia dojściu do dojrzałości. Nasiona z każdej linii zebrano w stanie dojrzałym, wysuszono i umieszczono w glebie. Pod względem szybkości kiełkowania nasiona uzyskane z transgenicznych roślin nie różniły się od nasion z nietransformowanych linii kontrolnych.

Przykład 7. Transgeniczne linie kukurydzy zawierające cytozoliczne lub ukierunkowujące na wakuolę kasety ekspresji SacB

Konstrukcja 10 kD-SacB

Kasetę ekspresji zawierającą gen Bacillus SacB transkrypcyjnie kontrolowany przez promotor zeinowy o 10 kD skonstruowano trawiąc plazmid pSSU-SacB opisany w przykładzie 2 enzymem restrykcyjnym SaII, a nasrępnie wypełniając tępe końce z zastosowaniem enzymu Klenowa Drugie trawienie enzymatyczne plazmidu za pomocą Ncol umożliwiło wydzielenie fragmentu o 1,3 kb metodą elektroforezy w żelu agarozowym. Fragmenty Ncol/SaII o 1,3 kb, z wypełnionymi tępymi końcami zligowano z plazmidem pCC3 (opisanym w przykładzie 6), strawionym uprzednio za pomocąNcol i Smal. Uzyskany zrekombinowany plazmid oznaczono jako 10kD-SacB.

180 543

Pełną kasetę ekspresji 10kD-SacB, zawieraj^^iąpromotor zeinowy o 10 kD, wystarczającą dla ekspresji specyficznej względem tkanki ' i stadium rozwoju, zastosowano bezpośrednio do transformowania kukurydzy przez bombardowanie cząstkami, w sposób opisany w przykładzie 6.

Fenotypowa charakterystyka transgenicznych nasion zawierających kasetę ekspresji 10eD-SacB

Transgeniczne linie kukurydzy zawierające kasetę 10kD-SacB hodowano w szklarni, w warunkach samozapylania. Fenotypowo transgeniczne ziarna kukurydzy zawierające kasetę 10kD-SacB nie bardzo różniły się od nasion typu dzikiego we wczesnym stadium rozwoju (10-15 dni po zapyleniu). Natomiast dojrzałe ziarna wykazywały silnie pomarszczony fenotyp, zdecydowanie różniący się od fenotypu nasion typu dzikiego (traugenicznych nasion nie zawierających kasety 10kD-SacB) w tym samym stadium. Różnicę w wadze nasion przedstawiono poniżej w tabeli 4.

Analiza traugenicznych nasion zawierających kasetę ekspresji 10eDISacB

Nasiona traugeniczne i dzikiego typu do analizy obecności fruktanu zebrano w stanie dojrzałym (około 45-55 dni po zapyleniu). Obecność fruetanu w szeregu nasionach wykazujących normalny fenotyp zębowy lub fenotyp pomarszczony ’ oznaczano metodą TLC opisaną w przykładzie 1. Tylko ziarna z pomarszczonym fenotypem dawały dodatni sygnał na płytce TLC zabarwionej układem mocznik-kwas fosforowy. Dodatni sygnał nie migrował od startu na płytce TLC, co sugeruje obecność polimeru o wysokim ciężarze cząsteczkowym.

Ilościową analizę ffuktanu w. nasionach wykazujących fenotyp zębowy i pomarszczony wykonano metodą antonową opisanąw przykładzie 5. Wagę nasion i procent fruktanu w przeliczeniu na suchą masę nasion podano w tabeli 4.

Tabela 4

Linia nasion	Waga nasion (mg)	% fruktozy (na suchą masę nasion)
654 nr 1	30	1,19
654 nr 2	30	2,38
654 nr 3	20	0,71
654 nr 4	40	2,77
654 nr 5	20	1,25
654 nr 6	270	0,23
654 nr 7	220	0,36
654 nr 8	240	0,16

Analiza TLC i danych z tabeli 4 wykazuje, że nasiona z fenotypem zębowym (654 nr 6,7 i 8) nie gromadzą fruksanu, a tylko w nasionach o silnie pomarszczonym fenotypie (654 nr 1-5) polimer tenjest syntetyzowany. Z danych tych wynika, że cytolityczna ekspresja genu Sac w bielmie kukurydzy zdecydowanie wpływa na rozwój bielma Na rozwój bielma może wpływać zmniejszenie gromadzonej suchej masy w nasioanch zawierających kasetę 10kD-SacB. Jakkolwiek skrobia znajduje się w nasionach zawierających ήΊΤη (co stwierdzono na podstawie zabarwienia jodem), to ilość skrobi była znacznie mniejsza, jeśli weźmie się pod uwagę 10-krotny spadek wagi nasiona

Kiełkowanie nasion zawierających kasetę 10kD-SacB nasion wykazujących fenotyp pomarszczony umieszczono w glebie metro-mix i doprowadzono do ich wyeiełkowrnia w warunkach szkłami. W ciągu 3 tygodni tylkojedno z 15 nasion wyeiełkowrło (szybkość kiełkowania 0,067%). Jeden mały kiełek (3,7 cm) nie okazał się żywotny i nie przeżył następnych 2-3 dni. W przeciwieństwie do tej gleby z 10 nasion transgenicznych kiełkujących w glebie zawierającej sacharozę (ośrodek nr 64) uzyskano 3 kiełki (30% kiełkowania). Wszystkie 3 kiełki rozwinęły się normalnie, osiągnęły dojrzałość i wydały nasiona.

180 543

Wyniki testów kiełkowania 10kD-SacB wyraźnie sugerują, że gromadenie fruktanu w cytozolu tkanki bielma wpływa na rozwój nasion, prawdopodobnie poprzez hamowanie gromadzenia składników odżywczych (zwłaszcza węglowodanu) w nasieniu. Powoduje to znaczne zmniejszenie stopnia kiełkowania i żywotności siewek.

Ośrodek 64

Składnik ilość/lito

Sole podstawowe Schenka i Hildebrandta 1,6 6 (Sigma nr 6765)

Koncentrat witaminowy Nitsch i Nitsch (Sigma) 1,0 ml nr 0390)

Sacharoza 10,27 g

Konstrukcja 10 kD-Blec-SacB

Kasetę ekspresji zawierającą gen Bacillus SacB funkcyjnie połączony z N i C-końcowymi sekwencjami lektyny jęczmienia ER i sekwencjami ukierunkowującymi na wakuolę, operacyjnie połączony z promotorem genu zeiny o 10 kD skonstruowano dodając najpierw C-końcową, sekwencję ukierunkowującą na wakuolę do plazmidu SacB:In2-1, uzyskując plazmid SacB:CTPP:In2-1 opisany w przykładzie 4.

N-końcowy sygnał od jęczmienia, zawarty w plazmidzie SK-5' BLEC, opisanym w przykładzie 4 złączono z promotorem zeiny o 10 kD zawartym w plazmidzie pCC3 (opisanym w przykładzie 6). Osiągnięto to trawiąc SK-5' BLEC enzymami BspHI i XhoI. Fragment uzyskany z tego trawienia zligowano z pCC3, strawionym Ncol i XhoI, uzyskując plazmid pCC3-BLEC. Kasetę ekspresji uzupełniono przez trawienie pCC3-BLEC za pomocą Ncol i wypełnienie tępych końców z zastosowaniem enzymu Klenowa. DNA wytrącono, ponownie rozpuszczono w wodzie i strawiono enzymem Xbail w sposób opisany w przykładzie 4. Wydzielony fragment zawierający promotor zeiny o 10 kD funkcyjnie połączony z 5'końcem sygnału lektyny jęczmienia ER zligowano z plazmidem SacB:CTPP-Iń2-1 uprzednio strawionym enzymami Xbal i EcoRV, uzyskując ostatecznie kasetę ekspresji, 10kD-BLEC-SacB.

Pełną kasetę ekspresji, 10kD-BLEC-SacB, zawierającą specyficzny względem tkanki i stopnia rozwoju promotor zeiny o 10 kD oprócz ER i sygnałów sortujących w wakuoli z lektyny jęczmienia wystarcza do skierowania białka SacB do wakuoli komórki. Kasetę zastosowano bezpośrednio do transformowana kukurydzy przez bombardowanie cząstkami opisane w przykładzie 6.

JOkośccowa analiza obecności fruktanu w trarnsgemcznych nasionach kukurydzy metodąTLC

Linie transformowane 10kD-BLEC-SacB hodowano w szklarni i w poszczególnych ziarnach oceniono obecność fruktanu w 30-35 dni po zapyleniu oraz w stanie dojrzałym (45-55 dni po zapyleniu). Zawartość fruktanu w szeregu nasionach z różnych odtworzonych linii oceniono metodą TLC opisaną w przykładzie 1. Dwie z 6 zbadanych linii kukur/dzy dawały dodatni sygnał, który nie migrował od startu na płytce TLC, co sugeruje obecność polimeru fruktozy o wysokim ciężarze cząsteczkowym.

Kiełkowanie tr;a^^i^ten^^:zn;ych nasion zawierających kasetę 10kD-BLEC-SacB

Nasiona zawierające kasetę 10kD-BLEC-SacB umieszczono w glebie metro-mix i hodowano w szklarni. Spośród 35 wysianych . nasion 29 wykiełkowało (stopień kiełkowania 83%), rozwinęło się do stanu dojrzałego i wydało nasiona R2 zawierające fruktan. Nie zaobserwowano różnic między nasionami transgenijznymi i liniami zębowymi typu dzikiego w odniesieniu do stopnia kiełkowania, żywotności siwek lub ilości ziaren.

Ilościowa analiza fruktano-dodatniej kukutydzy transformowanej 10kD-BLEC-SacB dojrzałych nasion zjednej z dwóch dodatnich linii zbadano pojedynczo w celu oznaczenia zawartości fruktanu metodąantronowąopisaną w przykładzie 5. W nasionach tej linii następuje segregacja względem genu SacB, tak że zgodnie z oczekiwaniami pewne z nich nie będą gromadzić fruktanu. W doświadczeniu tym nasiona dające wynik ujemny służyłyjako wewnętrzne nasiona kontrolne. Jako ujemne nasiona kontrolne użyto 4 nasiona typu dzikiego (koński ząb). Wyniki zestawiono poniżej w tabeli 5.

180 543

Tabela 5

Ilościowe pomiary fruktanu w liniach kukurydzy transformowanej 10kD-BLEC-SacB i w liniach kontrolnych

	% fruktanu (w przeliczeniu na suchą masę ziarna)
Koński ząb, nasiono nr 1	0,06
Koński ząb, nasiono nr 2	0,00
Koński ząb, nasiono nr 3	0,04
Koński ząb, nasiono nr 4	0,23
10kD-BLEC-SacB 625 nr 1	0,12
625 nr 2	0,28
625 nr 3	0,29
625 nr 4	0,88
625 nr 5	0,28
625 nr 6	0,33
625 nr 7	0,26
625 nr 8	1,35
625 nr 9	0,20
625 nr 10	1,94

Wyniki tabeli 5 wykazują, że nagromadzenie fruktanu w nasionach zawierających kasetę ekspresji 10kD-BLEC-SacB jest porównywalne z poziomem występującym w linii transformowanej kukurydzy zawierającej kasetę n0kD:Spor:I^-1 (poziom fruktanu podany w tabeli 3, przykład 6). Wyniki te sugerują, że kierowanie genu SacB do wakuoli bielma spełniło się oraz że receptor(y) odpowiedzialne za kierowanie białka do wakuoli bielma kukurydzy rozpoznają zarówno mono-jak i dwuliścienne sygnały kierujące.

Informacje uzyskane w tym przykładzie wykazują, że gromadzenie fruktanu o wysokim ciężarze cząsteczkowym w cytozolu bielma transgenicznej kukurydzy jest szkodliwe dla rozwoju tych nasion, hamując kiełkowanie i żywotność siewek. Fuzja sygnałów ukierunkowających na wakuolę (sygnałów mono- lub dwuliściennych) z białkiem SacB powstrzymuje ten niekorzystny wpływ. Białki Sac skierowane do wakuoli syntetyzuje fruktan bez wpływu na rozwój, kiełkowanie lub na żywotność siewek, ani też obecność fruktanu nie osłabia zdolności przekazywania tej cechy na rośliny potomne.

Przykład 8. Wzrost nagromadzania fruktanu w wysokocukrowych liniach kukurydzy

Opisano liczne mutantowe linie kukurydzy, często wydzielone z uwagi na odmienne właściwości fizyczne ziarna, takie jak zmieniona przezroczystość lub kształt ziarna w porównaniu „końskim zębem” typu dzikiego, określanym równieżjako „kukurydza połowa”. Szereg linii mutantowych dających „pomarszczone” ziarno scharakteryzowano stwierdzając, że zawierają one niższy poziom skrobi, ale zwiększoną zawartość rozpuszczalnych cukrów (przegląd - patrz Doehlert i Min Kuo, Plant Celi Physiol., 35:411-418 (1994)). Biochemiczne skazy nie zawsze są klarowne, jak to jest w przypadku takich linii mutantowych jak pomarszczona-4 (shrunken-4, sh4) cukrowa/cukrowa zwiększona (su/se). Jednakże allele mutantów zostały dobrze scharakteryzowane, a geny sklonowano w przypadku szeregu mutantówtakichjak pomarszczona-1 (sh1), pomarszczona^ (sh2) i krucha-2 (bt2) (McCarty i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 83:9099-9103 (1986), Bhave i inni, The Plant Celi, 2:581-583 (1990)). Jakkolwiek mutacje występująna różnych etapach drogi przemian biochemicznych kukurydzy, to często konsekwencją jest zmniejszone nagromadzenie i zwiększenie ilości rozpuszczalnych cukrów, w tym sacharozy.

180 543

Poziom blokady na drodze przemian, a więc i stężenie rozpuszczalnych cukrówjest różne dla różnych mutantów.

Ekspresja bakteryjnego genu SacB w linii homozygotycznego mutanta skrobiowego wywołuje wzrost poziomu nagromadzania fruktanu na skutek większej dostępności zasobu substratu. Do ekspresji genu SacB w linii mutantowej można doprowadzić przezbezpośredniątransformację lub przez tradycyjne krzyżowanie linii mutanta z trainsgeniczną linią kukurydzy zawierającąkasetę ekspresji SacB, takąjak opisana w przykładach 6 i 7. W tym przykładzie mutantowe linie kukurydzy zawierające gen SacB uzyskano w wyniku genetycznego krzyżowania linii „koński ząb” zawierającej wektor ekspresji 10 kD-Spor:SacB:IU2-1 z mutantami sh1, sh2, sh4 i su/se. Trarnsgeniczna linia SacB zawiera allel dzikiego typu w locus sh1, sh2 i su/se i z tego względu ziarno F1 z oryginalnej krzyżówki zostało „samozasilone”, tak że powstało ziarno F2 segregujące względem genu SacB, wraz z homozygotycznymi i heterozygotycznymi allelami mutantowymi. Ziarno homozygotyczne względem mutacji drogi przemiany skrobi można było łatwo zidentyfikować na podstawie pomarszczonego lub pokurczonego fenotypu. Pojedyncze ziarna posegregowane względem pomarszczonego i normalnego fenotypu dobrano do ilościowej analizy fruktanu metodą antronową opisaną w przykładzie 5. Wyniki analizy antronowej zamieszczono poniżej w tabeli 6.

Tabela 6

Wzrost nagromadzenia fruktanu wynikły ze zwiększonych poziomów sacharozy w liniach skrobiowego mutanta kukurydzy

202.1 SacB-koński ząb	4094-1.128 SacB-sh4	4092-1.20 SacB-sh2	4097-4.46 SacB-su	4089-4.68 SacB-sh
1,53	0,32	1,85	2,18	4,82
2,22	0,39	10,09	1,59	0,41
2,90	0,13	13,98	1,55	5,75
0,48	0,21	6,93	3,26	3,07
0,10	0,22	0,23	4,43	0,39
1,43	0,00	9,23	2,06	0,38
0,00	0,23	0,40	2,68	1,44
1,19	0,33	2,17	5,01	0,40
0,11	0,26	7,80	2,16	0,33
0,00	0,24	7,81	1,22	3,00
1,52	0,04	0,91	1,25	0,36
0,00	0,00	6,81	1,41	1,10
1,36	0,22	10,70	0,72	1,47
0,00		8,61	0,71	0,97
2,77		2,92	8,69	0,92

Wyniki zamieszczone w tabeli 6 sugerują, ze nagromadzanie fruktanu można zmieniać na drodze ekspresji genu SacB w różnych liniach kukurydzy. Linia mutantowa 4094.1.128 nie gromadzi fruktanu w ilościach zbliżonych do linii końskiego zębu z SacB (patrz przykład 6 i 7), co sugeruje, ze skaza genetyczna w tej linii może także wpływać na ekspresję SacB. Potwierdzenie tego znaleźć można w pracy Doehlert i Min Kuo, Plant Celi Physiol., 35:411-418 (1994). Uważa się, że skaza genetyczna w linii sh4 prowadząca do zwiększonych poziomów sacharozy związana jest z metabolizmem fosforanu pirydoksylu. Powoduje to ogólny spadek syntezy białka w rozwijających się ziarnach. Doehlert i Min Kuo wykazali także, że poziomy transkryptu

180 543 i białka w nasionach sh4 są znacząco zmniejszone. Gen SacB w opisywanej linii kukurydzy sh4 jest pod kontrolą promotora zeinowego. Zmniejszony poziom ekspresji zeiny w tym mutancie będzie powodować obniżenie poziomu białka SacB. Tym można wyjaśnić, dlaczego w linii tej nie występuje zwiększony poziom fruktanu, nawet mimo stwierdzenia, ze poziomy sacharozy są wyższe niż w liniach końskiego zębu.

Linia 4092-1.20 segreguje homozygotyczny i heterozygotyczny allel sh2 oraz gen SacB. Podano, że poziomy sacharozy w limach sh2 są najwyższe spośród linii mutantowych przebadanych w tym przykładzie (Doehlert i Min Kuo, Plant Cell Physiol., 35:411-418 (1994). Wyniki w tabeli 6 wykazują, ze gen SacB przy takim tle gromadzi największy poziom fruktanu. Linie 4097-4.26 i 4089-4.68 segregują odpowiednio względem homozygotycznych i heterozygotycznych alleli su i sh1. Segregująone również względem genu SacB. Linie su i sh1 gromadzą podobne, ale wyższe poziomy fruktanu w porównaniu z linami końskiego zębu zawierającymi gen SacB, ale mniejsze od stwierdzonych w tle sh2.

Z wyjątkiem linii mutantowej sh4 (co wyjaśniono powyżej) poszczególne ziarna z mutantowych linii skrobiowych, zawierające gen SacB, wymienione w tabeli 6, wykazują, że nagromadzenie fruktanu jest wyższe w liniach kukurydzy zawierających genetyczny blok na biosyntetycznej drodze skrobiowej. Wzrost poziomu sacharozy w cytozolu z uwagi na blok genetyczny, będący w równowadze z poziomem w wakuoli w linii mutantowej, powoduje, że wzrost syntezy fruktanu. Jakkolwiek może wydawać się oczywiste, że wzrost poziomu sacharozy w wakuoli komórki zawierającej skierowane do wakuoli białko SacB powinien prowadzić do zwiększonych poziomów fruktanu, to wyniki w tym przykładzie wyraźnie wykazują, że zmiany poziomów fruktnau w bielmie kukurydzy mogą być również związane ze zmianami poziomu sacharozy w cytozolu komórki. Wzrost poziomów sacharozy może mieć różne przyczyny (np. nadekspresja lub antysensowność genów metabolizujących sacharozę), albo, jak w tym przykładzie, ekspresję genu SacB w linii mutantowej z deficytem syntezy skrobi.

Zestawienie sekwencji (1) frnfonracja ogólna:

(i) Zgłaazająąy:

(A) Nazwa: E.I. DU PONT DE NEMOURS AND COMPANY (b) Ulica: 1007 Market Street (C) Miast: Wilmington (D) Stan: Delaware (E) Kraj: Stany Zjednoczone Ameryki (F) Kod pocztowy (ZIP) : 19898 (G) Telefon: 302-992-4931 (H) TELEFAX:: 302-773-0164 (I) TELEX: 6717325 (ii) Tytuł wynalazku: Transgeniczne uprawy gromadzące fruktan i sposób ich wytwarzania (iii) Liczba sekwencji: 21 (iv) Postać odczytywana komputerowo:

(A) Rodzaj nośnika: Dyskietka, 3.5 cala. 1.0 MB (b) Komputer: Macintosh (C) System operacyjny: Macintosh system 6.0 (D) Oprogramowanie: MICROSOFT WORD, 4.0 (v) Dane dotyczące niniejszego zgłoszenia:.

(A) Numer rzecznika: BB-1047-A (vi) Dane dotyczące zgłoszenia wcześniejszego:

(A) Numer zgłoszenia: 08/146,689 (B) Data zgłoszenia: 9 listopada 1993

180 543 (2) Informacja dotycząca sekwencji ID nr 1:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 31 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedynczy (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczny: nie (iv) Antysensowność: nie (ix) Cecha:

(A) Nazwa/klucz; misc_feature (b) Lokalizacja: 1..31 (D) Inna informacja: /produkS=„Syntetyczny oligomer” (xi) Opis sekwencji: Sekw. ID nr:1:

CTTCGCGAAG AAGATATCAA TAACCAAAAG C 31 (2) Informacja dotycząca sekwencji ED nr: 2:

(i) Charakterystka sekwencji:

(A) Długość: 21 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedynczy (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczny: nie (iv) Antysensowność: nie (ix) Cecha:

(A) Nazwa/klucz: misc feature (B) Lokalizacja: 1..21 (D) Inna informacja: /prok^c^ „Syntetyczny ohmon-ier” (xi) Opis sekwencji: Sekw. ID cr:2:

GAAGTTTGAA TCTTGAGATC T 21 (2) Infoimacca dotycząca sekwencji ED nr:3:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 32 par zasad (B) Typ: kwas suklemowy (C) Niciowość: pojedynczy (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczny: nie (iv) Astysensowsość: nie (ix) Cecha:

(A) Nazwa/klucz: misc_feature (B) Lokalizacja: 1..32 (D) Inna informacja: /produkt^ „SzcScSzczsz oligomer” (xi) Opis sekwencji: Sekw. ID nr:3:

TCTAGAGATA TCCATGGTTA ATTACACTTA GA 32 (2) IrSbnmacja dotycząca sekwencji ID nr: 4:

(i) Charraesrnztyka lekwencci:

(A) Długość: 21 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedynczy (D) Topologia: liniowa

180 543 (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczny: nie (iv) Antysensowność: nie (ix) Cecha:

(A) Nazwa/klucz: misc_feature (B) Lokalizacja: 1..21 (D) Inna informacja: /produkt= „Syntetyczny oligomer:

(xi) Opis sekwencji: Sekw. ID nr:4:

ACGTACGGCG TCTCTCATAT T 21 (2) Informacja dotycząca sekwencji ID nr:5:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 24 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedynczy (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczny: nie (iv) Antysensowność: nie (ix) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: miscfeature (b) Lokallisacja: 1..24 (D) Inna informacja: /produkt= „Syntetyczny oligomer” (xi) Opis sekwencji: Sekw. ID nr:5:

GTCGACTTAG TTGACTGTCA GCTG 24 (2) Informacja dotycząca sekwencji ID nr:6:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 137 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedynczy (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczny: nie (Iv) Antysensowność: nie (ix) Cecha:

(A) Nazwa/klucz: misc_feature (b) Lokalizacja: 1..137 (D) Inna informacja: /produkt= „Syntetyczny oligomer” (xi) Opis sekwencji: Sekw. ID nr:6:

ACTAGTACCT GCGATCATGA AAGCCCTCAC ACTCGCTCTC TTCTTAGCTC TTTCCCTCTA

TCTCCTGCCC AACCCAGCTC ATTCTAGGTT CAATCCAATC AGGCTTCCAA CCACAGACGA 120 ACCCGCCATG GCTCGAG 137 (2) Informacja dotycząca sekwencji ID nr: 7:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 137 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedynczy (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczny: nie (iv) Antysensowność: nie (ix) Cecha:

180 543 (A) Nazwa/klucz; misc_feature (B) Lokalizacja: 1..137 (D) Inna informacja: /produkt= „Syntetyczny oligomer” (xi) Opis sekwencji: Sekw. ID nr:7:

CTCGAGCCAT GGCGGGTTCG TGTGTGGTGG GGAGGCGGAT GGGATTGAAC CTGGAATGGG

CTGGATTGGG CAGGAGATAG AGGGAAAGAG CTAAGAAGAG AGCGAGTGTG AAGGCTTTCA 120 TGATCGCAGG TACTAGT 137 (2) Informacja dotycząca sekwencji ID nr: 8:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 39 aminokwasów (b) Typ: aminokwas (C) Niciowość: pojedynczy (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (iii) Hipotetyczny: nie (iv) Antysensowność: nie (ix) Cecha:

(A) Nazwa/klucz: Peptyd (b) Lokalizacja: 1..38

(xi

i) Opi

s sekwencj:

i: Sekw. ID

nr: 8:

Met

Lys

Ala

Leu

Thr

Leu

Ala

Leu

Phe

Leu

Ala

Leu Ser

Leu

Tyr Leu

1

5

10

15

Leu

Pro

Asn

Pro

Ala

His

Ser

Arg

Phe

Asn

Pro

Ile Arg

Leu

Pro Thr

20

25

30

Thr

His

Glu

Pro

Ala

Met

Pro

(2) Informacja dotycząca sekwencji ID nr: 9:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 56 par zasad (b) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedynczy (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczny: nie (iv) Antysensowność: nie (ix) Cecha:

(A) Nazwa/klucz: misj_featuIe (B) Lokalizacja: 1..56 (D) Inna informacja: /produkt= „Syntetyczny oligomer” (xi) Opis sekwencji: Sekw. ID nr: 9:

GAGGTCTACG CCGAGGCCAT CGCCGCCAAC TCCACTCTTG TCGCAGAATG AGATCT 56 (2) Informacja dotycząca sekwencji ID nr: 10:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 56 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (c) Niciowość: pojedynczy (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczny: nie (iv) Antysensowność: nie

180 543 (ix) Cecha:

(A) Nazwa/klucz: misc_feature (B) Lokalizacja: 1.. 56 (D) Inna informacja: /produkt= „Syntetyczny oligomer” (xi) Opis sekwencji: Sekw. ID nr: 10:

AGATCTCATT CTGCGACAAG AGTGGAGTTG GCGGCGATGG CCICGGCGTA GACCTC 56 (2) Informacja dotycząca sekwencji ID nr: 11:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 16 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Niciowoóć: pojedynezy (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (iii) Hipotetyczny: nie (iv) Antysensowność: nie (ix) Cecha:

(A) Nazwa/klucz: peptyd (B) Lokalizacja: 1..15 (D) Innainfomracja: 'znak = PePtyd (xi) Opis sekwencji: Sekw. ID nr: 11:

Val Tyr Ala Glu Ala Ile Ala Ala Asn Ser Thr Leu Val Ala Glu Pro 5 10 15 (2) Informacja dotycząca sekwencji ID nr: 12:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 38 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedynczy (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczny: nie (iv) AntcsensowkośO: nie (ix) Cecha:

(A) Nazwa/klucz: misc_fenture (b) Lokalizacja: 1..38 (D) Ima informacja: /produkt’ „Syntetyczny oligomer” (xi) Opis sekwencji: Sekw. ID nr: 12:

CTAACAGAAT TCATCATGAA GATGATGAGC ACCAGGGC 38 (2) Informacja dotycząca sekwencji ID nr: 13:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 38 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedynczy (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczny: nie (iv) Aktysensowność: nie (ix) Cecha:

(A) Nazwa/klucz: misc_feature (b) Lokalizacja: 1..38 (D) Inna informacja: /produkt^ „Syntetyczny oligomer” (xi) Opis sekwencji: Sekw. ID nr: 13:

180 543

GTCGACCATG GTCTGGGCGT GCGCGGTGCG GCGGCGGA (2) Informacja dotycząca sekwencji ID nr: 14:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 20 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedynczy (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczny: nie (iv) Antysensowność: nie (ix) Cecha:

(A) Nazwa/klucz: misc_feature (B) Lokalizacja: 1..20 (D) Inna informacja: /produkt= „Syntetyczny oligomer” (xi) Opis sekwencji: Skkw.IDnr ri4:

TTGTAGTTAA TGCGTATTAG 20 (2) Informacja dotycząca sekwencji ID nr: 15:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 22 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedynczy (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczny: nie (iv) Antysensowność: nie (ix) Cecha:

(A) Nazwa/klucz: misc_feature (B) Lokalizacja: 1..22 (D) Inna informacja: /produkt= „Syntetyczny oligomer” (xi) Opis sekwencji: Sekw. ID nr: 15:

CCATGGTGCA AATGTTGAAA GT 22 (2) Informacja dotycząca sekwencji IDS nr: 16:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 25 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyjeży (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząstki: cDNA (iii) Hipotetyczny: nie (iv) Antysensowność: nie (ix) Cecha:

(A) Nazwa/klucz; misc_feature (b) Lokalizacja: 1..25 (D) Inna informacja: /produkt= „Syntetyczny oligomer” (xi) Opis sekwencji: Sekw ID nr: 16:

ATGACATACC ATCATATTTG ATATC 25 (2) Informacja dotycząca sekwencji ID nr: 17:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 30 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedynczy (D) Topologia: liniowa

180 543 (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczny: NO (iv) Antysensowność: nie (ix) Cecha:

(A) Nazwa/klucz: misc_feature (B) Lokalizacja: 1..30 (D) Inna informacja: /produkt= „Syntetyczny oligomer” (xi) Opis sekwencji: Sekw. ID nr: 17:

TTCTATCTAG AATGCAGCAC CAACAAAGGG (2) Informacja dotycząca sekwencji ID nr: 18:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 30 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Nicowość: pojedynczy (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczny: nie (iv) Antysensowność: nie (ix) Cecha:

(A) Nazwa/klucz: misc_feature (b) Lokalizacja: 1..30 (D) Inna informacja: /produkt= „Syntetyczny oligomer” (xi) Opis sekwencji: Sekw. ID nr: 18:

ATGGCA;, CCA AGATGCTTGC ATTGTTCGCT (2) Informacja dotycząca sekwencji ED nr: 19:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 32 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedynczy (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczny: nie (iv) Antysensowność: nie (ix) Cecha:

(A) Nazwa/klucz: misc_feature (b) Lokalizacja: 1..32 (D) Inna informacja: /produkt= „Syntetyczny oligomer” (xi) Opis sekwencji: Sekw. ID nr: 19:

GACTCGGATC CAGCTGAGAA TTAGGAGCCT TG (2) Informacja dotycząca sekwencji ID nr: 20:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedynczy (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczny: me (iv) Antysensowność: nie (ix) Cecha:

(A) Nazwa/klucz: misc_feature (b) Lokalizacja: 1..13 (D) Inna informacja: /produkt= „Syntetyczny oligomer”

180 543 (xi) Opis sekwencji: Sekw. ID nr: 20:

CTAGCCCGGG TAC 13 (2) Informacja dotycząca sekwencji ID nr: 21:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedynczy (D) Topologia: iiniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczny: nie (iv) Antysensowność: nie (ix) Cecha:

(A) Nazwa/klucz: mis^feature (B) Lokalizacja: 1..13 (D) Inna informacja: /produkt= „Syntetyczny oligomer” (xi) Opis sekwencji: Sekw. ID nr: 21:

CTAGGTACCC GGG 13

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Claims (5)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Zrekombinowany konstrukt DNA zawierający promotor specyficzny względem tkanki wybrany z grupy obejmującej SEQ ID NO: 2,3,14 i 15, operacyjnie połączony z sekwencjąukierunkowującą na wakuolę wybraną z grupy obejmującej SEQ ID NO: 6,1,9 i 10, operacyjnie połączonąz sekwencjąkodująoąbakteryjny gen lewanosukrazy wybranąz grupy obejmującej SEQ ID NO: 1,4 i 5.
2. 2. Zrekombinowany konstrukt DNA zawierający promotor specyficzny względem tkanki wybrany z grupy obejmującej SEQIDNO: 2,3,14 i 15, operacyjnie połączony z sekwencjąukieruhkowującąna wakuolę wybraną z grupy obejmującej SEQ ID NO: 6,1, 9 i 10, operacyjnie połączonąz sekwencją kodującą gen lewanosukrazy EC 2.4.1.10.
3. 3. Sposób wytwarzania fruktanu, zgodnie z którym hoduje się rośliny wybrane z grupy obejmującej kukurydzę, ziemniaki i tytoń, zbiera się te rośliny i ekstrahuje się fruktan z zebranych roślin, znamienny tym, że hoduje się, zbiera i poddaje ekstrakcji rośliny stransformowane zrekombinowanym konstruktem DNA zawierającym promotor specyficzny względem tkanki wybrany z grupy obejmującej SEQ ID NO: 2,3,14 i 15, operacyjnie połączony z sekwencjąukierUnkowującąna wakuolę wybra^z grupy obejmującej SEQ ID NO: 6,1, 9 i 10, operacyjnie połączonąz sekwencjąkodującąbakteryjny gen lewanosukrazy wybraną z grupy obejmującej SEQ ID NO: 14 i 5.
4. 4. Sposób zwiększania poziomu fruktanu w roślinach, znamienny tym, że komórki rośliny transformuje się zrekombinowanym konstruktem DNA zawierającym promotor specyficzny względem tkanki wybrany z grupy obejmującej SEQ ID NO: 2,3,14 i 15, operacyjnie połączony z sekwencjąukieruńkowującąna wakuolę wybranąz grupy obejmującej SEQ ID NO: 6,7,9 i 10, operacyjnie połączoną z sekwencją kodującą bakteryjny gen lewanosukrazy wybraną z grupy obejmującej SeQ ID NO: 14 i 5, po czym z tej stransformowanej komórki hoduje się płodną, dojrzałą płciowo stransfonmowaną roślinę.
5. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że transformuje się komórki kukurydzy.

   * * *