PL180760B1

PL180760B1 - Sekwencje kwasu nukleinowego, zdefektowany wirus rekombinacyjny i kompozycja farmaceutyczna

Info

Publication number: PL180760B1
Application number: PL94312213A
Authority: PL
Inventors: Fabien Schweighoffer; Bruno Tocque
Original assignee: Rhone Poulenc Rorer Sa
Priority date: 1993-06-16
Filing date: 1994-06-15
Publication date: 2001-04-30
Also published as: SK156895A3; SK285169B6; ATE231916T1; UA46709C2; CA2165458A1; US6159947A; NO955011D0; JPH08511162A; EP0703980B1; RU2218400C2; DK0703980T3; ZA944303B; HUT74266A; JP4384260B2; CA2165458C; WO1994029446A3; ES2191031T3; FR2706486A1; NZ268038A; BR9407512A

Abstract

1. Sekwencja kwasu nukleinowego zawierajaca gen kodujacy polipeptyd o sekwencji zdefiniowanej jako SEQ ID nr 1 lub SEQ ID nr 2. 6. Zdefektowany wirus rekombinacyjny wybrany sposród retrowirusów, adenowiru- sów, wirusów adenopochodnych, wirusa ospy i wirusa HSV, znamienny tym, ze wirus ten zawiera w swoim genomie co najmniej jedna sekwencje kwasu nukleinowego zdefinio- wana jako SEQ ID nr 1 lub SEQ E D nr 2. 10. Kompozycja farmaceutyczna do terapii genowej zwiazanej z produkcja prze- ciwcial lub aktywnych peptydów obejmujaca kwasy nukleinowe lub geny kodujace aktyw- ne terapeutycznie czynniki oraz farmaceutycznie dopuszczalny nosnik, znamienna tym, ze zawiera co najmniej jedna sekwencje kwasu nukleinowego zdefiniowana jako SEQ E D nr 1 lub SEQ ID nr 2 bedaca pod kontrola funkcjonujacego w komórkach ssaczych promo- tora wybranego z grupy promotorów CMV, SV40, E1a, MLP, LTR lub villiny albo co najmniej jeden zdefektowany rekombinacyjny wirus zawierajacy ta sekwencje, w postaci dawkowej od 104 do 101 4 pfu/ml oraz dopuszczalne farmaceutycznie nosniki. PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sekwencja kwasu nukleinowego, zdefektowany wirus rekombinacyjny i kompozycja farmaceutyczna. Wynalazek dotyczy zwłaszcza sekwencji kwasów nukleinowych, zawierających gen kodujący wewnątrzkomórkowe białko wiążące (WBW). Geny te, ewentualnie włączone do odpowiednich wektorów ekspresyjnych można zastosować w terapii genowej.

180 760

Terapia genowa polega na korygowaniu braku lub nieprawidłowości (mutacji, nieprawidłowej ekspresji, etc.) przez wprowadzenie informacji genetycznej do dotkniętej chorobą komórki lub narządu. Ta informacja genetyczna może być wprowadzona albo in vitro do komórki wyodrębnionej z narządu, która to zmodyfikowana komórka jest następnie z powrotem wprowadzana do organizmu, albo bezpośrednio in vivo do odpowiedniej tkanki. W literaturze opisano służące do tego celu różne techniki transfekcji i transferu genów (patrz Roemer i Friedman, Eur. J. Biochem. 208 (1992), 211). Znane dotychczas ze stanu techniki sposoby podejścia do terapii genowej polegają na przeniesieniu genów kodujących aktywne polipeptydy zaangażowane w choroby genetyczne (hormony, czynniki wzrostu, etc.), geny antysensowne lub peptydy antygenowe dla wytworzenia szczepionek. Wynalazek niniejszy dotyczy nowego podejścia do terapii genowej, polegającego na przeniesieniu i ekspresji w komórce (lub w tkance) docelowej peptydu wewnątrzkomórkowego zdolnego do interakcji ze składnikami komórkowymi oraz do oddziaływania na funkcje komórkowe. Wynalazek mniejszy opiera się w szczególności na stwierdzeniu, że możliwa jest ekspresja in vivo przeciwciał modyfikowanych, które pozostają w przedziale wewnątrzkomórkowym i które mogą kontrolować niektóre fhnkcje komórkowe. Wynalazek opiera się także na stwierdzeniu, że dla zastosowania w terapii genowej możliwe jest klonowanie sekwencji DNA, kodujących te przeciwciała wewnątrzkomórkowe w wektorach, zwłaszcza wirusowych.

Zastosowanie przeciwciał w terapii ludzkiej pozwala generalnie na lokalizowanie i zobojętnianie kompleksów biologicznych krążących i/lub umiejscowionych na powierzchni komórek, co pociąga za sobą kaskadę zdarzeń kierowanych przez układ immunologiczny, która prowadzi do ich eliminacji. Jednakże w wielu przypadkach, jak rak lub choroby powodowane na przykład przez wirusy, podejście to jest nieskuteczne, ponieważ antygen odpowiedzialny za deregulację dotkniętych chorobą komórek jest niedostępny dla wstrzykiwanych przeciwciał.

Wynalazek niniejszy oferuje nowe, szczególnie korzystne podejście terapeutyczne, polegające na spowodowaniu produkcji w sposób ciągły i wewnątrzkomórkowy przeciwciał lub środków terapeutycznych, których wiązanie z epitopem zmniejsza i/lub usuwa deregulację.

Możliwość ekspresji przeciwciał przy użyciu metod rekombinacyjnych została już opisana w literaturze. Tak więc w opisie patentowym EP 88994 opisano ekspresję in vitro i oczyszczanie regionów zmiennych łańcuchów ciężkich i lekkich przeciwciał. Podobnie w opisie patentowym USA 4946778 opisano ekspresję in vitro sekwencji DNA, kodujących zmodyfikowane przeciwciała, składające się z regionów zmiennych łańcucha ciężkiego i lekkiego przeciwciała, połączonych za pomocą łącznika. Jednakże przeciwciała opisane w tym opisie patentowym są nieaktywne i są generalnie syntetyzowane w postaci nierozpuszczalnych ciał inkluzyjnych. W celu wyodrębnienia aktywności przeciwciała muszą więc być oczyszczane, a następnie poddane obróbkom chemicznym (denaturacja, renaturacje, etc.). Sekwencja według niniejszego wynalazku dostarcza możliwości zastosowania takich sekwencji DNA do bezpośredniej ekspresji in vivo aktywnych przeciwciał wewnątrzkomórkowych. Dostarcza to także możliwości zastosowania takich sekwencji DNA kodujących przeciwciała wewnątrzkomórkowe, znajdujących się pod kontrolą regionów umożliwiających ich ekspresję w komórkach ssaczych, do terapii genowej, zwłaszcza u człowieka. To nowe podejście pozwala na ukierunkowanie tych sekwencji do takich elementów komórkowych, które są niedostępne klasycznymi metodami szczepienia. Ponadto podejście to nie implikuje powstawania odpowiedzi immunologicznej, ale działa wewnątrzkomórkowo.

Przedmiotem wynalazku jest zatem sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca gen kodujący polipeptyd o sekwencji zdefiniowanej jako SEQ ID nr 1 lub SEQ ID nr 2. Korzystnie sekwencja kwasu nukleinowego zawiera sekwencję zdefiniowaną jako SEQ ID nr 1 lub SEQ ID nr 2. Bardziej korzystnie sekwencja ta jest pod kontrolą funkcjonującego w komórkach ssaczych promotora wybranego z grupy promotorów CMV, SV40, E1a, MLP LTR lub villiny. Sekwencja ta, korzystnie jest włączona do wektora. Może nim być korzystnie wektor wirusowy.

Przedmiotem wynalazku jest także wirus rekombinacyjny wybrany spośród retrowirusów, adenowirusów, wirusów adenopochodnych, wirusa ospy i wirusa HSV, charakteryzujący się tym, że wirus ten zawiera w swoim genomie co najmniej jedną sekwencję kwasu nukle4

180 760 inowego zdefiniowaną jako SEQ ID nr 1 lub SEQ ID nr 2. Korzystnie zdefektowany wirus według wynalazku zawiera sekwencję, która jest pod kontrolą funkcjonującego w komórkach ssaczych promotora wybranego z grupy promotorów CMV, SV40, Ela, MLP, LTR lub villiny. Bardziej korzystnie zawarta w nim sekwencja jest włączona do wirusowego wektora. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna do terapii genowej związanej z produkcją, przeciwciał lub aktywnych peptydów obejmująca kwasy nukleinowe lub geny kodujące aktywne terapeutycznie czynniki oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, charakteryzujący się tym, że zawiera co najmniej jedną sekwencję kwasu nukleinowego zdefiniowaną, jako sEq ID nr 1 lub SEQ ID nr 2 będącą pod kontrolą funkcjonującego w komórkach ssaczych promotora wybranego z grupy promotorów CMV, SV40, Ela, MLP, LTR lub villiny albo co najmniej jeden zdefektowany rekombinacyjny wirus zawierający tą sekwencję, w postaci dawkowej od 10⁴ do 10¹⁴ pfu/ml oraz dopuszczalne farmaceutycznie nośniki. Korzystnie kompozycja farmaceutyczna zawiera sekwencję kwasu nukleinowego włączoną do wektora, a najbardziej korzystnie zawiera sekwencję kwasu nukleinowego włączoną do wirusowego wektora. Korzystnie zdefektowany wirus wybrany jest z grupy adenowirusów, retrowirusów i adenopodobnych wirusów. Kompozycja farmaceutyczna korzystnie zawiera sekwencję kwasu nukleinowego w postaci dawkowej od 10⁶ do 10^ω pfu/ml.

Sekwencja kwasów nukleinowych, według wynalazku zawiera gen kodujący wewnątrzkomórkowe białko wiążące (WBW), będący pod kontrolą regionów umożliwiających jego ekspresję w komórkach ssaczych.

Zdefiniowana powyżej sekwencja kwasu nukleinowego może być zawarta w wektorze. W szczególności wektory te są pochodzenia wirusowego, tak jak retrowirusy, adenowirusy, wirusy adenopodobne, wirus opryszczki, wirus ospy, wirus HSV, etc.

Sekwencja kwasu nukleinowego lub wektory mogą służyć do otrzymywania środków farmaceutycznych o przeznaczeniu chirurgicznym i/lub terapeutycznym i działające na organizm ludzki lub zwierzęcy.

W rozumieniu niniejszego wynalazku określenie wewnątrzkomórkowe białko wiążące (WBW) oznacza każde białko lub fragment białka, zdolny do rozpoznawania składnika komórki w którym jest wyrażane, oraz do oddziaływania z tym składnikiem w sposób selektywny i łączenia się z nim. Może tu chodzić o oddziaływania chemiczne kowalencyjne lub niekowalencyjne. Oddziaływanie ze składnikiem komórkowym (białka, lipidy, aminokwasy, mRNA, tRNA, rRNA, DNA, etc) pozwala na oddziaływanie na funkcję komórkową, w którą jest zaangażowany wspomniany składnik, a także na regulowanie (stymulowanie, spowalnianie, hamowanie) tej funkcji.

Korzystnie białka WBW zgodnie z wynalazkiem stanowią cząsteczki pochodne przeciwciał lub mające zdolność wiązania porównywalną z przeciwciałami. W szczególności chodzi o białka mające selektywność i powinowactwo wystarczające do umożliwienia interakcji in vivo, której skutkiem jest zobojętnienie antygenu. Ze względu na swoje właściwości i lokalizację cząsteczki te są określane jako przeciwciała wewnątrzkomórkowe.

Przeciwciała, cząsteczki należące do nadgodziny immunoglobulin, są syntetyzowane w sposób naturalny (głównie przez limfocyty B) w postaci białek wydzielniczych. Są one następnie uwalniane do przedziałów zewnątrzkomórkowych (układ krążenia), gdzie wywierają swoją aktywność (rozpoznawanie i wiązanie antygenów nieswoistych). Obecnie wykazano, że możliwa jest ekspresja in vivo genów zmodyfikowanych, kodujących przeciwciała wewnątrzkomórkowe bez wpływu na specyficzność i powinowactwo przeciwciał,. Sekwencja kwasu nukleinowego według wynalazku, kodująca przeciwciała wewnątrzkomórkowe, zawiera zatem gen kodujący przeciwciała, zmodyfikowany w taki sposób, że przeciwciało to nie będzie wydzielane. W szczególności gen kodujący przeciwciało jest generalnie zmodyfikowany przez delecję lub mutację sekwencji odpowiedzialnych za sekrecję. Białko WBW może być utworzone przez fragmenty przeciwciał, na przykład przez fragmenty FAB lub F(ab)'2, noszące domeny wiązania antygenu. Zastosowanie tego typu przeciwciał wewnątrzkomórkowych pociąga za sobajednakże ekspresję sekwencji kwasów nukleinowych, zawierającej kilka genów kodujących odpowiednio regiony ciężkie i lekkie tych fragmentów, co pociąga za sobą także to, że łańcuchy te łączą się prawidłowo in vivo. Z tego powodu przeciwciało wewnątrzkomórkowe

180 760 utworzone na oparciu o sekwencję według wynalazku w szczególnie korzystnej postaci składa się z peptydu odpowiadającego miejscu wiązania regionu zmiennego łańcucha lekkiego przeciwciała, połączonego łącznikiem peptydowym w peptydem odpowiadającym miejscu wiązania regionu zmiennego łańcucha ciężkiego przeciwciała. Zastosowanie tego typu przeciwciała wewnątrzkomórkowego, oznaczonego ScFv, jest interesujące, ponieważ są one wyrażane przez jedyny gen. Konstrukcja sekwencji kwasów nukleinowych kodujących takie zmodyfikowane przeciwciała jest zilustrowana w przykładach.

Z drugiej strony sekwencje kwasów nukleinowych kodujące przeciwciała wewnątrzkomórkowe mogą być również modyfikowane na drodze chemicznej, enzymatycznej lub genetycznej w celu wytworzenia przeciwciał wewnątrzkomórkowych stabilizowanych i/lub wielofunkcyjnych, i/lub o zmniejszonej wielkości, i/lub w celu uprzywilejowania ich lokalizacji w tym lub innym przedziale wewnątrzkomórkowym. Sekwencja kwasu nukleinowego według wynalazku może również zawierać sekwencje kodujące peptydy sygnałowe lokalizacji jądrowej (NLS). W szczególności możliwa jest fuzja sekwencji według wynalazku z sekwencją kodującą NLS wirusa SV40, której sekwencja peptydowa jest następująca: MPKKKRK (Kalderon i współpr., Celi 39 (1984) 499).

Jak wskazano powyżej, sekwencja kwasu nukleinowego według wynalazku zawiera sekwencje umożliwiające ekspresję genu lub genów kodujących WBW w komórkach ssaczych. Generalnie geny WBW są zatem umiejscowione pod kontrolą regionów promotorowych transkrypcji i translacji, funkcjonujących w komórce ssaczej, w której ma następować ekspresja. Mogą to być sekwencje homologiczne w stosunku do wspomnianej komórki, to jest sekwencje odpowiedzialne naturalnie za ekspresję genów we wspomnianej komórce. Mogą to być również sekwencje innego pochodzenia, to jest sekwencje odpowiedzialne za ekspresję białek innych typów komórek, sekwencję odpowiedzialne za ekspresję przeciwciał w warunkach naturalnych, wirusowe sekwencje ekspresji, na przykład obecne w wektorze, do którego włączona jest sekwencja według wynalazku lub sekwencje syntetyczne albo semisyntetyczne.

Jeśli chodzi o stosowanie u ludzi, to w literaturze opisano wiele promotorów funkcjonalnych, takie jak na przykład promotory wirusowe CMV, SV40, Ela, MLP, LTR, ect. Promotory komórkowe, takie jak na przykład promotory genu kosmówczaka są interesujące ze względu na to, że umożliwiają ekspresję tkankowo-specyficzną (w przypadku kosmówczaka organiczną do jelita).

Z drugiej strony sekwencje ekspresyjne mogą być również modyfikowane, na przykład w celu przystosowania ich do ekspresji w szczególnym rodzaju wektora lub komórki, w celu zmniejszenia ich wielkości, w celu zwiększenia ich aktywności promotora transkrypcji, w celu generowania promotorów indukowalnych, poprawienia poziomu ich regulacji lub zmiany natury ich regulacji. Takie modyfikacje mogą być przeprowadzane na przykład przez mutagenezę in vitro, przez wprowadzenie dodatkowych elementów kontrolnych lub sekwencji syntetycznych lub przez delecje albo substytucje oryginalnych elementów kontrolnych. Szczególnie korzystne jest zastosowanie promotorów tkankowo-specyficznych, w celu skierowania ekspresji WBW do jednego typu tkanki.

Z drugiej strony, jeśli sekwencje kwasów nukleinowych nie zawierają sekwencji ekspresyjnych, to sekwencje te mogą być włączone do wektora ekspresji poniżej takiej sekwencji.

W celu otrzymania wektora według wynalazku przeprowadza się najpierw identyfikację funkcji komórkowej, na przykład zaangażowanej w patologię lub odpowiedzialnej za tę patologię, na którą zamierza się oddziaływać. Następnie przeprowadza się identyfikację odpowiedniego składnika komórkowego, zaangażowanego w tę funkcję, po czym ustala się, który WBW wydaje się być najbardziej przystosowany do tego składnika (przeciwciało, pochodne, etc.) pod względem jego lokalizacji, roli, natury, etc. Po wyselekcjonowaniu WBW odpowiadająca sekwencja kwasów nukleinowych może być otrzymana za pomocą technik biologii molekularnej (synteza chemiczna, klonowanie, modyfikacja enzymatyczna, etc.) i wprowadzona do odpowiedniego wektora zgodnie z metodologią opisaną w przykładach.

Następnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna, zawierająca co najmniej jedną sekwencję kwasów nukleinowych lub wektor, takie jak zdefiniowano poprzednio.

180 760

Sekwencje według wynalazku mogą być zastosowane jako takie, na przykład przez wstrzyknięcie człowiekowi lub zwierzęciu w celu indukowania ekspresji wewnątrzkomórkowej WBW w zamiarze wpływania na ustaloną funkcję komórkową W szczególności sekwencje )e mogą być wstrzykiwane w formie DNA za pomocą techniki opisanej w publikacji zgłoszenia międzynarodowego WO 90/11092. Mogą być one także podawane w postaci skompleksowanej, na przykład z podłożem DEAE-dekstran (Pagano i współpr., J. Virol. 1 (1967) 891), z białkami jądrowymi (Kaneda i współpr., Science 243 (1989) 375), z lipidami (Feigner i współpr., PNAS 84 (1987) 7413), w postaci lipozomów (Fraley i współpr., J. Biol. Chem. 255 (1980) 10431), ect.

W korzystnym sposobie realizacji wynalazku sekwencje nukleinowe takie jak zdefiniowano poprzednio są wprowadzone do wektora. Zastosowanie takich wektorów pozwala na uprzywilejowanie wnikania do komórek, zwiększenie oporności na enzymy i zwiększenie stabilności oraz poziomów ekspresji wewnątrzkomórkowej,. Wektory takie mogą być wektorami plazmidowymi lub wirusowymi. Korzystnie są to wektory wirusowe.

W korzystnym sposobie realizacji wynalazek dotyczy zatem sekwencji kwasów nukleinowych takich jak zdefiniowane poprzednio, wprowadzonych do wektora wirusowego, Wynalazek dotyczy także każdego wirusa rekombinacyjnego, zawierającego wprowadzoną do jego genomu co najmniej jedną sekwencję kwasów nukleinowych kodującąWHW.

Jak wskazano powyżej, jako wektory do transferu i ekspresji in vivo genów obejmujące sekwencje według wynalazku mogą być zastosowane różne wirusy. Przykładowo można wymienić retrowirusy (RSV, HMS, MMS, etc.), wirusy HSV, wirusy adenopodobne, adenowirusy, wirus ospy, etc.

Wirus rekombinacyjny według wynalazku jest wirusem zdefektowanym. Określenie „wirus zdefektowany” oznacza wirus niezdolny do replikacji w komórce celowej. Generalnie genom wirusów zdefektowanych stosowanych w zakresie wynalazku jest zatem pozbawiony co najmniej sekwencji niezbędnych do replikacji wspomnianego wirusa w zainfekowanej komórce. Regiony te mogą być bądź eliminowane (w całości lub części), uczynione niefunkcjonalnymi, bądź zastąpione przez inne sekwencji, a zwłaszcza przez sekwencje kwasów nukleinowych według wynalazku. Korzystnie zdefektowany wirus ma zachowane co najmniej sekwencje swojego genomu, niezbędne do opłaszczania cząstek wirusowych.

Zdefektowane wirusy rekombinacyjne pochodzące od retrowirusów, wirusów adenopodobnych, wirusa HSV (wirus opryszczki zwykłej) lub adenowirusów sąjuż opisane w literaturze [Roemer i Friedman, Eur. J. Biochem. 208 (1992) 211; Dobson i współpr., Neuron 5 (1990); Chiocca i współpr., New Biol. 2 (1990) 739; Miyanohara i współpr., New Biol. 4 (1992) 238; WO 91/18088; Akli i współpr., Nature Genetics 3 (1993) 224; StratfordPerricaudet i współpr., Human Gene Therapy 1 (1990) 241; EP 185573, Levrero i współpr., Gene 101 (1991) 195; EP 243204)].

Szczególnie korzystne jest zastosowanie sekwencji nukleinowych według wynalazku w formie włączonej do zdefektowanego adenowirusa rekombinacyjnego.

Istnieją różne serotypy adenowirusów, które różnią się nieco strukturą i właściwościami, ale nie są patogenne dla człowieka, a zwłaszcza dla osób o nieobniżonej odporności immunologicznej. Z drugiej strony wirusy te nie integrują się z genomem komórek, które infekcją i mogą mieć włączone ważne fragmenty DNA zewnątrzpochodnego. Wśród różnych serotypów korzystne jest stosowanie adenowirusów typu 2 lub 5 (Ad 2 lub Ad 5). W przypadku adenowirusa Ad 5 sekwencjami niezbędnymi do replikacji są regiony E1A i E1B.

Z drugiej strony mała wielkość genów kodujących przeciwciała wewnątrzkomórkowe według wynalazku pozwala na jednoczesne włączenie do tego samego wektora kilku genów kodujących przeciwciała wewnątrzkomórkowe, skierowanych przeciwko różnym regionom jednego lub kilku celowych składników komórkowych,. Korzystny sposób realizacji wynalazku stanowi zatem wektor, zwłaszcza wirusowy, zawierający co najmniej dwie sekwencje kwasów nukleinowych, kodujących wewnątrzkomórkowe białka wiążące skierowane przeciwko różnym epitopom.

Zdefektowane wirusy rekombinacyjne według wynalazku mogą być otrzymane przez homologiczną rekombinację między zdefektowanym wirusem a plazmidem przenoszącym między innymi sekwencję kwasów nukleinowych taką jak zdefiniowana poprzednio (Levrero

180 760 i współpr., Gene 101 (1991) 195; Graham, EMBO J. 3 (12) (1984) 2917). Homologiczna rekombinacja ma miejsce w następstwie ko-transfekcji wspomnianych wirusów i plazmidu w odpowiedniej linii komórkowej. Zastosowana linia komórkowa powinna korzystnie (i) być transformowalna przez wspomniane elementy, i (ii) przenosić sekwencje zdolne do uzupełniania części genomu zdefektowanego wirusa, korzystnie w formie zintegrowanej w celu uniknięcia ryzyka rekombinacji. Przykładowo jako linię odpowiednią do otrzymywania zdefektowanych adenowiiusóąw rekombinacyjnych można wymienić linię nerki zarodka ludzkiego 293 (Graham i współpr., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), która zawiera zwłaszcza, zintegrowaną w swoim genomie, część lewą genomu adenowirusa Ad5 (12%). Jako linię mającą zastosowanie do otrzymywania zdefektowanych retuowiussów rekombinacyjnych można wymienić przykładowo linię CRIP (Danos i Mulligan, PNAS 85 (1988) 6460).

Następnie zmultiplikowane wirusy wyodrębnia się i oczyszcza za pomocą klasycznych technik biologii molekularnej.

Wynalazek dotyczy ponadto także kompozycji farmaceutycznej do terapii genowej, zawierającej co najmniej jeden zdefektowany wirus rekombinacyjny taki jak zdefiniowano poprzednio.

Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku może mieć formę odpowiednią do podawania miejscowego, drogą doustną, pozajelitową, donosową, dożylną, domięśniową, podskórną, dooczną, etc.

Korzystnie, kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera dopuszczalne farmaceutycznie nośniki do preparatu iniekcyjnego. Mogą to być w szczególności jałowe, izotoniczne roztwory soli (fosforan jednosodowy, fosforan disodowy, chlorek sodu, chlorek potasu, wapnia lub magnezu, etc., albo mieszaniny takich soli), albo środki suche, zwłaszcza liofilizowane, które po dodaniu, zależnie od przypadku, jałowej wody lub surowicy fizjologicznej, pozwalają na rozpuszczenie substancji przeznaczonych do iniekcji.

Dawki podawanych kwasów nukleinowych (sekwencja lub wektor) mogą być dobrane zależnie od różnych parametrów, a zwłaszcza zależnie od zastosowanego sposobu podawania, rodzaju schorzenia, wyrażanego genu lub czasu trwania leczenia,. Generalnie zdefektowane wirusy rekombinacyjne według wynalazku są formułowane i podawane w formie dawek zawartych między 10⁴ a 10¹⁴ pfu/ml, a korzystnie 10⁶ do 10¹⁰ pfu/ml. Określenie pfu („plaque forming unit”) odpowiada mocy zakaźnej roztworu wirusa i jest oznaczane przez zakażenie odpowiedniej hodowli komórkowej i pomiar, zwykle po 48 godzinach, liczby łysinek zainfekowanych komórek. Techniki oznaczania miana pfu roztworu wirusa są dobrze udokumentowane w literaturze.

Powyżej zdefiniowana sekwencja kwasów nukleinowych może być zawarta w każdej komórce rekombinacyjnej.

Sekwencja według wynalazku, ewentualnie włączona do wektora, oraz zawierające je środki farmaceutyczne, mogą być zastosowane do leczenia różnych patologii, Mogą one więc być zastosowane do transferu i ekspresji genów in vivo we wszystkich rodzajach tkanek. Obróbka taka może być dobrana zależnie od leczonej patologii (transfer do poziomu danej tkanki może być zwłaszcza wywołany poprzez dobór wektora, a ekspresja przez dobór szczególnego promotora). Sekwencje lub wektory według wynalazku korzystnie stosuje się do wytwarzania u człowieka lub zwierzęcia, in vivo i wewnątrz komórki, białek zdolnych do oddziaływania w specyficzny sposób na różne funkcje komórkowe, takie jak proliferacja komórek, synteza metabolitów, synteza białek, replikacja i/lub transkrypcja dNa, etc. Wynalazek pozwala także na leczenie w sposób specyficzny, miejscowy i efektywny, wielu zaburzeń funkcjonowania komórek, będących przyczyną lub rezultatem różnych patologii, a w szczególności raka, chorób wirusowych i bakteryjnych, lub generalnie, wszelkich patologii, w których może być zidentyfikowany mediator komórkowy.

Zastosowanie do leczenia patologii związanych z proliferacją komórkową.

W szczególnie korzystnym sposobie realizacji sekwencja kwasu nukleinowego według wynalazku zawiera geny kodujące WBW, zdolne do oddziaływania i interferowania z aktywnością czynników zaangażowanych w proliferację komórkową. W proliferacji komórkowej odgrywa rolę wiele czynników, takich jak receptory membranowe (białka G), onkogeny, enzymy

180 760 (kroazy białkowe, famezylotransferazy, fosfolipazy, etc.), nukleozydy (ATP, AMP, GDP, GTP, etc.), czynniki aktyWacyjne (czynniki wymiany guanozyn (GFR, GAP, etc.), czynniki transkrypcyjne, etc. Wewnątrzkomórkowa ekspresja WBW zdolnych do wiązania i zobojętniania takich czynników pozwala na regulowanie procesu proliferacji komórkowej. Jest to szczególnie interesujące w sytuacjach, w których proliferacja komórkowa wymyka się naturalnym mechanizmom regulacji, co prowadzi na przykład do powstawania guzów. Z tymi zjawiskami deregulacji proliferacji komórkowej związane są liczne czynniki (produkty genów onkogennych i czynników zaangażowanych w sygnalizowanie skutku tych produktów). Także 90% raków gruczołowych trzustki posiada w dwunastym kodonie zmutowany onkogen Ki-ras (Almoguera i współpr., Celi 53 (1988) 549). Podobnie wykazano obecność zmutowanego genu ras w rakach gruczołowych okrężnicy i rakach tarczycy (50%) oraz w rakach płuc i białaczkach szpikowych (30%, Boss, J. L. Cancer Res. 49 (1989) 4682). Zidentyfikowano obecnie wiele innych onkogenów (myc, fos, jun, ras, myb, erb, etc.), których zmutowane formy wydają się odpowiedzialne za deregulację proliferacji komórkowej.

Ekspresja białek WBW, zdolnych do wiązania się z tymi czynnikami komórkowymi (korzystnie z ich formą onkogenną) i przez to spowalniania lub hamowania ich skutków oferuje możliwość nowego podejścia do terapii raka.

W szczególności korzystnym wariancie realizacji wynalazek niniejszy dotyczy wektorów, zawierających sekwencję kwasu nukleinowego, zawierającą gen kodujący przeciwciało zdolne do oddziaływania z produktem ekspresji onkogenu lub z czynnikiem zaangażowanym w drogę sygnalizowania onkogenu.

Spośród onkogenów celowych można wymienić onkogeny ras, fos, jun, myc, myb, etc.

Spośród czynników zaangażowanych w drogę sygnalizowania onkogenu można wymienić zwłaszcza receptory membranowe, które mogą być celem na poziomie swoich domen wewnątrzkomórkowych (białka G, kinazy (przykład: kinaza tyrozynowa), fosforylazy, famezylotransferazy), czynniki wymiany nukleozydowej (czynniki GAP, GRF, etc.), etc.

Wynalazek dotyczy w szczególności wektorów, zwłaszcza pochodzenia wirusowego, zawierających sekwencję kwasu nukleinowego, kodującą przeciwciało wewnątrzkomórkowe, skierowane przeciwko onkogenowi lub czynnikowi zaangażowanemu w drogę sygnalizowania onkogenu, składające się z peptydu odpowiadającego miejscu wiązania regionu zmiennego łańcucha lekkiego przeciwciała, powiązanego łącznikiem peptydowym z peptydem odpowiadającym miejscu wiązania regionu zmiennego łańcucha ciężkiego przeciwciała.

W szczególności wynalazek dotyczy defektowanych wirusów rekombinacyjnych, wyrażających przeciwciało wewnątrzkomórkowe skierowane przeciwko czynnikowi zależnej od ras drogi sygnalizowania.

Jak pokazano w przykładach, ekspresja przeciwciał 15 wewnątrzkomórkowych antyp21 (produkt ekspresji genu ras), anty-GAP lub anty-p53 pozwala na odwrócenie fenotypu transformującego komórkę nowotworową.

Zastosowanie w leczeniu chorób wirusowych

Sekwencja nukleinowa według wynalazku może być jeszcze sekwencją kodującą przeciwciała wewnątrzkomórkowe, zdolne do oddziaływania na cykl zakaźny wirusa patogennego (HIV, wirus brodawczaka, etc.).

W szczególności w przypadku wirusa HTV środki przeciwwirusowe będące aktualnie w dyspozycji lub w protokołach zaawansowanych badań klinicznych nie umożliwiają blokowania multiplikacji wirusa, ale jedynie spowolnienie postępu choroby. Jednym z głównych powodów tego jest to, że pojawiają się szczepy oporne na te środki przeciwwirusowe. Przy opracowaniu skutecznej szczepionki pojawiają się liczne przeszkody: zmienność genetyczna HIV nie pozwala na zdefiniowanie stabilnej struktury antygenowej jako podstawy humoralnej lub komórkowej odpowiedzi immunologicznej przeciwko różnym istniejącym szczepom. Tak jak w przypadku środków przeciwwirusowych, kiedy S wirus nabiera oporności na drodze selekcji poprzez krzyżowe mutacje punktowe, w przypadku testowanych obecnie szczepień wirus zdaje się uciekać układowi immunologicznemu.

Wynalazek niniejszy pozwala na nowe podejście do leczenia infekcji HIV, polegające na blokowaniu wirusa w czasie jego cyklu replikacji przez ekspresję WBW, a zwłaszcza

180 760 przeciwciał wewnątrzkomórkowych. Wynalazek niniejszy pozwala w szczególności na uwolnienie się od problemu zmienności genetycznej wirusa, w przeciwieństwie do podejść polegających na stosowaniu szczepionek i środków antywirusowych. W przypadku klasycznego szczepienia widoczne odpowiedzi immunologiczne mają zasadniczo miejsce w stosunku do regionów zmiennych. W przeciwieństwie do tego zastosowanie przeciwciał wewnątrzkomórkowych pozwala na wybranie nie tylko epitopu zachowywanego, ale również niezbędnego do funkcji białka wirusowego. Przeciwciało wewnątrzkomórkowe może być skierowane przeciwko epitopowi o wielkości wystarczającej do powstrzymania nabywania przez wirusa oporności i przystosowywania się przez krzyżowe mutacje punktowe. Z drugiej strony mała wielkość genu kodującego przeciwciało wewnątrzkomórkowe pozwala w sposób korzystny na celowanie do różnych regionów (jednego lub większej ilości białek) wychodząc z jednego wektora terapii genowej.

Dwa podstawowe wirusowe białka regulacyjne, tat i rev, są celami o podstawowej ważności dla stosowania wynalazku. Te dwa białka są niezbędne dla replikacji wirusowej. Ponadto ekspresja RNA informacyjnych anty-sensu lub rybozymów skierowanych na tat lub rev RNA informacyjnego wstrzymuje replikację wirusową. Mechanizm działania tych białek jest stosunkowo dobrze udokumentowany; tat jest czynnikiem transaktywacji transkrypcji, podczas gdy rev zapewnia przejście między fazami wczesną i późną cyklu replikacji. Te dwa białka wywierają swoje działanie łącząc się z wirusowymi informacyjnymi RNA, a region białkowy niezbędny do tego połączenia, konieczny dla ich funkcjonowania, jest stosunkowo dobrze oznaczony. Ponadto wykazano, że nadekspresja miejsca ich złączenia z RNA (region TAR dla tat i RRE dla rev) hamuje ich funkcje w ekspresji wirusowej.

W tych warunkach realizacja wynalazku polega na tym, że stosuje się sekwencję DNA kodującą przeciwciało wewnątrzkomórkowe skierowane przeciwko białkom tat lub rev i zdolne do zobojętniania ich aktywności. Korzystnie takie przeciwciała są skierowane przeciwko regionowi tat lub rev, odpowiedzialnemu za ich wiązanie z RNA.

Przeciwciała wewnątrzkomórkowe skierowane przeciwko tym epitopom mogą być otrzymane według metodologii opisanej w przykładach. W szczególności, odnośnie przeciwciał anty-tat, mogą być one otrzymane przez modyfikację genetyczną z przeciwciała monoklonalnego T-B (12) (Hybridolab).

Innym białkiem celowym ważnym w replikacji HIV, którego funkcja może być łatwo hamowana przez przeciwciało wewnątrzkomórkowe jest białko nukleokapsydu NCP7. Białko to odgrywa istotną rolę w retrotranskrypcji (faza wczesna), w integracji i w fazie później, ale co najmniej równie ważnej: opłaszczania. Ta wielofimkcyjność może być objaśniona przez fakt, że ma ono rolę strukturalną enzymatycznie aktywną Opisane ono zostało jako hybrydaza, która umożliwia kompleksowanie wirusowych kwasów nukleinowych: RNA/DNA i DNA/DNA podczas retrotranskrypcji oraz RNA/RNA i RNA/lys-3tRNA na poziomie opłaszczania. NCP7 wydaje się być niezbędny do wytwarzania wirusów zakaźnych.

Ekspresja cytoplazmatyczna przez terapię genową, przeciwciał wewnątrzkomórkowych skierowanych przeciwko NCP7, hamujących jego funkcję w dimeryzacji wirusowego RNA i opłaszczaniu stanowi inny szczególnie korzystny wariant realizacji wynalazku.

Przeciwciała wewnątrzkomórkowe skierowane przeciwko epitopom zobojętniającym tego białka mogą być otrzymane według metodologii opisanej w przykładach.

Cel terapii genowej, przy zastosowaniu kompozycji farmaceutycznej według wynalazku, mogą stanowić również inne składniki wirusów, a zwłaszcza: miejsce wiązania cząsteczki CD4 (przykład: glikoproteina otoczki (gpl20/gp41), region multimeryzacji otoczki, miejsce rozszczepienia gpl20/gp41, proteaza, integraza, a ogólnie wszystkie białka wirusowe. Domeny te ogólnie nie są dostępne kiedy otoczka jest w swojej formie natywnej. Z tego powodu są one bardzo mało immunogenne i szczepienie przy ich użyciu jest niemożliwe. Niniejszy wynalazek pozwala na dokładne ukierunkowanie składnika aktywnego kompozycji według wynalazku na składniki wirusowe i posiada także doskonałe możliwości terapeutyczne. Między innymi, tak jak wskazano powyżej, mała wielkość genów kodujących przeciwciało wewnątrzkomórkowe pozwala korzystnie na jednoczesną ekspresję, w tym samym wektorze, kilku przeciwciał wewnątrzkomórkowych skierowanych przeciwko różnym regionom jednego lub kilku celów.

180 760

Sekwencjami nukleinowymi według wynalazku mogą być również sekwencje kodujące WBW, zdolne do oddziaływania i interferowania z aktywnością czynników zaangażowanych w syntezę metabolitów, w syntezę białkową lub w replikację i/lub transkrypcję DNA.

Niniejszy wynalazek zostanie bardziej dokładnie opisany za pomocą poniższych przykładów.

Objaśnienie figur

Figura 1: (A) Mapa restrykcyjna ScFv-ras. (B) Mapa restrykcyjna ScFv-Gap. (C) Wpływ zobojętniający ekspresji tymczasowej przeciwciała wewnątrzkomórkowego według wynalazku na moc transformującą onkogenu ras lub Her2. Py = komórki kontrolne; ScFv = komórki transfekowane tylko plazmidem psv2 · ScFv · ras, VAL = komórki transfekowane wektorem wyrażającym ras onkogeniczny Ha-ras Val 12; VAL + ScFv = komórki ko-transfekowane plazmidem psv2 · ScFv · ras i Ha-ras VA112; HER2 = komórki transfekowane wektorem wyrażającym onkogeniczny Her2; HER2 + ScFv = komórki ko-transfekowane plamidem psv2 · ScFv · ras i Her2.

Ogólne techniki biologii molekularnej

Klasyczne metody stosowane w biologii molekularnej, takie jak preparatywne ekstrakcje plazmidowego DNA, wirowanie DNA plazmidowego w gradiencie chlorku cezu, elektroforeza na żelu agarozowym lub akryloamidowym, oczyszczanie fragmentów DNA przez elektroelucję, ekstrakcja białek fenolem lub mieszaniną fenol-chloroform, wytrącanie DNA ze środowiska solanki etanolem lub izopropanolem, transformacja w Escherichia coli, etc., są dobrze znane specjalistom i są dokładnie opisane w literaturze [Maniatis T. i współpr., „Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. i współpr. (wyd.), „Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, New York, 1987].

Plazmidy typu pBR322, pUC i fagi serii M13 są pochodzenia handlowego (Bethesda Research Laboratories).

W celu ligowania fragmenty DNA mogą być rozdzielone według wielkości za pomocą elektroforezy na żelach agarozowych lub akryloamidowych, ekstrahowane fenolem lub mieszaniną fenol/chloroform, strącane etanolem, po czym inkubowane w obecności ligazy DNA faga T4 (Biolabs) zgodnie z zaleceniami dostawcy.

Wypełnianie wystających końców 5' może być przeprowadzone za pomocą fragmentu Klenowa polimerazy DNA I E. coli (Biolabs) zgodnie z opisem dostawcy. Obcinanie wystających końców 3' przeprowadza się w obecności polimerazy DNA faga T4 (Biolabs), zgodnie z zaleceniami dostawcy. Obcinanie wystających końców 5' przeprowadza się przez łagodne działanie nukleazą S1.

Mutegeneza ukierunkowana in vitro przy użyciu obgodeoksynukleotydów syntetycznych może być przeprowadzona zgodnie z metodą opracowaną przez Taylora i współpr. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] przy użyciu zestawu sprzedawanego przez Amersham.

Enzymatyczna amplifikacja fragmentów DNA za pomocą techniki zwanej PCR [katalizowana polimerazą reakcja łańcuchowa, R.K. Saiki i współpr., Science 230 (1985) 1350-1354; K.B. Mullis i F.A. Faloona, Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] może być przeprowadzona przy użyciu urządzenia „DNA thermal cycler” (Perkin Elmer Cetus) zgodnie z zaleceniami producenta.

Weryfikacja sekwencji nukleotydowych może być przeprowadzona metodą opracowaną przez Sangera i współpr. [Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74 (1977) 5463-5467] przy użyciu zestawu sprzedawanego przez Amersham.

Przykład 1. Klonowanie i ekspresja sekwencji DNA kodującej przeciwciało wewnątrzkomórkowe anty-ras

Przykład ten opisuje klonowanie i ekspresję sekwencji kwasów nukleinowych kodującej wewnątrzkomórkowe białko wiążące, odtwarzające właściwości przeciwciała monoklonalnego Y13-259. Przeciwciało Y13-259 jest skierowane przeciwko białkom ras (nr ref. ATCC CRL 1742) (J. Virol. 43, 294-304, 1982) i jest przeciwciałem działającym zobojętniająco na funkcje onkogennych białek Ras po wstrzyknięciu do komórek [Smith i współpr., (1986) Nature, 320, 540-543; Kung i współpr., Exp. Cell Res. (1986) 162, 363-371].

180 760

1.1 Otrzymywanie sekwencji DNA

Sekwencję DNA kodującą przeciwciało wewnątrzkomórkowe (fragment ScFv) otrzymano zgodnie z techniką opisaną. w opisie patentowym US 4946778. Sekwencja ta została następnie umieszczona pod kontrolą promotora funkcjonalnego w komórkach ssaczych.

Poli A RNA izolowano z hybrydowej hodowli komórkowej wydzielającej przeciwciało Y13-259 zgodnie z techniką opisaną przez S.H. Chirguina i współpr. [Biochemistry 18, 5294 (1979)]. Te RNA wykorzystano do reakcji odwrotnej transkrypcji za pomocą starterów utworzonych z losowych heksanukleotydów. Otrzymane RNA służyły jako matryca dla dwóch reakcji PCR:

- jednej przeznaczonej do amplifikacji fragmentu zmiennego łańcucha ciężkiego (VH) Y13-259 ze specyficznymi starterami mysich VH,

- drugiej pozwalającej na otrzymanie fragmentu VL przy użyciu mieszaniny 10 starterów otrzymanych z sekwencji mysich.

Otrzymano także fragmenty o długości 340 pz i 325 pz i połączono je następnie za pomocą łącznika, który pozwala na prawidłowe umiejscowienie cDNA VH w stosunku do końca 5' cDNA VL. Łącznik ten koduje 15 aminokwasów, tworzących trzy powtórzenia motywu (Gly), Ser [R. Orlandi i współpr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 3833-3837 (1979)]. Sekwencja przeciwciała wewnątrzkomórkowego jest przedstawiona w sekwencji Nr id 1 (reszty 28 do 270). Sekwencja ta nadaje fuzji VH-VL wystarczający stopień swobody do umożliwienia ich połączenia w orientacji równoległej i zapewnienia prawidłowego powinowactwa do antygenu.

Połączona sekwencja kwasów nukleinowych VH-łącznik-VL jest następnie włączana do fagemidu, który umożliwia ekspresję przeciwciała wewnątrzkomórkowego (fragment ScFv) na powierzchni faga M13 (figura 1A). Ekspresja ta umożliwia łatwą identyfikację i selekcję przeciwciał wewnątrzkomórkowych, które rozpoznają prawidłowo antygen.

1.2 Badanie funkcjonalne zmodyfikowanego przeciwciała wewnątrzkomórkowego

Sekwencja DNA, która koduje zmodyfikowane przeciwciało wewnątrzkomórkowe (VH-łącznik-VL) jest izolowana z fagemidu przez restrykcję, następnie wprowadzana do wektora sv2 pod kontrolą pary wzmacniacz-promotor wczesny z SV40 (Schweighoffer i współpr., Science, 256, 825-827, 1992) w celu zbadania jego zdolności do antagonizowania efektów onkogennego Ras. Otrzymany plazmid oznaczono psv2 · ScFv · ras. Ocenę funkcjonalną przeprowadzono za pomocą kilku testów:

a) Przejściowa transfekcja komórek ssaczych

W celu oceny przez przejściową transfekcję komórek ssaczych plazmid psv2 · ScFv · ras ko-transfekowano w komórkach NIH 3T3 zgodnie z protokołem opisanym przez Schweighoffera i współpr. [Science, 256, 825-827 (1992)] za pomocą wektora, który umożliwia ekspresję genu Ha-ras Val 12. Stan aktywacji badanej drogi sygnałowej rejestrowano przez pomiar aktywności enzymatycznej, otrzymanej przy użyciu genu reporterowego „acetylotransferazy chloramfenikolowej (CAT)” umieszczonego pod kontrolą promotora zawierającego jednakowo kotransfekowane elementy promotorowe odpowiadające „trans” na działanie również kotransfekowanego Ras (RRE): te elementy RRE są utworzone przez promotor hybryda TK-wzmacniacz poziomu (Wasylyk i współpr., EMBO J., 7,2475,1988).

Otrzymane rezultaty przedstawiono na figurze 1C. Analiza uzyskanych aktywności CAT wskazuje na zdolność zmodyfikowanego przeciwciała wewnątrzkomórkowego, otrzymanego z przeciwciała Y13-259, do antagonizowania aktywności onkogennego Ras.

Plazmid psv2 · ScFv · ras, ko-tranfekowany plazmidem pozwalającym na ekspresję onkogenu posiadającego aktywność kinazy tyrozynowej, onkogenu HER2 (ludzki czynnik wzrostowy naskórka typu II), blokuje również jego aktywność w tekście na plazmidzie „CAT” (figura 1).

b) Tworzenie ognisk transformowanych komórek: Komórki rakowe posiadają właściwość tworzenia ognisk transformacji, a szczególnie fibroblasty NIH 3T3 wyrażające onkogenny Ras (Barlat i współpr., Oncogene (1993), B, 215-218).

Komórki NIH 3T3 hodowano tak jak w poprzednim teście w pożywce Dulbecc zmodyfikowanej przez Eagle’a (DMEM), zawierającej 10% cielęcej surowicy płodowej, w 37°C w otoczeniu wilgotnym zawierającym 5% CO2. Komórki te następnie ko-transfekowano onkogennym Ras: Ha-ras Va1 12, plazmid psv2 · ScFv · ras (patrz a) powyżej) oraz 10-krotnym

180 760 nadmiarem genu oporności na neomycynę, za pomocą techniki transfekcji do lipidów kationowych (Schweighoffer i współpr., Science, 256, 825-827, 1992). Na każdej płytce transfekowano taką samą łączną ilość DNA.

godziny po transfekcji transfekowane komórki powstające w każdej płytce Petriego o wielkości 100 mm podzielono w stosunku 1 do 10 i hodowano w tej samej pożywce, ale w obecności G418 (GIBCO/BRL) w ilości 0,4 mg na ml pożywki. Liczbę otrzymanych ognisk transformacji na pg transfekowanego DNA obliczano po 14 dniach hodowli.

Otrzymane rezultaty przedstawiono w poniższej tabeli. Są one średnia z czterech niezależnych prób.

Tabela

Transformacja komórek NIH 3T3 przez Ha-ras Val 12 w obecności przeciwciała wewnątrzkomórkowego anty-ras

Transfekowane plazmidy	Liczba ognisk na pg transfekowanego DNA
Ha-ras Val 12	110
psv2 · ScFv · ras	2
Ha-ras Val 12 + psv2 · ScFv · ras	30

Otrzymane rezultaty wskazują wyraźnie, że przeciwciało wewnątrzkomórkowe anty-ras zmniejsza bardzo silnie moc transfomrującąonkogennego genu ras.

Z drugiej strony biorąc pod uwagę rezultaty otrzymane w a), ekspresja tego fragmentu ScFv przeciwciała Y13-159 powinna również nie dopuścić do transformacji przez inne onkogeny, takie jak HER1, HER2, ułatwiające aktywację komórkowych białek Ras.

Zrozumiałe jest, że specjalista może na podstawie wyników opisanych w mniejszym zgłoszeniu odtworzyć wynalazek z sekwencjami kwasów nukleinowych, kodującymi przeciwciała wewnątrzkomórkowe (takie jak fragmenty ScFv), skierowane przeciwko innym składnikom komórkowym. Mogą być one otrzymane ze znanych przeciwciał skierowanych przeciwko składnikom komórkowym, albo przez zidentyfikowanie zobojętnianego antygenu, immunizację za pomocą tego antygenu lub jego preferowanego epitopu, a następnie wytworzenie przeciwciała wewnątrzkomórkowego wychodząc od przeciwciała, jego RNA lub otrzymanej hybrydy. Celem mogą być także inne składniki zaangażowane w procesy transformacji komórkowej. Na przykład zgodnie z tą samą metodologią mogą być otrzymane inne sekwencje DNA, kodujące wewnątrzkomórkowe przeciwciała wiążące anty-ras, wychodząc z hybryd M38, M8, M70, M90 i M30 (ATCC HB 9158), których przeciwciała są skierowane odpowiednio przeciwko resztom 1 do 23,24 do 69,90 do 106,107 do 130 i 131 do 152 białka Ha-ras. Ponadto, jak wskazano powyżej, korzystnie mogą być otrzymane wektory przenoszące jednocześnie kilka sekwencji kodujących różne przeciwciała wewnątrzkomórkowe, w celu nadania doskonałej aktywności zobojętniającej.

Przykład 2. Klonowanie i ekspresja sekwencji DNA kodującej przeciwciało wewnątrzkomórkowe anty-GAP

Przykład ten opisuje klonowanie i ekspresję sekwencji kwasów nukleinowych kodujących wewnątrzkomórkowe białko wiążące odtwarzające właściwości przeciwciała monoklonalnego skierowanego przeciwko białku GAP.

Białko GAP (białko aktywujące GTPazę) jest zaangażowane w zależną od ras drogę sygnalizowania. Oddziaływuje ono z białkami ras w sposób katalityczny i zwiększa 100 do 200krotnie szybkość hydrolizy GTP mierzoną in vitro dla normalnego białka p21. Różne prace wykazały, że domena katalityczna tego białka mająca około 1044 aminokwasów jest usytuowana w regionie karboksy-terminalnym (reszty 702-1044) i że region ten jest odpowiedzialny za interakcję białka GAP z białkami ras (patrz WO 91/02749).

Obecnie wykazano, że przeciwciało monoklonalne skierowane przeciwko domenie nazwanej „SH3” białka GAP neutralizuje funkcje onkogennych białek Ras w zarodku Xenopus (Duchesne i współpr., Science, 259, 525-528,1993).

Przy użyciu metodologii opisanej w 1.1 możliwe jest zsyntetyzowanie sekwencji DNA kodującej przeciwciało wewnątrzkomórkowe (fragment ScFv), odpowiadające temu przeciw180 760 ciału (Sekw. nr id. 2. reszty 11 do 250, figura IB). Taka sekwencja, włączona do wektora, może umożliwić hamowanie siły transformującej onkogennego genu ras w komórkach nowotworowych.

Z drugiej strony zgłaszający zidentyfikował również dokładniej epitopy rozpoznawane przez to przeciwciało. Epitopy te następnie zsyntetyzowano sztucznie i mogą być one wykorzystane do wytworzenia nowych przeciwciał zobojętniających, które mogą służyć do realizacji wynalazku.

a) Dokładniejsza identyfikacja:

Identyfikacji dokonano za pomocą techniki „skanowania epitopu”. Technika ta oparta jest na zasadzie, że dane przeciwciało może reagować z peptydami od 5 do 15 aminokwasów. Dzięki temu identyfikacja sekwencji epitopów może być przeprowadzona przez wytworzenie pełnego zestawu peptydów pokrywających, o 5-15 aminokwasach, odpowiadających pełnej sekwencji rozważanego antygenu. Technikę tę wykorzystano do oznaczenia epitopów funkcjonalnych domeny „SH3” GAP. W tym celu całość tej domeny przebadano przez sekwencje pokrywania, syntezując dekapeptyd co 2 aminokwasy.

-Synteza peptydów pokrywających peptydów pokrywających całość fragmentu z figury zsyntetyzowano chemicznie. Syntezę przeprowadzono podwójnie na 2 niezależnych nośnikach, stosując metodę Fmoc/tbutyl w fazie stałej (zestaw Cambridge Research Chemicals).

-Potwierdzenie epitopów funkcjonalnych

Epitopy funkcjonalne rozpoznawane przez przeciwciało Ac200 wykryto za pomocą testu ALISA przy użyciu króliczego przeciwciała antykoziego sprzężonego z peroksydazą. Jako substrat chromogeniczny enzymu zastosowano amino-di(3-etylobenzotiazodyno sulfonian) (ABTS).

Otrzymane rezultaty wykazują, że epitopy rozpoznawane przez to przeciwciało są następujące:

- PVEDRRRVRAI

- EISF

- EDGWVM

Epitopy te mogą być zastosowane przy użyciu klasycznych technik znanych specjalistom do wytworzenia przeciwciała zobojętniającego efekty ras. Przeciwciało to lub produkujące je hybrydy stosuje się następnie do wytworzenia sekwencji kwasów nukleinowych i wektorów według wynalazku, przy użyciu metodologii opisanej poprzednio.

Przykład 3. Otrzymywanie sekwencji kwasów nukleinowych kodującej przeciwciało wewnątrzkomórkowe anty-ras z ekstraktów RNA ze śledzion myszy immunizowanych peptydami pochodzącymi z części hiperzmiennych Ki-Ras (2A i 2B).

Przykład ten opisuje otrzymywanie sekwencji kwasów nukleinowych, kodującej przeciwciała wewnątrzkomórkowe (takie jak fragmenty ScFv) według wynalazku poprzez identyfikację zobojętnianego antygenu, immunizację za pomocą tego antygenu lub jego preferowanego epitopu, następnie wytworzenie sekwencji kwasów nukleinowych wychodząc z przeciwciała, jego RNA lub otrzymanej hybrydy.

Przykład ten wykazuje możliwość zastosowania wynalazku do dowolnego żądanego antygenu lub epitopu, nawet jeśli nie dysponuje się żadnym przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciwko wspomnianemu antygenowi lub epitopowi.

Antygenem celowym w tym przykładzie jest białko Ki-ras. W szczególności antygeny zastosowane do immunizacji są peptydami o długości 24 i 25 aminokwasów, odpowiadającymi poniższym odcinkom końcowym białek Ki-Ras 2 A i 2B:

- peptyd 2A: QYRLKKISKEEKTPGCVKIKKCIIM

- peptyd 2B: KYREKNSKDGKKKKKKSKTKCIIM

Po immunizacji myszy tymi peptydami, zgodnie z klasycznymi technikami immunologii, wycięto śledziony i wytworzono DNA wychodząc z RNA. Następnie sklonowano DNA kodujące regiony zmienne, co doprowadziło do utworzenia banku fagów wyrażających ScFv odpowiadające całemu zbiorowi użytych myszy. Następnie zidentyfikowano i wyizolowano przeciwciała wewnątrzkomórkowe (fragmenty ScFv), rozpoznające peptydy 2A i 2B, stosując

180 760 kolejne etapy selekcji przez powinowactwo do kolumny i płytki do mikromiareczkowania.

Następnie te ScFv badano funkcjonalnie zgodnie z protokołem opisanym w przykładzie 1.

Strategia opracowana w tym przykładzie pozwala na selekcjonowanie w korzystny sposób przeciwciał wewnątrzkomórkowych swoistych dla onkogenów Ki-Ras, które nie wpływają na inne protoonkogenne Ras. Selektywność takich narzędzi nie jest zatem wyłącznie komórkowa (z powodu odprzężenia dróg transdukcji w komórkach transformowanych przez ras), ale również cząsteczkowa.

Przykład 4. Otrzymywanie sekwencji kwasów nukleinowych kodującej przeciwciało wewnątrzkomórkowe przeciwko zmutowanym anty-p53.

Przykład ten opisuje otrzymywanie sekwencji kwasów nukleinowych, kodującej przeciwciała wewnątrzkomórkowe (takie jak fragmenty ScFv) skierowane przeciwko zmutowanym białkom p53. Te przeciwciała wewnątrzkomórkowe otrzymuje się wychodząc z różnych przeciwciał monoklonalnych, skierowanych przeciwko wspomnianym zmutowanym białkom p53.

Gen kodujący białko p53 jest zmieniony w wielkiej liczbie komórek nowotworowych (Caron de Fromentel i Souss, Genes, 4, 1-15, 1992). Zmutowane białko p53 nie ma takiej samej konformacji jak białko p53 typu dzikiego (Lane i Benchimol, Genes Dev. 4, 1-8, 1990). Ta zmiana konformacji może być wykryta przez przeciwciała monoklonalne (Milner i Cook, Virology, 154, 21-30, 1986; Milner, Nature, 310,143-145,1984).

Przeciwciała pAB240 rozpoznają zmutowane formy białek p53.

Ekspresja wewnątrzkomórkowa fragmentu ScFv przeciwciał swoistych dla zmutowanego p53 lub białek oddziaływujących specyficznie z tymi zmutowanymi białkami p53 powinna wywierać korzystne działanie na nowotwory obecne w zmutowanym p53.

Przykład 5. Klonowanie i ekspresja sekwencji DNA kodującej przeciwciało wewnątrzkomórkowe przeciwko wirusowi brodawczaka

Przykład ten opisuje klonowanie i ekspresję sekwencji DNA kodującej przeciwciało wewnątrzkomórkowe (fragment ScFv), skierowane przeciwko białku ludzkiego wirusa brodawczaka (HPV).

Celowym białkiem wirusowym jest białko E6. Białko to jest wytwarzane przez wirusy HPV 16 i 18, które są odpowiedzialne za 90% raków szyjki macicy u kobiet i które zidentyfikowano w przedrakowych uszkodzeniach nabłonka (Riou i współpr., Lancet 335 (1990) 117). Produkt genu E6 prowadzi do tworzenia guzów, zmniejszając silnie ilość anty-onkogenu, dzikiego p53, w komórkach HPV-pozytywnych (Wrede i współpr., Mol. Carcinog. 4 (1991) 171). W innych guzach p53 jest hamowany przez różne mechanizmy: mutacja (patrz przykład 4) lub asocjacja z białkami, takimi jak MDM2.

Sekwencja białka E6 została opisana w literaturze (Hawley-Nelson i współpr., EMBO J. 8(1989) 3905; Munger i współpr., J. Virol. 63 (1989) 4417). Szczególne regiony tego białka mogą być zidentyfikowane przez „skanowanie epitopu” (patrz przykład 2), po czym wykorzystane do immunizacji myszy zgodnie z protokołem opisanym w przykładzie 3. Następnie wytwarza się sekwencję DNA kodującą przeciwciało wewnątrzkomórkowe (fragment ScFv) skierowane przeciwko białku E6 ludzkiego wirusa brodawczaka (HPV), stosując opisaną poprzednio metodologię. Funkcjonalność tej sekwencji została wykazana po ekspresji in vivo, przez pomiar:

- zwiększenia zawartości p53 dzikiego w komórkach wyrażających E6

- rewersji morfologicznej komórek transformowanych przez HPV,

- blokady wpływu E6 na transaktywację p53, i

- hamowania transformacji przez E6 keratynocytów i fibroblastów ludzkich.

Przykład 6. Otrzymywanie sekwencji kwasów nukleinowych, kodującej przeciwciało wewnątrzkomórkowe anty-HIV, wychodząc z ekstraktów RNA śledzion myszy immunizowanych peptydami otrzymanymi z regionów aktywnych białek tat, rev i NCP7.

Przykład ten opisuje otrzymywanie sekwencji kwasów nukleinowych kodującej przeciwciała wewnątrzkomórkowe według wynalazku (takie jak fragmenty ScFv) przez identyfikację zobojętnianego antygenu, immunizację za pomocą tego antygenu lub jego korzystnego

180 760 epitopu, następnie otrzymywanie sekwencji kwasów nukleinowych wychodząc z przeciwciała, jego RNA lub otrzymanych hybryd.

Przykład ten wykazuje także możliwość zastosowania mniejszego wynalazku do każdego żądanego antygenu lub epitopu, nawet jeśli w stanie techniki nie zostało opisane żadne przeciwciało monoklonalne skierowane przeciwko wspomnianemu antygenowi lub epitopowi.

Antygenami celowymi w tym przykładzie są białka tat, rev i NCP7 wirusa HIV. W szczególności antygeny zastosowane do immunizacji sąpeptydami złożonymi z 6, 9 i 16 aminokwasów, odpowiadającymi regionom tych białek, odpowiedzialnym za ich interakcję z RNA (dla tat i rev) lub dimeryzację RNA (dla NCP7):

- peptyd tat: RKKRRQRRR

- peptyd rev: RQARRNRRRWRERQR

-peptyd NCP7: RAPRKK

Po immunizacji myszy tymi peptydami przy użyciu klasycznych technik immunologicznych wycięto śledziony i wytworzono DNA, wychodząc z RNA. Następnie sklonowano DNA kodujące dla regionów zmiennych, co doprowadziło do utworzenia banku fagów wyrażających ScFv odpowiadającego całemu zbiorowi użytych myszy. Następnie zidentyfikowano i wyizolowano przeciwciała wewnątrzkomórkowe (fragmenty ScFv), rozpoznające peptydy tat, rev i NCP7, stosując kolejne etapy selekcji przez powinowactwo do kolumny i płytki do mikromiareczkowania.

Następnie ScFv zbadano funkcjonalnie na jego zdolność blokowania cyklu replikacji wirusa HTV.

180 760

SEKW. Nr ID 1

1/1 31/11 lider PelB tCA AGG AGA CAG TCT ATA AGA AAT ACC TAT TCG ACG GCA GCC GCT GGA TTG CCA CCA CTC

ser arg

arg

gln

ser

ile

arg

asn

thr

tyo

ser thr ala

ala

ala gly

leu

61/21

Sfi

NcoI

91/31 Pstl

GcG gCC

CAG

CCG

GCC

ATG

_GCC

CAG

GCG

TAT

CCG CAG CAG

CCA

GGA CCA

GGC

CCA GCG CAG

ala ala

gln

pro

ala

met

ala

gln

val

lys

leu gln gln

ser

gly gly gly leu val gln

121/41

151/51

CD£>1

CCT GGA

AGG

TCC

CTG

AAA

CTC

TCC

TCT

GTA

GCC TCT GGA

TTC

ACT TTC

AGT

AAC

CAT

CCA

pro gly

arg

ser

leu

lys

leu

ser

cys

val

val ser gly phe

tho phe

ser

asn tyr gly

181/61

211/71

ATG AAC

TGG

ATT

CGC

CAG

ACT

CCA

CG^G

AAG

GGA CTG GAG

TGG

GTC GCA

TAG

ACT AGC AGC

met asn

trp

ile

arg

gin

thr

pro

gly

lys

gly leu glu tira

val ala

tyr

ile ser ser

241/81

271/91

GGT AGC

AGT

TAC

CTC

TAC

TAT

GCA

GAA ACG

GTG AAG (GGC

CGA

CCC ACC

ACC

TCC AGA GAC

gly ser

ser

tyr

leu

tyr

t}y

ala glu thr val lys gly arg phe thr

ser arg asp

301/101

331/111

AAT GCC

AAG

AAC

ACC

ccg

TAC

CCG

CAA ACG ACC AGC CCG

AGG

CCC GAG

GAG

AGC GCC CCG

asn ala

lys

asn

thr

leu tyr

leu gln met

thr ser leu

aog

ser glu

asp

tho

ala

leu

361/121

391/131

Styl

TAT TAC

TGT

GCA

AGA

GAC

GAG

GGT

ACG

GGC

ACC GAC (CCC

ΤΆΑ

GAC 'AAC

TGG

GGC (CAA GGG

tyr tyr

cys

ala

arg

his glu gly thr gly thr asp phe phe

asp tyr

tio?

gly gln gly

421/141

BstEII

451/15T.

Łącznik

ACC ACG

GTC

ACC

GTC

TCC

TCCA

GGT

GCGA AGC

GGT TCA GGC

GGA GGT GGC

TCT

(GGC

GGT

G<^<C

thr thr

val

thr

val

ser

gly gly gly gly ser gly gly gly gly

ser

g^yy g^yy g^yy

481/161

SacI

511/171

GGA TCG

(ACC

GCA

GAG

CTC

ACC

CAG

T(CC

CCA

CAT TCC CTG

TCT

GCA TCT

CCG

GGA GAA ACT

gly ser

asp

val

glu

leu

thr gin

ser

pro

his ser leu

ser

ala ser

leu

gly glu thr

541/181

571/191

GTC TCC

ATC

GAA

TCT

CCA

G(CA AGT

GAG

GGC

ATT TCC AAT

TAT

CCA GCG

T(^G

TAT CAG CAG

val ser

ile

glu

oys

leu

a!.a

ier

glu gly ile ser asn

tyr

leu ala

trr>

tyr

gln gln

601/201

631/211

AAG CCA

GGG

AAA

act

ACC

CCA

ICC

CCC

ATC

GAT GCT GCA AGT

AGC TCG

CAG

GAC

GGG GTC

lys pro gly

lyy

ier

Apo

C1u

ile

iiy

lyr lyr ala

ser

seo leu gln

asp

gly val

661/221

691/231

CCA TCA

CGG

CCC

AGT?

GGC

AGT

GCGA

TCT

GGC

ACA CAG TCCC

TCT?

GCC TAG

ATC

AGC

KAC ATG

pro ser

arg

phe

ser

gly

sse

gly

ser

gly thr gln phe

ser

leu lys

iiy

s^e

isn met

721/241

751/251

CAA CCT

(AGA

(AAT

GAA

GGG

GTC?

GAT

AAC

GCG

CCA CCA GCC TAC ATC TAC CCC CCC ACG

Tac

gin pro

glu

asp

glu

gly

val

tyr

cys( gln gln a].a lyr

lys tyr

pro

sse

Cłu

phe

781/261

811/271 Notl

GGA GCT

GGC

ACC

AAG

CCG

GAA

ATA

ΛΑΑ

C(G3

GCG GCC GCA

GTjG AAA

CTC

ACC

TCA GGA

gly ala

giy

tiar

lys

leu

glu

ile

lyS

arą

ala ala a!a

G1u gln lys

leu

ile

ser glu

CTG JAAT leu asn

TTAA TCA GGALTTę ACT ^GGCOCH OCH glu phe thr gly

GAG GAT glu asp

180 760

SEKW. Nr ID 2

1/1 lider Pe1B

31/11

Pstl

TTA TTA

CTC

GCG

GCC

CAG

CCG

GCC

ATG

GCCT

CAG

GTC

CAA CTC

CAG

GAG

TCA

CCT

AAC

leu leu

leu

sla

ala

gln

Aro

Ale

see

sIuI

gin av1 sin lee sin siu

sse

_lu _rr _iu

61/21

91/31

CTA GGG

CAG!

_CC

GGA

AGC

GCT

TCC

ATA

ACC

STC

ACA GTC

TCT

GGT

CTC

TCA

TTA AGT

leu gly

gln

pro

ala

gln

ser

eii

ese

Aie

A hr

cys

thr val

ser

gly

piie

ser

leu

ser

121/41

CDR1

151/51

AGC TAT

GGT

STA

SAC

TGG

ATT

TCC

CCA

TCT

CCA

(AAC

AAG GGT

CTG

GAG

TGG

CTG

GGA

lGCA

ser tyr gly val

his

trp

val

aeg

gin

s er

pro qly

lys gly

leu

glu

trp

leu

gly ( val

181/61

CDR2

211/71

ATA TGG

AGA

(GG

AGA

AGC

ACA

CAG

TAC

AAT

GCA

GCC

CTC ATG

TCC

AGA

CTG

AGC

ATC

ACC

ile trp

arg gly gly gly hr asp

tyr

s as

ala

ala phe met

ser

arg

leu

ser

ile

thr

241/81

271/91

AAG GAC

TAC

_CC

AAG

AGC

AAA

ATG

TTC

TTT CTTC

TTC

AAC AGT

CTG

CAA

CCT

GAT

GAC

ACT

lys asp

asn

ser

lys

ser

gln val phe phe lys

leu

asn ser

leu

gln

pro

asp

thr

301/101

331/111

CDR3

GCC ATG

TAC

AAC

AGT

GCC

AAA

AGG

GGT

GGC

CCG

GGG

TAT sec

GAT

GTC

TGG

GGC

CAA

GTC

ala met

tyr

syr

Ala

Aur

Aag aIu g1u Pp° A1u Str (ph

ais av1

srr _iu gin _iu

361/121

BstEII

391/131

łącznik

ACC ACG

GTC

ACC

ATC

TCC

ACA

CAA

GTG

GGG

GGT

TTC

GGG GGA

^Τ

GGC

TCT

AGC

GGC

thr thr

val

ttir

val

see

Aer

ery giy 9iy

ser

gly gly gly gly

ser

gly gly

421/141

VK->

SacI

451/151

GGA tcg

GAC

ATT

GAG

CTC

ACC

CAG

TCT

CCA

GCC

TCC

CTA TCT

GCA TCT

GTG

CCA GAr. ACT

gly ser

asp

ile

glu

leu

thr

gln ser pro

ala

ser

leu ser

ala

ser

val

gly glu thr

481/161

CDR1

511/171

GTC ACC

ATG

ACA

S^T

CGA

GCA AAT

GAG

AAA

ATT

TACA

AGT TArr

CTA GCA.

AGG

TAT

CAG

val thr

met

Str

syr

Aag

Ala

ner

rin aas

l ie

tts:

ser asn

leu

ala

trp

tm gln gln

541/181

571/191

CDR2

AAA CAG

GGA

AAG

ACT

AAG

CTC

AGT

AAT

gct

GCA ACA lTTC

CCA

(GGA aat

AGT

GTG

lys gln

gil

Aut

sse

Aro

Aln

leu

le u

v v1

Itr

ala

ala thr

lys pro gly

asn

gly val

601/201

631/211

PstI

CCA TCA

AGG

TTC

AGT

GGC

AGT

GGA

TCA

GGC

ACA

CAA

TTT TCT

CTC

AAG

ATC AAC AGC

CTC

pro ser

arg

phe

ser

gly

ser

gly

ser

gly thr gln phe ser

leu lys

ile asn ser

leu

661/221

CDR3

CAG CCT

GGA

AAT

CTT

AGG

AAC

TAT

TAC

TGT

CCT

srA

ACT aat

GGG

ACT

CCG

TAT AGG

TCC

gln pro

glu

ssp

Ale

iu

Asn

syt

tyr

cys

l ee

Sin phe lyr

gly thr pro

tyr arg

phe

721/241

7751251

Not II

GGC GGG

GGC

ACC

AAG

CTC

GAA ACG

AAA

CGG GCG GCC GCA GAA

CAA AAA CTC ATC TCA GAA

gly gly gly

thr

lys

Ueu

glu thr

lys

arg

ala

ala ala glu gln lys

leu

ile

ser

glu

781/261

EcoRI

CTG ΑΑΤ leu asn

TAA TAA GAĄ _CTC ACT GGC OCH OCH glu phe thr gly

GAG GAT glu asp

180 760

Fig. 1Α

Fig. 1B

180 760

AKTYWACJA

HER2+ScFv

Fig. 1C

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sekwencja kwasu nukleinowego zawierająca gen kodujący polipeptyd o sekwencji zdefiniowanej jako SEQ ID nr 1 lub SEQ ID nr 2.
2. Sekwencja kwasu nukleinowego według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera sekwencję kwasu nukleinowego zdefiniowanąjako SEQ ID nr 1 lub SEQ ID nr 2.
3. Sekwencja kwasu nukleinowego według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że sekwencja jest pod kontrolą funkcjonującego w komórkach ssaczych promotora wybranego z grupy promotorów CMV, SV40, E1a, MLP, LTR lub villiny.
4. Sekwencja kwasu nukleinowego według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że sekwencja ta jest włączona do wektora.
5. Sekwencja kwasu nukleinowego według zastrz. 4, znamienna tym, że sekwencja ta jest włączona do wirusowego wektora.
6. Zdefektowany wirus rekombinacyjny wybrany spośród retrowirusów, adenowirusów, wirusów adenopochodnych, wirusa ospy i wirusa HSV, znamienny tym, że wirus ten zawiera w swoim genomie co najmniej jedną sekwencję kwasu nukleinowego zdefiniowaną jako SEQ ID nr 1 lub SEQ ID nr 2.
7. Zdefektowany wirus według zastrz. 6, znamienny tym, że zawarta w nim sekwencja jest pod kontrolą funkcjonującego w komórkach ssaczych promotora wybranego z grupy promotorów CMV, SV40, E1a, MLP, LTR lub villiny.
8. Zdefektowany wirus według zastrz. 7, znamienny tym, że zawarta w nim sekwencja jest włączona do wektora.
9. Zdefektowany wirus według zastrz. 8, znamienny tym, że zawarta w nim sekwencja jest włączona do wirusowego wektora.
10. Kompozycja farmaceutyczna do terapii genowej związanej z produkcją przeciwciał lub aktywnych peptydów obejmująca kwasy nukleinowe lub geny kodujące aktywne terapeutycznie czynniki oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienna tym, że zawiera co najmniej jedną sekwencję kwasu nukleinowego zdefiniowanąjako SEQ ID nr 1 lub SEQ ID nr 2 będącą pod kontrolą funkcjonującego w komórkach ssaczych promotora wybranego z grupy promotorów CMV, SV40, Ela, MLP, LTR lub villiny albo co najmniej jeden zdefektowany rekombinacyjny wirus zawierający tą sekwencję, w postaci dawkowej od 10⁴ do 10¹⁴ pfu/ml oraz dopuszczalne farmaceutycznie nośniki.
11. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 10, znamienna tym, że zawiera sekwencję kwasu nukleinowego włączoną do wektora.
12. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 11, znamienna tym, że zawiera sekwencję kwasu nukleinowego włączoną do wirusowego wektora.
13. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 10 albo 11, albo 12, znamienna tym, że zdefektowany wirus wybrany jest z grupy adenowirusów, retrowirusów i adenopodobnych wirusów.
14. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 10 albo 11, albo 12, znamienna tym, że zawiera sekwencję kwasu nukleinowego w postaci dawkowej od 10⁶ do 10¹⁰ pfu/ml.