PL181638B1

PL181638B1 - Sposób oznaczania sklonnosci do rozwoju zakrzepicy PL

Info

Publication number: PL181638B1
Application number: PL34254994A
Authority: PL
Inventors: Bjorn Dahlback
Original assignee: Bjorn Dahlback
Priority date: 1993-01-29
Filing date: 1994-01-28
Publication date: 2001-08-31
Also published as: SE9300300D0

Abstract

1 . Sposób oznaczania sklonnosci do rozwoju zakrzepicy u danego osobnika w wyniku dziedziczonej APC-odpomosci spowodowanej mutacja (mutacjami) genu, znamienny tym, ze oznacza sie w próbce komórek pochodzacych od tego osobnika wystepowanie mutacji w genie dla Czynnika V, przy czym mutacje sa zlokalizowane w jednym, w wiekszej ilosci frag- mentów i/lub w sekwencji kwasu nukleinowego w genie dla Czynnika V, powodujac ekspresje zmutowanej czasteczki Czynnika V/Va, co jest zwiazane z wystepowaniem APC-odpornosci, a wiec, sklonnosci do rozwoju zakrzepicy. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób oznaczania skłonności do rozwoju zakrzepicy. Nowa aktywność kofaktora antykoagulanta uczestnicząca w ludzkim układzie krzepnięcia krwi, jak stwierdzono, jest prawdopodobnie zaangażowana również w układzie krzepnięcia krwi niektórych innych gatunków ssaków.

Krzepnięcie krwi jest złożonym procesem, w którym bierze udział wiele białek, których funkcje wspólnie z płytkami składają się na hemostazę. Układ krzepnięcia podlega ścisłej regulacji przez szereg białek antykoagulacyjnych obecnych w osoczu i na powierzchni śródbłonkowych komórek krwi (Esmon, J. Biol. Chem., 264. 4743-4746, 1989; Bauer, Sem. Hematol. 28, 10-18, 1991; Rapaport, Blood 73, 359-365; 1989). W warunkach fizjologicznych mechanizmy pro- i antykoagulacyjne są delikatnie zrównoważone, co zapewnia hemostazę i krzepnięcie. Zaburzenia tej równowagi prowadzą albo do krwawień albo do zakrzepów.

Przedmiot wynalazku jest ściśle związany ze stwierdzoną nową aktywnością, biorącą udział w ważnym fizjologicznie układzie antykoagulacji, związanym z białkiem C i białkiem S, co zostało wyjaśnione w ostatnich latach i jest przedstawione poniżej jako część powiązanych ze sobą interakcji w procesie koagulacji krwi, zilustrowanych na schemacie 1.

We wspomnianym powyżej układzie antykoagulacji, kluczowym składnikiem jest białko C, czyli białko osoczowe zależne od witaminy K. Białko to po aktywacji przebiegającej na komórkach śródbłonkowych przez kompleks: trombina/trombomodulina do aktywnego białka C (APC) selektywnie rozkłada czynniki krzepnięcia V_a i VIII_a, czyli aktywne formy odpowiednio czynników krzpnięcia V1 VIII (Esmon, jak wyżej; Stenflo w książce: „Protein C and related proteins”; pod red. Bertina'y (Churchill Livingstone Longham Group, W. Brytania ,21-54,1988 oraz Mann i wsp. Ann. Rev. Biochem 57 915-956, 1988 i Kane i wsp., Blood 71, 539-555, 1988).

Na aktywność APC wpływa inne, zależne od witaminy K białko osoczowe, nazwane białkiem S, pełniące rolę kofaktora w stosunku do APC w procesach rozkładu czynników V_a i VHI_a (Esmon, j ak wyżej, Stenflo, j ak wyżej, i Dahlback, Thromb. Haemostas. 66,49-61,1991).

Wspomniane wyżej czynniki Va i VIIIa są kofaktorami związanymi z fosfolipidami biorącymi udział w aktywacji odpowiednio czynnika X i protrombiny, a zatem, pośrednio zaangażowanymi w konwersję fibrynogenu do fibryny, to znaczy, w powstawanie skrzepu. Zgodnie z tym, szybkość reakcji krzepnięcia jest zależna od równowagi między aktywacją czynników VIII

181 638 i V a rozkładem ich form aktywnych, przy czym nieaktywne formy czynników VIII i V są słabymi substratami dla APC.

Zaburzenia w układzie krzepnięcia krwi często manifestują się poważnymi stanami, często zagrażającymi życiu, a wiedza o ich przyczynach ma często zasadnicze znaczenie dla prawidłowej diagnozy i/lub powodzenia leczenia ujawniającej się choroby albo skriningu osobników wykazujących predyspozycje do chorób związanych z krzepliwością krwi. Przykładowo, konsekwencjąwykrycia niedoboru białka C towarzyszącego trombofilii było zastosowanie lecznicze oczyszczonego białka C.

Trombofilię można zdefiniować jako skłonność do choroby zakrzepowo-zatorowej żył występującą w młodym wieku u dorosłych przy braku znanych czynników ryzyka. Jakkolwiek u niektórych pacjentów z trombofiliąstwierdza się nieprawidłowości, to w większości takich przypadków nie wykrywa się zmian w próbach laboratoryjnych.

Schemat ciynnik XI

Czynnik IX trombop1aatyna tkankowa czynnik VII; Ca^*

Ca

2* czynn i k X

Czynnik IX_aFosfolipid Ca²*

Bi alko S

Czynnik VI l I --'-czynn i k V 1 t l _a

Z /

/ .J

Aktywowane

O i ałko C (APC) tromóomo<Ju 1 i na białko C

Prot.romt> i na czynnik X_afos-fo lipid

Ca czynnik V-.-czynnik V tromio i na czynnik XIII czynn i k XH i f t brynogen f i bryna bryna (rozpuszczalna) (nierozpuszczalna) etapy prokoagulacyjne etapy hamowania koagulacja.

181 638

Niniejszy wynalazek jest związany z nowym defektem w odpowiedzi antykoagulacyjnej na aktywną formę białka C, zwanym odpornościąna APC. Okazuje się, że defekt tenjest dziedziczny i związany z trombofilią rodzinną.

W pewnych przypadkach trombofilię wiązano z hipotetycznymi czynnikami, takimi jak przeciwciało przeciw białku C (Mitchell i wsp., New England Journal of Medicine, 316. 1638-1642, 1987), przeciwciało przeciw kardiolipinie (Amer i wsp., Thrombosis Research 57, 247-258,1990) i z defektem cząsteczki czynnika VIII (Dahlback i wsp., Thromb. Haemost. 65. Abstrakt 39, 658, 1991).

W opisie patetnowym PCT, WO 93/10261, opublikowanym ' po dacie najwcześniejszego pierwszeństwa zastrzeganego dla niniejszego zgłoszenia, ujawnione są metody in vitro diagnozowania objawów zaburzeń krzepnięcia krwi bądź skriningu osobników wykazujących skłonność do zaburzeń krzepnięcia krwi. Próby te są oparte na pomiarze antykoagulacyjnej odpowiedzi na egzogenne APC dodane do próbki osocza pobranego od osobnika poddawanego badaniom. Słaba odpowiedź antykoagulacyjna na APC, to jest, odporność na APC, wskazuje na wystąpienie objawów lub skłonność do zaburzeń krzepliwości krwi, a zwłaszcza do choroby zakrzepowozatorowej. W cytowanej publikacji nie podano wyjaśnienia powstania odporności na APC, jednak przepuszcza się, że oporność ta wynika z nieznanych dotychczas interakcji w układzie krzepnięcia albo wywołują ją nieznane czynniki krzepnięcia. Wykluczono jednak niektóre możliwe hipotezy, wiążące oporność na APC z funkcyjnym niedoborem białka S, z przeciwciałem hamującym białko C, z inhibitorem proteazy dla APC lub z mutacją genu dla cząsteczki opornego na APC czynnika Va albo czynnika VIII.

Jak wykazały badania twórców wynalazku, oporność na APC wynika z niedoboru uprzednio nierozpoznanej aktywności kofaktora antykoagulanta zwiększającej działanie proteolityczne APC skierowane przeciw czynnikowi Vai czynnikowi VIIIa. Obserwacje stanowiące podstawę do wykrycia aktywności kofaktora antykoagulacji zostały opisane przez Dahlbacka i wsp. i opublikowane po dacie najwcześniejszego pierwszeństwa zastrzeganego w niniejszym zgłoszeniu (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1004-1008, 1993).

Badania twórców wykazały zwłaszcza, że tę aktywność antykoagulacyjną wykazuje czynnik V, co jest spostrzeżeniem zdumiewającym, gdyż czynnik V jest prekursorem prokoagulacyjnego czynnika Va, który to czynnik Va jest rozkładany przez APC w wyżej wspomnianym układzie antykoagulacyjnym z udziałem białka C. Tak więc, czynnik V jest drugim po wspomnianym wyżej białka S kofaktorem, jaki znaleziono dla APC. Zgodnie z tym, tej nowej aktywności kofaktora antykoagulanta nadano nazwę „aktywność APC-kofaktora 2” albo „aktywność antykoagulacyjna czynnika V” i tam, gdzie to stosowne czynnik V jest również nazwany „APCkofaktorem-2”. Uprzednio znana aktywność czynnika V jest znana pod nazwą „aktywności prokoagulacyjnej czynnika V”. Nie możnajednak całkowicie wykluczyć ewentualności, że aktywność ta jest związana z czynnikiem Va.

Wykrycie tej nowej aktywności kofaktora antykoagulanta było związane z obserwacjąjednego pacjenta z zakrzepem i z nienormalną opornością na APC wykrytą podczas badania osocza tego pacjenta metodami ujawnionymi w opisie patentowym PCT WO 93/10261 (z pierwszeństwa z 13 listopada 1991 r., w którym Stany Zjednoczone sąjednym z krajów wyznaczonych; ujawnienie tego opisu jest wprowadzone do niniejszego opisu jako odnośniki) i przez Dahlback'a i wsp. (Thromb. Haemost. 65, streszczenie 39, 658, 1991). Badając dużą populację pacjentów z chorobą zakrzepową wykazano, że oporność na APC jest przyczyną 30-40% idiopatycznych zdarzeń zakrzepowo-zatorowych (Thromb. Haemostas. 69, streszczenie 39, 999, 1993).

Okazało się także, że surowa frakcja uzyskana z normalnego osocza wykazuje aktywność naprawiającą defekt osocza APC-opornego, podczas gdy odpowiednia frakcja osocza APC-opornego pochodzącego od pacjenta z silną APC-opornościąbyła nieaktywna. Świadczy to o istnieniu nowego kofaktora dla APC. Dodatkowo, stosując preparaty oczyszczone pod kątem tej aktywności do prób zaprojektowanych do celów pomiaru tej aktywności uzyskano rozstrzygający dowód na istnienie nowego kofaktora dla APC.

181 638

Nieoczekiwanie okazało się, że ludzki czynnik V, niezależnie od swej znanej funkcji prekursora dla prokoagulacyjnego czynnika V_a wykazuje aktywność kofaktora dla APC. Jest prawdopodobne, że ta podwójna funkcja ludzkiego czynnika V występuje również w czynniku V pochodzącym z krwi niektórych gatunków zwierząt, zwłaszcza ssaków ale nie występuje u innych gatunków. Przykładowo, wszystkie uzyskane dotychczas wyniki wskazują, że aktywności tej nie wykazuje osocze bydlęce.

Ta aktywność czynnika V jako kofaktora oznacza, że zwiększa on działanie proteolityczne aktywnego białka C i w konsekwencj i rozkład czynnika V_a będącego aktywną formą czynnika V, a także zwiększa rozkład czynnika VIIIa.

Uprzednio było wiadomo, że prokoagulacyjna aktywność czynnika V wynika z jego aktywacji przez trombinę, podczas której to aktywacji ulegają rozszczepieniu trzy wiązania peptydowe i powstaje prokoagulacyjny czynnik Va w postaci kompleksu wytworzonego w miejscach N- i C-końcowych części natywnego czynnika V. Funkcja dwu dużych aktywnych peptydów pochodzących z centralnej części czynnika V pozostajejednak nieznana. Jak to będzie przedstawione w części doświadczalnej niniejszego ujawnienia, nie wykryto aktywności APC-kofaktora 2 w czynniku Va w próbie APC- oporności.

Aktywność APC-kofaktora 2 wykazuje preferencyjnie cała, nienaruszona cząsteczka czynnika V; prawdopodobnie duże fragmenty odszczepiane podczas jego aktywacji do czynnika Va są odpowiedzialne za większą część tej aktywności. Nie można jednak całkowicie wykluczyć ewentualności, że aktywność ta jest związana z jednostką molekularną tworzącą bardzo trwały kompleks z czynnikiem V, który to kompleks nie podlega rozszczepieniu w procesach oczyszczania zastosowanych do izolacji czynnika V wykazującego aktywność APC-kofaktora 2.

Wyniki doświadczeń wykonanych tuż przed dokonaniem niniejszego zgłoszenia wykazały w typowym badaniu wiązania DNA u dużej rodziny z dziedziczną PAC-opornością, że istnieje ścisły związek pomiędzy polimorfizmem w genie dla czynnika V i ekspresją APC-oporności.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób oznaczania skłonności do rodzaju zakrzepicy u danego osobnika w wyniku dziedziczonej APC-odporności spowodowanej mutacją (mutacjami) genu charakteryzujący się tym, że oznacza się w próbce komórek pochodzących od tego osobnika występowanie mutacji w genie dla czynnika V, przy czym mutacje są zlokalizowane w jednym lub w większej ilości fragmentów i/lub w sekwencji kwasu nukleinowego w genie dla czynnika V, i powodując ekspresję zmutowanej cząsteczki czynnika V/Va, co jest związane z występowaniem APC-odporności, a więc, skłonności do rozwoju zakrzepicy.

Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że oznacza się mutację (mutacje) jako nienormalny brak lub nienormalną obecność fragmentu (fragmentów) i/lub sekwencji kwasu nukleinowego w genie dla czynnika V, spowodowane przez tą mutację, przy czym oznaczenia prowadzi się w oparciu na próby hybrydyzacji kwasów nukleinowych, sekwencjonowania kwasów nukleinowych albo w oparciu o próby immunologiczne. Mutację taką (mutacje) korzystnie oznacza się pośrednio, wiążąc jej występowanie z neutralnym polimorfizmem w genie czynnika V.

U osobników posiadających skłonność do rozwoju zakrzepicy zgodnie ze sposobem według wynalazku można w oparciu o stwierdzoną nową rolę antykoagulacyjną czynnika V oznaczyć w próbie funkcjonalną aktywność wybranego składnika koagulacji krwi, w celu zdiagnozowania zaburzeń koagulacyjnych i antykoagulacyjnych krwi, zwłaszcza zaburzeń zakrzepowozatorowych a także określania skłonności do tych zaburzeń u osobników, korzystnie u ssaków zwłaszcza u ludzi, związanego z układem antykoagulacyjnym białka C i obejmującym białko C, aktywne białko C (APC), białko S lub antykoagulacyjny czynnik V w oparciu o powiązanie tej aktywności funkcjonalnej z konwersją specyficznego dla APC substratu, w obecności wspomnianych składników układu antykoagulacyjnego białka C.

Metoda ta polega na tym, że do roztworu testowego zawierającego próbkę i substrat dla APC dodaje się jedną lub dwie substancje inne niż oznaczony składnik, albo inhibitor jego aktywności, wybrane spośród a) APC, b) białka S lub inhibitora, który blokuje aktywność białka S, oraz c) posiadającego antykoagulacyjną aktywność czynnika V albo inhibitora, który blokuje tą

181 638 aktywność, mierzy się szybkość powodowanej przez APC konwersji substratu, oraz wykonuje się korelację zmierzonej wielkości z aktywnością oznaczanego składnika, przy czym gdy badanym składnikiem jest białko C/APC lub białko S, do medium testowego dodaje się co najmniej czynnika V posiadający aktywność antykoagulacyjnąlub inhibitor blokujący tą aktywność i diagnozuje się na podstawie poziomu substancji analizowanej w próbce od osobnika skłonności do zaburzeń koagulacyjnych i antykoagulacyjnych a także ocenia się skłonność do zaburzeń zakrzepowo-zatorowych.

Do medium testowego można także dodać dwie substancje inne niż oznaczany składnik, albo inhibitorjego aktywności, wybrane spośród a) APC, b) białka S lub inhibitora, który blokuj e aktywność białka S, oraz c) posiadającego antykoagulacyJnąaktywność czynnika V albo inhibitora, który blokuje tą aktywność.

Inną drogąjest dodawanie dwóch substancji innych niż oznaczany składnik, albo inhibitor jego aktywności, wybrane spośród a) APC, b) białka S lub inhibitora, który blokuje aktywność białka S, oraz c) posiadającego antykoagulacyjną aktywność czynnika V albo inhibitora, który blokuje tą aktywność, każdą w ilości wystarczającej do dostosowania do zmiennego poziomu wspomnianych substancji, korzystnie wspomnianą substancję dodaje się w nadmiarze.

W metodzie tej korzystnie oznacza się antykoagulacyjny czynnik V jako kofaktor dla APC, lub antykoagulacyjny czynnik V związany z odpornością na APC.

Aktywność antykoagulacyjną czynnika V można także oznaczać w obecności dodanego białka S, albo inhibitora blokującego pochodzącąz próbki aktywność białka S, natomiast w przypadku, gdy oznacza się białko C po aktywacji do APC lub APC, do medium testowego dodaje się czynnik V posiadający aktywność antykoagulacyjną albo inhibitor blokujący aktywność pochodzącą z próbki i białko S lub inhibitor blokujący pochodzącą z próbki aktywność białka S. Korzystnie w przypadku, gdy oznacza się białko S, do medium testowego dodaje się czynnik V posiadający aktywność antykoagulacyjną albo inhibitor blokujący aktywność pochodzącą z tej samej próbki oraz APC. Do medium testowego dodaje się także czynnik VIII i/lub czynnik Villa. Jeżeli stosuje się białka koagulacyjne do pomiaru substratowej konwersji APC, a substrat dla APC zawiera czynnik Va i/lub czynnik VIIIa i próbka pochodzi od osobnika, wtedy do medium testowego dodaje siębiałko S albo inhibitor białka S, z tym, że jeśli próbka pochodzi od osobnika leczonego antagonistami witaminy K lub z deficytem innego pochodzenia zależnych od witaminy K czynników koagulacji, wówczas modyfikuje się aktywności tych czynników zależnych od witaminy K w próbce przez dodanie co najmniej jednego czynnika koagulacji zależnego od witaminy K w formie aktywnej lub nieaktywnej, ewentualnie w połączeniu z białkiem S.

Do medium testowego można dodawać taką ilość wybranej substancji aby poziomjej aktywności funkcjonalnej był stały w porównywalnych próbkach, ewentualnie wprowadza się funkcjonalny nadmiar wybranej substancji w porównaniu z poziomem tej substancji występującym w samej próbce. Jako inhibitor można stosować przeciwciało wiążące się swoiście z epitopem związanym z aktywnością APC, lub z antykoagulacyjną aktywnością czynnika V związaną z opornością na APC. Jako próbkę najczęściej stosuje się krew albo próbkę pochodzącą z krwi, zwłaszcza próbkę osocza, a także jedną albo dwie dodawane substancje wprowadza się w postaci osocza z deficytem oznaczanej substancji. Można także dodawać do medium testowego prawidłowe osocze z deficytem oznaczanej substancji, w tym przypadku właściwym jest aby oznaczaną substancję stanowił antykoagulacyjny czynnik V jako kofaktor dla APC, a osocze z deficytem oznaczanej substancji stanowiło osocze wolne od czynnika V. Oznaczaną substancję może stanowić antykoagulacyjny czynnik V związany z opornością na APC, a osocze wolne od oznaczanej substancji może stanowić osocze wolne od czynnika V. Najbardziej dogodna metoda charakteryzuje się tym, że w przypadku gdy oznaczaną substancję stanowi antykoagulacyjny czynnik V kofaktor dla APC lub związany z opornościąna APC do medium testowego dodaje się czynnik koagulacji krwi lub odczynnik, który aktywuje układ koagulacji krwi na drodze zewnętrznej lub wewnętrznej, można także ponadto korzystnie dodawać koagulacyjne czynniki krwi wybrane z grupy obejmującej czynnik VTI/Vna, czynnik IX, czynnik IXa, czynnik X/Xa, czynnik II, czynnik XIa, czynnik XIIa oraz aktywator kontaktowy lub czynnik tkankowy.

181 638

Metodę tę można bardzo dobrze zrealizować wtedy gdyjeśli oznaczaną substancję stanowi antykoagulacyjny czynnik V posiadający aktywność antykoagulacyjną jako kofaktor dla APC lub związany z opornością na APC, dodaje się osocze z deficytem aktywności antykoagulacyjnej, które to osocze stanowi osocze ludzkie, pozbawione tej aktywności, albo też osocze ludzkie od jednego lub więcej osobników, których osocze jest pozbawione takiej aktywności.

Aktywność antykoagulacyjną czynnika Vjako kofaktora dla APC oznacza się także w próbce w oparciu o próbę koagulacji, w której to próbie (i) jednąporcję próbki inkubuje się przy nieobecności dodanego APC, ale ewentualnie w obecności innych składników układu krzepnięcia krwi, umożliwiających pomiar konwersji substratu przez APC i (ii) jednąporcję próbki inkubuje się w obecności dodanego APC i ewentualnie w obecności innych składników układu krzepnięcia krwi, umożliwiających pomiar konwersji substratu przez APC, i wyniki prezentuje się jako czas aglutynacji, ewentualnie po odpowiedniej konwersji, przy czym wyniki poniżej ustalonej wartości „odcięcia” przyjętej w oparciu o pomiar czasów aglutynacji wykonany w ten sam sposób u normalnych osobników, wskazują na niedobór aktywności antykoagulacyjnej czynnika V. W powyżej zastosowanej odmianie metody do medium testowego dodaje się prawidłowe osocze wolne od oznaczanej substancji a oznaczaną substancję stanowi antykoagulacyjny czynnik V jako kofaktor dla APC, a osocze wolne od oznaczanej substancji stanowi osocze wolne od czynnika V.

Oznaczaną substancję może stanowić antykoagulacyjny czynnik V związany z odpornością na APC, a plazmę wolną od oznaczanej substancji stanowi osocze wolne od czynnika V. W przypadku gdy oznaczaną substancję stanowi antykoagulacyjny czynnik V jako kofaktor dla APC lub związany z opornością na APC do medium testowego dodaje się czynnik koagulacji krwi lub odczynniki, które aktywują układ krzepnięcia krwi na drodze wewnętrznej lub zewnętrznej. Można też dodawać inne składniki koagulacji krwi, które to składniki wybrane są z grupy obejmującej czynnik VII/VIIa, czynnik IX, czynnik IXa, czynnik X/Xa, czynnik II, czynnik XIa, czynnik XIIa oraz odczynnik, takijak aktywator kontaktowy lub czynnik tkankowy. Natomiast w przypadku gdy oznaczaną substancję stanowi antykoagulacyjny czynnik V, posiadający aktywność antykoagulacyjną jako kofaktor dla APC, lub związany z opornością na APC, dodaje się osocze wolne od tej aktywności antykoagulalcyjnej, które to osocze stanowi osocze ludzkie, które zostało pozbawione tej aktywności, albo też osocze ludzkie od jednego lub więcej osobników, których osocze było pozbawione takiej aktywności.

Tak więc, wyrażenia „czynnik V” i „czynnik V wykazujący aktywność APC-kofaktora 2” i podobne obejmują, również wspomniany kompleks czynnika V, jak również fragmenty czynnika V, korzystnie inne niż fragmenty pochodzące z rozszczepienia czynnika V trombiną, posiadające tę aktywność. Modyfikowany czynnik V z zachowaną aktywnością APC-kofaktora można również otrzymać przez rozkład proteolityczny innymi enzymami pochodzenia ludzkiego lub nie-ludzkiego, takimi jak enzymy jadu żmiji i inne proteazy. Ponadto okazało się, że aktywność APC-kofaktora 2 zachowuj e się po częściowej proteolizie nieznanym enzymem podczas procesu oczyszczania, co wskazuje na potencjalne istnienie fragmentów czynnika V z aktywnością APC kofaktora 2. Produkty ekspresyjne APC-kofaktora 2 jak również czynnika V wykazujące aktywność antykoagulacyjjną.obejj7iujjifragmenty i podjednostki czynnika V/V_a wykazujące tę aktywność albo determinantę immunoloficzną związaną z rejonem związanym z tą aktywnością Jakkolwiek dla wygody, czynniki koagulacji ani czynniki podobne nie są opisane w niniejszym opisie, to o ile nie podano inaczej, należy rozumieć, że są to czynniki pochodzenia ludzkiego.

W części doświadczalnej niniejszego ujawnienia opisane sąprocedury oczyszczania i charakteryzacji aktywności APC-kofaktora 2 i jest zweryfikowane powiązanie tej aktywności z czynnikiem V. Podsumowując, istnieją następujące dowody na obecność aktywności APC-kofaktora 2 w czynniku V.

1. Proces zaprojektowany dla izolaaji akaywności APO kofaktora 2 t waześniejsze metody izolacji czznniOk V są bardzo podobne. Podczas elektroforezy w żelu poliakrylaamldowym SDS-PAGE pojawiająsię trzy pasma odpowiadające wilkości około 200-220 ODa (część C-końcowa), 140-160 OdA (część N-końcowa) i 330 ODa, co jest również bardzo podobne do opisu czynnika V. (Patrz sekcja doświadczalna ujawnienia arae artykuł Dahlbacka i wsp. w J. Clin. In8

181 638 vest. 66, 583-591, 1980). Przy użyciu wyższych stężeń inhibitorów proteazy podczas procesu oczyszczania zwiększa się intensywność pasma dla 330 kDa zarówno dla aktywności APC-kofaktora 2 jak i dla czynnika V. Przykładowo, chlorowodorekbenzamidyny w stężeniu 10 mM daje znaczny wzrost intensywności pasma dla 330 kDa.

2. Swoista antysurowica poliklonalna przeciw ludzkiemu czynnikowi V (Dakopatt A/S, Dania) reaguje z każdym z trzech pasm związanych z aktywnością APC-kofaktora 2 w próbie hybrydyzacji techniką Westerna.

3. Po dodaniu trombiny do preparatów zawierających aktywność APC-kofaktora 2, te trzy pasma zanikają a otrzymanych produktów nie można odróżnić od produktów powstałych w wyniku aktywacji czynnika V trombiną.

4. Otrzymano siedemnaście przeciwciał monoklonalnych reagujących z czynnikiem V stosując preparaty oczyszczony z użyciem aktywności APC-kofaktora 2 jako immunogenu. Dwa z tych przeciwciał monoklonalnych częściowo hamują aktywność APC-kofaktora 2 nie hamując przy tym aktywności prokoagulacyjnej czynnika V.

5. Aktywność prokoagulacyjną czynnika V i aktywność APC-kofaktora 2 eluowano łącznie na każdym z niżej testowanych materiałów: Heparin Sepharose, Blue-Sepharose, Wheat Germ Lectin Sepharose, Q-Sepharose i S-Sepharose (Pharmacia, Szwecja), ilustrujących materiały stosowane do badań.

6. Zarówno aktywność prokoagulacyjna czynnika V jak i aktywność APC-kofaktora 2 pozostały na matrycy zawierającej przeciwciała poliklonalne przeciw ludzkiemu czynnikowi V (Dakopatts A/S, Dania).

7. Zarówno aktywność prokoagulacyjna czynnika V jak i aktywność APC-kofaktora 2 pozostaje na matrycach takich jak Sepharose i Affigel, zawierających antysurowice przeciw różnym fragmentom bydlęcego czynnika V, który reaguje krzyżowo z ludzkim czynnikiem V.

8. Zarówno aktywność prokoagulacyjna czynnika V jak i aktywność APC-kofaktora 2 zostaje zatrzymana i eluuje wspólnie na nośniku chromatograficznym takim jak Affigel, zawierającym przeciwko monoklonalne o wysokim powinowactwie, uprzednio przygotowane przy użyciu preparatu oczyszczonego w odniesieniu do aktywności APC-kofaktora 2 jako immunogenu. Samo w sobie, to przeciwciało nie hamuje ani aktywności APC-kofaktora 2 ani prokoagulacyjnej aktywności czynnika V. Eluowanie prowadzono przy wartości pH około 10,5 do 11.

9. Publikacja, w której stwierdzono, że autoprzeciwciała przeciw czynnikowi V mogąprowadzić do trombozy (Kapur A. i wsp., A. J. Hematol. 42, 384-388, 1993).

Preparaty wzbogacone w aktywność APC-kofaktora 2 otrzymano takimi samymi metodami jakie były uprzednio stosowane do izolacji czynnika V. Okazało się, że dwuwartościowe jony metali, takie jak jon wapniowy wykazują działanie stabilizujące na aktywność APC-kofaktora 2, tak więc jony wapniowe dodawano podczas procesu oczyszczania.

Zastosowano zasadniczo tę samą procedurę oczyszczania jaka była użyta w pierwszych próbach mających na celu wyjaśnienie istoty nowej aktywności ujawnionej w wyżej wspomnianym opisie patentowym PCT, WO 93/10261. Zgodnie z przedstawionymi w niniejszym opisie wynikami prób, tę nową aktywność zidentyfikowano jako aktywność kofaktora w stosunku do APC wyrażonąjako nowa właściwość czynnika V, bądź, być może, jego kompleks albo fragmenty, jak to opisano powyżej. Tak więc, stanąsię dostępne alternatywne, prostsze metody preparatywne. Po ulepszeniu stosowano nowoczesne metody, takie jak chromatografię żelową, chromatografię powinowactwa z np. przeciwciałem przeciw aktywności APC-kofaktora 2 jako ligandem powinowactwa, chromatografię jonowymienną i podobne. Ponadto, mogą znaleźć zastosowanie metody oparte na technikach rekombinacji DNA.

Zgodnie z powyższym preparat osocza pochodzi z krwi albo z produktów pokrewnych krwi takich jak osocze, który to preparat jest oczyszczony pod względem składnika krzepnięcia krwi wykazującego aktywność antykoagulacyjnąjako kofaktor dla APC, co zwiększa jego aktywność proteolityczną skierowaną przeciw czynnikowi Va i czynnikowi VIIIa, który to składnik krzepnięcia krwi zawiera czynnik V albo ewentualnie trwały kompleks czynnika V i jednostki molekularnej o zdolności ekspresji tej aktywności.

181 638

Normalny poziom czynnika V w osoczu wynosi około 10-20 pg/ml. Analogicznie do innych czynników koagulacji/antykoagulacji krwi, przyjęto umownie aktywność APC-kofaktora 2 w 1 ml normalnego osocza jako 1 jednostkę (U). W oparciu o preparat osocza według wynalazku można również utworzyć przeciwciała i preparaty przeciwciał swoiste wobec regionu czynnika V, który jest związany z aktywnością APC-kofaktora 2, to jest, regionu, w którym istnieje miejsce zawierające epitop powodujący albo aktywność APC-kofaktora 2 albo nieaktywność APC-kofaktora 2. Te preparaty przeciwciał mogąbyć poliklonalne albo monoklonalne. Przeciwciała w tych preparatach wiążą się swoiście zjednym lub z większą ilością miejsc na czynniku V związanych z aktywnością APC-kofaktora 2. Alternatywnie, takie miejsce mogłoby zawierać epitop związany z nieaktywnością APC-kofaktora 2 w czynniku V, to znaczy z APC-opomością. W niniejszym opisie wynalazku wyrażenie „epitop związany z nieaktywnością APC-kofaktora 2” obejmuje epitop związany ze spadkiem lub utratą aktywności APC-kofaktora 2.

Przeciwciała poliklonalne można uzyskać stosując znane techniki, obejmujące immunizację odpowiednich zwierząt, takichjak myszy, króliki, psy, konie, owce, kozy, ptaki, np. kury, kurczaki i podobne, odpowiednim immunogenem i wyodrębnienie powstałych przeciwciał z odpowiedniego płynu pochodzącego od tego zwierzęcia, np. z krwi albo z surowicy w przypadku immunizacji zwierząt albo jaj w przypadku immunizacji ptaków.

Przeciwciała takie mogąbyć przeciwciałami monoklonalnymi, możliwymi do otrzymania znanymi sposobami, np. w sposób w zasadzie zgodny z opisanym przez Kohlefa G. i Milsteiha N. (Naturę 256,495.1975). Sposób wytwarzania przeciwciał monoklonalnych polega na immunizacji ssaka, korzystnie myszy, odpowiednim immunogenem, wytworzeniu komórek hybrydowych przez fuzję limfocytów takichjak komórek śledziony, pochodzących od tego immunizowanego ssaka z komórkami szpiczaka, selekcji komórek fuzyjnych w odpowiedniej pożywce, sknningu komórek wytwarzających przeciwciała (hybrydoma) i wytworzeniu przeciwciał monoklonalnych w płynie puchlinowym jamy otrzewnowej myszy albo ewentualnie, w pożywce hodowli, przez namnożenie w niej tych hybrydoma. Przeciwciała monoklonalne i ich fragmenty wiążące antygen można również otrzymać metodami rekombinacji, co jest znane ze stanu techniki. W metodach tych można użyć odpowiednie komórki gospodarza pochodzące z organizmów eukariotycznych lub prokariotycznych. Takie komórki gospodarza są dobrze znane ze stanu techniki.

Jako immunogen można zastosować oczyszczony preparat czynnika V lub jego fragmenty albo pochodne zawierające determinaty antygenowe odpowiedzialne za ekspresję aktywności APC-kofaktora 2. Takie fragmenty lub pochodne, w celu nadania im antygenowości można koniugować z immunogennym nośnikiem, zwykle z białkiem.

Stosując jako immunogen ludzki czynnik V nie wykazujący aktywności APC-kofaktora 2 (który można otrzymać w sposób opisany poniżej) w połączeniu z dwuetapowym procesem skriningu w celu selekcji komórek hybrydom wytwarzających przeciwciała monoklonalne reaguj ące z tym immunogenem ale me z normalnym, niezmienionym ludzkim czynnikiem V, można ewentualnie uzyskać przeciwciała monoklonalne reagujące swoiście z epitopem dla ludzkiej nieaktywności APC-kofaktora 2, to znaczy, z epitopem związanym ze spadkiem lub utratą aktywności APC-kofaktora 2.

Przeciwciała monoklonalne, przynajmniej częściowo wiążą się z aktywnością APC-kofaktora 2 czynnika V i hamują tę aktywność. Mogą istnieć także ich pochodne i fragmenty tych przeciwciał monoklonalnych, zdolne do wiązania z antygenami.

Przeciwciała monoklonalne mogąbyć wytwarzane przez komórki hybrydom mysio/mysie, gdyż są one łatwe do otrzymania. Jako przykład takich przeciwciał monoklonalnych mogą służyć przeciwciała wytwarzane przez nową hybrydową linię komórkowązdeponowaną w dniu 8 grudnia 1993 r. W PHLS Centre for Applied Microbiology & Research, European Collection od Animal Celi Culture, Salisbury, W Brytania pod tymczasowym numerem akcesyjnym ΧΑΜ-4-5-1 93120846. Przeciwciała monoklonalne wytwarzane przez te hybrydomy otrzymały oznakowanie M4 (Master 4).

O ile nie zaznaczono inaczej, termin „przeciwciało” (albo „preparat przeciwciała”) obejmuje przeciwciała nienaruszone, z ich dwoma łańcuchami ciężkimi i dwoma łańcuchami lekkimi

181 638 oraz różne formy przeciwciał zderywatyzowanych, zawierających domeny zmienne (F_v), np. fragmenty takie jakFab, Fab', F(ab')2; przeciwciałajednołańcuchowe, przeciwciała znakowane, np. znakowane znacznikiem radioaktywnym, fluorescencyjnym albo sprzęgnięte z enzymem, przeciwciała związane z fazą stałą i podobne.

Preparaty przeciwciał, utworzone na podstawie izolowanego czynnika V, mogą zawierać określoną ilość przeciwciał monoklonalnych o wyżej opisanej swoistości, np. 12,3,4,5 lub więcej różnych przeciwciał monoklonalnych albo sąpoliklonalne. Preparaty przeciwciał poliklonalnych i monoklonalnych skierowanych swoiście przeciw epitopom obecnym w miejscu związanym z aktywnością APC-kofaktora 2 mogąbyć użyteczne w próbach immunologicznych, do swoistego oznaczania obecności lub nieobecności aktywności APC-kofaktora 2 w danej próbce (ilościowo i jakościowo).

Czynnikiem .wytwarzającym takie przeciwciała monoklonalne mogąbyć komórki hybrydowe (hybrydomy) i korzystnie, wyżej wspomniane hybrydomy o tymczasowym numerze akcesyjnym XAM-4-5-1 93120846.

Jakkolwiek były znane poliklonalne i monoklonalne przeciwciała swoiste wobec czynnika V, które można stosować do oczyszczania czynnika V, to nie zostały dotychczas ujawnione przeciwciała monoklonalne umyślnie hodowane przeciw regionowi czynnika V związanemu z aktywnością APC-kofaktora 2.

Preparat przeciwciała (monoklonalnego jak również poliklonalnego) można w większości przypadków stosować w procesach oczyszczania opartych na chromatografii powinowactwa. W procesach tych przeciwciała wiąże się ze stałym nośnikiem i stosuje do selektywnego związania czynnika V obecnego np. w preparacie osocza. Następnie eluuje się i zbiera czynnik V, związany ze stałym nośnikiem.

Jakie przeciwciała monoklonalne wiążące się z czynnikiem V i hamujące przynajmniej częściowo aktywność APC-kofaktora 2 w czynniku V można stosować do hamowania aktywności czynnika V. Takie przeciwciała monoklonalne, takjak uprzednio znane przeciwciała przeciw czynnikowi V można również stosować do otrzymywania preparatów osocza nie wykazujących aktywności APC-kafaktora 2.

Czynnik V, jego podjednostki lub fragmenty wykazujące aktywność antykoagulacyjną jako kafaktora dla APC stosować można do wytwarzania leku lub preparatu farmaceutycznego przeznaczonego do zwiększania lub przywracania aktywności antykoagulacyjnej APC in vivo. Preparaty takie są zwłaszcza przeznaczone do leczenia pacjentów cierpiących na choroby naczyń krwionośnych, takie jak zaburzenia zatorowo-zakrzepowe, w tym zakrzepicę i rozsiane zakrzepy wewnątrznaczyniowe (DIC). Taki lek lub preparat farmaceutyczny może zawierać wysoce oczyszczony preparat czynnika V, który można przechowywać w niskich temperaturach, takichjak -70°C.

Preparaty można również stosować w innych stanach lub sytuacjach, w których może być korzystna skorgowana lub zwiększona aktywność antykoagulacyjna krwi, na przykład w różnych sytuacjach klinicznych związanych ze zwiększonym ryzykiem zakrzepów tętniczych i żylnych.

Ponadto, ponieważ aktywność APC-kofaktora 2 ma zasadnicze znaczenie dla działania APC, aktywność tę można stosować jako taką albo w połączeniu z białkiem C/APC i/lub z białkiem S. Przypadki kliniczne, w których może się to okazać ważne dotyczą pacjentów z deficytem aktywności APC-kafaktora 2, zwłaszcza w sytuacjach zwiększonego ryzyka zakrzepu. Dodatkowo podana aktywność APC-kofaktora 2 może być ponadto korzystna w zawale mięśnia sercowego po leczeniu trombolitycznym, w okresie pooperacyjnym, zwłaszcza u pacjentów wysokiego ryzyka, jako adiuwant dla pacjentów', u których leczono zakrzepy, dla pacjentów podlegających mikrochirurgii i w podobnych przypadkach.

Preparat wykazujący aktywność APC-kofaktora 2 można podawać drogą, jaką zazwyczaj stosuje się w terapii przy użyciu czynników koagulacji/antykoagulacji krwi, w więc, drogą iniekcji albo infuzji dożylnych lub dotętniczych. Analogicznie jak się zaleca dla innych czynników krwi nie można wykluczyć podawania doustnego. Ilość podana pacjentowi powinna być skuteczna w tym sensie, że przynajmniej na pewien czas w pełni lub częściowo przywróci działanie własnego aktywnego białka C pacjenta bądź podawanych łącznie białka C/aktywnego białka C w

181 638 tym znaczeniu, że nawet słabsze działanie może być korzystne dla pacjenta z ryzykiem zakrzepu. Można założyć, że użyteczne będą dawki w zakresie od 1do 100 a możliwie od 40 do 70 mg/dzień Korzystne jest podawanie wielokrotne, ponieważ czynnik V wykazujący aktywność APC-kofaktora 2 podlega metabolizmowi w organizmie ssaków.

Preparat można przygotowywać w postaci różnych znanych typów kompozycji farmaceutycznych, takich samych jakie stosuje się dla innych czynników koagulacj/antykoagulacji krwi, należy jednak zachować określone wymagania stabilności, niezbędna dla czynnika V wykazującego aktywność APC-kofaktora 2. Przykładowo mogą być stosowane liofilizaty lub proszki suszone metodą rozpyłową, ewentualnie rozcieńczane w odpowiednich nośnikach oraz sterylne lub wytwarzane w warunkach aseptycznych roztwory wodne.

Białko C/aktywne białko C i/lub białko S stosować można do wytwarzania kompozycji farmaceutycznych do leczenia zaburzeń związanych z niedoborem aktywności APC-kofaktora 2. W tym celu mogą być stosowane te same typy kompozycji jakie są zalecane dla znanego użycia leczniczego białka C i białka S.

Preparat czynnika V pozbawiony aktywności APC-kofaktora 2, korzystnie pochodzi od ludzi. Jego potencjalne zastosowanie lecznicze obejmuje przypadki, w których zwiększenie aktywności czynnika V_a ponad aktywność APC-kofaktora 2 jest korzystne dla pacjenta.

Wyżej opisane sposoby leczenia i preparaty sąwskazane dla ssaków, zwłaszcza dla ludzi.

A. Próby oparte na oznaczaniufunkcji APC, białka C, aktywności APC-kofaktora 2 i białka S.

W tych próbach stosuje się protokoły podobne do opisanych w piśmiennictwie (Bertina i wsp., Res. Clin. Lab. 20, 127-138, 1990; Wolf i wsp., Thromb. Haemost. 62, 1144-1145, 1989, publikacje zgłoszeń patentowych PCT WO-A-9102812; WO-A-9101382; WO 93/10261, którego wyznaczenie na Stany Zjednoczone włączono do opisu jako załącznik; Bahlaback i wsp., Thromb. Haemost. 65, streszczenie 39, 658, 1991). Tak więc, dany składnik w układzie APC, białka S i czynnika V, przy czym ten ostatni pod względem właściwości jako APC-kofaktora 2, oznacza się na podstawie konwersji odpowiedniego substratu dla APC przez APC. Normalnymi substratami dla APC sączynniki Va i/lub VHIa. Jeden z nich lub obydwa korzystnie dodaje się do oznaczonego roztworu w postaci preparatów wzbogaconych lub wysoce oczyszczonych, w tym preparatów otrzymanych techniką rekombinacji DNA, białek nieaktywnych (czynnik V, czynnik VIII) albo aktywnych. W obrębie serii próbek, które należy porównać, w oznaczanych roztworach znajdują się zasadniczo takie same poziomy:

a) co najmniej jednego spośród: czynnika V wykazującego aktywność APC-kofaktora 2 albo inhibitora, który blokuje aktywność pochodzącąz tej samej próbki i białka S albo inhibitora, który blokuje aktywność białka S pochodzącego z tej próbki, jeśli ma być oznaczany APC albo białko C;

b) co najmniej jednego spośród białka S albo inhibitora blokującego pochodzącąz próbki aktywność białka S i APC, jeśli ma być oznaczona aktywność APC-kofaktora 2, oraz

c) co najmniej jednego z pośród czynnika V wykazującego aktywność APC-kofaktora 2 albo inhibitora, który blokuje tę właśnie pochodną z próbki aktywność i APC, jeśli ma być oznaczane białko S.

Tak więc, końcowe roztwory badane dla serii próbek, które będą porównywane zawierają próbkę i substrat dla APC i ewentualnie, również w korzystnych wariantach, jedną lub dwie, korzystnie dwie substancje nie pochodzące z próbki i wybrane spośród APC, białka S albo inhibitora dla białka S oraz czynnika V wykazującego aktywność APC-kofaktora 2 albo inhibitora tej aktywności, z zastrzeżeniem, że jedną z tych substancji jest substancja, która ma być oznaczana (np. APC, białko C, białko S albo aktywność APC-kofaktora 2).

W niniejszym sposobie prowadzi się:

a) w jednym luy w więkswej Hożej etapów ankub ację w wo dnym roztworzt do oznaczzń, próbki i substratu dla APC, który to substratjest nieodłącznie obecny w próbce lub jest dodany do oznaczanego roztworu i ewentualnie dalszych składników koagulacji krwi nieodłącznie obecnych w tej próbce albo dodanych do oznaczanego roztworu,

181 638

b) pomiar konwersji substratu pod działaniem APC podczas inkubacji według punktu a), oraz

c) korelację zmierzonej wartości z oznaczaną aktywnością. Korelację tę wykonuje się w znany sposób. W sposobie tym do oznaczanego roztworu z punktu a) dodaje się ewentualnie jedną albo dwie, korzystnie dwie substancje wybrane spośród APC, białka S lub inhibitora białka S i czynnika V wykazującego aktywność antykoagulacyjną albo inhibitora tej aktywności, z zastrzeżeniem, że jedna z pozostających w tym roztworze substancji; APC białko S albo aktywność APC- kofaktora 2 j est obecna w próbce i j est składnikiem, którego aktywność funkcyjna ma być oznaczana. Dla czynnika V, aktywnościątąjest aktywność antykoagulacyjna jako kofaktora dla APC.

Przykładami innych składników, które mogą być obecne są enzymy koagulacyjne i inne czynniki krwi umożliwiające pomiar rozkładu czynników V_a i/lub VIiI_a. Te inne czynniki mogą być dodane osobno albo mogąbyć już wcześniej obecne w próbce. W przypadku, gdy próbka zawiera białko C a oznaczaną substancjąjest APC, wówczas należy dodać aktywator dla białka C. W przypadku, gdy próbka zawiera różne poziomy czynników koagulacyjnych (innych niż te, które mają być oznaczane), przeszkadzających w reakcjach analizy, wówczas należy zapewnić ich nadmiar (to znaczy zasadniczo stałe poziomy w oznaczanych roztworach) w celu uniknięcia różnic w wynikach oznaczeń między poszczególnymi próbkami. W próbkach osocza można zapewnić wspomniane stałe poziomy dodając w nadmiarze normalne osocze nie zawierające oznaczanej substancji. Dodawane składniki mogą również występować w formach wzbogaconych albo wysoce oczyszczonych. Można wykazać, ze dodanie czynnika Vni/VHI_a i/lub form czynnika V nie wykazujących aktywności APC-kofaktora jest korzystne. Przykładami form nie wykazujących aktywności APC-kofaktora są ludzki czynnik V bez tej aktywności, czynnik V pochodzący z gatunków normalnie pozbawionych tej aktywności (np. bydlęcy czynnik V a także fragmenty czynnika V wykazujące aktywność czynnika V ale pozbawione aktywności APC-kofaktora 2).

Białko S dodaje się do badanego roztworu w celu wyeliminowania różnic w mierzonym poziomie spowodowanych różnicami w poziomie białka S w poszczególnych próbkach, wówczas, gdy oznacza się aktywność APC-kofektora 2 albo białko C. Jeśli oznacza się białko S, to w tym samym celu można dodać aktywność APC-kofaktora 2. Główną ideą takiego postępowania jest utrzymanie w badanych roztworach należących do różnych serii w zasadzie stałego poziomu funkcyjnej aktywności czynników innych niż ten, który jest oznaczany. Jak podano powyżej, można tego dokonać wprowadzając do badanego roztworu te czynniki w nadmiarze, np. dodając normalne osocze w nadmiarze i/lub wprowadzając nadmiar funkcyjny inhinitorów dla tych czynników, np. przeciwciał wiążących się z epitopem odpowiedzialnym za aktywność tych czynników. Dahlback z powodzeniem wprowadził przeciwciało monoklonalne swoiste wobec epitopów odpowiedzialnych za aktywność APC-kofaktora białka S do roztworu, w którym oznaczał aktywność APC-kofaktora 2 (HPS 54, Dahlback i wsp., J. Biol. Chem. 265, 8127-8235,1990). Podobnie, funkcyjne inhibitory aktywności APC-kofaktora 2, takiejak przytoczone powyżej przeciwciała monoklonalne mogą być potencjalnie dodawane do badanych roztworów podczas oznaczania białka S.

Według wynalazku, oznaczenia aktywności funkcyjnej prowadzi się dogodnie wobec dodanego czynnika Vffl/VIII_a.

Zasady dotyczą kolejności mieszania, dodawanych składników, i różnych metod wykonywania pomiarów sąogólnie znane specjalistom. (Patrz powyższe cytowania). Dotyczy to również oznaczania aktywności APC, którą można śledzić za pomocą substratów, takich jak fibrynogen (próby koagulacji) i substratów chromogennych dla enzymów koagulacyjnych, na aktywność, których wpływa aktywność APC. Odpowiednimi substratami chromogennymi, fluorogennymi i lumonogennymi są zatem substraty trombiny i czynnika X_a.

Próbkę na ogół stanowi osocze od osobnika/pacjenta albo próbką może być czynnik V wykazujący aktywność APC-kafaktora 2, białko C (APC) albo białko S. Wszystkie te substancje pochodzą z procesu produkcyjnego albo ze standardów przeznaczonych do użycia w tej próbie.

Zamiast czynnika V oczyszczonego z osocza, może użyć natywny czynnik V (w skrócie FV) wytwarzany technologiąrekombinacji DNA (rFV) jako abdukt w metodach diagnostycznych dla

181 638 białka C/APC albo białka S, jako standard albo odczynnik kontrolny w próbach oznaczania aktywności koagulacyjnej czynnika V lub jako środek leczniczy do podawania pacjentom, u których wystąpił częściowy lub całkowity niedobór aktywności APC-kofaktora 2. Alternatywnie, do tych samych celów oraz w adduktach stosowanych w metodach oznaczania aktywności antykoagulacyjnej czynnika V można użyć rekombinatowe warianty lub fragmenty czynnika V ze zmodyfikowanymi ekspresjami aktywności pro- i antykoagulacyjnej. Takie modyfikacje można otrzymać w wyniku mutacji miejsc trombiny lub miejsc rozszczepienia APC w czynniku V. Aktywność prokoagulacyjna czynnika V w poprzednim przypadku i aktywność antykoagulacyjna czynnika V w ostatnim przypadku jest częściowo lub całkowicie stracona. Poza tym, taki produkt rekombinacji lub jego odpowiednie immunogenne peptydowe fragmenty można stosować do wytwarzania przeciwciał monoklonowych do celów diagnostyczncyh lub leczniczych.

W próbach oznaczania aktywności APC-kofaktora 2 z zastosowaniem czynników Va i/lub VIIIa jako substratów dla APC i czynników obecnych w próbce do pomiaru konwersji substratu dla APC, czułość wykrywania aktywności APC znacznie się zwiększa w osoczu pacjentów pozostających na leczeniu antagonistami witaminy K, w wyniku czego zwiększa się wydłużenie czasu aglutynacji w niektórych próbach aglutynacji, zwłaszcza APTT. Tę zwiększoną czułość wykrywania aktywności APC można wytłumaczyć obniżonymi poziomami.białek zależnych od witaminy K, takich jak czynniki IX, X i II. Ponieważ aktywność APC-kofaktora 2 nie jest zależna od witaminy K, może się okazać możliwy pomiar tej aktywności w osoczach od takich pacjentów przez dodanie do oznaczanego roztworu niektórych białek zależnych od witaminy K, takich jak co najmniej jeden z czynników IX, IXa X i II, ewentualnie łącznie z białkiem S. Białka te można dodawać w postaci eluatu soli z metalem ciężkim, takim jak eluat z cytrynianem baru (Dahlback, Biochem J. 209. 837-46, 1983) albo eluat z wodorotlenkiem glinowym (Bertina i wsp., Thrombos Hemostas 511-5,1984) albo w postaci czystych składników przed pomiarem konwersji substratu dla APC. Jeśli osocze zawiera heparynę (zwykłą albo o niskim ciężarze cząsteczkowym) korzystne jest zneutralizowanie tego działania przez dodanie nadmiaru heparyny bądź przez dodanie polibrenu albo Protaminy lub podobnego odczynnika, jako inhibitorów heparyny w celu zmniejszenia wpływu na wyniki pomiarów.

Jak zaznaczono powyżej, metody oznaczania aktywności funkcyjnych PC/APC albo białka S bądź aktywności antykoagulacyjnej czynnika V sąpodobne do metod opisanych wcześniej, np. w cytowanych publikacjach, których ujawnienia są włączone do niniejszego opisu jako odnośniki. Tak więc, nie powinien być potrzebny szczegółowy opis tych metod. W zasadzie metody te opierają się na pomiarze konwersji substratu. Szybkość tej konwersji można oznaczać bezpośrednio lub pośrednio i odnosić ją do oznaczanej substancji. Przykładowo, mogą się one opierać na testach koagulacji lub na metodach chromogennych, korzystnie w obecności dalszych składników potrzebnych do oznaczenia szybkości konwersji, obecnych nieodłącznie w próbce albo do tej próbki dodanych.

Składniki te mogąbyć obecne w odczynniku służącym do wprowadzenia aktywnego czynnika koagulacji, potrzebnego do oznaczenia szybkości konwersji substratu. Taki odczynnik zapewnia obecność przynajmniej czynnika IXa i może zawierać czynnik koagulacji lub odczynnik aktywujacy ten układ poprzez szlak wewnątrzustrojowy lub zewnątrzustrojowy. Zgodnie z tym, odczynnikiem może być czynnik IXa albo czynnik XI_a(szlak wewnątrzustrojowy), czynnik XIIa, (szlak wewnątrzustrojowy), kalikreina (szlak wewnątrzustrojowy), aktywator kontaktu (szlak wewnątrzustrojowy) taki jak koalin, celit albo kwas elagikowy (szlak wewnątrzustrojowy), odczynnik APTT (Activated Partial Thromboplastine Time; to jest, odczynnik zawierający fosfolipid i aktywator kontaktu (szlak wewnątrzustrojowy), tromboplastyna tkankowa (odczynnik PT, PT = Prothrombin time (szlak zewnątrzustrojowy)), czynnik tkankowy, czynnik VIIa i czynnik Xa.

Dodatek innych składników zależy od zastosowanego modelu i może wymagać dołączenia inhibitorów proteazy osoczowej dla enzymów innych niż oznaczane albo inhibitora polimeryzacji fibryny. Ca²⁺ może występować w postaci rozpuszczalnej w osoczu soli jako źródła jonów Ca²⁺ w postaci wolnej, nieskompleksowanej, to znaczy silnychjonów wapniowych w wolnej nie14

181 638 skompleksowanej formie. Dogodnie, takie dodatkowe składniki zawierają również czynnik VHI/VIII_a i czynnik V/Va.

Substrat, dla którego' oznacza się szybkość konwersji może być syntetycznym substratem dla enzymu, na którego aktywność ma wpływ forma białka C, to jest: trombina (= czynnik Ii.) i czynnik X,,. Odpowiednie substraty syntetyczne są rozpuszczalne w wodzie i korzystnie posiadają strukturę oligopeptydu a trzema, czterema lub pięcioma resztami aminokwasowymi i końcową grupą aminową chronioną przed atakiem przez aminopeptydazy. Ochronę taką zapewnia się albo przez wprowadzenie grupy blokującej albo wprowadzając D-aminokwas na końcu aminowym. W celu uzyskania wykrywalnej odpowiedzi, końcową grupę karboksylową syntetycznego substratu poddaje się amidowaniu grupą, która będzie swoiście uwalniana i wykrywana w wyniku działania odpowiedniej proteazy układu krzepnięcia krwi. Grupę, która ma być uwalniana wybiera się spośród grup chromogennych, fluorogennych lub cheminolugenogennych i spośród innych grup wykrywalnych analitycznie. Zagadnienia te sąopisane np. przez H.C. Hemkera („Handbook of synthetic substrates in hemostatic testing” w wydawnictwie: CRC Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences, tom 19, wyd. 2,71-134,1983). W przypadku próbek innych niż próbki osocza można jako substrat stosować egzogenny fibrynogen.

W celu uzyskania dokładnych wyników w odniesieniu do oznaczanej substancji, w niektórych przypadkach uzasadnione jest próbowanie utrzymania możliwie najwyższej zawartości próbki osocza. Zawartość próbki osocza w testach dających dobrą swoistość powinna wynosić powyżej 10%, zwłaszcza powyżej 20% albo powyżej 35% (objętościowo). Jednak w innych przypadkach można stosować zasadniczo niższe zawartości, to jest, poniżej 10% (objętościowo).

B. Metody immunologiczne oznaczania aktywności APC-kofaktora 2.

Preparat przeciwciała umożliwia wykonywanie oznaczeń immunologicznych aktywności APC-kofaktora 2. Oznaczenie takie polega na tym, że przeciwciało przeciw APC-kofaktorowi 2 tworzy kompleks immunologiczny z czynnikiem V wykazującym aktywność APC-kofaktora 2 w próbce, w ilości, która jest miarąjakościowąlub ilościowąpoziomu aktywności APC-kofaktora 2 w tej próbce. Próbki mogą być takie same jak przy próbach opartych na oznaczaniu funkcji. Odczynniki do stosowania w próbach B i C.

Jako odczynniki, standardy lub wzorce w wyżej opisanych próbach można stosować oczyszczone preparaty zawierające czynnik V wykazujący aktywność APC-kofaktora 2, które to preparaty zostały oczyszczone od osocza lub wytworzone techniką rekombinacji DNA, preparaty białka C, ewentualnie w formie aktywnej lub w połączeniu z aktywatorem białka C i preparaty białka S, zawierające określone ilości zawartego w nich odpowiedniego czynnika. Preparat białka C można łączyć z co najmniej jednym czynnikiem krzepnięcia zależnym od witaminy K, wybranym spośród czynników IX, X i II, ewentualnie w połączeniu z białkiem S. Produkty i preparaty do stosowania leczniczego mogą być również otrzymane techniką rekombinacji dNa. Ponadto, przeciwciała monoklonalne również można otrzymać techniką rekombinacji DNA i w zasadzie, z zastosowaniem reakcji PCR (enzymatycznej amplifikacji DNA), która jest techniką dobrze znanąi może być stosowana do otrzymywania takich przeciwciał o żądanej swoistości.

Istnieją wskazania, że można uzyskać informację o różnych mutacjach czynnika V w oparciu o interakcję między aktywność ćąantykoagulacyjną czynnika V i białkiem S. Można zaprojektować metody uzyskania takiej informacji w obecności lub nieobecności odpowiedniego przeciwciała. Takie metody w obecności przeciwciała mogą być użyte jako ilościowe metody analizowania substancji takiej jak aktywność antykoagulacyjna czynnika V i białko S.

Wykazano, że przyczyną APC-oporności j est mutacja w genie dla czynnika V. Jest to ostateczny dowód na to że próby hybrydyzacji kwasów nukleinowych a także sekwencjonowanie kwasów nukleinowych mogą być stosowane w sposób konwencjonalny do celów wykrywania osobników z ryzykiem występowania zakrzepów w wyniku niskiego poziomu aktywności APC-kofaktora 2. Te typu prób mogą być stosowane do sprawdzania nieprawidłowej obecności lub braku jednego lub większej ilości fragmentów i/lub sekwencji kwasów nukleinowych, które są unikalne dla występowania lub niewystępowania ekspresji cząsteczki czynnika V wykazującego aktywność APC-kofaktora 2 bądź pozbawionego tej aktywności. Protokóły i warunki

181 638 sątakie same, jakie normalnie stosuje się dla innych genów, z tym, że używa się odczynniki swoiste dla genu czynnika V i ewentualnie mutanty związane z APC-opornościąalbo swoiste dla genu normalnego czynnika V. Do tego celu może być odpowiednia próbka dowolnych komórek pochodzących z organizmu danego osobnika.

Jak wykazały liczne próby, czynnik V, zwłaszcza ludzki czynnik V, jest zdolny do aktywacji i wykazywania proWoagulacyjnej aktywności czynnika V_a ale jest pozbawiony zdolności wywierania działania antykoagulacyjnego, korzystnie aktywności antykoagulacyjnej jako kofaktor wobec APC.

Stwierdzono także, że czynnik V, zwłaszcza ludzki czynnik V zdolny jest do wykazywania aktywności antykoagulacyjnej, zwłaszcza jako kofaktor dla AC, ale pozbawiony jest zdolności ekspresji aktywności prokoagulacyjnej czynnika Va.

Takie czynniki mogą być oczyszczone z osocza metodami podobnymi do stosowanych przy oczyszczaniu czynnika V albo przygotowane technikami rekombinacji DNA. Możliwe zastosowania obejmują standardy (wzorce), odczynniki wspomagające i zastosowania lecznicze.

Wynalazek ten jest w dalszej części opisu ujawniony w sekcji doświadczalnej z powołaniem się na rysunki. Na rysunkach tych:

figura 1 przedstawia chromatografię na żywicach: Q-Sepharose (A) i Sephacryl S-300 (B) czynnika V i aktywności APC-kofaktora 2;

figura 2 przedstawia wyniki charakteryzacji wyizolowanej aktywności APC-kofaktora 2/czynnika V metodą elektroforezy w żelupoliakryloamidowym SDS-PAGE, w próbie hybrydyzacji Westerna i metodą elektroforezy w żelu agarozowym;

figura 3 przedstawia wspólne oczyszczanie aktywności APC-kofaktora 2 i czynnika V techniką chromatografii powinowactwa z udziałem przeciwciała monoklonalnego i figury 4A i B- przedstawa ^korekcję APC-oporności za pomocą oczyszczonej aktywności APC-kofaktora 2/ czynnika V.

MATERIAŁY i METODY

Próba na aktywność APC-kofaktora 2

Do pomiaru aktywności APC-kofaktora 2 podczas jego oczyszczania opracowano modyfikacjęopicanej ostatnio metody APC-APTT (opis patentowy PCT/SE/9200781 i Dahlback i wsp., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 90,1004-1008,1993). W metodzie tej stosuje się osocze od osobnika z dziedziczną słabą odpowiedzią na APC i frakcje uzyskane z normalnego osocza, testowego na zdolność do normalizowania słabej odpowiedzi na APC. Te próbę, nazywaną próbą na aktywność APC-kofaktora 2 wykonywano następująco: inkubowano w czasie 5 minut w temperaturze 37°C, 50 μΐ osocza wykazującego słabą odpowiedź na APC (osocza APC-oporne) z 50 μΐ badanej frakcji i 50 al aktywnego odczynnika na czas tromboplastyny (APTT) dostarczonego z firmy APTT-automated Organon Technika (Stany Zjednoczone) a- następnie inicjowano koagulację przez dodanie 5 al mieszaniny APC-CaCR Jeśli nie wskazano inaczej, był to roztwór o składzie: 20 nM ludzkiego APC w 10 mM Tris-HCl, 0,05 M NaCl, 30 mM CaCl₂, pH = 7,5, zawierający 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i mierzono czas koagulacji. Obecność aktywności APC-kofaktora 2 w badanej próbce jest związana ze wzrostem czasu koagulacji.

Każdąpróbkę analizowano również równolegle bez dodatku APC do roztworu CaCl₂ i wyliczano zależne od APC wydłużenie czasu koagulacji. Dla sporządzenia krzywej dawka - odpowiedź dla aktywności APC-kofaktora 2, mieszano osocze z -brakiem aktywności APC-kofaktora 2 z osoczem kontrolnym i stosowano jako osocze testowe w metodzie APC-APTT. Odpowiedź antykoagulacyjną APC odnoszono do procentowej zawartości osocza kontrolnego. Krzywa miała charakter krzywej wykładniczej. Ponieważ nie było wiadomo, czy osocze z niedoborem aktywności APC-kofaktora 2 jest całkowicie pozbawione czynnika V wykazującego aktywność APC-kofaktora 2, próba ta umożliwiała jedynie pół-ilościowe oznaczenie tego kofaktora w różnych frakcjach. Próba ta jednak umożliwiała śledzenie aktywności APC-kofaktora 2 podczas jego oczyszczania.

Próbę oznaczania czynnika V metodą koagulacji prowadzono stosując osocze z niedoborem czynnika V, jak to opisano poprzednio (j. Clin. Invest. 66, 583-591, 1980). Obecność akty16

181 638 wacji czynnika V uwidoczniała się skróceniem czasu koagulacji osocza ubogiego w czynnik V. W obydwu próbach oznaczania aktywności APC-kofaktora 2 i oznaczania czynnika V w próbie koagulacji przedstawione są oryginalne dane dotyczące koagulacji a nie wyniki wyrażone w jednostkach.

Metody elektroforetyczne, immunologiczne i inne:

Elektroforezę żelową w warstwie żelu poliakryloamidowego,, w gradiencie od 5 do 15% wobec dodecylosiarczanu sodowego (SDS-PAGE) i próbę hybrydyzacji Westema prowadzono stosując opisane poprzednio techniki (J. Biol. Chem. 261,9495-9501,1986). Swoista poliklonalna antysurowica królika przeciw czynikowi V była darem Dakopatts A/S. Dane demonstrujące swoistość tej antysurowicy cytowano poprzednio (Blood 68,244-249,1986). Przeciwciała poliklonalne królika hodowano przeciw wyizolowanym fragmentom ciężkich i lekkich łańcuchów bydlęcego czynnika V (J. Biol. Chem. 261,9495-9501,1986). Przeciwciała monoklonalne hodowano stosując metody standardowe, szczegółowo opisane poprzednio (J. Biol. Chem. 265. 8127-8135, 1990). Oczyszczone białko z puli S-300 stosowano jako antygen do immunizacji myszy Balb/c. Otrzymano siedemnaście różnych przeciwciał. Reaktywność tych przeciwciał oznaczano w próbach hybrydyzacji Westerna. Ilość około 20 mg przeciwciała oznaczonego jako Master 30 sprzęgano z 4 ml żelu Affigel 10 (Biorad), postępując według instrukcji producenta. Z żelem Affigel sprzęgano również frakcje IgG antysurowicy poliklonalnej przeciw fragmentom ludzkiego czynnika V i bydlęcego czynnika V (około 5 mg/ml).

Przykład 1. Oczyszczanie aktywnego APC-kofaktora 2

Wszystkie prace z próbkami prowadzono w łaźni z lodem. Procesy chromatografii i wirowania prowadzono w zimnym pomieszczeniu, korzystnie w temperaturze 4°C. Kolekcja krwi: ludzkie, świeżo zozmrożone (w temperaturze -70°C) osocze z dodatkiem cytrynianu otrzymano z miejscowego banku krwi. To zamrożone osocze (2,3 litra) rozmrożono w temperaturze 37°C i dodano następujące inhibitory proteazy: fluorek fenylometanosulfonylu (PMSF) w stężeniu 1 mM, diizopropylofluorofosforan (DFP); 1 mM), inhibitor trypsyny z soji (50 mg/litr), trasylo (aprotynina w ilości 1,5 mg/litr, co jest równoważne 10 jednostkom/ml) i benzydaminę (10 mM). Osocze (utrzymywane w łaźni z lodem) poddano adsorpcji z cytrynianem baru w sposób opisany poprzednio (Dahlback, Biochem. J. 209,837-845,1983) i zaabsorbowane na soli barowej osocze poddano frakcjonowanej precypitacji glikolem polietylenowym (PEG 6000; 8% wagowo-objętościowo) przez dodanie stałego PEG. Aktywność APC-kofaktora 2 odzyskiwano w supematancie 8 procentowego PEG. Ten supernatant 8 procentowego PEG rozcieńczano równą objętością 10 mM roztworu benzydarniny i następnie mieszano z żywicą Q-Sepharose (Pharmacia LKB Biotechnology, Upsala, Szwecja) zrównoważonąw roztworze o składzie: 20 mM Tris HCl, 0,1M NaCl, 1 mM CaCl^ (pH = 7,5), zawierającym 10 mM benzamidyny. Po godzinie łagodnego mieszania zbierano żel w lejku Buchnera i przemywano: A, buforem do równoważenia w ilości 3 litrów, B, buforem do równoważenia w ilości 1 litra z dodatkiem 0,1% Tween'u 20 i C buforem do równoważenia w ilości 2 litrów, zawierającym 0,15 M NaCl zamiast 0,1 M NaCl. Następnie żel umieszczono w kolumnie (o średnicy 5 cm) i eluowano zaabsorbowane białka liniowym gradientem NaCl (0,15 - 0,5 M NaCl w roztworze zawierającym 20 mM Tris HCl, 1 mM CaC^, 10 mM benzamidyny (pH = 7,5). Każdy gradient zużywano w ilości 1,5 litra. Szybkość przepływu wynosiła 330 ml/godzinę. Zbierano frakcje po 11 ml. ' Frakcje analizowano na aktywność APC-kofaktora 2 i aktywność czynnika V w rozcieńczeniach 1/10 (fig. 1).

Frakcje łączono, jak wskazano poziomym słupkiem i poddawano strącaniu za pomocą (NH₄)₂SO₄ o 70% nasyceniu. Strąt zbierano przez wirowanie, rozpuszczano w minimalnej objętości roztworu o składzie: 20 mM Tris HCl, 0,15 M NaCl, 1 mM CaCl2 (pH = 7,5), zawierającym 10 mM benzamidyny, 1 mM DFP i 1 mM PMSF i podawano na kolumnę (2,5 cm x 93 cm) wypełnioną żywicą Sephacryl S-300 (Pharmacia) zrównoważoną tym samym buforem ale bez DFP i PMSF. Kolumnę przemywano z szybkością 10 ml/godzinę i zbierano frakcje po 1,2 ml. Frakcje te analizowano w próbie na aktywność APC-kofaktora 2 i w próbie na aktywność czynnika V w rozcieńczeniach 1/10 (fig. 1). Frakcje łączono jak wskazano poziomymi paskami i przechowywano w temperaturze -70°C.

181 638

Przy^adż. Chromatografia powinowactwa z użyciem przeciwciał monoOlonalnych

Białko otrzymane w przykładzie 1 w procesie chromatografii na kolumnie S-300 (w przykładowym przebiegu 6 mg w roztworze o składzie: 20 mM Tris HCl, 0,1 M NaCl, 2 mM CaCl2 (pH = 7,5) podawano na kolumnę o wymiarach 0,75 cm x 7,5 cm wypełnioną żywicą Affigel z zmobilizowanym przeciwciałem monoklonalnym o nazwie Master 30, otrzymanym w przykładzie 3. Następnie kolumnę wraz z wprowadzonym na niąbiałOiem równoważono w roztworze o składzie: 20 mM Tris HCl, 0,1 MNaCl, 2 mM CaCl2 (pH = 7,5). Kolumnę przemywano do czasu osiągnięcia absorbancji eluatu równej zero i następnie eluowano związane białka roztworem zawierającym 50 mM dietyloaminy i 2 mM CaCl2 (pH = 10,6). Eluat natychmiast zobojętniano za pomocą 3M Tris HCl (pH = 7,5) w ilości 50 pl na 1 ml frakcji. Frakcje analizowano w razelańeerniu 1:5 wykonując próbę na aktywność APC-kpfaOtora 2 i próbę koagulacji na czynnik V. Aktywne frakcje łączono, zatężkna przez ultraflltraeJę (membrany YM10) i przechowywano w temperaturze -70°C. Oczyszczony APC-kofantor 2/eoynnik V aktywowano trombiną w sposób opisany uprzednio (J. Clin. Jnvnst. 66, 583-591, 1980).

Przykład 3. Wytwarzanieprzeciwciał mpnp0lonalnyeh

Oczyszczone białka z przykładu 1, to znaczy czynnik V (APC-OofaOtor 2) stosowano jako immunogen do immunizacji myszy Balb/c postępując według standardowej procedury. Następnie, komórki śledziony od tych myszy poddawano fuzji z komórkami Sp 2/0 Ag 14 mysiej linii OomóreO szpiczakk i selekcjonowano w pożywce hipoOsantyna - aminopteryna - tymidyna (DMEM) w sposób opisany proae Kuhlefa i Milstein'a (cytowanych powyżej).

Do wykrywania przeciwciał wytworzonych przeciw czynnikowi V w anś'zsurpwiey uzyskanej od tych myszy oraz do wykrywania komórek hybrydowych wytwarzających przeciwciała zastosowano próbę ELISA (anzymatzczną próbę immunoabsorpeji w fazie stałej). W tych próbach, ceznniOlrm V (10 pg/ml) w standardowym buforze do powlekania, powlekano dołki w płytkach do miOromianowania. Antysurowiee pochodzące od immunizowanych myszy i supernatanty hodowli OomóreO hybrydowych dodawano do dołków w rpzciańeeeniu i zawartość poszczególnych dołków analieawanp na obecność przeciwciał związanych z czynnikiem V przy użyciu znakowanego enzymem drugiego przeciwciała w znany sposób.

Komórki hybrydowe z dołków dających reakcję dodatnią, to znaczy, komórki wytwarzające przeciwciała, klonowano metodą ograniczonych rozeieńeeeń, subOlonowano i namnażano. Po implanśaeji do jamy otrzewnowej myszy traktowanych uprzednio pristanem wytwarzano przeciwciała mono^o^lne w płynie puchlinowym w dużych ilościach.

Otrzymano siedemnaście przeciwciał (master). Wszystkie te przeciwciała reagowały z determinantami antygenowymi na czynniku V, co wykazały analizy techniką Westerna, przy czym większość tych przeciwciał manoklonalnych (skrót Mab) była skierowana przeciw temu samemu regionowi czynnika V, a mianowicie, fragmentowi aktywacji zawartemu w centralnym regionie o wielkości 150 ODa w czynniku V.

Jedno z tych przeciwciał, oznaczone nazwą Master 30, użyto do oczyszczania czynnika V metodą powinowactwa według przykładu 2.

Przykład 4. W niniejszym przykładzie analizowano przeciwciała mona0lonalna wytworzone w przykładzie 3 w celu określenia ich wpływu na aktywność koagulac^ąi aktywność APC-kafkktora 2 w osoczu.

Do normalnego osocza dodawano wzrastające ilości oczyszczonego Mab aż do stężenia 400 pg/ml i po 15 - 30 minutowej inkubacji wykonywano pomiar aktywności czynnika V w znanej próbie oznaczania czynnika V opartej na pomiarze koagulacji i określano odpowiedź na egzogenny APC postępując w niżej podany sposób.

Próbki normalnego osocza zawierające różne stężenia Mab (10 - 400 pg/ml) inkubowano z handlowym odczynnikiem APTT. W badaniach użyto odczynnik „Automated APTT” z firmy Organon. Podobne wyniki uzyskano stosując odczynnik APTT z firmy COATEST APC Resistance, Chromagenix AB, Molndal, Szwecja). Po inkubacji w czasie 5 minut w temperaturze 37°C dodawano albo 30 mM CaCl2 w roztworze o składzie: 20 mM Tris HCl, 50 mMNaCl (pH = 7,5) z dodatkiem 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) albo aktywne białko C (APC) w ilości

181 638 około 2 pg/ml w 30 wM CaCl₂ w roztworze o składzie: 20 wM Tris HCl, 50 mM NaCl (pH = 7,5) z dodatkiem 0,1 % BSA i oznaczano czasy koagulacji. Próbę APTT prowadzono w sposób zasadniczo zgodny z opisanym przez Dahlbacka i wsp. w PNAS 90, 1004-1008, 1993.

Obecność przeciwciał monzklonaluych nie wpływała wcale lub tylko w niewielkim stopniu na zwykły czas krzepnięcia (APT), to znaczy, na czas aglutynacji uzyskany dla próbek zawierających dodany CaCl₂. Czas aglutynacji w tych próbkach wynosił 40-45 sekund. Jednak dwa z badanych przeciwciał monokloualuych, oznaczone jako Master 1 i Master 4 skracały czas aglutynacji w próbkach, do których dodano APC w roztworze CaCl2 (czas APC).

Uzyskano następujące czasy aglutynacji:

czas APC przy nieobecności Mab 110-120 sekund czas APC wobec Master 4 80-90 sekund.

Uzyskane wyniki wskazując częściowe hamowanie aktywności APC-kofaktora 2 w osoczu w obecności przeciwciała Master 4. To częściowe hamowanie aktywności wykazywane przez Master 4 było zależne od dodanej ilości. Maksymalne hamowanie występowało w próbkach o zawartości 50-100 pg Master 4 na ml osocza. Przeciwciało Master 4 zdeponowano jak to zaznaczono powyżej.

Wyniki powyższych prób sąopisane poniżej w odniesieniu do załączonych figur 1-4 (A, B).

Figura 1 ilustruje chromatografię na żywicy Q-Sepharose (A) i Sephacryl S-300 (B) czynnika V i aktywności APC-kofaktora 2. Na obydwu kolumnach krzywa chowania aktywności APC-kofaktora 2 (sekcje górne) jest zgodna z krzywądla czynnika V (sekcje środkowe). Aktywność czynnika V jest wyrażona jako skrócenie czasu aglutynacji osocza z niedoborem czynnika V, podczas gdy aktywność APC-kofaktora 2 związano z zależnym od APC przedłużeniem czasu aglutynacji osocza APC-opornego. Frakcje łączono w miejscach wskazanych poprzecznymi słupkami.

Figura 2 ilustruje kyuikl prób charakteryzacji wyizolowanego APC-kofaktora 2/czyuuika V metodami elektroforezy SDS-PAGE, hybrydyzacji Westema i elektroforezy w żelu agarzzzwym. Połączony materiał z kolumny S-300 z przykładu 1 analizowano metodą SDS-PAGE, przed i po inkubacji z trombiną. Żele albo barwiono błękitem Czomassle (A) albo poddawano próbom hybrydyzacji techniką Westerna stosując przeciwciało wouokloualue (Master 30) otrzymane w przykładzie 3 (B) albo przeciwciała pzliklzualue (C). Próbki poddawane elektroforezie SDS-PAGE redukowano. Około 20 pg białka podawano do każdego pasma w żelu barwionym białkiem a do każdego pasma stosowanego do hybrydyzacji Westerna dodawano 1 pg białka. Pasma z białkiem trawionym trombiną są oznaczone literą T. Pozycje znaczników masy cząsteczkowej sąpodane po lewej stronie. Polipetydy związane z czynnikiem V sązzuacoone strzałkami a fragmenty powstałe w wyniku działania trombiną^. Biol. Chem. 257,6556-6564) sąoouaczzne grotami strzałek. Fragment o wielkości 150 kDa bami się słabo błękitem Coomassie ale jest łatwo zauważalny w próbie Westerna. Pasma nieciągłe są oznaczone gwiazdkami. Połączony materiał z chromatografii na żywicy S-300 analizowano również metodą elektroforezy w żelu agarzzowyw (sekcja dolna). Pozycje albuminy (alb), pasma α,, o^, β] i β2 osocza kontrolnego są oznaczone liniami pionowymi.

Figura 3 ilustruje wspólne oczyszczanie aktywności APC -kofaktora 2 i czynnika V metodą chromatografii powinowactwa z użyciem przeciwciała wznoklonaluego. Na kolumnę do chromatografu i pokiuzwactwa ze związanym przeciwciałem wonoklonalnym (Master 30) naniesiono połączony materiał z kolumny S-300. Ponieważ pojemność wiążąca kolumny została przekroczona, większość białka przechodzi przez kolumnę. Po wymyciu kolumny, związane białko ehowano roztworem o wysokim pH (początek dumania wskazany jest strzałką). Frakcje analizowano zarówno na aktywność APC-kofaktora 2 jak i na obecność czynnika V. Aktywność czynnika V oznaczano na podstawie skrócenia czasu aglutynacji w osoczu z brakiem czynnika V, podczas gdy aktywność APC-kofaktora 2 dawała zależne od APC wydłużenie czasu aglutynacji w osoczu opornym na APC. Dwie linie kreskowane oznaczają czasy aglutynacji buforowanych roztworów kontrolnych.

181 638

Figura 4 (A-B) ilustruje naprawę APC-opornosci przez oczyszczony APC-kofaktor 2/czynnik V. Oczyszczony metodą chromatografii powinowactwa APC-kofaktor 2/czynnik V (we wskazanych stężeniach w objętości 50 pl) mieszano z osoczem opornym na APC (40 ml). Następnie mieszaniny analizowano w próbie na aktywność APC-kofaktora 2 (A) z dodatkiem (o) i bez dodatku (o) APC w roztworze CaCf i w próbie na obecność czynnika V (B). Każdy punkt reprezentuje średnią z dwóch pomiarów.

WYNIKI

Aktywność APC-kofaktora 2 analizowano stosując próby biologiczne z zastosowaniem osocza pobranego od osobników z APC-opornością (osocze AS) jako osocza testowego i procedury opracowanej dla oczyszczania APC-kofaktora 2 z normalnego osocza. Pierwszym etapem tego oczyszczania była absorpcj a na cytrynianie,baru, pozwalaj ąca na usunięcie białek zależnych od witaminy K, w tym białek C i S. Eluat po absorpcj i cytrynianem baru nie wykazywał aktywności APC-kofaktora 2. Przy frakcjonowaniu supematantu osocza za pomocą strącania glikolem polietylenowym PEG 6000 aktywność APC-kofaktora 2 znajdowała się w supematancie ze strącania 8% PEG, podczas gdy rozpuszczony osad po strącaniu 0-8% roztworami PEG 6000 nie wykazywał aktywności APC-kofaktora 2. Aktywność APC-kofaktora 2 w supematancie ze strącania 8% PEG oczyszczano początkowo metodą chromatografii anionowymiennej na kolumnie wypełnionej żywicąQ-Sepharose a następnie metodą filtracji żelowej na żywicy Sephacryl S-300 (fig. 1). Sposób oczyszczania był bardzo podobny do sposobu oczyszczania czynnika koagulacji V (J. Clin. Invest. 66, 583-591 1980). Czynnik V znajdowano w tych samych frakcjach, które zawierały aktywność APC-kofaktora 2. Oczyszczanie prowadzono co najmniej 10 razy, z różnymi modyfikacjami, otrzymując w zasadzie bardzo podobne profile eluowania dla aktywności czynnika V i aktywności APC-kofaktora 2. Białko uzyskane z puli z kolumny S-300 wykazywało aktywność zarówno czynnika V jak i APC-kofaktora 2 i posiadało właściwości opisane uprzednio dla czynnika V (J. Clin. Invest. 66, 583-591, 1980). Dodatkowe wysiłki w celu rozdzielenia tych dwu aktywności z zastosowaniem szeregu innych zasad chromatografii, takich jak chromatografia na żywicach Heparin Sepharose, Blue Sepharose i Sepharose z aglutyniną z kiełków pszenicznych nie dały zadawalających wyników (których nie przytoczono) a aktywność APC-kofaktora 2 oczyszczano łącznie z czynnikiem V na każdym zastosowanym nośniku chromatograficznym.

Elektroforeza w żelu poliakryloamidowym SDS białka uzyskanego z puli z kolumny S-300 dała pasmo o wielkości 330 000 (odpowiadające jednemu łańcuchowi czynnika V) oraz pasma odpowiadające masom cząsteczkowym około 220.000 i 130.000 -150.000 (fig. 2). Te pasma reprezentują rozszczepiony czynnik V i jak białko o masie cząsteczkowej 330 000 reagują z antysurowicąpoliklonalnąprzeciw czynnikowi V w próbach hybrydyzacji Westerna (fig. 2). Pasmo o wielkości 220 000 reperezentuje C-końcowąc-zęść czynnika V, w tym łańcuch lekki czynnika Va o wielkości 74 kDa i większy (150 000) złożony z dwu fragmentów aktywacji. Pasmo to jest rozpoznawane przez antysurowicą przeciw lekkiemu łańcuchowi bydlęcego czynnika Va (wyniki nie są przedstawione). Pasma o wielkości 130 000-150 000 zawierająN-końcową część czynnika V (łańcuch ciężki o wielkości 105 kDa oraz mniej szy złożony z dwu fragmentów aktywacji) i reagują z antysurowicą przeciw łańcuchowi ciężkiemu bydlęcego czynnika Va (wyniki nie są przedstawione). Dodatkowe pasma o niższych masach cząsteczkowych, nie reagujące z antysurowicąpoliklonalnądla czynnika V w próbach hybrydyzacji Westerna były czasami widoczne ale jeśli występowały, to ich krzywe eluowania podczas chromatografii na kolumnie S-300 nie odpowiadały aktywności czynnika V ani aktywności APC-kofaktora 2 (jak wynikało z analizy metodą SDS-PAGe). Inkubacja oczyszczonego białka z trombiną dawała fragmentu charakterystyczne dla czynnjka V, rozszczepionego trombiną a przy okazji tracono aktywność w próbie na APC-kofaktor 2, co sugeruje, że aktywność APC-kofaktora 2 wykazuje tylko czynnik V a nie czynnik V_a. W procesie elektroforezy w żelu agarozowym, to oczyszczone białko migruje jako jedna substancja do pozycji alfa (fig. 2). Z tej pozycji żelu można eluować zarówno aktywność czynnika V jak i aktywność APC-kofaktora 2 (nie jest to uwidocznione).

181 638

Czynnik V jest szczególnie wrażliwy na proteolizę. Z tego względu w końcowym protokóle uwzględniono cały szereg inhibitorów proteazy. Przy prowadzeniu procesu przy braku inhibitorów proteazy w wyniku procedury oczyszczania otrzymywano bardziej rozłożony produkt, nie zawierający substancji o masie cząsteczkowej 330 000 ale zawierający pasma o wielkości 220 000 i 130 000-150 000. Oczyszczony produkt wykazywał aktywność zarówno czynnika V jak i APC-kofaktora 2. Dla utrzymania stabilności czynnika V potrzebne sąjony wapnia. Jeśli w procesie oczyszczania nie stosowano wapnia to aktywności czynnika V i APC-kofaktora 2 stopniowo zanikały.

Białko S-300 stosowano jako antygen w przykładnie 3 do produkcji przeciwciał monoklonalnych. Otrzymano siedemnaście takich przeciwciał. Wszystkie one reagowały z jednołańcuchowym czynnikiem V o wielkości 330 000 i z produktami o wielkości 220 000 co wykazano w próbie Westerna (fig. 2). Po rozszczepieniu czynnika V trombiną wszystkie przeciwciała reagowały z fragmentem aktywacji o wielkości 150 000 (większy z dwu fragmentów aktywacji).

Jedno z przeciwciał (Master 30) immobilizowano na żelu Affigel i stosowano do chromatografii powinowactwa (fig. 3). Na kolumnę wprowadzano białko z kolumny S-300. Białko związane na kolumnie eluowano. Okazało się, że wykazuje ono aktywność czynnika V i APC-kofaktora 2. Krzywe eluowania obydwu tych aktywności były ze sobązgodne ale wykazywały znaczne ślady. Inne warunki eluowania, takie jak wyższe lub niższe wartości pH albo użycie środków denaturujących były próbowane, ale nie dały zadawalających wyników, gdyż zanikały wówczas obydwa rodzaje aktywności. Całość białka kolumny S-300 podawano również na kolumny z immbilizowanymi przeciwciałami poliklonalnymi przeciw ludzkiemu czynnikowi V albo przeciw fragmentom bydlęcego czynnika Va. Aktywności czynnika V i APC-kofaktora 2 pozostająna kolumnach, ale denaturujące warunki wymagane do eluowania związanego białka powodują utratę obydwu tych aktywności biologicznych (wyników nie cytowano).

Wzrastające stężenie oczyszczonego metodą powinowactwa APC-kofaktora 2/czynmka V dodawano do osocza AS i oznaczano odpowiedź antykoagulacyjną na APC. Obserwowano zależnąod dawki antykoagulacyjną odpowiedź na APC (fig. 4A). Aby uzyskać odpowiedź na APC w osoczu porównywalną do tej jaką daje normalne osocze (czasy koagulacji wobec APC wynoszące 90-110 sekund), należało dostarczyć około 25 mg/litr, co stanowi taki sam rząd wielkości stężenia w jakim występuje czynnik V w normalnym osoczu. Białko oczyszczone metodą powinowactwa było również aktywne w próbie na czynnik V, co wykazano stwierdzając skrócenie czasu koagulacji (fig. 4B).

PRÓBY NA OBECNOŚĆ SKŁADNIKÓW W UKŁADZIE APC-KOFAKTORA

W następujących przykładach wykazano, że utrzymując stałe poziomy dwóch składników w układzie APC-kofaktora zawierającego APC, czynnik V wykazujący aktywność APC-kofaktora 2 i białko S i zmieniając poziomy pozostałych składników, można uzyskać różne szybkości konwersji substratu. Nasuwa się więc wniosek, że można zaprojektować metody analizy jak opisane powyżej dla każdego z tych składników. Próba z zastosowaniem osocza z deficytem aktywności APC-kofaktora 2 została ujawniona w sekcji: Materiały i Metody.

Przykład 5. Działanie APC-kofaktora 2 w analizie z odczynnikiem chromogennym

Zasada oznaczenia jest oparta na monitorowaniu rozkładu czynnika VIIIa przez APC na drodze zależnej od czynnika IXa aktywacji czynnika X, w którym to układzie czynnik VIIIa służy jako ważny kofaktor dla czynnika IXa. Tak więc, obniżony poziom czynnika VIIIa będzie powodował zmniejszenie wytwarzania czynnika Xa, co można oznaczyć przez hydrolizę czułego na czynnik Xa chromogennego substratu peptydowego.

I. Ilość 50μ1 normalnrgo osocza w coacieńczcniu 1:20 w buforze fo milimoiiliiti· Tris HT1 (pH = 7,3), I = 0,15 i 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), zawierającego wysoce oczyszczony koncentrat czynnika VIII (Octonativ M*, Kabi Pharmacia AB, Sztokholm, Szwecja) w ilości 2 jednostek międzynarodowych / ml mieszano z 50 pl trombiny bydlęcej o aktywności 0,06 nkat/ml (aktywność względem substratu S-2238 (Chromogenix AB, MÓ1 ndal, Szwecja)) w czasie 30 sekund w temperaturze 37°C.

181 638

II. Następnie, do powyższej mieszaniny dodano 100 μ! mieszaniny reagenta (R) zawierającej 40 mllimsli/litr Tris HCl (pH = 7,3) i 0,15% BSA, 12 mlllmoli/llto CaCl2 i 30 amoli/litr fosfolipidów oraz inne składniki wymienione poniżej i prowadzi się inkubację w czasie 2 minut w temperaturze 37°C.

III. Z powyższej mieszaniny pobrano próbkę 25 al i rozcieńczono ją ilością 1000 μ1 buforu Tris HCl (pH = 7,3) o stężeniu 50 milimoli/litr, I = 0,15, z dodatkiem 0,2% BSA, po czym analizowano aktywność czynnika VIII w próbie o nazwie COATEST^R VIII postępując według zasad wykonywania tego testu (Cbromogenix AB, MÓlndal, Szwecja).

IV. Ilość 200 al odczynnika zawierającego bydlęcy czynnik IXa i bydlęcy czynnik X (COATEST FVIIIR, Chrsmogenix AB, MÓlndal, Szwecja) oraz 30 amoli/litr fosfolipidów mieszano z ilością 100 al rozcieńczonej próbki pobranej z p. II i z ilością 100 al CaCl2 o stężeniu 25 milimoli/litr. Po 5 minutowej inkubacji w temperaturze 37°C dodano 200 al chromogenicznego substratu dla czynnika Xa o nazwie S-2765 (Chromogenix AB, MÓlndal, Szwecja) w stężeniu 0,9 m^moli/litr-. Po dalszych 3 minutach inkubacji w temperaturze 37°C zatrzymano hydrolizę substratu przez dodanie 100 al 20% kwasu octowego i odczytano absorbancj ę uwolnionego chromoforu pNA (^-nitroanilina) w fotometrze, przy długości fali 405 nm. W tym układzie, stężenie aktywnego czynnika VIII w próbce jest wprost proporcjonalne do absorpcji. Zawartości dodatkowych składników w różnych mieszaninach R były następujące:

A. nie było,

B. APC, 0,4 ag/ml,

C. APC, 0,4 ag/ml + aktywność APC-kofaktora 2, 0,3 jednostki/ml,

D. APC, 0,4 ag/ml + ludzkie białko S, 1 ag/ml,

E. APC, 0,4 ag/ml + ludzkie białko S, 1 ag/ml + aktywność APC-kofaktora 2, 0,3 jednostki/ml.

Normalne osocze zawiera około 10 ag/ml wolnego białka S, tak więc, rozcieńczenia próbek wnoszą 0,05 x 0,05 x 10 = 0,025 ag w etapie II, co odpowiada jednej czwartej dodanej ilości oczyszczonego ludzkiego białka S. Zawartość aktywności APC-kofaktora 2 powinna być przyjmowanajako wartość szacunkowa, gdyż dotychczas nie ist^i^^jiąilośeiowe metody oznaczania tej aktywności.

Wyniki

Mieszanina R	Białko S stęż. w etapie II (g/ml	A 405	Wpływ aktywności APC-kofaktora 2 na aktywność APC wyrażoną,jaWo A 405
A	0,125	0,678
B	0,125	0,623
C	0,125	0,509	-0,114 (C-B)
D	0,625	0,559
E	0,625	0,389	-0,170 (E-D)

Wyniki wskazuj, że dodanie aktywności APC-kofaktora 2 zwiększa aktywność APC na obydwu poziomach stężenia białka S, co jest zilustrowane zmniejszeniem wytwarzania czynnika Xa, a więc, zwiększoną szybkością inaktywacji czynnika VIIIa w etapie Π.

Przykład 6. Działanie APC-kofaktora 2 w próbie aglutynacji

Kofaktory Va i VIIIa biorą udział w wytwarzaniu trombiny, enzymu odpowiedzialnego za powstawanie fibryny. Te kofaktory są degradowane przez APC, a więc, aktywność APC jest wyrażona w próbie aglutynacji jako wydłużenie czasu potrzebnego do powstania skrzepu fibryny. Ponieważ białko C (PC) krąży we krwi jako proenzym, białko C aktywuje się w próbce przez dodanie enzymu z jadu żmiji, Protac CR (Pentapharm, Bazylea, Szwajcaria). Przeprowadzono następujące doświadczenie:

181 638

I. Ilość 10 μΐ koncentratu czynnika VIII (Octonativ M, Kabi Pharmacia AB, Sztokholm, Szwecja) o stężeniu 10 jednostek międzynardowych/ml zmieszano ze 100 Ml osocza z deficytem PC, 100 Ml odczynnika APTT, 25 μΐ enzymu Protac C o stężeniu 1,5 jednostek/ml i do powyższej mieszaniny dodano 25 pl mieszaniny reagenta R zawierającej 50 milimoli/litr Tris HCl (pH = 7,5), I = 0,15, 0,2% BSA i dalsze składniki wymienione poniżej. Mieszaninę tę inkubowano w czasie 4 minut w temperaturę 37°C.

II. Do powyższej mieszaniny dodano następnie 100 il CaCf o stężeniu 22 milimole/litr i mierzono czas potrzebny do wytworzenia się skrzepu w temperaturze 37°C.

Dodatkowe składniki w mieszaninach R:

A. nie dodano,

B. PC, 2 ig/ml,

C. PC, 2 ig/ml + aktywność APC-kofaktora 2, 2,6 jednostek/ml,

D. PC, 4 ig/ml,

E. PC, 4 ig/ml + aktywność APC-kofaktora 2, 2,6 jednostek/ml,

F. APC-kofaktor 2, 2,6 jednostek/ml.

Osocze z deficytem białka C współdziała wraz z innymi białkami osocza w procesie powstawania skrzepu, jak również z białkiem S, będącym kofaktorem dla APC. Końcowe stężenie aktywności APC-kofaktora 2 w etapie I wynosi około 0,2 - 0,3 jednostki/ml (patrz wyżej).

Wyniki	Białko C	Czas	Przedłużenie aktywności APC
Mieszanina R	stęż. w etapie I	aglutynacji	przez APC-kofaktor 2,
	ig/ml	sek.	sek
A	0	42,3 ± 0,7 (n=5)
B	0,2	62,7 ± 1,2 (n=5)
C	0,2	71,4 ± 1,6 (n=3)	8,7
D	0,4	79,3 ± 2,9 (n=5)
E	0,4	104,5 ± 8,6 (n=3)	25,2
F	0	45,9

Powyższe doświadczenie wyraźnie wskazują, że dodanie aktywności APC-kofaktora 2 zwiększa aktywność APC wyrażoną jako zwiększone wydłużenie czasu aglutynacji. Wpływ jako taki dodania preparatu APC-kofaktora 2 przy braku białka C jest niewielki.

181 638

FIG.2

181 638

Absorbancja przy 280nm Czas aglutynacji (sekundy)

FIG.3

Numer frakcji

181 638

FIG.4A

Czas aglutynacji (sekundy)

FIG.4B

Dodane białko (μ^/ΓΠΐ)

181 638

FIG.1

GD

<

Czas aglutynacji (sekundy) Absorbancja przy 280

Numery frakcji Numery frakcji nm

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób oznaczania skłonności do rozwoju zakrzepicy u danego osobnika w wyniku dziedziczonej APC-odporności spowodowanej mutacją (mutacjami) genu, znamienny tym, że oznacza się w próbce komórek pochodzących od tego osobnika występowanie mutacji w genie dla Czynnika V, przy czym mutacje są zlokalizowane w jednym, w większej ilości fragmentów i/lub w sekwencji kwasu nukleinowego w genie dla Czynnika V, powodując ekspresję zmutowanej cząsteczki Czynnika V/Va, co jest związane z występowaniem APC-odporności, a więc, skłonności do rozwoju zakrzepicy.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że oznacza się mutację (mutacje) jako nienormalny brak lub nienormalna obecność fragmentu (fragmentów) i/lub sekwencji kwasu nukleinowego w genie Czynnika V, spowodowane przez tą mutację, przy czym oznaczenia prowadzi się w oparciu na próby hybrydyzacji kwasów nukleinowych, sekwencjonowania kwasów nukleinowych albo w oparciu o próby immunologiczne.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że oznacza się mutację (mutacje) pośrednio, wiążąc jej występowanie z neutralnym polimorfizmem w genie Czynnika V.