PL181682B1

PL181682B1 - Sposób wytwarzania modyfikowanych P-chiralnych analogów nukleotydów

Info

Publication number: PL181682B1
Application number: PL30880395A
Authority: PL
Inventors: Wojciech J Stec; Lucyna Wozniak
Original assignee: Pan
Priority date: 1995-05-26
Filing date: 1995-05-26
Publication date: 2001-09-28
Also published as: PL308803A1

Abstract

1. Sposób wytwarzania modyfikowanych P-chiralnych analogów nukleozydów o wzorze ogólnym 5, w którym R1 oznacza 4,4'-dimetoksytrytyl (DMT) lub 9-fenyloksanten-9-ol (Px), R oznacza atom wodoru, grupę wodorotlenową lub grupę metoksylową, r5 oznacza grupę acetylową lub grupę t-butylodimetylosililową a B oznacza zablokowaną zasadę purynową lub pirymidynową, z wykorzystaniem związków o ogólnym wzorze 3 do wytwarzania wiązania estrowego, znamienny tym, że związkiem o ogólnym wzorze 3, gdzie r\R2 i B mająpodane wyżej znaczenie, fosforyluje się, ewentualnie w obecności aktywatora, alkohol pierwszorzędowy, korzystnie będący resztą5'-hydroksylowąnukleozydu o wzorze ogólnym 4, gdzie R5 oznacza grupę acetylową lub t-BuMe2Si, a otrzymany produkt o wzorze 5 wyodrębnia się i rozdziela na diastereoizomery znanymi metodami.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania modyfikowanych P-chiralnych analogów nukleozydów o ogólnym wzorze 5, w którym R1 oznacza 4,4'-dimetoksytrytyl (DMT) lub 9-fenyloksanten-9-ol (Px), R2 oznacza atom wodoru, grupę wodorotlenową lub grupę metoksylową, R5 oznacza grupę acetylową lub grupę t-butylodimetylosililową, a B oznacza zablokowane zasady purynowe lub pirymidynowe, z estrów seleno- lub tioloalkilowych kwasów fosforu z wykorzystaniem związków o ogólnym wzorze 3, w którym R1, R2 i B mają podane wyżej znaczenie, do wytwarzania wiązania estrowego.

Znana jest zaproponowana w 1978 roku koncepcja wykorzystania oligonukleotydów jako potencjalnych leków przeciwwirusowych - koncepcja ANTISENSE (P. C. Zamecnik, M. L. Stephenson, 1978. Inhibition of Rous Sarcoma Virus Replication and Cell Transformation by a Specific Oligo-deoxynucleotide; Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1975, 280).

Spowodowała ona wzrost zainteresowania syntezą i własnościami oligonukleotydów i ich modyfikowanych analogów jak tiofosforany czy metylofosfoniany (J. S. Cohen, Antisense Oligodeoxynucleotides as Antiiiral Agents, Antivr. Res, 1991, 16, 121.; M. W. Bradley, L. A. Chrisecy, J. W. Hawkins, Antisense Therapeutics, W Gene Regulation, Biology of Antisense RNA and DNA, 1991; 1; Robert P. Erickson, Jonathan, G. Izant, Eds., Raven Press, New York, 1991, 285-294). Koncepcja ta opiera się na wykorzystaniu oddziaływań pomiędzy oligonuklotydami komplementarnymi do fragmentów cząsteczek pre-mRNA lub mRNA, powodujących w efekcie zahamowanie biosyntezy niepożądanych białek. Możliwe jest również oddziaływanie antysensowego DNA z podwójną helisą DNA (tworzenie struktury trójniciowej), dające ten sam efekt końcowy, wyrażający się specyficznym zahamowaniem procesu transkrypcji. Oba te procesy charakteryzuje wysoka selektywność, spowodowana oddziaływaniami ze ściśle określonymi fragmentami DNA lub RNA. Przyjmuje się, że antysensowe oligonukleotydy mogą tworzyć kompleksy z DNA i RNA w różnych fazach procesu ekspresji

181 682 genu w komórkach eukariotycznych. Powinowactwo oligonukleotydów w stosunku do sekwencji rozpoznawczej jest wynikiem oddziaływań hybrydyzacyjnych (parowanie zasad typu Watsona-Cricka oraz oddziaływania warstwowe w tworzącej się podwójnej helisie) i wzrasta wraz z długością kompleksu oligonukleotyd rozpoznawana sekwencja.

Wprowadzenie modyfikacji do cząsteczki ANTISENSE (tiofosforany, metanofosfoniany) może powodować zmianę tych oddziaływań, będącą wynikiem zmiany geometrii wokół modyfikowanych wiązań (Y. N. Vorobvov, Nonionic Analogs of Oligonucleotide Duplexes. Molecular Mechanical Calculations of the Influence of Configuration of Asymmetrical Phosphorus Atoms in Methylphosphonate d(TPMe)6 and Phosphotriester Derivatives d(TPEt)6 on the Structure and Stability of their Complexes with dA6, 1990; Molekulycanaya Biologiya 24, 58), oraz wzrost ich trwałości w komórkach, będący rezultatem odporności na działanie enzymów nukleolitycznych (V. L. Potter, B. A. Connolly, F. Eckstein, Synthesis and Configurational Analysis of a Dinucleoside Phosphate Isotopically Chiral at Phosphorus. Stereochemical Course of Penicillium Citrum Nuclease P1 Reaction. 1983, Biochemistry, 22, 1369; F. R. Bryant.

S. J. Benkovic, Stereochemical Course of the Reaction Catalyzed by Nucleotide Phosphodiesterasefrom Snake Penom, 1979, Biochemistry, 18, 2825).

Oligo(nukleozydometanofosfoniany) (OligoMe) są niejonowymi analogami DNA, zawierającymi neutralne ugrupowania metanofosfonianowe, zastępujące w naturalnej cząsteczce DNA wiązania fosfodiestrowe.

Wiązanie metanofosfonianowe jest całkowicie odporne na działanie nukleaz, a jego niejonowy charakter powoduje, ułatwienie transportu OligoMe poprzez błonę komórkową do cytoplazmy (S. Agrawal, P. S. Sarin, M. Zamecnik, P. C. Zamecnik, Cellular Uptake and Anti-HIV Activity of Oligonucleotides and their Analogs. W Gene Regulation. Biology of Antisense RNA and DNA., 1991, Vol. 1; Robert P. Erickson and Jonathan G. Izant eds., Reven Press, 273-284).

Szereg interesujących wyników wskazuje na efektywność użycia komplementarnych (antysensowych) fragmentów OligoMe do specyficznego zahamowania syntezy zarówno in vitro jak in vivo niepożądanych (szkodliwych) białek.

Krótkie fragmenty (7-12 merowe) OligoMe zastosowano z powodzeniem do zahamowania procesu dojrzewania pre-mRNA wirusa Herpes simplex (typ 1) C. C. Smith, L. Aurelian, M. P. Reddy, P. S. Miller, P. O. P. Ts'o, Antiviral Effect of an Oligo(nucleoside methylphosphonate) Complementary to the Splice Junction of Herpes simplex virus type 1 Immediate Early pre-mRNAs 4 and 5, 1986, Proc. Natl. Acad.,Sci., USA, 83, 2787), a także namnażania tego wirusa w oocytach żaby (Xeropus laevis) (C. Casenave, M. Cherrier, T. T. Nauyen, C. Helene, Rate of Degradation of and f-0ligodeoxynucleotides in Xenopus oocytes: Implications for Anti-messenger Strategies. Nucl. Acida. Res. 19187,15, 10507).

Analogicznie udało się zahamować ekspresję genu β-globiny w retikulocytach królika (K. Blake, A. Murakami, P. S. Miller, Inhibition of Rabbit Globin mRNA Translation a Sequence - Specific Oligodeoxyribonucleotides, 1985, Biochemistry, 24, 132). Właściwości te wskazują na znaczące potencjalne możliwości wykorzystania OligoMe. Wynika stąd duże zainteresowanie syntezą i własnościami tej klasy związków w wielu laboratoriach badawczych i firmach biotechnologicznych (P. O. P. Ts'o, L. Aurelian, E. Chang, P. S. Miller, w Antisense Strategies, Annals of the New York Academy of Sciences, 1993, 660. 159).

Innym aspektem, a jednocześnie utrudnieniem badań nad OligoMe jest występowanie centrum asymetrii na atomie fosforu, wynikające z zamiany ligandu tlenowego na niejonową grupę metylową. Konsekwencją stereochemiczną jest występowanie w oligomerze o długości n par zasad 2n-1 izomerów powstających w rezultacie kolejnych niestereospecyficznych reakcji wzrostu łańcucha nukleotydowego.

Stwierdzono, że łańcuchy homochiralne Rp i Sp, tj. takie, których konfiguracja absolutna na wszystkich intemukleotydowych metanofosfonianowych atomach fosforu jest albo Rp, albo Sp, oraz łańcuchy niestereoregulame, wykazują zróżnicowane własności fizykochemiczne, a także zróżnicowanie zdolności do tworzenia adduktów z oligonukleotydami o komplementarnej

181 682 sekwencji. Badania przeprowadzone na analogach tiofosforanowych dinukleotydach potwierdziły różnice w zachowaniu oligo-Rp i oligo-Sp, między innymi stereoselektywność w stosunku do nukleaz (B.V. L. Potter, B.A.Connolly, F. Eckstein, Biochemistry, 22, 1983, 1369; F.R. Bryant, S. J. Benkovic, Biochemistry, 18 (1979) 2825.

W ostatnich latach wykazano, że okta(tymidylo-metanofosfoniany), w których sześć spośród siedmiu wiązań metylofosfonianowych ma ściśle zdefiniowaną konfigurację na atomie fosforu i wysoką czystość diastereomeryczną, otrzymane w wyniku kondensacji niestereospecyficznej odpowiednich diastereoizomerycznie czystych tetramerów, wykazują dramatyczne różnice w temperaturach mięknięcia T_m, świadczące o różnej trwałości kompleksów izomerycznych związków z matrycą kwasu pentadeka-deoksyadenylowego (Z. L. Leśnikowski, M. Jaworska, W. J. Stec, Nuci. Acids Res., 18,1990, 2109).

Wykorzystane w tych badaniach OligoMe o zdefiniowanej konfiguracji na atomie fosforu uzyskano w wyniku stereokontrolowanej reakcji pomiędzy aktywowaną za pomocą odczynnika Grignarda grupą 5'-hydroksylową nukleozydu i izomerycznie czystym p-nitrofenylometylo-fosfonianem nukleozydu (J. Leśnikowski, M. Jaworska, W. J. Stec, 1990, Octa(thymidine methanephosphonates) of Partially Defined Stereochemistry: Synthesis and Effect of Chirality at Phosphorus on Binding to Pentadeca-deoxyriboadenylic Acid, Nucleic Acids Res, 18 1990, 2109; Z. J. Leśnikowski, M. Jaworska-Maślanka, W. J. Stec, Stereospecific Synthesis of P-chiral Di(2-O-Deoxyribonucleoside) methanephosphonates, Nucleosides & Nucleotides, 1991, 10, 733); Z. J. Leśnikowski, M. Jaworska, W. J. Stec, Stereoselective Synthesis of P-homochiral Thymidine Methylphosphonates. Nucl. Acid Res, 1988, 16,11675).

Metoda ta wymaga jednak długich czasów reakcji i do tej pory została sprawdzona jedynie w syntezie tetramerowych fragmentów homotymidylowych oraz heteromerycznych struktur heksamerowych.

Próby uzyskania diastereoizomerycznie czystych OligoMe w wyniku reakcji pomiędzy metylodichlorofosfimą i odpowiednimi zablokowanymi w pozycjach 5' lub 3'-nukleozydami prowadzone w niskich temperaturach (-80°C) pozwoliły na otrzymanie w przewadze (8:1) izomerów Rp odpowiednich metylofosfonianów dinukleozydów (T. Loschner, J. Engels, One Pot Rp-Diastereoselective Synthesis of Dinucleoside Methylphosphonates Using Methyldichlorophosphine, Tetrahedron Lett, 1989, 30(41), 5587; J. W. Engels, T. Loschner, A. Frauendorf, Diastereoselective Synthesis of Thymidine Methylhosphonate Dimers, Nucleosides & Nucleotides, 1991, 10, 347).

Metodą tą nie można jednak otrzymać dłuższych stereoregulamych łańcuchów, ponieważ tworzące się przejściowo w wyniku kolejnych reakcji kondensacji chlorometylofosfoniny 3'-0-nukleozydów są, nawet w niskich temperaturach, konfiguracyjnie labilne.

Opisana ostatnio metoda polegająca na zastosowaniu jako monomerów 5'-DMT-O-nukleozydo-3'-O-(Se-metylo selenometanofosfonianów) rozdzielonych na diastoreoizomery pozwala na otrzymanie diastereomerycznie czystych OligoMe w roztworze (L.A. Woźniak, J. Pyzowski, M. Wieczorek, W. J. Stec, J. Org. Chemistry, 1994, 59, 5843).

Katalizatorami tej reakcji są sole litu oraz l,8-diazabicyklo[5.4.0]-undek-7-en (DBU).

Oligonukleotydy zawierające n-chiralnych wiązań intemukleotydowych występują w postaci 2n izomerów.. Metody chromatograficzne pozwalają na efektywny rozdział krótkich fragmentów, zwłaszcza dimerów, które mogą być z powodzeniem wbudowane w postaci diastereomerycznie czystej do łańcuchów chimerycznych zawierających naprzemiennie wiązania metanofosfonianowe o zdefiniowanej konfiguracji na atomie fosforu [Rp] oraz wiązania fosfodiestrowe lub tiofosforanowe. Strategia taka została przedstawiona jako bardzo obiecująca, wobec wysokiego stopnia inhibicji uzyskanego w wyniku działania oligonukleotydów o budowie chimerycznej z fluorkiem kwasów fosforu o wzorze ogólnym 3 i wykorzystania ich do wytwarzania wiązania estrowego w estrach o wzorze ogólnym 5 (L. Arnold, Frist International Antisense Conference of Japan, Kyoto, Abs. #25,1994).

Sposób wytwarzania modyfikowanych P-chiralnych analogów nukleozydów o wzorze ogólnym 5, w którym R¹ oznacza 4,4'-dimetoksytrytyl (DMT) lub 9-fenyloksanten-9-ol (Px),

181 682

R² oznacza atom wodoru, grupę wodorotlenową lub grupę metoksylową, R⁵ oznacza grupę acetylową lub grupę t-butylodimetylosililową, a B oznacza zablokowaną zasadę purynową lub pirymidynową, z wykorzystaniem związków o ogólnym wzorze 3 do wytwarzania wiązania estrowego, według wynalazku polega na tym, że związkiem o ogólnym wzorze 3, gdzie R¹, R2 i B mają podane wyżej znaczenie, fosforyluje się, ewentualnie w obecności aktywatora, alkohol pierwszorzędowy, korzystnie będący resztą 5'-hydroksylową nukleozydu o wzorze ogólnym 4, gdzie R2, R5 i B mają podane wyżej znaczenie, a otrzymany produkt o wzorze 5 wyodrębnia się i rozdziela na diastereoizomery znanymi metodami.

W sposobie według wynalazku, korzystnie stosuje się związek o wzorze 3, w którym Ri, R2 i B mają podane wyżej znaczenie, otrzymany przy wykorzystaniu estrów selenoalkilowych lub tioloalkilowych kwasów fosforu o ogólnym wzorze 1, gdzie Ri, R2 i B mają podane wyżej znaczenie, R³ oznacza grupę metylową, metylofenylową lub nitrometylofenylową, zaś X oznacza siarkę lub selen, jako odczynników fosforylujących w stosunku do fluorku o ogólnym wzorze 2, w którym R⁴ oznacza kation srebra lub kation alkiloamoniowy, korzystnie trietyloamoniowy. Reakcja pomiędzy 1 i 2 prowadzi do wytworzenia wiązania estrowego i powstania związku o wzorze 3, który po wyodrębnieniu, lub bez, poddaje się reakcji z alkoholem w warunkach katalizy zasadowej, do wytworzenia związku o wzorze 5.

Produkt 3 poddaje się reakcji korzystnie z grupą 5'-hydroksylową nukleozydu o wzorze ogólnym 4 stosując jako katalizator zasadowy organiczne aminy, korzystnie DBU, a produkt o wzorze 5 wyodrębnia i rozdziela znanymi metodami.

Sposób według wynalazku, prowadzi się korzystnie w warunkach bezwodnych, w nieprotonowym rozpuszczalniku organicznym, korzystnie w acetonitrylu.

Metoda według wynalazku odznacza się trwałością chemiczną monomerów o wzorze 3 oraz możliwością katalizy procesu zawiązywanie wiązania estrowego i uzyskania produktu 5 z wysoką wydajnością.

Również reakcja pomiędzy 1 i 2 prowadzi do wytworzenia wiązania estrowego z wysoką wydajnością i odznacza się łatwością wyodrębniania monomerów o wzorze 3, metodami wytrącania z rozpuszczalników niepolarnych, korzystnie eteru naftowego lub węglowodorów alifatycznych.

Sposób według wynalazku opiera się na reakcji podstawienia nukleofllowego przy atomie fosforu w alkiloseleno i alkilotiolofosfonianach nukleozydów o wzorze ogólnym 1, za pomocą fluorków o wzorze ogólnym 2, i wykorzystania wytworzonych związków 3 jako odczynników fosforylujących alkohole pierwszorzędowe, w szczególności grupy 5'-hydroksylowe nukleozydów, w obecności aktywatora, którym może być amina, korzystnie taka jak l,8-diazabicyklo[5.4.0J-undek-7-en (DBU). Produkty reakcji w etapie I wydziela się stosując wytrącanie związków 3 w węglowodorach alifatycznych, natomiast związek o wzorze 5 oczyszcza i rozdziela na diastereoizomery metodami chromatograficznymi.

Poniżej przedstawiono przykład wykonania wynalazku, nie ograniczający jego zakresu.

Przykład I.

Synteza (Rp)-3'-metanofosfonianu 5'-O-DMT- tymidylolo(3'->5'))3'-O-acetylotymidyny (wzór 5).

Do roztworu 5'-0-DMT-tymidylo-3'-0-fluorometano-fosfonianu (0.312 g, 0.5 mmol), 3i P NMR: 30.6 i 30.7 ppm, Jp_F= 1059 i 1060 Hz; MS FAB-[m/z]*623.4) i 3'-O-acetylotymidyny (0.057 g, 0.2 mmol) w suchym acetonitrylu dodano roztwór DBU w acetonitrylu (3:7 v/v, 0.15 ml). Po 15 minutach roztwór reakcyjny rozcieńczono chloroformem i estrahowano dwa razy za pomocą kwasu cytrynowego (0.1 mol). Warstwę organiczną suszono za pomocą MgSO4. Po zatężeniu rozpuszczalników pod zmniejszonym ciśnieniem produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym, stosując gradient chloroform-etanol (0-3%) jako eluent.

Wydajność: 92% 31 P NMR: 31.51 ppm i 31.47 ppm (MeCN).

Produkt poddano deprotekcji i w pełni odblokowany porównano z wzorcem otrzymanym na drodze niezaleznej.

181 682

W tabeli 1 zamieszczono dane spektroskopowe otrzymanych monomerów o ogólnym wzorze 3.

Tabela 1

Substrat 1	Produkt 3
B'	³¹P NMR:Ó* [ppm]	J1 P Se [Hz]	^3,P NMR: δ* [ppm]	J1 P-F [Hz]	diast. ratio	FAB-MS
T[S„]**	49.7	430	30.7 30.6	1060 1059	3/2	623.4
CBz[Rp]	50.3	430	30.3 30.2	1060 1059	1/1	712.2
G^,b,ir[Rp]	50.6	431	31.3 30.9	1058 1060	1/1	718.2
A^Bz[S_p]	50.2	432	30.6 30.3	1057 1059	1/1	736.2

W tabeli 2 zamieszczono dane fizykochemiczne wszystkich otrzymanych tą metodą związków o wzorze 5.

Tabela 2

Substraty	Produkt 5
3	4	³¹P NMR: ^[pp^m]	diastereom. FAST/SLOW	HPLCR, [min]	FAB-MS
I	II	III	IV	V	VI
Gb	T	32.47	55	11.28	982.4*
		32.75	45	12.20
	CB	32.67	44	13.45	1071.4
		32.89	56
	Ab	32.60	47(61)	15.79	1167.6
		32.94	53(39)	16.34
	G'Bz	32.39	50	9.68	1077.4
		33.15	50	9.86
_cBz	T	32.23	55	13.16	976.4
		32.55	45	13.79
	_cBz	31.79	45		1065.4
		32.22	55
	AB	32.43	55		1161.7
		32.67	45
	G‘bu	32.04	57		1071.6
		33.03	43

ciąg dalszy tabeli na str. 7

181 682 ciąg dalszy tabeli

T	T	31.34 31.71	54 46	\| 887.4 1 i
	cB^z	32.63	54	12.81	976.4
		33.15	46	13.23
	ABz	32.43	59	17.87	1072.7
		32.79	41	18.71
	_G'bu	32.04	58	9.47	982.5
		33.46	42	9.92
A^Bz	T	32.33	52	12.69	1000.5
		32.71	48	13.63
	_cBz	32.57	49	14.95	1089.6
		32.94	51	15.31
	ABz	32.39	57		1185.8
		32.62	43
	G^	32.10	54	10.87	1095.4
i 1	33.29	46	11.30

181 682

wzór 1 wzór 2 wzór 3

wzór 3 wzór 4 wzór 5

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz. Cena 2,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania modyfikowanych P-chiralnych analogów nukleozydów o wzorze ogólnym 5, w którym R¹ oznacza 4,4'-dimetoksytrytyl (DMT) lub 9-fenyloksanten-9-ol (Px), R² oznacza atom wodoru, grupę wodorotlenową lub grupę metoksylową, R⁵ oznacza grupę acetylową lub grupę t-butylodimetylosililową, a B oznacza zablokowaną zasadę purynową lub pirymidynową, z wykorzystaniem związków o ogólnym wzorze 3 do wytwarzania wiązania estrowego, znamienny tym, że związkiem o ogólnym wzorze 3, gdzie R1, R2 i B mają podane wyżej znaczenie, fosforyluje się, ewentualnie w obecności aktywatora, alkohol pierwszorzędowy, korzystnie będący resztą 5'-hydroksylową nukleozydu o wzorze ogólnym 4, gdzie R5 oznacza grupę acetylową lub t-BuMe2Si, a otrzymany produkt o wzorze 5 wyodrębnia się i rozdziela na diastereoizomery znanymi metodami.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że fosforylację prowadzi się w warunkach bezwodnych, w nieprotonowym rozpuszczalniku organicznym, korzystnie w acetonitrylu.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się związek o wzorze 3 otrzymany bezpośrednio w środowisku reakcji, w warunkach bezwodnych i bez wyodrębniania wykorzystuje się jako odczynnik fosforylujący alkoholu o wzorze 4.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako aktywator procesu pomiędzy związkiem o ogólnym wzorze 3 i alkoholem o wzorze 4 stosuje się aminy, korzystnie 1,8-diazabicyklo-[5.4.0]-undek-7-en (DBU).