PL181695B1 - Sposób ekspresji bialka blony zewnetrznej P2 Haemophilus influenzae typu b (Hib-P2) w komórkach E.coli, szczepionka przeciwko Haemophilus influenzae typu boraz wektory ekspresyjne PL - Google Patents

Abstract

1 .Sposób ekspresji bialka blony zewnetrznej P2 H aem ophilus influenzae typu b (Hib-P2) w ko m órkach E.coli znamienny tym, ze a) przeprowadza sie transform acje E .coli wektorem zaw ierajacym marker selek cy jn y i gen kodujacy bialko wybrane z grupy obejmujacej (i) dojrzale bialko P2 i (ii) bialko funkcyjne obejmujace dojrzale bialko P2 przylaczone do am inokwasów od 1 do 22 bialka kapsydu kodowanego przez gen ? 10 faga T7, w którym gen polaczony jest operacyjnie z pro- motorem faga T7 i b) hoduje sie transformanty E .coli w pozywce LB zawierajacej glukoze i czynnik selekcyjny w temperaturze okolo 30°C do zawartosci eksprymowanego bialka co najmniej 2% w szystkich bialek ulegajacych ekspresji w komórkach E.co li. 9. Szczepionka przeciwko H aem ophilus influenzae typu b znam ienna tym, ze zawiera ponow - nie zwiniete bialko blony zewnetrznej P2 z Haemophilus influenzae typu b (Hib-P2) lub jego bialko fu zyjne wraz z farmaceutycznie dopuszczalnym rozcienczalnikiem, nosnikiem lub zaróbka, przy czym bialko obecne jest w ilosci od 2 do 100 µg/kg wagi ciala. II. Wektor ekspresyjny pN V -3, znamienny tym, ze sklada sie z wektora pE T -17b z wklonowana w miejsca restrykcyjne Nde I i Xho I sekwencja oznaczona numerem identyfikacyjnym 11. 12. Wektor ekspresyjny pN V -2, znamienny tym, ze sklada sie z wektora pET-17b z w klono wana w miejsca restrykcyjne Bam HI i X hol sekwencja oznaczona numerem identyfikacyjnym 9. 13. Wektor ekspresyjny pN V -6, znamienny tym, ze sklada sie z wektora pET-11 a z w klono wana w miejsca restrykcyjne N del i Bam HI sekwencja oznaczona numerem identyfikacyjnym 13. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób ekspresji białka błony zewnętrznej P2 Haemophilus influenzae typu b (Hib-P2) w komórkach E.coli, szczepionka przeciwko Haemophilus influenzae typu b oraz wektory ekspresyjne. Wynalazek, w korzystnym wykonaniu, dostarcza ponadto sposobu oczyszczania i nadawania właściwej konformacji rekombinowanemu białku.

Haemophilus influenzae typu b powoduje bakteryjne zapalenie opon i inne infekcje inwazyjne u dzieci w wieku poniżej 4 lat w USA. Białko P2 z wielu szczepów H.influenzae typu b oczyszczono i scharakteryzowano (Munson et al. J.Clin.Invest. 72: 677-684 (1993) i Vachon et al. J.Bacteriol. 162:9188-924 (1985). Gen strukturalny, kodujący białko P2 typu HI sklonowano i oznaczono sekwencją DNA (Hansen E.J., et al. Infection and Immunity 56: 2709-2716 (10.1988); Hansen E.J., et al. Infection and Immunity 57:1100-1107 (04.1989) i Munson Je, R., Tolan Jr. R.W., Infection and Immunity 57: 88-94 (01.1989).

Jakkolwiek rekombinowane białko P2 eksprymowano wH.influenzae Rd (Hansen E.J. et al. Infection and Immunity 56:2709-2716 (10.1988) i w komórkach E.coli (Munson Jr, R., Tolan Jr. R.W., Infection and Immunity 57:88-94 (01.1989), poziom ekspresji w komórkach E.coli był niski, prawdopodobnie z powodu wysokiej toksyczności białka P2 w E.coli, co sugerował Munson (Munson Jr R., Tolan Jr. R.W. Infection and Immunity 57:88-94 (01/1989) i Hansen (Hansen E.J., et al. Infection and Immunity 56:2709-2716 (10.1988). Wynalazek dostarcza sposobu ekspresji białka Hib-P2 w komórkach E.coli, w których białko Hib-P2 tworzy ponad 2% wszystkich białek eksprymowanych w komórkach E.coli.

Ogólnym celem wynalazku jest dostarczenie sposobu ekspresji rekombinowanego białka błony zewnętrznej P2 z Haemophilus influenzae typu b (hib-P2) lub jego białka fuzyjnego, w komórkach E.coli.

Szczegółowym celem wynalazku jest dostarczenie sposobu ekspresji białka błony zewnętrznej P2 z Haemophilus influenzae typu b (hib-P2) lub jego białka fuzyjnego, w komórkach E coli, obejmującego:

a) transformację komórek E.coli wektorem obejmującym marker selekcyjny i gen kodujący białko wybrane z grupy obejmującej:

i) dojrzałe białko P2 ii) białko fuzyjne, obejmujące dojrzałe białko P2 z przyłączonym fragmentem (pozycje aminokwasowe 1-22) genu białka kpsydu 010 faga T7;

gdzie wymieniony gen jest przyłączony, w sposób umożliwiający działanie, do promotora T7; i

b) transformanty E.coli rosnące w podłożu LB, zawierającym glukozę i czynnik selekcyjny, w temperaturze około 30°C, gdzie syntetyzowane jest wymienione białko, stanowiąc ponad

2% wszystkich białek eksprymowanych w komórkach E.coli.

181 695

W kolejnym, konkretnym zastosowaniu wynalazek dostarcza sposobu oczyszczania i nadawania właściwej konformacji białku błony zewnętrznej P2 z Haemophilus injluenzae typu b (Hib-P2) lub jego białku fuzyjnemu, wytworzonemu według wyżej wymienionych sposobów.

Kolejnym, szczegółowym celem wynalazku jest dostarczenie szczepionki obejmującej białko błony zewnętrznej P2 z Haemophilus injluenzae typu b (Hib-P2) lub jego białko fuzyjne, wytworzone według wyżej wymienionych sposobów, w ilościach wystarczających do powstania przeciwciał ochronnych w organizmie zwierzęcia, skierowanych przeciw Haemophilus influenzae typu b; wraz z farmaceutycznie użytecznym nośnikiem lub wypełniaczem.

Kolejnym, szczegółowym celem wynalazku jest dostarczenie wymienionej wyżej szczepionki, gdzie wymienione białko błony zewnętrznej P2 lub jego białko fuzyjne jest przyłączone do polisacharydu otoczkowego Haemophilus.

Następnym, szczegółowym celem wynalazku jest dostarczenie sposobu zapobiegania bakteryjnemu zapaleniu opon u zwierząt, obejmującego podawanie zwierzęciu szczepionki białka Hib-P2 lub białka fuzyjnego, zgodnie ze sposobami podanymi wyżej.

Kolejnym szczegółowym celem wynalazku jest dostarczenie sposobu przygotowania koniugatu polisacharydu, obejmującego: uzyskanie opisanego powyżej białka błony zewnętrznej P2 lub białka fuzyjnego; uzyskanie polisacharydu z komórek Haemophilus·, skoniugowanie białka z polisacharydem.

Kolejnym szczegółowy celem wynalazku jest dostarczenie sposobu oczyszczania opisanego powyżej białka błony zewnętrznej P2 lub białka fuzyjnego, obejmującego: lizę transformowanych komórek E.coli, w celu uwolnienia białka P2 lub białka fuzyjnego, w postaci nierozpuszczalnych inkluzji; przemycie inkluzji buforem, w celu usunięcia białek komórkowych E.coli·, zawieszenie i rozpuszczenie inkluzji w roztworze wodnym denaturanta; rozcieńczenie otrzymanego roztworu w detergencie; oraz oczyszczenie upłynnionego białka P2 lub białka fuzyjnego poprzez filtrację żelową.

Kolejnym szczegółowym celem wynalazku jest dostarczenie sposobu ponownego uzyskania właściwej konformacji przez opisane wyżej zewnętrzne białko błonowe P2 lub białko fuzyjne, obejmującego: lizę transformowanych komórek E.coli, w celu uwolnienia białka P2 lub białka fuzyjnego, w postaci nierozpuszczalnych inkluzji; przemycie inkluzji buforem, w celu usunięcia białek komórkowych E.coli·, zawieszenie i rozpuszczenie inkluzji w roztworze wodnym denaturanta; rozcieńczenie otrzymanego roztworu w detergencie; oraz oczyszczenie upłynnianego białka P2 lub białka fuzyjnego poprzez filtrację żelową, oraz przetrzymywanie produktu po filtracji żelowej w temperaturze około 4°C, w roztworze wodnym, zawierającym wysokie stężenie NaCl ijonów wapnia, do czasu ponownego uzyskania konformacji natywnej przez białko P2.

Cele i korzyści wynikające z wynalazku wynikają z przedstawionego poniżej opisu.

Figura 1. Obraz żelu poliakryloamidowego przedstawiającego kinetykę indukcji plazmidu pNV-3 (żel barwiony błękitem Coomassiego, 8-16% liniowy gradient SDS-PAGE (Novex)). Ścieżka 1 przedstawia markery wielkości: fosforylazę b (97.4 kD), BSA (66 kD), owalbuminę (45 kD), anhydrazę węglanową (31 kD), inhibitor trypsyny z soi (21.5 kD) i lizozym (14.4 kD). Ścieżki 2 i 14: 4 pg oczyszczonej poryny rHib (rekombinowanej). Ścieżki 3-13: próbki ekstraktów z E.coli, uzyskane z komórek pobranych w czasie :0,15,30,45,60,120,180,240,300,360 i 420 minut po dodaniu IPTG do hodowli. W każdym czasie pobierano 5 ml hodowli i natychmiast chłodzono do 4°C. Komórki następnie żwirowano i przechowywano w -75°C. Pełnokomórkowy ekstrakt otrzymywano poprzez dodanie 150 μΐ Tris-HCl pH 8.0, 5M mocznik, 1% SDS, 30 mM NaCl, 2.5% β-merkaptoetanol i 0.05% błękit bromofenolowy. Po ogrzaniu do wrzenia przez 5 minut, próbki rozcieńczano, w proporcji 1:10 buforem elektroforetycznym i następnie nakładano po 10 pl na żel.

Figura 2. Obraz żelu poliakryloamidowego przedstawiający kinetykę indukcji plazmidu pNV-6 (żel barwiony błękitem Coomassiego, 8-16% liniowy gradient SDS-PAGE (Novex).

Ścieżka 1 przedstawia markery wielkości: fosforylazę b (97.4 kD), BSA (66 kD), owalbuminę (45 kD), anhydrazę węglanową (31 kD), inhibitor trypsyny z soi (21.5 kD) i lizozym (14.4 kD).

Ścieżki 2 i 14: 4 pg oczyszczonej poryny rHib (rekombinowanej). Ścieżki 3-13: próbki esktra181 695 któw z E.co/z, uzyskane z komórek pobranych w czasie: 0,15,30,45,60,120,180,240,300,360 i 420 minut po dodaniu ITPG do hodowli. W każdym czasie pobierano 5 ml hodowli i natychmiast chłodzono do 4°C. Komórki zbierano przez żwirowanie i przechowywano w -75°C. Pełnokomórkowy ekstrakt przygotowywano tak, jak opisano dla figury 1.

Figury 3 i 3A. Rysunek obrazujący filtrację żelową poryny rHib. Inkluzje ekstrahowano 6M chlorowodorkiem guanidyny, a następnie dodano detergent, jak opisano to w przykładzie 6. Mieszaninę wirowano w celu usunięcia zanieczyszczającego materiału i nakładano na kolumnę o wymiarach 189x2.5cm(S-300),zrównoważoną 100mMTris-HCl, lOmMEDTA, IMNaCl i 0.0,5% 3,14-Zwittergent pH 8.0. Nakładano następnie kolejną próbkę w tym samym buforze, z 20 mM CaCl₂. Dla każdej frakcji określano gęstość optyczną przy 280 nm. Strzałki wskazują punkty elucji markerów wielkości (Sigma); 1 = niebieski dekstran (2.000 kD), 2 = dehydrogenaza alkoholowa (150 kD); 4 = BSA; 6 = cytochrom c (12.4 kD). Wstawka wykazuje semilogarytmiczną krzywą pozornej masy cząsteczkowej wobec punktu elucyjnego. Numer 3 wskazuje pozycję głównego piku poryny traktowanej jonami Ca. Numer 5 wskazuje pozycję głównego piku nietraktowanej poryny.

Figury 4A-4C. Sekwencja DNA fragmentu i Sall-Sall pNV-l. Podkreślono miejsca restrykcyjne. Syntetyczne oligonukleotydy wykorzystywane do sekwencjonowania DNA podkreślono podwójnie. Strzałki wskazują kierunek reakcji sekwencjonowania. Strzałki skierowane w lewo obrazują sekwencjonowanie łańcucha komplementarnego do przedstawionego na rysunku. Pozostała część plazmidu jest identyczna z plazmidem pUC 18. Promotor lac położony jest w kierunku 3' od drugiego miejsca Sali.

Figury 5A-5C. Sekwencja DNA fragmentu BamHI-XhoI plazmidu pNV-2. Część wektora pET-17b, kodująca sekwencję fuzyjną oznaczona jest pogrubionymi literami. Miejsca restrykcyjne zostały podkreślone. Pozostała cześć plazmidu jest identyczna z plazmidem pET-17b.

Figury 6A-6C. Sekwencja DNA fragmentu Ndel-Xhol plazmidu pNV-3. Miejsca restrykcyjne są podkreślone. Pozostała część plazmidu jest identyczna z plazmidem pET-17b.

Figury 7A-7C. Sekwencja DNA fragmentu Ndel-BamHI plazmidu pNV-6. Miejsca restrykcyjne są podkreślone. Pozostała część plazmidu jest identyczna z plazmidem pET-1 la.

Figury 8A i 8B. Obraz żelu poliakryloamidowego (cześć A) i Westerm biot (część B) wykazujące immunogenność natywnego antyP2 z Haemophilus influenzae z rekombinowanym P2. Część A: (żel barwiony błękitem Coomasiego, liniowy gradient SDS-PAGE 8-16% (Novex). Ścieżka 1 przedstawia markery wielkości: fosforylazę b (97.4 kD), BSA (66 kD), owalbuminę (45 kD), anhydrazę węglanową (31 kD), inhibitor trypsyny z soi (21.5 kD) i lizozym (14.4 kD). Ścieżka 3:1 pg oczyszczonej poryny b zHaemophilus influenzae. Ścieżki 2,4,9,12 i 15 sączyste. Ścieżki 5> i 6 przedstawiąekstrakt z komórekEco/ż szczepu BL21 przed i po 3 godzinach indukcji z IPTG. Ścieżki 7 i 8 pokazująBL21 (pNV-3) przed i po indukcji. Ścieżki lOill pokazująBL21 (DE3) [pNV-3] przed i po indukcji. Ścieżki 13 i 14 pokazują BL21 (DE3)[pNV-6] przedipo indukcji. Próbki przed nałożeniem na żel przygotowano tak, jak opisano dla figury 1. Część B: (Western biot z żelu, z rozdzielonymi próbkami, takimi jak podano w części A). Po przeniesieniu białek na membranę nitrocelulozową (Novex), membranę blokowano mlekiem w proszku. Następnie dodano poliklonalne przeciwciało, otrzymane poprzez immunizację królików koniugowaną szczepionkę złożoną z oczyszczonego P2 i Hib szczepu A2, który to szczep jest równoważny ze szczepem Eagan oraz polisacharydu, wyizolowanego z tego samego organizmu. Dodano następnie pokryte, przeciwkrólicze IgG, sprzężone z alkaliczna fosfatazą. Prążki poryny barwiono z wykorzystaniem nitrobłękitu tetrazolinowego (Sigma), reagującego z uwolnionym fosforanem z 5-bromo-4-chloro-3-indolilofosforanu, do utworzenia soli p-toluidynowej (Sigma) (Blake et al. AnaLBiochem. 136: 175-179 (1984)).

Wynalazek dostarcza sposobu ekspresji białka błony zewnętrznej P2 z Haemophilus influenzae typu b lub jego białka fuzyjnego.

W jednym z zastosowań wynalazek dostarcza sposobu ekspresji biała błony zewnętrznej

P2 z Haemophilus influenzae typu b (hib-P2) lub jego białka fuzyjnego, w komórkach E.coli, obejmującego:

181 695

a) transformację komórekE.coli wektorek obejmującym marker selekcyjny i gen kodujący białko wybrane z grupy obejmującej:

i) dojrzałe białko P2 ii) białko fuzyjne, obejmujące dojrzałe białko P2 z przyłączonym fragmentem (pozycje aminokwasowe 1-22) genu białka kapsydu φ 10 faga T7;

gdzie wymieniony gen jest przyłączony, w sposób umożliwiający działanie, do promotora T7; i

b) rosnące transformanty E.coli w podłożu LB, zawierającym glukozę i czynnik selekcyjny, na który wrażliwe są komórki E.coli (korzystnie karbenicylina), w temperaturze około 30°C; gdzie jest syntetyzowane Hib-P2 lub białko fiizyjne, gdzie białko Hib-P2 lub białko fuzyjne eksprymowane jest z wydajnością większą niż 2% wszystkich białek E.coli w korzystnym zastosowaniu białko Hib-P2 lub białko fuzyjne eksprymowane w taki sposób stanowi około 5% wszystkich białek E.coli. W kolejnym, korzystnym zastosowaniu białko Hib-P2 lub białko fuzyjne eksperymowane w taki sposób stanowi więcej niż około 10% wszystkich białekE.coli. W następnym, korzystnym zastosowaniu białko Hib-P2 lub białko fuzyjne eksprymowane w taki sposób stanowi więcej niż około 40% wszystkich białek E.coli.

W kolejnym, korzystnym zastosowaniu, wektor obejmujący gen Hib-P2 przyłączony w sposób umożliwiający działanie do promotora T7 plazmidu ekspresyjnego pET-17b, pEt-11 a, pET-24a-d(+) lub pET-9a, wszystkie plazmidy dostępne handlowo w firmie Novagen (565 Science Drv, Madison, WI 53711, USA). Plazmidy pET-17b, pET-9a i pET-24-a-d(+) obejmują sekwencję promotora T7, miejsce wiązania rybosomów, miejsca restrykcyjne umożliwiające insercję genu strukturalnego i sekwencję terminacyjnąT7. Ponadto plazmid pET-11 a posiada operator lac przyłączony do promotora T7 oraz kopię genu lacl. Zastosowane w wynalazku konstrukty sąróżne od konstruktów wykorzystanych przez Munsona Jr R., i Tolana Jr R.W. Infections and Immunity 57: 88-94 (01.1989), i umożliwiająnieoczekiwanie wydajną syntezę białka P2 i białaka fuzyjnego.

Stransformowane komórki E.coli rosną w podłożu zawierającym czynnik selekcyjny, np. dowolny β-laktam, na który wrażl iwe są komórki E. coli, taki j ak karbenicylina. Wektor ekspresyjny pET dostarcza markera selekcyjnego, nadającego transformantom odporność na antybiotyk.

Według wynalazku cześć 3'genu P2, zawierająca sekwencję terminacyjnąP2, zostaje usunięta. Skonstruowany fragment kończy się więc około 40 przed kodonem stop.

W wynalazku można zastosować dowolny szczep E.coli, kodujący polimerazę T7. W korzystnym zastosowaniu jest to szczep E.coli BL21 (DE3) ΔοιηρΑ. Wymienione wyżej plazmidy można wykorzystać do transformacji tego szczepu lub szczepu dzikiego BL21 (DE3). Szczep BL21 (DE3) ńompA jest lizogenem faga λ DE3, zawierającym gen polimerazy T7 RNA, znajdujący się pod kontrolą indukowalnego promotora lacUV5. E.coli szczep BL21 (DE3) ńompA jest szczepem korzystnym, ponieważ nie syntezuje białka OmpA, które mogłoby zanieczyszczać oczyszczone białko poryny i dawać niepożądane, uboczne efekty immunogenne. Transformowany szczep E.coli według wynalazku można hodować i indukować w podłożu LB, zawierającym glukozę i karbenicylinę, w temperaturze około 30°C i przy niskim napowietrzaniu (około 150 rpm). W tych warunkach otrzymuje się wysoki poziom ekspresji P2.

Długotrwała, wydajna ekspresja P2 może być toksyczna dla komórek E. co li. Najwyższy poziom ekspresji Hib-P2, o którym donoszono wynosi mniej niż 2% całkowitych białek komórkowych (MunsonJrR., iTolanJr. R.W. Infections and Immunity 57:88-94 (01.1989). Nieoczekiwanie, wynalazek umożliwia ekspresję białka Hib-P2 i białka fuzyjnego, w komórkach E. coli z wydajnością około 35-50%, jak wynika z pomiarów densytometrycznych żelu SDS-PAGE, barwionego błękitem Coomassiego.

W kolejnym, korzystnym zastosowaniu wynalazek dostarcza szczepionki obejmującej białko błony zewnętrznej P2 z Haemophilus influenzae typu b (Hib-P2) lub jego białka fuzyjnego, przygotowanego sposobami podanymi powyżej, wraz z farmaceutycznie użytecznym rozcieńczalnikiem lub wypełniaczem, gdzie szczepionkę można podawać w ilościach efektywnych dla powstawania przeciwciał ochronnych w zwierzęciu, skierowanych przeciw Haemophilus in181 695 fluenzae typu b. W korzystnym zastosowaniu zwierzę wybrane jest z grupy obejmującej: istoty ludzkie, cielęta, świnie, owce lub kurczaki. W kolejnym, korzystnym zastosowaniu zwierzęciem jest istota ludzka.

W kolejnym, korzystnym zastosowaniu wynalazek dostarcza opisanej powyżej szczepionki, gdzie białko błony zewnętrznej P2 lub białko fuzyjne jest skoniugowane z polisacharydem otoczkowym Haemophilus (CP). Haemophilus CP można przygotować lub zsyntezować tak, jak opisano przez: Schneersona et al. J.Exp.Med. 152: 361-376 (1980); Marburga et al. J.Am.Chem.Soc. 108:5282(1986); Jenningsaetal. J.Immunol. 127:1011-1018(1981)iBeuvery etal. Infct. Immunol. 40:39-45 (1983); treść jest w pełni określona przez podanie odnośników.

W kolejnym, korzystnym zastosowaniu wynalazek dostarcza sposobu przygotowania koniugatu polisacharydu, obejmującego: uzyskanie przedstawionego powyżej białka zewnętrznej błony P2 lub białka fuzyjnego; uzyskanie CP lubjego fragmentu z komórek Haemophilus!', i przyłączenie białka błony zewnętrznej P2 lub białka fuzyjnego do CP lub fragmentu CP.

Koniugaty według wynalazku mogąbyć utworzone poprzez reakcję redukcyjną grup końcowych fragmentu CP z pierwotnymi grupami aminowymi poryny, w reakcji redukcyjnej aminacji. Grupy redukcyjne mogą zostać utworzone poprzez selektywną hydrolizę lub poprzez specyficzne, oksydacyjne rozszczepienie, lub poprzez kombinację obu sposobów. Korzystnie CP koniugowany jest z białkiem poryny metodą Jenningsa et al. US Patent No 4,356,170 - treść której jest włączona do wynalazku poprzez ten odnośnik - obejmujący kontrolowaną oksydację CP za pomocą nadjodanu, a następnie redukcyjną aminację z białkiem poryny.

Szczepionka według wynalazku obejmuje białko Hib-P2, białko fuzyjne lub szczepionkę skoniugowanąw efektywnej ilości, zależnej od sposobu podawania. Jakkolwiek korzystne są zarówno wstrzyknięcia podskórne i domięśniowe, to Hib-P2, białko fuzyjne lub szczepionka mogą być podawane dożylnie lub dootrzewnowo. Dla specjalistów jest oczywistym, że ilości które należy podawać w konkretnych przypadkach, można łatwo ustalić, bez konieczności przeprowadzania niepotrzebnych doświadczeń. Użyteczne ilości mieszczą się w granicach od 2 do 100 mikrogramów białka na kilogram masy ciała.

Szczepionka według wynalazku może być wytwarzana w postaci kapsułek, roztworu płynnego, zawiesiny lub eliksiru do podawania doustnego, lub w postaci sterylnego płynu, takiego jak roztwór lub zawiesina. Dowolny, obojętny nośnik jest nośnikiem korzystnym, na przykład roztwór fizjologiczny, bufor fosforanowy, lub dowolny nośnik w którym białko Hib-P2, białko fuzyjne lub szczepionka skoniugowana posiada użyteczną rozpuszczalność. Szczepionka może mieć postać preparatu podawanego w jednej dawce lub w postaci flakonu wielodawkowego, użytecznego w masowych szczepionkach. Patrz: Remington's Pharmaceuticals Sciences, Mack Publ. Co., Easton PA, Osol (Eds.) (1980), oraz New Trends and Developments in Vaccines, Voller et al. (Eds.) Uni v. Park Press, Baltimore, MD (1978)- gdzie podane są konkretne sposoby przygotowania i stosowania szczepionek.

Białko Hib-P2 lub szczepionka skoniugowana według wynalazku może ponadto obejmować adjuwanty, wzmagające produkcję przeciwciał P2. Takie adiuwanty obejmują, nie ograniczając zakresu wynalazku, różnorodne receptory olejowe, takie jak pełny adiuwant Freunda (CFA), dipeptydy znane jako MDP, saponiny, wodorotlenek glinu czy cytokiny limfatyczne.

Adiuwant Freunda stanowi emulsję oleju mineralnego w wodzie, zmieszaną z substancją immunogenną. Jakkolwiek adjuwant Freunda jest skuteczny, nie stosuje się go zazwyczaj u ludzi. Stosuje się natomiast wodorotlenek glinu. Białko Hib-P2, białko fuzyjne lub szczepionka skoniugowana mogąbyć zaadsorbowane na wodorotlenku glinu, z którego uwalniane sąpowoli po wstrzyknięciu. Białko Hib-P2, białko fuzyjne lub szczepionka skoniugowana mogąbyć również zamknięte w liposomach, według Fullertona US Patent 4,235,877.

W kolejnym korzystnym zastosowaniu, wynalazek dostarcza sposobu zapobiegania bakteryjnemu zapaleniu opon u zwierząt, obejmującego podanie zwierzęciu białka Hib-P2 lub szczepionki skoniugowanej, wytworzonej według przedstawionych sposobów, w ilościach wystarczających do zapobiegania bakteryjnemu zapaleniu opon.

181 695

W kolejnym zastosowaniu wynalazek dostarcza sposobu oczyszczania powyżej opisanego białka P2 błony zewnętrznej lub białka fuzyjnego, obejmującego: lizę stransformowanych komórek E.coli w celu uwolnienia białka P2 lub białka fuzyjnego w postaci nierozpuszczalnych inkluzji; przemycie inkluzji buforem, w celu usunięcia białek komórkowych E.coli', zawieszenie i rozpuszczenie inkluzji w roztworze wodnym denaturanta; rozcieńczenie otrzymanego roztworu w detergencie; oraz oczyszczenie upłynnionego białka P2 lub białka fuzyjnego poprzez filtrację żelową w nieobecności denaturanta.

Etap lizy można przeprowadzić dobrze znanymi metodami, np. poprzez sonikację, trawienie enzymatyczne, szok osmotyczny lub w prasie mikroporowej.

Inkluzje można przemyć dowolnym buforem, zdolnym upłynnić białka komórkowe E.coli, bez upłynniania inkluzji obejmujących białko P2 lub białko fuzyjne. Bufory takie obejmują, lecz nie są ograniczone do: buforu TEN (50mMTrisHCl, 1 mMEDTA, 100mMNaCl,pH 8.0). Stosować można również inne bufory: Bicynę, Tricynę, HEPES.

Denaturanty, możliwe do zastosowania według wynalazku, obejmują2-8 M mocznik, 2-6 M chlorowodorek guanidyny, korzystniej 4-8 M mocznika lub 4-6 M chlorowodorek guanidyny, najkorzystniej 8 M mocznik, 6 M chlorowodorek guanidyny.

Przykłady detergentów, które można zastosować do rozcieńczania upłynnionego białka P2 lub białka fuzyjnego obejmują, lecz nie są ograniczone do: SDS, Cetavlon (Aldrich); detergentów niejonowych, takich jak Tween, Triton XI00 oraz glukozyd oktylu; i detergentów obojnaczych, takich jak 3,14 - Zwittergent i Chaps.

Upłynnione białko P2 lub białko fuzyjne oczyszczone być może metodą filtracji żelowej, w celu oddzielenia od wysoko i niskocząsteczkowych zanieczyszczeń. Można wymienić następujące typy materiałów filtracyjnych (nie ograniczając zakresu wynalazku): Sephacryl-300, Sepharose CL-6B i Bio Gel A-1.5m. Elucja następuje za pomocą buforu wykorzystywanego do rozcieńczania upłynnionego białka. Frakcje zawierające białko P2 lub białko fuzyjne można identyfikować metodą elektroforezy żelowej, frakcje można następnie łączyć, dializować i zagęszczać.

Ostatecznie, zasadniczo czyste (> 95%) białko P2 lub białko fuzyjne uzyskać można poprzez chromatografię skoncentrowanych frakcji na kolumnie Fast Flow Sepharose High Performance (Pharmacia).

W kolejnym zastosowaniu wynalazek dostarcza sposobu ekspresji Hib-P2 w drożdżowy systemie ekspresyjnym (Sreekrishna et al. J.Basic Microbiol. 28: 265-278 (1988) i systemie archebakteryjnym (Biaseio i Pfeifer PNAS 87: 6772-6776 (1990); Cline et al. J.Bacteriol. 171: 4987-4991 (1989). Klonowanie genu kodującego białko P2 lub genu fuzyjnego w wektorze ekspresyjnym można przeprowadzić metodamiu standardowymi, obejmującymi ligację na końcu tępe lub lepkie, trawienie enzymami restrykcyjnymi w celu otrzymania odpowiednich końców, ewentualne uzupełnianie końców lepkich, traktowanie fosfatazę alkaliczną w celu uniknięcia niepożądanego łączenia się końców oraz ligację za pomocą użytecznych ligaz. Patrz Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manuał, 2ed ed. CSH, NY, CSH Lab. Press (1989) - dla przedstawienia ogólnych sposobów klonowania.

Białko Hib-P2 i białko fuzyjne eksprymowane według wynalazku musi być następnie odpowiednio pofałdowane, w celu uzyskania właściwej struktury przestrzennej odpowiadającej immunologicznie konformacji białka natywnego. W kolejnym zastosowaniu wynalazek dostarcza sposobu nadawania właściwej konformacji opisanemu powyżej białku P2 lub białku fuzyjnemu, obejmującego: lizę transformowanych komórek E.coli, w celu uwolnienia białka P2 lub białka fuzyjnego, w postaci nierozpuszczalnych inkluzji;; przemycie inkluzji buforem, w celu usunięcia białek komórkowych E.coli', zawieszenie i rozpuszczenie inkluzji w roztworze wodnym denaturanta; rozpuszczenie i zawieszenie białka błony zewnętrznej P2 w wysokiej soli (korzystnie 2-8 mocznik lub około 2-6 M chlorowodorek guanidyny, korzystniej 4-8 M mocznik lub około 4-6 M chlorowodorek guanidyny, najkorzystniej około 8 M mocznik lub około 6 M chlorowodorek guanidyny); rozcieńczenie otrzymanego roztworu w detergencie (korzystnie Zwittergent, SDS lub Tween-20; oczyszczenie upłynnionego białka P2 lub białka fuzyjnego poprzez

181 695 filtrację żelową, oraz przetrzymywanie produktu po filtracji żelowej w temperaturze około 1-15°C (korzystnie 4°C), do czasu przyjęcia przez białko P2 właściwej konformacji (korzystnie 1-10 tygodni; korzystniej 3 tygodnie).

Na etapie filtracji żelowej usuwa się zanieczyszczenia nisko i wysokocząsteczkowe oraz oddziela się poryny mono- i trimeryczne.

Po filtracji żelowej, w celu utrzymania poryny w roztworze niezbędne jest wstępne zastosowanie wysokiej soli (1-4 M NaCl). Jony Ca (korzystnie ImM - IM CaCl₂; korzystniej około 20 mM CaCl₂) lecz nie jony Mg, konieczne są do wydajnej agregacji poryny rHib. Na tym etapie, gdy poryna Hib jest trimeryczna, konformacja jej nie jest konformacją natywną ponieważ gdy sól zostaje usunięta z roztworu, poryna precypituje. Nie następuje to w przypadku poryny Hib typu dzikiego. Jednakże gdy poryna przetrzymywana jest w temperaturze 4°C, następuje powolne przekształcenie konformacyjne, co pozwala usunąć sól z roztworu, bez niebezpieczeństwa precypitacji poryny.

Białko na tym etapie jest w około 80-90% czyste, jak można wnosić z rozdziału białka na żelu SDS-PAGE, barwionym następnie błękitem Coomassiego. Materiał jest następnie nanoszony na kolumnę z wymieniaczem jonowym i wymywany gradientem soli. Otrzymany materiał jest około 95% czystości.

W kolejnym korzystnym zastosowaniu wynalazek dostarcza zasadniczo czystego, o właściwej konformacji, białka błony zewnętrznej P2 z Haemophilus influenzae typu b (Hib-P2), otrzymanego sposobami podanymi powyżej. Zasadniczo czyste białko jest białkiem zasadniczo pozbawionym obecności innych komórkowych składników Haemophilus influenzae, o czym świadczą wyniki elektroforezy. Białko takie, zasadniczo czyste, wykazuje czystość większą niż 95%, co zmierzono metodą densytomerycznej analizy żelu SDS-PAGE.

Wynalazek jest dokładniej przedstawiony w poniższych, nie ograniczających, przykładach.

Przykład 1

Klonowanie białka błony zewnętrznej P2 z Haemophilus influenzae typu b.

Całkowity genomowy DNA wyizolowano z 0,5 g Haemophilus influenzae typu b, szczepu Eagan, stosując znane metody (Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manuał, 2ed ed. CSH, NY, CSH Lab. Press (1989). DNA to stosowano jako matrycę w reakcji PCR z dwiema, specyficznymi dla genu P2, starterami. Stosowano standardowe warunki reakcji PCR (US Pat. No 4,683,195; US Pat.No 4,683,202; Saiki et al. Science 230:1350-1354 (1985); Innis et al. PCR Protocols: A guide to methods and applications. Academic Press, Inc. San Diego, CA (1990), treść odnośników jest w pełni włączona przez ich przywołanie w tym miejscu.

Starter specyficzny do końca 5' genu P2, jest komplementarny do sekwencji położonej 40 pz przed kodonem startu translacji (ATG) i posiada sekwencję (Sek.Id.Nr 1):

5'-TTCTGGCGAGTCGACAATTCTATTGG-3'

Starter specyficzny do końca 3' genu P2, jest komplementarny do sekwencji położonej 300 pz za kodonem stop i posiada sekwencję (Sek.Id.Nr 2):

5'-AACCTTTATCGTCGACGAGCAATTGG-3'

Oba stertery posiadają miejsce rozpoznawane przez enzym Sali, co ułatwia klonowanie otrzymanych produktów PCR.

Po amplifikacji otrzymany produkt wyizolowano poprzez elektroforezę na 0.8% żelu agarozowym. Na żelu widoczny był jeden prążek, o wielkości 1.4 kpz. DNA oczyszczono i strawiono trzema enzymami (EcoRI, Dral i Pvul), otrzymując prążki o spodziewanej wielkości. Następnie fragment 1.4 kpz strawiono enzymem Sali i zligowano ze strawionym enzymem Sali plazmidem pUC18 (Yanish-Perronn et al., Gene 33: 103-119 (1985), stosując ligazę T4.

Mieszaniną ligacyjną transformowano następnie kompetentne komórki E.coli szczepu

DH5 la(Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manuał, 2ed ed. CSH, NY, CSH Lab.

Press (1989). Otrzymane kolonie izolowano i analizowano metodą miniprepów. Otrzymany w ten sposób DNA analizowano trawiąc enzymem Sali i otrzymując dwa prążki: wektora, o wielkości 2.7 kpz i wstawki, o wielkości 1.4 kpz.

181 695

Ligacja, prowadząca do uzyskania plazmidu pNV-1, nie była ligację kierunkową. Oznacza to, że wstawka obecna była w plazmidzie w obu orientacjach. W celu określenia orientacji wstawki plazmid trawiono dwoma enzymami: Mlul i Narl. Wielkość otrzymanych fragmentów wskazywała czy wstawka zorientowana była w tym samym kierunku, co promotor lac, czy w przeciwnym. Przetestowano kilkanaście izolatów plazmidowych i we wszystkich wstawka znajdowała się w orientacji przeciwnej do orientacji przeciwnej do orientacji promotora lac. Wskazuje to, iż wstawki zligowane w orientacji takiej, jak orientacja promotora lac tracone były podczas hodowli transformantów. Sugeruje to, iż ekspresja rHib P2 w komórkach E.coli jest dla nich toksyczna. Do podobnych konkluzji doszła wcześniej grupa Munsona i grupa Hansena (Munson i Tolan Infect. Immunity 57:88-94 (1989). Hansen et al Infect. Immun. 56: 2709-2716 (1989)).

Klony zawierające fragment o wielkości 1.4 kpz wybrano następnie do sekwencjonowania DNA. Jeden z klonów, oznaczony pNV-1, zsekwencjonowano w obu kierunkach, stosując metodę Sangera (Sanger et al. PNAS 74: 5463 (1977)). Plazmid pNV-l posiadał sekwencję identyczną z wcześniej opublikowaną sekwencją genu Hib, szczepu Minn A (Munson Jr R., Tolan Jr. W.R. Infect. Immun. 57: 88-94 (01.1989)).

Techniki zastosowane w wymienionych doświadczeniach znaleźć można w: Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manuał, 2ed ed. CSH, NY, CSH Lab. Press (1989) i Ausbel et al. Curr. Protoc. Mol. Biol. vol. 1,2 Wiley-Liss NY (1992), treść tych odnośników jest w pełni włączona przez ich przywołanie w tym miejscu.

Przykład 2

Konstrukcja wektorów ekspresyjnych, zawierających gen białka błony zewnętrznej P2.

Wektor ekspresyjny pET-17b (Novagen pET System Manuał) użyto do ekspresj i P2. Plazmid oparty jest na promotorze genu φ 10 faga T7. Promotor ten nie jest rozpoznawany przez DNA zależnąRNA polimerazę E.coli, a zatem nie powoduje ekspresji znaczących poziomów poryny, w nieobecności polimerazy RNA faga T7. Szczep BL21 (DE3) jest lizogenem faga λ, kodującym wspomnianą polimerazę pod kontrolą promotora lacUV5. Przygotowano dwa typy rekombinowanych białek P2 wykorzystując wektor ekspresyjny pET-17b. Jeden zawierał dojrzałe białko P2, z metioninąna końcu N. Drugi, białko fuzyjne („fusion-P2”) obejmujący dojrzałe białko P2 z dołączonymi 22 aminokwasami z genu 10 faga T7 na końcu N, będący pochodną wektora pET-17b.

W celu sklonowania P2 do pET-17b, zmodyfikowano metodą PCR wyjściowy gen P2 (w wektorze pVN-l). W celu skonstruowania dojrzałego P2, zaprojektowano oligonukleotyd (starter) umożliwiający wklonowanie dojrzałej poryny w miejsce Ndel pET-17b. Oligonukleotyd ten miał następującą sekwencję: Sek.Id.Nr 3

5' GCTTCAGCAGCACATATGGCTGTTGTTTATAACAACGAAGGGAC-3'

W celu skonstruowania fuzyjnego białka P2 zaprojektowano oligonukleotyd, umożliwiający klonowanie dojrzałej poryny w miejsce BamHI pER-17b, dając gen fuzyjny przyłączony do genu 10, kodującego główne białko kapsydu faga T7. Oligonukleotyd ten miał następującą sekwencję: Sek.Id.Nr 4

5'GCAGCTTCGCAGCGGATCCAGCTGTTGTTTATAACAACGAAGGG-3'

Sekwencja na 3' końcu została wyeliminowana poprzez wprowadzenie miejsca Xhol, około 40 pz od kodonu stop. Zaprojektowano oligonukleotyd zawierający miejsce Xhol, co pozwoliło na klonowanie w tak utworzonym miejscu Xhol, w wektorze pET-17b. Oligonukleotyd ten miał następującą sekwecję: Sek.Id.Nr 5

5'-GCAAAAAAAGCGAATATCTCGAGTCGCCTTGCTTT-3'

W celu utworzenia 1.1 kpz fragmentu DNA z pełnej frekwencji P2 (pNV-1) zastosowano metodę PCR z 5' oligonukleotydem, zawierającym miejsce Ndel i 3' oligonukleotydem wprowadzającym miejsce Xhol. Fragment następnie strawiono Ndel i Xhol, oczyszczono i zligowano z wektorem pET-17b, linearyzowanym Ndel i Xhol. Otrzymano konstrukt zawierający sekwencję dojrzałego P2 (pNV-3 lub Ν-Χ).

181 695

W podobny sposób utworzono 1.1 kpz fragment z pełnej długości pNV-1, z 5' oligonukleotydem wprowadzającym miejsce BamHI i 3' oligonukleotydem wprowadzającym miejsce Xhol. Fragment ten strawiono BamHI i Xhol, oczyszczono i zligowano z wektorem pET-Ι 7b, strawionym BamHI-XhoI. Otrzymano w ten sposób konstrukt fuzyjny P2 (pNV-2 lub B-Χ). Oboma konstruktami (pNV-3 i pNV-2) transformowano komórki E.coli szczepu DH5a, nie zawierające polimerazy T7 Plazmidowe DNA izolowano z wielu transformantów DH5a. Sekwencjonowano oba rodzaje konstruktów, z obu końców, by upewnić się że sekwencje złączy się w należytym porządku.

Figura 1 pokazuje kinetykę indukcji IPTG komórek E.coli szczepu DH5a(DE3) [pNV-3]. Należy zwrócić uwagę, iż przed dodaniem inkuktora obserwuje się znaczące poziomy poryny. Wynika to z prostego faktu, iż promotor lacUV5 nie jest w pełni zahamowany. Poziom poryny wzrasta po indukcji gwałtownie i osiąga maksimum po około 3 godzinach.

Poryna ulegająca ekspresji w komórkach szczepu BL21 (DE3) jest nadal toksyczna. Dalszego ze stransformowanym szczepem należy obchodzić się ostrożnie (przechowywać zamrożonym, w czasie między doświadczeniami; indukować w 30°C) ponieważ możliwe jest wystąpienie spontanicznych delecji lub innych mutacji, unieczynniających białko poryny.

Przykład 3

Konstruowanie plazmidu pNV-6

Plazmid pET-1 la (Novagen pET System Mnual) zawiera takie same sygnały ekspresyjne, co pET-17b. Plazmid ten zawiera ponadto operator lac przylegający do promotora genu 010 faga T7. Dzięki temu promotor T7 znajduje się pod kontroląrepresora lac. Plazmid pET-Ι la zawiera ponadto dodatkową kopię genu lacl, kodującego represor lac. Dzięki temu podstawowy poziom ekspresji poryny, znajdującej się w takim systemie regulacyjnym, jest znacznie niższy.

Plazmid pET-11 a zawiera mniej użytecznych miej sc restrykcyjnych, w porównaniu z pRTl 7b. Obejmuje miejsce Ndel, położone w tym samym miejscu, co wpETl 7b, co umożliwia zastosowanie oligonukleotydu o Sek.Id.Nr3, do powielania genu P2, od strony 5'. Wektor ten nie posiada jednak miejsca Xhol. Zamiast tego możliwe jest wprowadzenie w obecne w nim miejsce BamHI, za pomocą oligonukleotydu o Sek.Id.Nr 6:

5'AAAAAAAGCGAATCTTTGGATCCGCCTTGCTTTTAATAATG-3'

W celu otrzymania fragmentu o wielkości 1,1 kpz zastosowano technikę PCR, powielając plazmid pNV-l (pełnej długości gen P2) z zastosowaniem oligonukleotydów 3 i 6. Otrzymany fragment strawiono Ndel i BamHI, oczyszczono i zligowano z plazmidem pETl 1 a, strawionym uprzednio Ndel i BamHI. W rezultacie otrzymano konstrukt zawierający dojrzały gen P2 (pNV-6). Sekwencjonowano oba rodzaje konstruktów, z obu końców, by upewnić się że sekwencje złączy się z należytym porządku.

Figura 2 pokazuje kinetykę indukcji komórekE.coli szczepu DH 5a(DE3) [pNV-6]. Należy zwrócić uwagę, iż przed dodaniem induktora obserwuje się znacznie niższe poziomy poryny niż te, obserwowane w przypadku plazmidu pNV-3. Poziom poryny wzrasta po unkucji nieco wolniej, w porównaniu z pNV-3, lecz po około 3 godzinach osiąga poziom porównywalny z pNV-3. Niższe poziomy ekspresji nieindukowanego pNV-3 oznaczają iż toksyczność plazmidu pNV-6 jest niższa, a on sam jest bardziej stabilny.

Przykład 4

Konstrukcja szczepu ekspresyjnego BL21 (DE3) AompA

Szczep E.coli DEM558 (z kolekcji S.Bensona; Silhavy TJ et al. „Experiments with gene fusion” CSH Laboratory, CSH NY (1984), BRE51 (Bremer E et al. FEMS Microbiol. Lett.

33:173-178 (1986) i BL21 (DE3) hodowano na szalkach agarowych, w temperaturze 37°C.

Transdukcja PI: Lizat P1 _vir szczepu DEM588 E coli wykorzystano do transdukcji markera oporności na tetracyklinę do szczepu BRE51 (Bremer E et al. FEMS Microbiol. Lett. 33:173-178 (1986)), który ma wydeletowany cały gen ompA (Silhavy TJ et al. „Experiments with gene

181 695 fusions” CSH Laboratory, CSH NY (1984)). Szczep DME558 zawierający marker oporności na tetracyklinę, położony w pobliżu genu ompA, hodowano w pobliżu LB do gęstości OD 9600 nm)=0.6. Następnie pobrano 1/10 ml 0.5 M chlorku wapnia i dodano do 10 ml hodowli i 0.1 ml roztworu zawierającego 1 x 10⁹ pfu Pl_vir Hodowlę inkubowano przez 3 godziny w 37°C. Po tym czasie obserwowano znaczące obniżenie gęstości komórek. Dodano następnie 1/2 ml chloroformu i przechowywano kulturę faga w 4°C. Ponieważ typowo 1 -2% chromosomu E coli można upakować w każdym fagu, otrzymaną ilość fagów pokrywa cały chromosom bakteryjny, obejmujący też marker oporności na tetracyklinę, położony w pobliżu genu ompA.

Następnie szczep BRE51, nie posiadający genu ompA, hodowano w podłożu LB, w temperaturze 37°C. Nocną hodowlę rozcieńczono 1:50 świeżym podłożem LB i hodowano przez 2 godziny. Komórki następnie żwirowano i zawieszono w solacji MS. 1/10 ml zawiesiny komórek bakteryjnych zmieszano z 0.05 ml lizatu fagowego opisanego powyżej i inkubowano przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodano równą objętość 1M cytrynianu sodu i komórki wysiano na płytki LB, uzupełnione 12.5 pg/ml tetracykliną. Płytki inkubowano przez noc w 37°C. Tetracyklinoopome transduktanty (12 pg/ml) przeszukiwano pod kątem braku ekspresji białka OmpA, stosując metodę SDS-PAGE i Western blotting, jak opisano to poniżej. Bakterie oporne na antybiotyk posiadały gen oporności na tetracyklinę zintegrowany z chromosomem bardzo blisko miejsca genu ompA, który był wydeletowany w tym szczepie. Jeden ze szczepów oznaczono skrótem BRE-T^R.

Drugą rundę produkcji fagów przeprowadzono stosując szczep BRE-T^r, stosując tę samą co poprzednio metodę. Fagi reprezentujące te populację, posiadały zarówno gen oporności na tetracyklinę, jak delecję genu ompA. Fagi te zebrano i zachowano. Fagi te używano następnie do infekowania E.coli BL21 (DE3). Po infekcji bakterie zawierały gen tetracyklinooporności. Ponadto było wysoce prawdopodobne, że delecja ompA zostanie wyselekcjonowana wraz z cechą tetracyklinooporności, na szalkach LB z tetracykliną.

Kolonie bakterii rosnące na szalkach, hodowano osobno w podłożu LB i testowano na obecność białko OmpA. Z wybranych do przebadania kolonii, wszystkie nie wytwarzały białka OmpA, co sprawdzono stosując SDS-PAGE i western blotting.

SDS-PAGE jest odmianą techniki Laemmliego (Laemmli UK, Naturę 227: 680-685 (1970), opisaną uprzednio (Blake, Gotschlisch J.Exp.Med. 159: 452-462 (1984). Przeniesienie białek rozdzielonych w elektroforezie na membranę ImmunobilonP (Millipore Corp., Bedford MA, USA) dokonano według metody Towbina i wsp. (Towbin H et al. PNAS 76: 4350-4354 (1979)), z modyfikacją polegającą na przemyciu membrany na początku, w metanolu. Bioty przeszukiwano odczynnikiem sprzężonym z fosfatazą (Blake MS et al. Anal. Biochem. 136: 175-17(1984)).

Przykład 5

Ekspresja białka błony zewnętrznej P2

Konstrukty zawierające zarówno dojrzałe P2, jak białko fuzyjne P2 zastosowano do transformowania szczepu ekspresyjnego BL21 (DE3) AompA. Szalki z transformantami hodowano w 30°C. Kolonie obu typów izolowano z płytek i analizowano. Okazało się, że zasadniczo wszystkie transformanty zawierały pożądany plazmid.

Analizowano różne klony fuzyjne i dojrzałe genu P2, pod względem charakterystyki ekspresji białka. Kolonie indukowano i hodowano w podłożu LB, zawierającym 0.4% glukozę 1118 μΜ karbenicylinę (zamiast ampicyliny), z napowietrzaniem (100-150 rpm), w 30°C. Ekspresję P2 analizowano w 0.1 ml kultury, rozdzielając elektroforetycznie całkowite białka E.coli w 8-16% gradientowym żeli PAGE z SDS (patrz figury 1 i 2).

Przykład 6

Oczyszczanie i nadawanie właściwej konformacji białku błony zewnętrznej P2.

181 695

Szczep E.coli BL21 (DE3) ΔοιηρΑ [pNV-3] hodowano do środkowej fazy logarytmicznej (OD = 0.6 przy 600 nm) w podłożu LB. Następnie dodano ITPG (końcowe stężenie 0.4 mM) i komórki hodowano przez kolejne 3 godziny w 30°C. Komórki następnie żwirowano i przemyto kilkoma objętościami buforu TEN (50mM Tris-Hcl, 0.2 M NaCl, 10 mM EDTA pH 8.0) i zamrożono w -75°C.

W celu oczyszczenia białka, około 3 g komórek rozmrożono i zawieszono w 9 ml buforu TEN. Dodano następnie lizozym (Sigma, 0.25 mg/ml), deoksycholan (Sigma, 1.3 mg/ml) i PMSF (Sigma, 10 pg/ml), a mieszaninę łagodnie strząsano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. W tym czasie komórki lizowały i uwalniały DNA, tak że roztwór stał się bardzo lepki. Dodano następnie DNazę (Sigma, 2 5 pg/ml) i roztwór mieszano przez dodatkowągodzinę w temperaturze pokojowej. Mieszaninę następnie odwirowano przy 15 krpm w rotorze SA-600 przez 30 minut a supematant odrzucono. Pelet zawieszono dwa razy w 10 ml TEN, a supematant odrzucano. Następnie pelet zawieszono w 10 ml 8M mocznika (Pierce) w buforze TEN. Alternatywnie, pelet zawieszano w 10 ml 6M chlorowodorku guanidyny (Sigma) w buforze TEN. Mieszaninę łagodnie mieszano, rozbijając strąki. Zawiesinę sonikowano następnie przez 20 minut lub do czasu osiągnięcia jednorodnej zawiesiny. Następnie dodawano 10 ml 10% roztworu wodnego 3,14-zwittergentu i roztwór dokładnie mieszano. Roztwór następnie sonikowano przez 10 minut. Pozostały nierozpuszczalny materiał usuwano przez wirowanie.

Mieszaninę nakładano następnie na 180 x 2.5 cm z Sephacrylem 300 (Pharmacia), zrównoważoną 100 mM Tris-HCI, lOmMEDTA, IMNaCl i 0.05% 3,14-ZwittergentpH 8.0. Utrzymywano przepływ na poziomie 1 ml/minutę. Zbierano frakcje po 10 ml. W czasie filtracji poryna tworzyła trimery. Mierzono OD_{280 nm} dla każdej frakcji, a frakcje zawierające białko poddawano elektroforezie SDS-PAGE. Frakcje zawierające porynę zbierano i przechowywano w 4°C przez okres 3 tygodni. W czasie inkubacji w tej temperaturze następowała powolna zmiana konformacyjna poryny. Konieczne było by roztwór w czasie tej przemiany nie zawierał wysokiego stężenia soli. Dlatego zebrane i połączone frakcje dializowano wobec 50 mM Tris-HCI, 200 mM NaCl, 10 mM EDTA i 0.05% 3,14-zwittergentu pH 8.0. Materiał nakładano następnie na kolumnę 2.5 cm Fast Flow Q (Pharmacia), zrównoważona tym samym buforem. Niezwiązane białka wymywane były buforem początkowym. Stosowano liniowy gradient NaCl (0.2 - 2.0 M) do elucji. Poryna ulegała elucji mniej więcej w środku gradientu. Frakcje analizowano elektroforetycznie (SDS-PAGE). Najczystsze frakcje zbierano i dializowano wobec buforu TEN, zawierającego 3,14-zwittergent.

Przykład 7

Sprzęganie oksydowanego polisacharydu otoczkowego Hib z natywnym białkiem P2 z Haemophilus influenzae

Oksydowany polisacharyd otoczkowy Hib (10.4 mg) dodano do natywnego białka Hib P2 (3.1 mg) oczyszczonego metodąMunsona et al. J.Clin. Invest. 72: 677-684 (1983), rozpuszczonej w 0.21 ml 0.2 M buforu fosforanowego o pH 7.5, zawierającym 5% glikozydu oktylu. Po rozpuszczeniu polisacharydu dodano do roztworu 7 mg cyjanoborowodorku sodowego i mieszaninę reakcyjną inkubowano przez 4 dni w 37°C. Następnie mieszaninę reakcyjną rozcieńczono 0,15 M roztworem NaCl, zawierającym 0.01 % timerosal i rozdzielono stosując filtrację żelową, na kolumnie z Biogel A-1.5 m (BioRad).

Koniugat (Hib-PP) uzyskano w postaci pojedynczego piku elucyjnego, lokującego w pobliżu pustej objętości kolumny. Analiza roztworu koniugatu na zawartość kwasu sialowego i białka wykazała, że koniugat zawiera 43% polisacharydu (w przeliczeniu na suchą masę). Białko P2 stanowiło 44% uzyskanego koniugatu a polisacharyd 12% uzysku. Odzysk białka w różnych eksperymentach wahał się zwykle w granicach 50-80%, a polisacharydu w granicach 9-13%.

181 695

Przykład 8

Badania immunogenności natywnego koniugatu Hib-PP

Badania immunogenności przeprowadzono jak następuje. Immunogenność koniugatu Hib-PP i koniugatu Hib z toksyną tężcową (Hib-TT), przygotowanym w podobnej procedurze sprzęgania, analizowano używając 7-mio tygodniowych białych królików nowozelandzkich. Konjugaty polisacharydowe (10 pg) podawano w dniach: 0, 7 i 14, a surowice zbierano w 28 dniu. Konjugaty podawano w roztworze fizjologicznym.

Testy z wykorzystaniem techniki ELISA z antygenami polisacharydowymi, podsumowano w tabeli 1. PP w tabeli 1 oznacza białko błony zewnętrznej (porynę), P2, oczyszczoną z Haemophilus influenzae typu b.

Tab. 1 Wyniki testu ELISA dla skoniugowanej szczepionki przeciw Haemophilus influenzae typu b (Hib-białko)
szczepionka	adiuwant	miano ELISA
Hib-TT	roztw.fizjologiczny	270
Hib-PP	roztw.fizjologiczny	6205
Hib-PP/PP (30 pg)	roztw.fizjologiczny	8055
Hib, oksydowany	roztw fizjologiczny	0

Analiza Western biotów zarówno z oczyszczonym, rekombinowanym P2, jak lizatami pochodzącymi z komórekE.coh eksprymujących rekombinowane białko P2, przeprowadzona z wykorzystaniem poliklonalnych przeciwciał, wytworzonych przez króliki immunizowane szczepionką skoniugowaną obejmującą polisacharyd Hib przyłączony do białka natywnego P2, wyizolowanego ze szczepu Hib A2 (równoważnego szczepowi Eagan). Przeciwciała wykorzystane w analizie Western biotów sprawdzono uprzednio techniką ELISa, że miana anty-polisacharydowe 8500 i anty-P2 60.000.

Figura 8 pokazuje rezultaty wskazujące, iż poliklonalne przeciwciała, wytworzonych przez króliki immunizowane szczepionką skoniugowaną obejmująca polisacharyd Hib przyłączony do białka natywnego P2, reagująz rekombinowanym białkiem P2 na biotach. Wskazuje to, iż natywne i rekombinowane białko P2 posiada wspólne epitopy.

Rekombinowane białko P2 oczyszczone z wysoce ekspresyjnego szczepu E.coh, przypomina natywne białko P2 oczyszczone z Haemophilus influenzae typu b, w następujących aspektach. Po pierwsze, przeciwciała skierowane przeciw natywnemu białku P2 z Haemophilus influenzae reagująz rekombinowanym białkiem P2 z systemu ekspresyjnego E.coli na western biotach, co wskazuje na istnienie wspólnych epitopów białka rekombinowanego i natywnego P2.

Po drugie, P2 jest poryną. Podobnie jak inne poryny z bakterii Gram-Ujemnych, P2 składa się z trzech identycznych łańcuchów polipeptydowych i ich natywna, trimeryczna konformacja, tworzy kanały zwilżane wodą, zależne od napięcia błonowego, położone w zewnętrznej błonie bakterii. Oczyszczone, rekombinowane białko P2 jest trimerem, jak to wykazano stosując filtrację żelową na Superose 12 (Pharmacia). Rekombinowane białko P2, wymywane z kolumny, odpowiada masie cząsteczkowej około 120 kD. Natywne białko P2 z Haemophilus influenzae i inne bakteryjne poryny, takie jak poryny klasy 2 i 3 z Neisseria meningitidis posiadają podobny profil elucyjny. Niepofałdowane białko P2 jest nierozpuszczalne i wymywane jest z kolumny w postaci monomeru. Dodanie CaCl₂ ułatwia przyjęcie właściwej, trimerycznej konformacji przez P2, jak przedstawiono to na figurze 3.

Wszystkie publikacje wymienione w wynalazku włączone są na zasadzie podania odnośnika.

Jakkolwiek wynalazek został opisany z pewnymi szczegółami, w celu jasności i lepszego zrozumienia, jasne jest dla specjalistów, że możliwe sa różne zmiany w formie i szczegółach, nie zmieniające zakresu wynalazku i dołączonych zastrzeżeń.

181 695

Zestawienie sekwencji (1) Informacje ogólne (i) Składający wniosek:

North American Vaccine, Inc.

12103 Indian Creek Court

Belteville, MD 20705

Wynalazcy:

Tai, Joseph Y.

Pulle, Jeffrey K.

Soper, Thomas S.

Liang, Shu-Mei (ii) Tytuł wynalazku: Sposób wydajnej ekspresji, oczyszczania i nadawania właściwej konformacji białku błony zewnętrznej P2 z Haemophilus influenzae typu B (iii) Liczba sekwencji: 14 (iv) Adres do korespodencji (A) Adres: Steme, Kassler, Goldstein & Fox (B) Ulica: 1100 New York Ave., Suitę 600 (C) Miasto: Washington (D) State: D.C (E) Kraj: USA (F) Kod: 20005-3934 (v) Forma zapisu komputerowego:

(A) Typ przenośnika: Dyskietka (B) Komputer: IBM PC kompatybilny (C) System operacyjny: PC-DOS/MS-DOS (D) Oprogramowanie: Patent Release #1.0, ver. #1.25 (vi) Dane dotyczące zgłoszenia (A) Numer zgłoszenia: (Do wypełnienia) (B) Data wpłynięcia: Dołączona (C) Klasyfikacja:

(vii) Dane dotyczące poprzednich zgłoszeń (A) Numer zgłoszenia: US 08/096.181 (B) Data wpłynięcia: 23.07.1993 (viii) Informacja o prawniku (A) Nazwisko: Esmond, Robert W.

(B) Numer referencyjny: 1438. 001PC01 (ix) Informacje telekomunikacyjne (A) Numer telefon: (202) 371 -2600 (B) Numer faxu: (202) 371 -2540 (2) Informacja o Sek.Id.Nr 1:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 26 pz (B) Typ: Kwas nukleinowy (C) Ilość łańcuchów: jeden

181 695 (D) Topologia cząsteczki: liniowa (xi) Opis sekwencji: Sek.Id.Nr. 1:

TTCTGGCGAG TCGACAATTC TATTGG (2) Informacja o Sek.Id.Nr 2:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 26 pz (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Ilość łańcuchów: jeden (D) Topologia cząsteczki: liniowa (xi ) Opis sekwencji: Sek.Id.Nr 2:

AACCTTTATC GTCGACGAGC AATTGG (2) Informacja o Sek.Id.Nr 3 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 44 pz (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Ilość łańcuchów: jeden (D) Topologia cząsteczki: liniowa (xi) Opis sekwencji: Sek.Id.Nr 3:

GCTTCAGCAG CACATATGGC TGTTGTTTAT AACAACGAAG GGAC (2) Informacja o Sek.Id.Nr 4 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 45 pz (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Ilość łańcuchów: jeden (D) Topologia cząsteczki: liniowa (xi) Opis sekwencji: Sek.Id.Nr 4:

GCAAGCTTCAG CAGCGGATCC AGCTGTTGTT TATAACAACG AAGGG (2) Informacja o Sek.Id.Nr 5 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 35 pz (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Ilość łańcuchów: jeden (D) Topologia cząsteczki: liniowa (xi) Opis sekwencji: Sek.Id.Nr 5:

GCAAAAAAAG CGAATCTCTC GAGTGCCCTT GCTTT (2) Informacja o Sek.Id.Nr 6 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 41 pz (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Ilość łańcuchów: jeden (D) Topologia cząsteczki: liniowa (xi) Opis sekwencji: Sek.Id.Nr 6:

AAAAAAAGCG AATCTTTGGA TCCGCCTTGC TTTTAATAAT G

181 695 (2) Informacja o Sek.Id.Nr 7 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 1477 pz (B) Typ. kwas nukleinowy (C) Ilość łańcuchów, jeden (D) Topologia cząsteczki: liniowa (ix) Cechy:

(A) Nazwa/kod: CDS (B) Położenie: 65.. 1147 (xi ) Opis sekwencji. Sek.Id Nr 7:

GTCGACAATT CTATTGGAGA AAAGTTCAAT CATAGATAGT AAACAACCAT AAGGAATACA 60

AATT ATG AAA AAA ACA CTT GCA GCA TTA ATC GTT GGT GCA TTC GCA GCT 109

Met Lys Lys Thr Leu Ala Ala Leu Ile Val Gly Ala Phe Ala Ala 15 10 15

TCA Ser

GCA GCA

AAC Asn

GCA GCT GTT

GTT Val

TAT AAC AAC GAA GGG ACT

AAC Aen 30

GTA Val

157

Ala

Ala

Ala Ala 20

Val

Tyr

Asn 25

Asn

Glu

Gly

Thr

GAA

TTA

GGT

GGT

CGT

TTA

AGC

ATT

ATC

GCA

GAA

CAA

AGT

AAT

AGC

ACT

205

Glu

Leu

Gly

Gly 35

Arg

Leu

Ser

Ile

Ile 40

Ala

Glu

Gin

Ser

Asn 45

Ser

Thr

GTA

GAT

AAT

CAA

AAA

CAG

CAA

CAC

GGT

GCA

TTA

CGC

AAT

CAA

GGT

TCA

253

Val

Αερ

Asn 50

Gin

Lys

Gin

Gin

Ηχε 55

Gly

Ala

Leu

Arg

Asn 60

Gin

Gly

Ser

CGT

TTC

CAC

ATT

AAA

GCA

ACT

CAT

AAC

TTC

GGT

GAT

GGT

TTC

TAT

GCA

301

Arg

Phe 65

His

Ile

Lys

Ala

Thr 70

His

Asn

Phe

Gly

Asp 75

Gly

Phe

Tyr

Ala

CAA

GGT

TAT

TTA

GAA

ACT

CGT

TTT

GTT

ACA

AAA

GCC

TCT

GAA

AAC

GGT

349

Gin 80

Gly

Tyr

Leu

Glu

Thr 85

Arg

Phe

Val

Thr

Lys 90

Ala

Ser

Glu

Aen

Gly 95

TCA

GAT

AAC

TTC

GGT

GAT

ATT

ACA

AGC

AAA

TAT

GCT

TAT

GTT

ACT

TTA

397

Ser

Αερ

Aen

Phe

Gly 100

Αερ

Ile

Thr

Ser

Lys 105

Tyr

Ala

Tyr

Vq1

Thr 110

Leu

GGA

AAT

AAA

GCA

TTC

GGT

GAA

GTA

AAA

CTT

GGT

CGT

GCG

AAA

ACT

ATT

445

Gly

Αεη

Lys

Ala 115

Phe

Gly

Glu

Val

Lys 120

Leu

Gly

Arg

Ala

Lys 125

Thr

Ile

GCT

GAT

GGC

ATA

ACA

AGT

GCA

GAA

GAT

AAA

GAA

TAT

GGC

GTT

CTC

AAC

493

Ala

Asp

Gly 130

Ile

Thr

Ser

Ala

Glu 135

Asp

Lys

Glu

Tyr

Gly 140

Val

Leu

Αεη

AAT

AGT

GAC

TAT

ATT

CCT

ACT

AGT

GGT

AAT

ACG

GTT

GGC

TAT

ACT

TTT

541

Asn

Ser 145

Asp

Tyr

Ile

Pro

Thr 150

Ser

Gly

Asn

Thr

Val 155

Gly

Tyr

Thr

Phe

AAA

GGT

ATT

GAT

GGT

TTA

GTA

TTA

GGC

GCT

AAT

TAT

TTA

TTA

GCA

CAA

589

Lys 160

Gly

Ile

Asp

Gly

Leu 165

Val

Leu

Gly

Ala

Asn 170

Tyr

Leu

Leu

Ala

Gin 175

AAG

CGT

GAG

GGT

GCA

AAA

GGT

GAA

AAT

AAG

CGG

CCT

AAT

GAT

AAG

GCT

637

Lys

Arg

Glu

Gly

Ala 180

Lys

Gly

Glu

Asn

Lye 185

Arg

Pro

Aen

Αερ

Lys 190

Ala

GGT

GAA

GTA

CGT

ATA

GGT

GAA

ATC

AAT

AAT

GGA

ATT

CAA

GTT

GGT

GCA

685

Gly

Glu

Val

Arg 195

Ile

Gly

Glu

Ile

Aen 200

Asn

Gly

Ile

Gin

Val 205

Gly

Ala

181 695

AAA TAT GAT GCA AAC GAC ATC GTT GCA AAA ATT GCT TAT GGT AGA ACT73 3

Lys Tyr Asp Ala Asn Asp Ile Val Ala Lys Ile Ala Tyr Gly ArgThr

210 215220

AAC JAC AAA TAT AAC GAA TCT GAC GAG CAT AAA CAG CAA TTA AAT GGT781

Asn Tyr Lys Tyr Asn Glu Ser Asp Glu His Lys Gin Gin Leu AsnGly

225 230235

GTA TTA GCA ACT TTA GGC TAT CGT TTT AGT GAT TTA GGC TTA TTA GTG829

Val Leu Ala Thr Leu Gly Tyr Arg Phe Ser Asp Leu Gly Leu LeuVal

240 245 250255

TCT CTA GAT AGT GGC TAT GCA AAA ACT AAA AAC TAT AAA ATT AAA CAC8 77

Ser Leu Asp Ser Gly Tyr Ala Lys Thr Lys Asn Tyr Lys Ile LysHis

260 265270

GAA AAA CGC TAT TTC GTA TCT CCA GGT TTC CAA TAT GAA TTA ATG GAA9 25

Glu Lys Arg Tyr Phe Val Ser Pro Gly Phe Gin Tyr Glu Leu HecGlu

275 280285

GAT ACT AAT GTC TAT GGC AAC TTC AAA TAT GAA CGC ACT TCT GTA GAT973

Aep Thr Asn Val Tyr Gly Asn Phe Lys Tyr Glu Arg Thr Ser ValAsp

290 295300

CAA GGT GAA AAA ACA CGT GAA CAA GCA GTA TTA TTC GGT GTA GAT CAT1021

Gin Gly Glu Lys Thr Arg Glu Gin Ala Val Leu Phe Gly Val AspHis

305 310315

AAA CTT CAC AAA CAA CTA TTA ACC TAT ATT GAA GGT GCT TAC GCT AGA1069

Lys Leu His Lys Gin Leu Leu Thr Tyr Ile Glu Gly Ala Tyr AlaArg

320 325 330335

ACT AGA ACA ACT GAG ACA GGT AAA GGC GTA AAA ACT GAA AAA GAA AAA1117

Thr Arg Thr Thr Glu Thr Gly Lys Gly Val Lys Thr Glu Lys GluLys

340 345350

TCA GTG GGT GTA GGT TTA CGC GTT TAC TTC TAATCATTTG TTAGAAATAC1167

Ser Val Gly Val Gly Leu Arg Val Tyr Phe 355360

ATTATTAAAA GCAAGGCGAA TCGAAAGATT CGCTTTTTTT GCTCAAAATC AAGTTAAAAA1227

ATGATTAAGT TAAAAGTGTA TAAATATTTA GGCTATTTTA TAAGTAACAA ΑΑΤΑΤΤΆΑΤΑ1287

AAAAATCTGT GACATATATC ACAGATTTTT AAATCAATTA ACTATTTAAG TGTTTACTAT1347

TAATTCTCTT TCCACTTTCC GTTTACTACT GTGCCGATTA CTTGGTAATT TGGCGTAAAC1407

ACGGCTAAGT TTGCTATCTT ACCTTTTTCT ACCGAACCTA AACGATCATC TATACCAATT1467

GCTCGTCGAC1477 (2) Informacja o Sek.Id.Nr 8 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 361 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (D) Topologia cząsteczki, liniowa (ii) Typ cząsteczki białko (xi) Opis sekwencji Sek Id.Nr 8

Mec Lys Lye Thr Leu Ala Ala Leu Ile Val Gly Ala Phe Ala Ala Ser 1 ' 5 10 15

181 695

Ala Ala Asn Ala Ala Val Val Tyr 20

Leu Gly Gly Arg Leu Ser Ile Ile 3540

Asp Asn Gin Lys Gin Gin His Gly 5055

Phe His Ile Lys *Ala Thr His Asn 6570

Gly Tyr Leu Glu Thr Arg Phe Val 85

Asp Asn Phe Gly Asp Ile Thr Ser 100

Asn Lys Ala Phe Gly Glu Val Lys 115120

Asp Gly Ile Thr Ser Ala Glu Aep 130135

Ser Asp Tyr Ile Pro Thr Ser Gly 145150

Gly Ile Asp Gly Leu Val Leu Gly 165

Arg Glu Gly Ala Lys Gly Glu Asn 180

Glu Val Arg Ile Gly Glu Ile Asn 195200

Tyr Asp Ala Asn Asp Ile Val Ala 210215

Tyr Lys Tyr Asn Glu Ser Asp Glu 225230

Leu Ala Thr Leu Gly Tyr Arg Phe 24 5

Leu Asp Ser Gly Tyr Ala Lys Thr 260

Lys Arg Tyr Phe Val Ser Pro Gly 275280

Thr Asn Val Tyr Gly Asn Phe Lys 290295

Gly Glu Lys Thr Arg Glu Gin Ala 305310

Leu Hig Lys Gin Leu Leu Tnr Tyr 325

Arg Thr Thr Glu Thr Gly Lys Gly 340‘

Val Gly Val Gly Leu Arg Val Tyr 355360

Asn Asn Glu Gly Thr Asn Val Glu 253 0

Ala Glu Gin Ser Asn Ser Thr Val 45

Ala Leu Arg Asn Gin Gly Ser Arg 60

Phe Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Gin 7580

Thr Lys Ala Ser Glu Asn Gly Ser 9095

Lya Tyr Ala Tyr Val Thr Leu Gly 105110

Leu Gly Arg Ala Lys Thr Ile Ala 125

Lys Glu Tyr Gly Val Leu Asn Asn 140

Asn Thr Val Gly Tyr Thr Phe Lys 155160

Ala Asn Tyr Leu Leu Ala Gin Lys 170175

Lys Arg Pro Asn Asp Lys Ala Gly 185190

Asn Gly Ile Gin Val Gly Ala Lys 205

Lys Ile Ala Tyr Gly Arg Thr Asn 220

His Lys Gin Gin Leu Asn Gly Val 235240

Ser Asp Leu Gly Leu Leu Val Ser 250255

Lys Asn Tyr Lys Ile Lys Hic Glu 265270

Phe Gin Tyr Glu Leu Met Glu Asp 285

Tyr Glu Arg Thr Ser Val Asp Gin 300

Val Leu Phe Gly Val Asp His Lys 315320

Ile Glu Gly Ala Tyr Ala Arg Thr 330335

Val Lys Thr Glu Lys Glu Lys Ser 345350

Phe

181 695 (2) Informacja o Sek.Id.Nr 9 (i) Charakterystyka sekwencji (A) Długość· 1137 pz (B) Typ· kwas nukleinowy (C) Ilość łańcuchów: jeden (D) Topologia cząsteczki: liniowa (ix) Cechy· (A) Nazwa/kod. CDS (B) Położenie. 4.. 1092 (xi ) Opis sekwencji Sek.Id.Nr 9·

CAT ATG

GCT AGC

ATG ACT GGT GGA CAG CAA ATG

GGT Gly

CGG Arg

GAT TCA

AGC Ser 15

48

Met 1

Ala

Ser

Met

Thr Gly 5

Gly

Gin

Gin

Met 10

Asp

Ser

TTG

GTA

CCG

AGC

TCG

GAT CCA

GCT

GTT

GTT

TAT

AAC

AAC

GAA

GGG

ACT

96

Leu

Val

Pro

Ser

Ser 20

Asp Pro

Ala

Val

Val 25

Tyr

Asn

Asn

Glu

Gly 30

Thr

AAC

GTA

GAA

TTA

GGT

GGT CGT

TTA

AGC

ATT

ATC

GCA

GAA

CAA

AGT

AAT

144

Asn

Val

Glu

Leu 35

Gly

Gly Arg

Leu

Ser 40

Ile

Ile

Ala

Glu

Gin 45

Ser

Asn

AGC

ACT

GTA

GAT

AAT

CAA AAA

CAG

CAA

CAC

GGT

GCA

TTA

CGC

AAT

CAA

192

Ser

Thr

Val 50

Asp

Asn

Gin Lye

Gin 55

Gin

His

Gly

Ala

Leu 60

Arg

Asn

Gin

GGT

TCA

CGT

TTC

CAC

ATT AAA

GCA

ACT

CAT

AAC

TTC

GGT

GAT

GGT

TTC

24 0

Gly

Ser 65

Arg

Phe

His

Ile Lys 70

Ala

Thr

His

Asn

Phe 75

Cly

Asp

Gly

Phe

TAT

GCA

CAA

GGT

TAT

TTA GAA

ACT

CGT

m

GTT

ACA

AAA

GCC

TCT

GAA

288

Tyr 80

Ala

Gin

Gly

Tyr

Leu Glu 85

Thr

Arg

Phe

Val 90

Thr

Lys

Ala

Ser

Glu 95

AAC

GGT

TCA

GAT

AAC

TTC GGT

GAT

ATT

ACA

AGC

AAA

TAT

GCT

TAT

GTT

336

Asn

Gly

Ser

Asp

Asn 100

Phe Gly

Asp

Ile

Thr 105

Ser

Lys

Tyr

Ala

Tyr 110

Val

ACT

TTA

GGA

AAT

AAA

GCA TTC

GGT

GAA

GTA

AAA

CTT

GGT

CGT

GCG

AAA

384

Thr

Leu

Gly

Asn 115

Lys

Ala Phe

Gly

Glu 120

Val

Lys

Leu

Gly

Arg 125

Ala

Lys

ACT

ATT

GCT

GAT

GGC

ATA ACA

AGT

GCA

GAA

GAT

AAA

GAA

TAT

GGC

GTT

432

Thr

Ile

Ala 130

Asp

Gly

Ile Thr

Ser 13 5

Ala

Glu

Asp

Lys

Glu 140

Tyr

Gly

Val

CTC

AAC

AAT

AGT

GAC

TAT ATT

CCT

ACT

AGT

GGT

AAT

ACG

GTT

GGC

TAT

480

Leu

Asn 14 5

Asn

Ser

Asp

Tyr Ile ISO

Pro

Thr

Ser

Gly

Asn 155

Thr

Val

Gly Tyr

ACT

TTT

AAA

GGT

ATT

GAT GGT

TTA

GTA

TTA

GGC

GCT

AAT

TAT

TTA

TTA

528

Thr 160

Phe

Lys

Gly

Ile

Asp Gly 165

Leu

Val

Leu

Gly 170

Ala

Asn

Tyr

Leu

Leu 175

GCA

CAA

AAG

CGT

GAG

GGT GCA

AAA

GGT

GAA

AAT

AAG

CGG

CCT

AAT

GAT

576

Ala

Gin

Lys

Arg

Glu 180

Gly Ala

Lys

Gly

Glu 185

Asn

Lys

Arg

Pro

Asn 190

Asp

-AAG

GCT

GGT

GAA

GTA

CGT ATA

GGT

GAA

ATC

AAT

AAT

GGA

ATT

CAA

GTT

624

Lys

Ala

Gly

Glu 195

Val

Arg Ile

Gly

Glu 200

Ile

Asn

Asn

Gly

Ile 205

Gin

Val

181 695

GGT Gly

GCA Ala

AAA Lys 210

TAT GAT GCA AAC GAC

ATC GTT GCA

AAA ATT

GCT TAT

GGT Gly

672

Tyr

Asp Ala Asn

Asp 215

Ile

Val

Ala

Lys

Ile 220

Ala

Tyr

AGA

ACT

AAC

TAC

AAA

TAT

AAC

GAA

TCT

GAC

GAG

CAT

AAA

CAG

CAA

TTA

720

Arg

Thr 225

Asn

Tyr

Lys

Tyr

Asn 230

Glu

Ser

Asp

Glu

His 235

Lys

Gin

Gin

Leu

AAT

GGT

GTA

TTA

GCA

ACT

TTA

GGC

TAT

CGT

TTT

AGT

GAT

TTA

GGC

TTA

768

Aen 240

Gly

Val

Leu

Ąla

Thr 245

Leu

Gly

Tyr

Arg

Phe 250

Ser

Asp

Leu

Gly

Leu 255

TTA

GTG

TCT

CTA

GAT

AGT

GGC

TAT

GCA

AAA

ACT

AAA

AAC

TAT

AAA

ATT

816

Leu

Val

Ser

Leu

Asp 260

Ser

Gly

Tyr

Ala

Lys 265

Thr

Lys

Asn

Tyr

Lys 270

Ile

AAA

CAC

GAA

AAA

CGC

TAT

TTC

GTA

TCT

CCA

GGT

TTC

CAA

TAT

GAA

TTA

864

Lys

His

Glu

Lys 275

Arg

Tyr

Phe

Val

Ser 280

Pro

Gly

Phe

Gin

Tyr 285

Glu

Leu

ATG

GAA

GAT

ACT

AAT

GTC

TAT

GGC

AAC

TTC

AAA

TAT

GAA

CGC

ACT

TCT

912

Met

Glu

Asp 290

Thr

Asn

Val

Tyr

Gly 295

Asn

Phe

Lys

Tyr

Glu 300

Arg

Thr

Ser

GTA

GAT

CAA

GGT

GAA

AAA

ACA

CGT

GAA

CAA

GCA

GTA

TTA

TTC

GGT

GTA

960

Val

Asp 305

Gin

Gly

Glu

Lys

Thr 310

Arg

Glu

Gin

Ala

Val 315

Leu

Phe

Gly

Val

GAT

CAT

AAA

CTT

CAC

AAA

CAA

CTA

TTA

ACC

TAT

ATT

GAA

GGT

GCT

TAC

1008

Asp 320

His

Lys

Leu

His

Lys 325

Gin

Leu

Leu

Thr

Tyr 330

Ile

Glu

Gly

Ala

Tyr 335

GCT

AGA

ACT

AGA

ACA

ACT

GAG

ACA

GGT

AAA

GGC

GTA

AAA

ACT

GAA

AAA

1056

Ala

Arg

Thr

Arg

Thr 340

Thr

Glu

Thr

Gly

Lys 345

Gly

Val

Lys

Thr

Glu 350

Lys

GAA AAA TCA Glu Lys Ser TTAGAAATAC .

GTG GGT GTA GGT TTA CGC GTT Val Gly Val Gly Leu Arg Val 355 360 hTTATTAAAA GCAAGGCGAC TCGAG

TAC Tyr

TTC Phe

TAATCATTTG

1102 1137

(2) Informacja o Sek Id.Nr 10 (i) Charakterystyka sekwencji (A) Długość: 363 aminokwasy (B) Typ- aminokwas (D) Topologia cząsteczki· liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: Sek.Id

Mec Ala Ser Met Thr Gly Gly Gin 15

Val Pro Ser Ser Asp Pro Ala Val 20

Val Glu Leu Gly Gly Arg Leu Ser 3540

Thr Val Άερ Asn Gin Lys Gin Gin 5055

Nr 10 .

Gin Met Gly Arg Asp Ser Ser Leu 1015

Val Tyr Asn Asn Glu Gly Thr Aen 2530

Ile Ile Ala Glu Gin Ser Asn Ser 45

His Gly Ala Leu Arg Asn Gin Gly 60

181 695

His Asn Phe Gly Asp Gly Phe Tyr 7580

Phe Val Thr Lys Ala Ser Glu Asn 9095

Thr Ser Lys Tyr Ala Tyr Val Thr 105110

Val Lys Leu Gly Arg Ala Lye Thr 125

Glu Asp Lys Glu Tyr Gly Val Leu 140

Ser Gly Asn Thr Val Gly Tyr Thr 155160

Leu Gly Ala Asn Tyr Leu Leu Ala 170175

Glu Asn Lys Arg Pro Asn Asp Lys 185190

Ile Aen Asn Gly Ile Gin Val Gly 205

Val Ala Lye Ile Ala Tyr Gly Arg 220

Asp Glu His Lye Gin Gin Leu Asn 235240

Arg Phe Ser Aep Leu Gly Leu Leu 250255

Lys Thr Lys Asn Tyr Lys Ile Lys 265270

Pro Gly Phe Gin Tyr Glu Leu Met 285

Phe Lys Tyr Glu Arg Thr Ser Val 300

Gin Ala Val Leu Phe Gly Val Asp 315320

Thr Tyr Ile Glu Gly Ala Tyr Ala 330335

Lys Gly Val Lys Thr Glu Lys Glu 345350

Val Tyr Phe

Ser Arg Phe His Ile Lys Ala Thr 65 70

Ala Gin Gly Tyr Leu Glu Thr Arg 85

Gly Ser Asp Asn Phe Gly Asp Ile 100

Leu Gly Asn Lys Ala Phe Gly Glu 115120

Ile Ala Asp Gly Ile Thr Ser Ala 130135

Asn Asn Ser Asp Tyr Ile Pro Thr 145150

Phe Lys Gly Ile Asp Gly Leu Val 165

Gin Lys Arg Glu Gly Ala Lys Gly 180

Ala Gly Glu Val Arg Ile Gly Glu 195200

Ala Lye Tyr Asp Ala Asn Asp Ile 210215

Thr Asn Tyr Lys Tyr Asn Glu Ser 225230

Gly Val Leu Ala Thr Leu Gly Tyr 245

Val Ser Leu Asp Ser Gly Tyr Ala 260

Hie Glu Lys Arg Tyr Phe Val Ser 275200

Glu Asp Thr Asn Val Tyr Gly Asn 290295

Asp Gin Gly Glu Lys Thr Arg Glu 305310

His Lys Leu His Lys Gin Leu Leu 325

Arg Thr Arg Thr Thr Glu Thr Gly 340

Lye Ser Val Gly Val Gly Leu Arg 355 360 (2) Informacja o Sek.Id.Nr 11 (i) Charakterystyka sekwencji (A) Długość 1074 pz (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Ilość łańcuchów· jeden (D) Topologia cząsteczki· liniowa

181 695 (ix) Cechy (A) Nazwa/kod CDS (B) Położenie: 4.. 1092 (xi ) Opis sekwencji- Sek Id Nr 11

CAT ATG

GCT GTT

GTT TAT

AAC AAC GAA GGG

ACT AAC

GTA Val

GAA Glu

TTA Leu

GGT Gly 15

48

Met 1

Ala

Val

Val

Tyr 5

Asn Αεη

Glu

Gly

Thr 10

Asn

GGT

CGT

TTA

AGC

ATT

ATC

GCA GAA

CAA

AGT

AAT

AGC

ACT

GTA

GAT

AAT

96

Gly

Arg

Leu

Ser

Ile 20

Ile

Ala Glu

Gin

Ser 25

Asn

Ser

Thr

Val

Asp 30

Asn

CAA

AAA

CAG

CAA

CAC

GGT

GCA TTA

CGC

AAT

CAA

GGT

TCA

CGT

TTC

CAC

144

Gin

Lyc

Gin

Gin 35

His

Gly

Ala Leu

Arg 40

Asn

Gin

Gly

Ser

Arg 45

Phe

His

ATT

AAA

GCA

ACT

CAT

AAC

TTC GGT

GAT

GGT

TTC

TAT

GCA

CAA

GGT

TAT

192

Ile

Lys

Ala 50

Thr

His

Asn

Phe Gly 55

Asp

Gly

Phe

Tyr

Ala 60

Gin

Gly

Tyr

TTA

GAA

ACT

CGT

TTT

GTT

ACA AAA

GCC

TCT

GAA

AAC

GGT

TCA

GAT

AAC

240

Leu

Glu 65

Thr

Arg

Phe

Val

Thr Lys 70

Ala

Ser

Glu

Asn 75

Gly

Ser

Asp

Asn

TTC

GGT

GAT

ATT

ACA

AGC

AAA TAT

GCT

TAT

GTT

ACT

TTA

GGA

AAT

AAA

288

Phe 80

Gly

Asp

Ile

Thr

Ser 85

Lys Tyr

Ala

Tyr

Val 90

Thr

Leu

Gly

Asn

Lye 95

GCA

TTC

GGT

GAA

GTA

AAA

CTT GGT

CGT

GCG

AAA

ACT

ATT

GCT

GAT

GGC

336

Ala

Phe

Gly

Glu

Val 100

Lys

Leu Gly

Arg

Ala 105

Lys

Thr

Ile

Ala

Asp 110

Gly

ATA

ACA

AGT

GCA

GAA

GAT

AAA GAA

TAT

GGC

GTT

CTC

AAC

AAT

AGT

GAC

384

Ile

Thr

Ser

Ala 115

Glu

Asp

Lys Glu

Tyr 120

Gly

Val

Leu

Asn

Asn 125

Ser

Asp

TAT

ATT

CCT

ACT

AGT

GGT

AAT ACG

GTT

GGC

TAT

ACT

TTT

AAA

GGT

ATT

432

Tyr

Ile

Pro 130

Thr

Ser

Gly

Asn Thr 135

Val

Gly

Tyr

Thr

Phe 140

Lys

Gly

Ile

GAT

GGT

TTA

GTA

TTA

GGC

GCT AAT

TAT

TTA

TTA

GCA

CAA

AAG

CGT

GAG

480

Asp

Gly 145

Leu

Val

Leu

Gly

Ala Asn 150

Tyr

Leu

Leu

Ala 155

Gin

Lys

Arg

Glu

GGT

GCA

AAA

GGT

GAA

AAT

AAG CGG

CCT

AAT

GAT

AAG

GCT

GGT

GAA

GTA

S28

Gly 160

Ala

Lys

Gly

Glu

Asn 16S

Lys Arg

Pro

Asn

Asp 170

Lys

Ala

Gly

Glu

Val 175

CGT

ATA

GGT

GAA

ATC

AAT

AAT GGA

ATT

CAA

GIT

GGT

GCA

AAA

TAT

GAT

576

Arg

Ile

Gly

Glu

Ile 180

Asn

Asn Gly

Ile

Gin 185

Val

Gly

Ala

Lyc

Tyr 190

Asp

GCA

AAC

GAC

ATC

GTT

GCA

AAA ATT

GCT

TAT

GGT

AGA

ACT

AAC

TAC

AAA

624

Ala

Asn

Asp

Ile 195

Val

Ala

Lys Ile

Ala 200

Tyr

Gly

Arg

Thr

Asn 205

Tyr

Lye

TAT

AAC

GAA

TCT

GAC

GAG

CAT AAA

CAG

CAA

TTA

AAT

GGT

GTA

TTA

GCA

672

Tyr

Asn

Glu 210

Ser

Asp

Glu

His Lye 215

Gin

Gin

Leu

Asn

Gly 220

Val

Leu

Ala

ACT

TTA

GGC

TAT

CGT

TTT

AGT GAT

TTA

GGC

TTA

TTA

GTG

TCT

CTA

GAT

720

Thr

Leu 225

Gly

Tyr

Arg

Phe

Ser Asp 230

Leu

Gly

Leu

Leu 235

Val

Ser

Leu

Asp

181 695

AGT Ser 240

GGC Gly

TAT GCA Tyr Ala

AAA Lys

ACT Thr 245

AAA Lys

AAC TAT AAA Asn Tyr Lys

ATT Ile 250

AAA Lys

CAC His

GAA Glu

AAA Lys

CGC Arg 255

768

TAT

TTC

GTA

TCT

CCA

GGT

TTC

CAA

TAT

GAA

TTA

ATG

GAA

GAT

ACT

AAT

816

Tyr

Phe

Val

Ser

Pro 260

Gly

Phe

Gin

Tyr

Glu 265

Leu

Met

Glu

Asp

Thr 270

Asn

GTC

TAT

GGC

AAC

TTC

AAA

TAT

GAA

CGC

ACT

TCT

GTA

GAT

CAA

GGT

GAA

864

Val

Tyr

Gly

Asn 275

Phe

Lys

Tyr

Glu

Arg 280

Thr

Ser

Val

Asp

Gin 285

Gly

Glu

AAA

ACA

CGT

GAA

CAA

GCA

GTA

TTA

TTC

GGT

GTA

GAT

CAT

AAA

CTT

CAC

912

Lys

Thr

Arg 290

Glu

Gin

Ala

Val

Leu 295

Phe

Gly

Val

Asp

His 300

Lys

Leu

His

AAA

CAA

CTA

TTA

ACC

TAT

ATT

GAA

GGT

GCT

TAC

GCT

AGA

ACT

AGA

ACA

960

Lys

Gin 3C5

Leu

Leu

Thr

Tyr

Ile 310

Glu

Gly

Ala

Tyr

Ala 31S

Arg

Thr

Arg

Thr

ACT

GAG

ACA

GGT

AAA

GGC

GTA

AAA

ACT

GAA

AAA

GAA

AAA

TCA

GTG

GGT

1008

Thr 320

Glu

Thr

Gly

Lys

Gly 325

Val

Lya

Thr

Glu

Lys 330

Glu

Lys

Ser

Val

Gly 335

GTA Val

GGT Gly

TTA Leu

CGC Arg

GTT Val

TAC Tyr

TTC Phe

TAATCATTTG *

ITAGAAATAC ATTATTAAAA

1059

340

GCAAGGCGAC TCGAG

1074 (2) Informacja o Sek Id Nr 12 (i) Charakterystyka sekwencji (A) Długość 342 aminokwasów (B) Typ aminokwas (D) Topologia cząsteczki liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: Sek.Id.Nr 12

Met Ala Val Val Tyr Asn Asn Glu Gly Thr Aon Val Glu Leu Gly Gly 15 1015

Arg Leu Ser Ile Ile Ala Glu Gin Ser Asn Ser Thr Val Asp Asn Gin 20 2530

Lys Gin Gin His Gly Ala Leu Arg Asn Gin Gly Ser Arg Phe His Ile 35 4045

Lys Ala Thr His Asn Phe Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Gin Gly Tyr Leu 50 5560

Glu Thr Arg Phe Val Thr Lys Ala Ser Glu Asn Gly Ser Asp Asn Phe 65 70 7580

Gly Asp Ile Thr Ser Lys Tyr Ala Tyr Val Thr Leu Gly Asn Lys Ala 85 9095

Phe Gly Glu Val Lys Leu Gly Arg Ala Lys Thr Ile Ala Asp Gly Ile 100 105110

Thr Ser Ala Glu Asp Lys Glu Tyr Gly Val Leu Asn Asn Ser Asp Tyr 115 ‘ 120125

181 695

Ile Pro Thr Ser Gly Asn Thr Val Gly Tyr Thr Phe 130 135140

Gly Leu Val Leu Gly Ala Asn Tyr Leu Leu Ala Gin 145 150155

Ala Lys Gly Glu Αεη Lys Arg Pro Asn Asp Lys Ala 155170

Ile Gly Glu Ile Asn Asn Gly Ile Gin Val Gly Ala 180185

Asn Asp Ile Val Ala Lys Ile Ala Tyr Gly Arg Thr 195200

Asn Glu Ser Asp Glu His Lys Gin Gin Leu Asn Gly 210 215220

Leu Gly Tyr Arg Phe Ser Asp Leu Gly Leu Leu Val 225 230235

Gly Tyr Ala Lys Thr Lys Asn Tyr Lys Ile Lys His 245250

Phe Val Ser Pro Gly Phe Gin Tyr Glu Leu Met Glu 260265

Tyr Gly Asn Phe Lys Tyr Glu Arg Thr Ser Val Asp 275280

Thr Arg Glu Gin Ala Val Leu Phe Gly Val Asp His 290 295300

Gin Leu Leu Thr Tyr Ile Glu Gly Ala Tyr Ala Arg 305 310315

Glu Thr Gly Lys Gly Val Lys Thr Glu Lys Glu Lys 325330

Gly Leu Arg Val Tyr Phe 340

Lys	Gly	Ile	Asp
Lys	Arg	Glu	Gly 160
Gly	Glu	Val 175	Arg
Lys	190	Asp	Ala
Asn 205	Tyr	Lys	Tyr
Val	Leu	Ala	Thr
Ser	Leu	Asp	Ser 240
Glu	Lys	Arg 255	Tyr
Asp	Thr 270	Asn	Val
Gin 285	Gly	Glu	Lys
Lya	Leu	His	Lys
Thr	Arg	Thr	Thr 320
Ser	Val	Gly 335	Val

(2) Informacja o Sek.Id Nr 13 (i) Charakterystyka sekwencji.

(A) Długość: 1072 pz (B) Typ. kwas nukleinowy (C) Ilość łańcuchów: jeden (D) Topologia cząsteczki: liniowa (ix) Cechy· (A) Nazwa/kod CDS (B) Położenie. 4 . 1029 (xi ) Opis sekwencji. Sek.Id Nr 13

CAT ATG GCT GTT GTT TAT AAC AAC Met Ala Val Val Tyr Asn Asn 1 S

GGT CGT TTA AGC ATT ATC GCA GAA

Gly Arg Leu Ser Ile Ile Ala Glu 20

GAA GGG ACT AAC GTA GAA TTA GGT

Glu Gly Thr Asn Val Glu Leu Gly

15

CAA AGT AAT AGC ACT GTA GAT AAT

Gin Ser Aen Ser Thr Val Asp Aen

30

181 695

CAA AAA CAG CAA CAC GGT GCA TTA CGC AAT CAA GGT TCA CGT TTC CAC144

Gin Lys Gin Gin Hie Gly Ala Leu Arg Aen Gin Gly Ser Arg Phe Hie

4045

ATT AAA GCA ACT CAT AAC TTC GGT GAT GGT TTC TAT GCA CAA GGT TAT192

Ile Lys Ala Thr Hie Asn Phe Gly Aep Gly Phe Tyr Ala Gin GlyTyr

55€0

TTA GAA ACT CGT TTT GTT ACA AAA GCC TCT GAA AAC GGT TCA GAT AAC24 0

Leu Glu Thr Arg Phe Val Thr Lys Ala Ser Glu Asn Gly Ser AepAsn

7075

TTC GGT GAT ATT ACA AGC AAA TAT GCT TAT GTT ACT TTA GGA AAT AAA288

Phe Gly Asp Ile Thr Ser Lys Tyr Ala Tyr Val Thr Leu Gly AsnLys

85 9095

GCA TTC GGT GAA GTA AAA CTT GGT CGT GCG AAA ACT ATT GCT GAT GGC336

Ala Phe Gly Glu Val Lys Leu Gly Arg Ala Lys Thr Ile Ala AspGly

100 105110

ATA ACA AGT GCA GAA GAT AAA GAA TAT GGC GTT CTC AAC AAT AGT GAC384

Ile Thr Ser Ala Glu Asp Lye Glu Tyr Gly Val Leu Asn Asn SerAsp

11S 120125

TAT ATT CCT ACT AGT GGT AAT ACG GTT GGC TAT ACT TTT AAA GGT ATT432

Tyr Ile Pro Thr Ser Gly Aon Thr Val Gly Tyr Thr Phe Lys GlyIle

130 135140

GAT GGT TTA GTA TTA GGC GCT AAT TAT TTA TTA GCA CAA AAG CGT GAG48 0

Asp Gly Leu Val Leu Gly Ala Asn Tyr Leu Leu Ala Gin Lys ArgGlu

145 150155

GGT GCA AAA GGT GAA AAT AAG CGG CCT AAT GAT AAG GCT GGT GAA GTA52 0

Gly Ala Lys Gly Glu Aen Lys Arg Pro Asn Asp Lye Ala Gly GluVal

160 165 170175

CGT ATA GGT GAA ATC AAT AAT GGA ATT CAA GTT GGT GCA AAA TAT GATS76

Arg Ile Gly Glu Ile Asn Asn Gly Ile Gin Val Gly Ala Lys TyrAsp

180 185190

GCA AAC GAC ATC GTT GCA AAA ATT GCT TAT GGT AGA ACT AAC TAC AAA624

Ala Asn Asp Ile Val Ala Lys He Ala Tyr Gly Arg Thr Asn TyrLys

195 200205

TAT AAC GAA TCT GAC GAG CAT AAA CAG CAA TTA AAT GGT GTA TTA GCA672

Tyr Asn Glu Ser Asp Glu His Lys Gin Gin Leu Asn Gly Val LeuAla

210 215220

ACT TTA GGC TAT CGT TTT AGT GAT TTA GGC TTA TTA GTG TCT CTA GAT72 0

Thr Leu Gly Tyr Arg Phe Ser Asp Leu Gly Leu Leu Val Ser LeuΑερ

225 230235

AGT GGC TAT GCA AAA ACT AAA AAC TAT AAA ATT AAA CAC GAA AAA CGC768

Ser Gly Tyr Ala Lys Thr Lys Asn Tyr Lys Ile Lys His Glu LysArg

240 245 250255

TAT TTC GTA TCT CCA GGT TTC CAA TAT GAA TTA ATG GAA GAT ACT AAT016

Tyr Phe Val Ser Pro Gly Phe Gin Tyr Glu Leu Met Glu Asp ThrAsn

260 265270

GTC TAT GGC AAC TTC AAA TAT GAA CGC ACT TCT GTA GAT CAA GGT GAA8 64

Val Tyr Gly Asn Phe Lys Tyr Glu Arg Thr Ser Val Asp Gin GlyGlu

275 280285

AAA ACA CGT GAA CAA GCA GTA TTA TTC GGT GTA GAT CAT AAA CTT CAC912

Lys Thr Arg Glu Gin Ala Val Leu Phe Gly Val Asp His Lys LeuHis

290 295 300*

181 695

AAA Lys

CAA Gin 305

CTA Leu

TTA ACC TAT

ATT GAA

GGT Gly

GCT Ala

TAC Tyr

GCT Ala 315

AGA ACT

AGA A CA

960

Leu

Thr

Tyr

Ile 310

Glu

Arg

Thr

Arg

Thr

ACT Thr 320

GAG Glu

A CA Thr

GGT Gly

AAA Lys

GGC Gly 325

GTA Val

AAA Lys

ACT Thr

GAA Glu

AAA Lys 330

GAA Glu

AAA Lys

TCA Ser

GTG Val

GGT Gly 335

1008

GTA Val

GGT Gly

TTA Leu

CGC Arg

GTT Val

TAC Tyr

TTC Phe

TAATCATTTG ‘

TTAGAAATAC ATTATTAAAA

1059

340

GCAAGGCGGA TCC 1072 (2) Informacja o Sek.Id.Nr 14 (i) Charakterystyka sekwencji· (A) Długość: 342 aminokwasów (B) Typ aminokwas (D) Topologia cząsteczki, liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: Sek.Id.Nr 14·

Met Ala Val Val Tyr Asn Asn Glu 15

Arg Leu Ser Ile Ile Ala Glu Gin 20

Lys Gin Gin His Gly Ala Leu Arg 3540

Lys Ala Thr His Asn Phe Gly Asp 5055

Glu Thr Arg Phe val Thr Lys Ala 6570

Gly Asp Ile Thr Ser Lys Tyr Ala 85

Phe Gly Glu Val Lys Leu Gly Arg 100

Thr Ser Ala Glu Asp Lys Glu Tyr 115120

Ile Pro Thr Ser Gly Asn Thr Val 130135

Gly Leu Val Leu Gly Ala Asn Tyr 145150

Ala Lys Gly Glu Asn Lys Arg Pro 165

Ile Gly Glu Ile Asn Asn Gly Ile 180

Asn Asp Ile Val Ala Lys Ile Ala 195 200

Gly	Thr 10	Asn	Val	Glu	Leu	Gly 15	Gly
Ser 25	Asn	Ser	Thr	Val	Αερ 30	Asn	Gin
Asn	Gin	Gly	Ser	Arg 45	Phe	His	Ile
Gly	Phe	Tyr	Ala 60	Gin	Gly	Tyr	Leu
Ser	Glu	Asn 75	Gly	Ser	Asp	Asn	Phe 80
Tyr	Val 90	Thr	Leu	Gly	Asn	Lys 95	Ala
Ala 105	Lys	Thr	Ile	Ala	Asp 110	Gly	i;e
Gly	Val	Leu	Asn	Asn 125	Ser	Asp	Tyr
Gly Tyr	Thr	Phe 14 0	Lys	Gly	Ile	Asp
Leu	Leu	Ala 1SS	Gin	Lys	Arg	Glu	Gly 160
Asn	Asp 170	Lys	Ala	Gly	Glu	Val 175	Arg
Gin 185	Val	Gly	Ala	Lys	Tyr 190	Asp	Ala
Tyr	Gly	Arg	Thr	Asn	Tyr	Lys	Tyr

205

181 695

Asn Glu Ser Asp Glu 210

Leu Gly Tyr Arg Phe 225

Gly Tyr Ala Lys Thr 245

Phe Val Ser Pro Gly 260

Tyr Gly Asn Phe Lys 275

Thr Arg Glu Gin Ala 290

Gin Leu Leu Thr Tyr 305

Glu Thr Gly Lys Gly 325

Gly Leu Arg Val Tyr 340

His Lys Gin Gin Leu Asn 215

Ser Asp Leu Gly Leu Leu 230 235

Lys Asn Tyr Lys Ile Lys 250

Phe Gin Tyr Glu Leu Met 265

Tyr Glu Arg Thr Ser Val 280

Val Leu Phe Gly Val Αερ 29 5

Ile Glu Gly Ala Tyr Ala 310 315

Val Lys Thr Glu Lys Glu 330

Phe

Gly Val Leu Ala Thr 220

Val Ser Leu Asp Ser 240

Hic Glu Lys Arg Tyr 255

Glu Asp Thr Asn Val 270

Asp Gin Gly Glu Lys 285

His Lye Leu His Lys 300

Arg Thr Arg Thr Thr 320

Lys Ser Val Gly Val

335

2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314

FIG.1

2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314

FIG. 2

181 695

FIG.3

FIG.3A

181 695

Soli — oligo #1 —

GTCGACAATT CTATTGGAGA AAAGTTCAAT CATAGATAGT AAACAACCAT AAGGAATACA 60

Asel

AATT ATG AAA AAA ACA CTT GCA CCA TTA ATC GTT GGT GCA TTC GCA GCT 109 Met Lys Lys Thr Leu Ala Ala Leu Ile VoI Gly Alo Phe Ala Ala 15 1015

Pvull — oligo #2—

TCA GCA GCA AAC GCA GCT GTT GTT TAT AAC AAC GAA GGG ACT AAC GTA 157 Ser Alo Ala Asn Alo Ala Vol Val Tyr Asn Asn Glu Gly Thr Asn Val 20 2530 — o I i go #5 ~

GAA TTA GGT GGT CGT TTA AGC ATT ATC GCA GAA CAA AGT AAT ACC ACT 205 Glu Leu Gly Gly Arg Leu Ser He Ile Ala Glu Gin Ser Asn Ser Thr 35 4045 — oligo #12 —

GTA GAT AAT CAA AAA CAG CAA CAC GGT GCA TTA CGC AAT CAA GGT TCA 253 Val Asp Asn Gin Lys Gin Gin His Gly Alo Leu Arg Asn Gin Gly Ser 50 5560 — oligo #13—

CGT TTC CAC ATT AAA GCA ACT CAT AAC TTC GGT GAT GGT TTC TAT GCA 301 Arg Phe His Ile Lys Alo Thr His Asn Phe Gly Asp Gly Phe Tyr Alo 65 7075

CAA GGT TAT TTA GAA ACT CGT TTT GTT ACA AAA GCC TCT GAA AAC GGT349

Gin Gly Tyr Leu Glu Thr Arg Phe Vol Thr Lys Alo Ser Glu AsnGly

85 9095

TCA GAT AAC TTC GGT GAT ATT ACA AGC AAA TAT GCT TAT GTT ACT TTA397

Ser Asp Asn Phe Gly Asp Ile Thr Ser Lys Tyr Alo Tyr Vol ThrLeu

100 105110 — oligo #6 —

GGA AAT AAA GCA TTC GGT GAA GTA AAA CTT GGT CGT GCG AAA ACT ATT 445 Gly Asn Lys Alo Phe Gly Glu Val Lys Leu Gly Arg Alo Lys Thr He 115 120125

FIG.4A

181 695 —ol igo #7—

GCT GAT GGC ATA ACA AGT GCA GAA GAT AAA GAA TAT GGC GTT CTC AAC 493 Al o Asp Gly Ile Thr Ser Ala Glu Asp Lys Glu Tyr Gly VaI Leu Asn

130 135140

SpelDrol

AAT AGT GAC TAT ATT CCT ACT AGT GGT AAT ACG GTT GGC TAT ACT TTT 541 Asn Ser Asp .Tyr Ile Pro Thr Ser Gly Asn Thr Vol Gly Tyr Thr Phe

145 150155

Hhąl

AAA GGT ATT GAT GGT TTA GTA TTA GGC GCT AAT TAT TTA TTA GCA CAA589

Lys Gly Ile Asp Gly Leu Val Leu Gly Ala Asn Tyr Leu Leu AloGin

160 165 170175 — -oligo #8—FnuDI

AAG CGT GAG GGT GCA AAA GGT GAA AAT AAG CGG CCT AAT GAI AAG GCT637

Lys Arg Glu Gly Ala Lys Gly Glu Asn Lys Arg Pro Asn Asp LysAla

180 185190

SnoBlEcoRI

GGT GAA GTA CGT ATA GGT GAA ATC AAT AAT GGA ATT CAA GTT GGT GCA685

Gly Glu Vol Arg Ile Gly Glu Ile Asn Asn Gly Ile Gin Vol GlyAlo

195 200205

AAA TAT GAT GCA AAC GAC ATC GTT GCA AAA ATT GCT TAT GGT AGA ACT733

Lys Tyr Asp Ala Asn Asp He Vol Alo Lys Ile Ala Tyr Gly ArgThr

210 215220 — ol igo #11 —

AAC TAC AAA TAT AAC GAA TCT GAC GAG CAT AAA CAG CAA TTA AAT GGT781

Asn Tyr Lys Tyr Asn Glu Ser Asp Glu His Lys Gin Gin Leu AsnGly

225 230235

GTA TTA GCA ACT TTA GGC TAT CGT TTT AGT GAT TTA GGC TTA TTA GTG829

VaI Leu Alo Thr Leu Gly Tyr Arg Phe Ser Asp Leu Gly Leu LeuVoI

240 245 250255

XboI — ohgo #3 — — ol igo #14 —

TCT CTA GAT ACT GGC TAT GCA AAA ACT AAA AAC TAT AAA ATT AAA CAC 877 Ser Leu Asp Ser Gly Tyr Ala Lys Thr Lys Asn Tyr Lys Ile Lys His

260 265 270 HG.4B

181 695

Asel

GAA AAA CGC TAT TTC GTA TGT CCA GGT TTC CAA TAT GAA TTA ATG GAA925

Glu Lys Arg Tyr Phe Vol Ser Pro Gly Phe Gin Tyr Glu Leu MetGlu

275 280285

GAT ACT AAT CTC TAT GGC AAC TTC AAA TAT GAA CGC ACT TCT GTA GAT973

Asp Thr Asn Vol Tyr Gly Asn Phe Lys Tyr Glu Arg Thr Ser VolAsp

290 295300 — -oligo #16-— — ol i go #9 —Sou3A

CAA GGT GAA AAA ACA CCT CAA CAA GCA GTA TTA TTC GCT GTA GAT CAT 1021

Gin Gly Glu Lys Thr Arg Glu Gin Alo Vol Leu Phe Gly Vol Asp His

305 310315

AAA CTT CAC AAA CAA CTA TTA ACC TAT ATT GAA GGT GCT TAC GCT AGA1069

Lys Leu His Lys Gin Leu Leu Thr Tyr He Glu Gly Alo Tyr AloArg

320 325 330335

ACT AGA ACA ACT GAG ACA GGT AAA GGC GTA AAA ACT GAA AAA GAA AAA1117

Thr Arg Thr Thr Glu Thr Gly Lys Gly Vol Lys Thr Glu Lys GluLys

340 345350 — ol igo #15 — Ml ul

TCA GTG GCT GTA GGT TTA CGC GTT TAC TTC TAATCATTTG TTAGAAATAC 1167 Ser Vol Gly Vol Gly Leu Arg Vol Tyr Phe

355360 — oi igo #4 —

ATTATTAAAA GCAAGGCGAA TCGAAAGATT CGCTTTTTTT GCTCAAAATC AAGTTAAAAA Asel ATGATTAAGT TAAAAGTGTA TAAATATTTA GGCTATTTTA TAAGTAACAA AATATTAATA	1227 1287
— PCR-4 — Drol AAAAATCTGT GACATATATC ACAGATTTTT AAATCAATTA ACTATTTAAG	TGTTTACTAT	1347
Asel —PCR-5 — TAATTCTCTT TCCACTTTCC GTTTACTACT GTGCCGATTA CTTGGTAATT	TGGCGTAAAC	1407
SouJA ACGGCTAAGT TTGCTATCTT ACCTTTTTCT ACCGAACCTA AACGATCATC	TATACCAATT	1467
GCTCGTCGAC FIG.4C		1477

181 695

Hdęl Nhel Hj_ndIII*

CAT ATG GCT AGC ATG ACT GGT GGA CAG CAA ATG GGT CGG GAT TCA AGC 48

Met Alo Ser Met Thr Gly Gly Gin Gin Met Gly Arg Asp Ser Ser 1 5 1015

ΚρηIBamHI

TTG GTA CCG AGC TCG GAT CCA GCT GTT GTT TAT AAC AAC GAA GGG ACT96

Leu VaI Pro Ser Ser Asp Pro Ala Vol Val Tyr Asn Asn Glu GlyThr

2530

AAC GTA GAA TTA GGT GGT CGT TTA AGC ATT ATC GCA GAA CAA AGT AAT144

Asn VaI Glu Leu Gly Gly Arg Leu Ser Ile Ile Ala Glu Gin SerAsn

4045

AGC ACT GTA GAT AAT CAA AAA CAG CAA CAC GGT GCA TTA CGC AAT CAA192

Ser Thr Val Asp Asn Gin Lys Gin Gin His Gly Alo Leu Arg AsnGin

5560

GGT TCA CGT TTC CAC ATT AAA GCA ACT CAT AAC TTC GGT GAT GGT TTC240

Gly Ser Arg Phe His He Lys Alo Thr His Asn Phe Gly Asp GlyPhe

7075

TAT GCA CAA GGT TAT TTA GAA ACT CGT TTT GTT ACA AAA GCC TCT GAA288

Tyr Alo Gin Gly Tyr Leu Glu Thr Arg Phe Val Thr Lys Alo SerGlu

85 9095

AAC GGT TCA GAT AAC TTC GGT GAT ATT ACA AGC AAA TAT GCT TAT GTT336

Asn Gly Ser Asp Asn Phe Gly Asp He Thr Ser Lys Tyr Ala TyrVoI

100 105110

ACT TTA GGA AAT AAA GCA TTC GGT GAA GTA AAA CTT GGT CGT GCG AAA384

Thr Leu Gly Asn Lys Alo Phe Gly Glu Val Lys Leu Gly Arg AloLys

115 120125

ACT ATT GCT GAT GGC ATA ACA AGT GCA GAA GAT AAA GAA TAT GGC GTT432

Thr He Alo Asp Gly He Thr Ser Alo Glu Asp Lys Glu Tyr GlyVaI

130 135140

FIG.5A

181 695

Spel

CTC AAC AAT AGT GAC TAT ATT CCT ACT AGT GGT AAT ACG GTT GGC TAT 480

Leu Asn Asn Ser Asp Tyr Ile Pro Thr Ser Gly Asn Thr Vol Gly Tyr

145 150155

OrałHhol

ACT TTT AAA GGT ATT GAT GGT TTA GTA TTA GGC GCT AAT TAT TTA TTA528

Thr Phe Lys Gly Ile Asp Gly Leu VaI Leu Gly Ala Asn Tyr LeuLeu

160 165 170175

FnuDI

GCA CAA AAG CGT GAG GGT GCA AAA GGT GAA AAT AAG CGG CCT AAT GAT576

Ala Gin Lys Arg Glu Gly Ala Lys Gly Glu Asn Lys Arg Pro AsnAsp

180 185190

SnaB1EcoRl

AAG GCT GGT GAA GTA CGT ATA GGT GAA ATC AAT AAT GGA ATT CAA GTT624

Lys Ala Gly Glu Val Arg Ile Gly Glu Ile Asn Asn Gly Ile GinVal

195 200205

GGT GCA AAA TAT GAT GCA AAC GAC ATC GTT GCA AAA ATT GCT TAT GGT672

Gly Ala Lys Tyr Asp Ala Asn Asp He Vol Ala Lys Ile Ala TyrGly

210 215220

AGA ACT AAC TAC AAA TAT AAC GAA TCT GAC GAG CAT AAA CAG CAA TTA720

Arg Thr Asn Tyr Lys Tyr Asn Glu Ser Asp Giu His Lys Gin GinLeu

225 230235

AAT GGT GTA TTA GCA ACT TTA GGC TAT CGT TTT AGT GAT TTA GGC TTA768

Asn Gly Val Leu Ala Thr Leu Gly Tyr Arg Phe Ser Asp Leu GlyLeu

240 245 250255

Xbol

TTA GTG TCT CIA GAT AGT GGC TAT GCA AAA ACT AAA AAC TAT AAA ATT 816 Leu VoI Ser Leu Asp Ser Gly Tyr Ala Lys Thr Lys Asn Tyr Lys Ile

260 265270

Asę!

AAA CAC GAA AAA CGC TAT TTC GTA TCT CCA GGT TTC CAA TAT GAA TTA 864 Lys His Glu Lys Arg Tyr Phe VoI Ser Pro Gly Phe Gin Tyr Glu Leu

275 280285

FIG.5B

181 695

ATG GAA GAT ACT AAT GTC TAT GGC AAC TTC AAA TAT GAA CGC ACT TCT912

Met Glu Asp Thr Asn Vol Tyr Gly Asn Phe Lys Tyr Glu Arg ThrSer

290 295300

GTA GAT CAA GGT GAA AAA ACA CGT GAA CAA GCA GTA TTA TTC GGT GTA960

Vol Asp Gin Gly Glu Lys Thr Arg Glu Gin Alo Vol Leu Phe GlyVoI

305 310315

GAT CAT AAA CTT CAC AAA CAA CTA TTA ACC TAT ATT GAA GGT GCT TAC1008

Asp His Lys Leu His Lys Gin Leu Leu Thr Tyr Ile Glu Gly AloTyr

320 325 330335

GCT AGA ACT AGA ACA ACT GAG ACA GGT AAA GGC GTA AAA ACT GAA AAA1056

Alo Arg Thr Arg Thr Thr Glu Thr Gly Lys Gly Voi Lys Thr GluLys

340 345350

Mlul

GAA AAA TCA GTG GGT GTA GGT TTA CGC GTT TAC TTC TAATCATTTG1102

Glu Lys Ser Vol Gly Vol Gly Leu Arg Vol Tyr Phe 355360

Xhol

T TAGAAATAC AT TAT ΓΑΑΑΑ GCAAGGCCAC TCGAG ] 13 7

FIG.5C

181 695

Hde!

CAT ATG GCT GTT GTT TAT AAC AAC GAA GGG ACT AAC GTA GAA TTA GGT48

Met Ala Val Va 1 Tyr Asn Asn Glu Gly Thr Asn VoI Glu LeuGly

1015

GGT CCT TTA AGC ATT ATC GCA GAA CAA AGT AAT AGC ACT GTA GAT AAT96

Gly Arg Leu Ser Ile Ile Ala Glu Gin Ser Asn Ser Thr Vol AspAsn

2530

CAA AAA CAG CAA CAC GGT CCA TTA CGC AAT CAA GGT TCA CCT TTC CAC144

Gin Lys Gin Gin His Gly Ala Leu Arg Asn Gin Gly Ser Arg PheHis

4045

ATT AAA GCA ACT CAT AAC TTC GGT GAT GGT TTC TAT GCA CAA GGT TAT192

Ile Lys Ala Thr His Asn Phe Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Gin GlyTyr

5560

HA GAA ACT CGT TTT GTT ACA AAA GCC TCT GAA AAC GGT TCA GAT AAC240

Leu Glu Thr Arg Phe Vol Thr Lys Ala Ser Glu Asn Gly Ser AspAsn

7075

TTC GGT GAT ATT ACA ACC AAA TAT GCT TAT GTT ACT TTA GGA AAT AAA288

Phe Gly Asp Ile Thr Ser Lys Tyr Ala Tyr Val Thr Leu Gly AsnLys

85 9095

GCA TTC GGT GAA GTA AAA CTT GGT CGT GCG AAA ACT ATT GCT GAT GGC336

Ala Phe Gly Glu Va 1 Lys Leu Gly Arg Ala Lys Thr ile Ala AspGly

100 105110

ATA ACA AGT GCA GAA GAT AAA GAA TAT GGC Gil C1C AAC AAI AGI GAC384

Ile Thr Ser Ala Glu Asp Lys Glu Tyr Gly Val Leu Asn Asn SerAsp

115 120125

SfielOraj

TAI ATT CCT ACT AGT GGT AAT ACG GIT GGC TAT ACT TTT AAA GGT ATT 432 Tyr He Pro Thr Ser Gly Asn Thr Vol Gly Tyr Thr Phe Lys Gly He

130 135140

Hhol

GAI GGT TTA GTA TTA GGC GCT AAI TAT TTA TTA GCA CAA AAG CGT GAG 480

Asp Gly Leu Vol Leu Gly Ala Asn Tyr Leu Leu Ala Gin Lys Arg Glu 145 150155

FIG.6A

181 695

GGT GCA AAA GGT GAA AAT AAG CGG CCT AAT GAT AAG GCT GGT GAA GTA528

Gly Ala Lys Gly Glu Asn Lys Arg Pro Asn Asp Lys Ala Gly GluVal

160 165 170175

EcoRl

CGT ATA GGT GAA ATC AAT AAT GGA ATT CAA CTT GGT GCA AAA TAT GAT576

Arg [le Gly Glu Ile Asn Asn Gly Ile Gin Val Gly Ala Lys TyrAsp

180 185190

GCA AAC GAC ATC GTT GCA AAA ATT GCT TAT CGT AGA ACT AAC TAC AAA624

Ala Asn Asp He Val Ala Lys He Ala Tyr Gly Arg Thr Asn TyrLys

195 200205

TAT AAC GAA TCT GAC GAG CAT AAA CAG CAA TTA AAT GGT GTA TTA GCA672

Tyr Asn Glu Ser Asp Glu His Lys Gin Gin Leu Asn Gly Vol LeuAla

210 215220

Xbol

ACT TTA GGC TAT CGT TTT AGT GAT TTA GGC TTA TTA GTG TCT CTA GAT720

Thr Leu Gly Tyr Arg Phe Ser Asp Leu Gly Leu Leu Val Ser LeuAsp

225 230235

AGT GGC TAT GCA AAA ACT AAA AAC TAI AAA ATT AAA CAC GAA AAA CGC768

Ser Gly Tyr Ala Lys Thr Lys Asn Tyr Lys Ile Lys His Glu LysArg

240 245 250255

Asel

TAT TTC GTA TCT CCA GCT TTC CAA TAT GAĄ TTA ATG GAA GAT ACT MT816

Tyr Phe Vol Ser Pro Gly Phe Gin lyr Glu Leu Met Glu Asp ThrAsn

260 265270

GTC TAT GGC AAC TTC AM TAT GM CGC ACT TCT GTA GAT CM GGT GM864

Vol Tyr Gly Asn Phe Lys Tyr Glu Arg Thr Ser Vol Asp Gin GlyGlu

275 280285

AM ACA CGT GM CM GCA GTA TTA TTC GCT GTA GAT CAT AM CH CAC912

Lys Thr Arg Glu Gin Ala Val Leu Phe Gly Vol Asp His Lys LeuHis

290 295300

AM CM CTA TTA ACC TAT ATT GM GCT CCI TAC CCI AGA ACT AGA ACA960

Lys Gin Leu Leu Thr Tyr Ile Glu Gly Alo Tyr Ala Arg Thr ArgThr

305 310315

FIG.6B

181 695

ACT GAG ACA GGT AAA GGC GTA AAA ACT GAA AAA GAA AAA TCA GTG GGT1008

Thr Glu Thr Gly Lys Gly Val Lys Thr Glu Lys Glu Lys Ser VolGly

320 325 330335

Mlul

GTA GGT TTĄ CGC GTT TAC TTC TAATCATTTG TTAGAAATAC ATTATTAAAA1059

Vol Gly Leu Arg Val Tyr Pheend

340

Xhol

GCAAGGCCAC TCGAG .. ..1074

FIG.6C

181 695

Hdel

CAT ATC GCT GTT GIT TAT AAC AAC GAA GGG ACT AAC GTA GAA TTA GGT48

Mel Ala Vol VoI Tyr Asn Asn Glu Gly Thr Asn Vol Glu LeuGly

1015

GGT CGT TTA AGC ATT ATC GCA GAA CAA AGT AAT AGC ACT GTA GAT AAT96

Gly Arg Leu Ser [le Ile Alo Glu Gin Ser Asn Ser Thr VoI AspAsn

2530

CAA AAA CAG CAA CAC GGT GCA TTA CGC AAT CAA GGT TCA CGT TTC CAC144

Gin Lys Gin Gin His Gly Ala Leu Arg Asn Gin Gly Ser Arg PheHis

4045

ATT AAA GCA ACT CAT AAC TTC GGT CAT GGT TTC TAT GCA CAA CGT TAT192

He Lys Ala Thr His Asn Phe Gly Asp Gly Phe Tyr Alo Gin GlyTyr

5560

TTA GAA ACT CGT TTT GTT ACA AAA GCC TCT GAA AAC GGT TCA GAT AAC240

Leu Glu Thr Arg Phe Vol Thr Lys Alo Ser Glu Asn Gly Ser AspAsn

7075

TTC GGT GAT ATT ACA AGC AAA TAT GCT TAT GTT ACT TTA GGA AAT AAA288

Phe Gly Asp Ile Thr Ser Lys Tyr Ala Tyr Val Thr Leu Gly AsnLys

85 9095

CCA TTC GGT GAA GTA AAA CTT CGT CGT GCG AAA ACT ATT GCT GAT GGC336

Alo Phe Gly Glu VoI Lys Leu Gly Arg Alo Lys Thr I le Alo AspGly

100 105110

ATA ACA AGT GCA GAA GAT AAA GAA TAT GGC GTT CTC AAC AAT ACT CAC384

He Thr Ser Alo Glu Asp Lys Glu Tyr Cly Vol Leu Asn Asn SerAsp

115 120125

SpelDrol

TAT ATT CCT ACT AGT GGT AAT ACG GTT CGC TAT ACT TTT ĄĄĄ CGT ATT 432

Tyr He Pro Thr Ser Gly Asn Thr Vol Gly Tyr Thr Phe Lys Gly He

130 135140

FIG.7A

181 695

Hhol

GAT GGT TTA GTA TTA GGC GCT AAT TAT TTA TTA GCA CAA AAG CGT GAG480

Asp Gly Leu Val Leu Gly Alo Asn Tyr Leu Leu Ala Gin Lys ArgGlu

145 150155

GGT GCA AAA GGT GAA AAT AAG CGG CCT AAT GAT AAG GCT GGT GAA GTA528

Gly Alo Lys Gly Glu Asn Lys Arg Pro Asn Asp Lys Alo Gly GluVol

160 165 170175

EcoRI

CGT ATA GGT GAA ATC AAT AAT GGA ATT CAA GTT GGT GCA AAA TAT GAT576

Arg Ile Gly Glu He Asn Asn Gly Ile Gin Val Gly Alo Lys TyrAsp

180 185190

GCA AAC GAC ATC GTT GCA AAA ATT GCT TAT GCT AGA ACT AAC TAC AAA624

Ala Asn Asp Ile Vol Alo Lys He Alo Tyr Gly Arg Thr Asn TyrLys

195 200205

TAT AAC GAA TCT GAC GAG CAT AAA CAG CAA TTA AAT GGT GTA TTA GCA672

Tyr Asn Glu Ser Asp Glu His Lys Gin Gin Leu Asn Gly Vol LeuAlo

210 215220

Xbol

ACT TTA GGC TAT CGT TTT AGT GAT TTA GGC TTA TTA GTG TCT CTA GAI720

Thr Leu Gly Tyr Arg Phe Ser Asp Leu Gly Leu Leu Val Ser LeuAsp

225 230235

AGT GGC TAT GCA AAA ACT AAA AAC TAT AAA ATT AAA CAC GAA AAA CGC768

Ser Gly Tyr Alo Lys Thr Lys Asn Tyr Lys Ile Lys His Glu LysArg

240 245 250255

Asel

TAT TTC GTA TCT CCA GGT TTC CAA TAT GAĄ TTA ATG CAA GAT ACT AAT 816

Tyr Phe VoI Ser Pro Gly Phe Gin Tyr Glu Leu Met Glu Asp Thr Asn 260 265270

GTC TAT GGC AAC TTC AAA TAT GAA CGC ACT TCT GTA GAT CAA GGT GAA864

Vol Tyr Gly Asn Phe Lys Tyr Glu Arg Thr Ser Vol Asp Gin GlyGlu

275 280285

AAA ACA CGT GAA CAA GCA CTA TTA TTC GGT GTA GAT CAT AAA CTT CAC912

Lys Thr Arg Glu Gin Alo Vol Leu Phe Gly Vol Asp His Lys LeuHis

FIG.7B

181 695

290 295300

AAA CAA CTA TTA ACC TAT ATT GAA GGT GCT TAC GCT AGA ACT AGA ACA960

Lys Gin Leu Leu Thr Tyr [le Glu Gly Ala Tyr Ala Arg Thr ArgThr

305 310315

ACT GAG ACA GGT AAA GGC GTA AAA ACT GAA AAA GAA AAA TCA GTG GGT1008

Thr Glu Thr Gly Lys Gly Val Lys Thr Glu Lys Glu Lys Ser ValGly

320 325 330335

Mlul

GTA GGT TTA CGC GTT TAC TTC TAATCATTTG TTAGAAATAC ΑΤΪΑΤΤΑΑΑΑ 1059

Vol Gly Leu Arg Yal Tyr Phe

340

Bmrtil

GCAAGGCGGĄ TCC 1072

FIG.7C

181 695 kDa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

FIG. 8A

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

FIG. 8B

Departament Wydawnictw UP RP Nakład 70 egz Cena 6,00 zł

Claims (13)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób ekspresj i białka błony zewnętrznej P2 Haemophilus influenzae typu b (Hib-P2) w komórkach E.coli znamienny tym, że

   a) przeprowadza się transformację E.coli wektorem zawierającym marker selekcyjny i gen kodujący białko wybrane z grupy obejmującej (i) dojrzałe białko P2 i (ii) białko funkcyjne obejmujące dojrzałe białko P2 przyłączone do aminokwasów od 1 do 22 białka kapsydu kodowanego przez gen φ 10 faga T7, w którym gen połączony jest operacyjnie z promotorem faga T7 i

   b) hoduje się transformanty £. coli w pożywce LB zawierającej glukozę i czynnik selekcyjny w temperaturze około 30°C do zawartości eksprymowanego białka co najmniej 2% wszystkich białek ulegających ekspresji w komórkach E.coli.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że hoduje się transformanty E. coli do zawartości eksprymowanego białka co najmniej 10% wszystkich białek ulegających ekspresji w komórkach E.coli.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że hoduje się transformanty E.coli do zawartości eksprymowanego białka co najmniej 40% wszystkich białek ulegających ekspresji w komórkach E.coli.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że transformację przeprowadza się wektorem wybranym z grupy obejmującej pET-17b, pET-11 a, pET-24a-d(+) i pET-9a.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że transformację przeprowadza się wektorem zawierającym gen białka Hib-P2 połączony z promotorem faga T7 w ekspresyjnym plazmidzie pET-17b.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje dalsze etapy oczyszczania, w których

   c) przerowadza się lizę uzyskanych w etapie b) komórkach E.coli i uwalnia się białko w postaci nierozpuszczalnych ciał inkluzyjnych.

   d) przemywa się ciała inkluzyjne uzyskane w etapie c) buforem rozpuszczającym białka komórkowe E.coli, w którym nie są rozpuszczalne ciała inkluzyjne, korzystnie TEN, EDTA, NaCl, Bicyną, Tricyną lub HEPES, i usuwa się zanieczyszczające białka komórkowe E.coli,

   e) zawiesza się i rozpuszcza ciała inkluzyjne uzyskane w etapie d) w wodnym roztworze środka denaturującego, korzystnie guanidyny lub mocznika,

   f) rozcieńcza się roztwór uzyskany w etapie e) detergentem rozcieńczającym rozpuszczone białko P2 lub białko fuzyjne, korzystnie detergentem jonowym, niejonowym lub amfoterycznym i

   g) oczyszcza się białko za pomocą filtracji żelowej.
7. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że obejmuje dalszy etap fałdowania, w którym h) umieszcza się produkt po filtracji żelowej w temperaturze około 4°C w roztworze wodnym o wysokim stężeniu NaCl i jonów wapnia do uzyskania sfałdowanego białka o wykształconej strukturze trzeciorzędowej.
8. 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że

   i) otrzymuje się polisacharyd otoczkowy Haemophilus i

   j) przeprowadza się koniugację białka błony zewnętrznej P2 lub białka fuzyjnego z polisacharydem otoczkowym.

   181 695
9. 9. Szczepionka przeciwko Haemophilus influenzae typu b znamienna tym, że zawiera ponownie zwinięte białko błony zewnętrznej P2 z Haemophilus influenzae typu b (Hib-P2) lub jego białko fuzyjne wraz z farmaceutycznie dopuszczalnym rozcieńczalnikiem, nośnikiem lub zaróbką, przy czym białko obecne jest w ilości od 2 do 100 pg/kg wagi ciała.
10. 10. Szczepionka według zastrz. 9, znamienna tym, że zawiera białko błony zewnętrznej P2 sprzężone z polisacharydem otoczkowym Haemophilus.
11. 11. Wektor ekspresyjny pNV-3, znamienny tym, że składa się z wektora pET-17b z wklonowanąw miejsca restrykcyjne Nde I i Xho I sekwencją oznaczonąnumerem identyfikacyjnym 11.
12. 12. Wektor ekspresyjny pNV-2, znamienny tym, że składa się z wektora pET-17b z wklonowaną w miejsca restrykcyjne Barn HI i Xhol sekwencją oznaczoną numerem identyfikacyjnym 9.
13. 13. Wektor ekspresyjny pNV-6, znamienny tym, że składa się z wektora pET-Ι la z wklonowanąw miejsca restrykcyjne Ndel i Barn HI sekwencją oznaczoną numerem identyfikacyjnym 13.

    * * *