PL182597B1

PL182597B1 - Kompozycja farmaceutyczna i kosmetyczna do modyfikowania apoptozy

Info

Publication number: PL182597B1
Application number: PL95320963A
Authority: PL
Inventors: Georges A. Quash; Alain Doutheau
Original assignee: Galderma Rech Dermatologique
Priority date: 1994-12-29
Filing date: 1995-12-22
Publication date: 2002-02-28
Also published as: MX9704491A; PL320963A1; DK0723778T3; PT723778E; KR970706807A; FI972780A7; US5744499A; ATE191339T1; IL116586A0; WO1996020701A1; FR2728790B1; NO973034D0; AU4451296A; GR3033732T3; ES2147272T3; JP2000515845A; CA2166243C; FR2728790A1; BR9510509A; AU704064B2

Abstract

. 1. Kompozycja farmaceutyczna, do modyfikowania apoptozy, zawierajaca czynnik aktywny w farmaceutycznie dopuszczalnym podlozu, znamienna tym, ze obejmuje jako czynnik aktywny, co najmniej jeden zwiazek wybrany sposród metionalu, malonodialdehydu i kazdego czynnika, który zwieksza wewnatrzkomórkowy poziom metionalu lub dialdehydu malonowego. 14. Kompozycja kosmetyczna, do modyfikowania apoptozy, zawierajaca czynnik akty- wny w kosmetycznie dopuszczalnym podlozu, znamienna tym, ze obejmuje jako czynnik aktywny, co najmniej jeden zwiazek wybrany sposród metionalu, dialdehydu malonowego i czynni- ka, który zwieksza wenatrzkomórkowy poziom metionalu lub dialdehydu malonowego. (1 3 ) B1 PL PL PL PL PL PL PL

Description

Wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej i kosmetycznej zawierającej związek wybrany spośród metionalu, malonodialdehydu i każdego czynnika, wpływającego na wenątrzkomórkowy poziom metionalu lub malonodialdehydu. Takie środki lecznicze są w szczególności przeznaczone do modyfikowania zjawiska programowanej śmierci komórek (apoptozy).

Wynalazek dotyczy kompozycji, które modyfikująapoptozę i stosuje się go do zapobiegania i/lub zwalczania starzenia się skóry wywołanego przez światło lub upływ czasu.

Istnieją dwa typy mechanizmów, związanych ze śmierciąkomórek. Pierwszy, typu konwencjonalnego, znany jest jako nekroza. Morfologicznie, nekrozę charakteryzuje pęcznienie mitochondriów i cytoplazmy oraz uszkodzenie jądra, po którym następuje zniszczenie komórki i jej autoliza, czemu towarzyszy stan zapalny. Nekroza przebiega biernie i przypadkowo. Nekroza tkanki jest generalnie wynikiem np. urazu fizycznego komórek lub zatrucia chemicznego.

Inna forma śmierci komórki jest znana jako apoptoza [J.F.R. Kerr i A.H. Wylie, Br.J.Cancer, 265,239 (1972)] ale w przeciwieństwie do nekrozy, apoptoza nie prowadzi do zjawiska zapalenia. Wyżej wymieniony artykuł opisuje, jak w różnych warunkach fizjologicznych powstaje apoptoza. Jest to wysoce selektywna forma samobójstwa komórki, charakteryzująca się łatwymi do zaobserwowania zjawiskami morfologicznymi i biochemicznymi. Tak więc, można zwłaszcza zaobserwować nagromadzenie chromatyny, które może, lecz nie musi, być związane z aktywnością endonukleazy, tworzenie ciał apoptotycznych i fragmentację kwasu deoksyrybonukleinowego (DNA), przez aktywację endonukleaz, do fragmentów DNA o 180-200 parach zasad (fragmenty takie można obserwować drogą elektroforezy w żelu agarozowym).

Apoptozę można uznać za programowaną śmierć komórek, związaną z rozwojem, różnicowaniem i homeostazą tkanki. Uważa się więc, że różnicowanie, wzrost i dojrzewanie komórek jest ściśle związane z apoptozą. W ten sposób w zdrowym człowieku istnieje równowaga między wszystkimi tymi zjawiskami.

W dziedzinie medycyny, znaczna ilość sytuacji patologicznych stanowi zmodyfikowany lub nawet pozbawiony równowagi mechanizm apoptozy, albo mechanizm apoptozy, który nie powoduje rozregulowania innego zjawiska biologicznego, aby dojść do równowagi. Tak więc, opisano, że samorzutna modyfikacja apoptozy, przez pobudzanie jej lub hamowanie, umożliwia leczenie wielu schorzeń, szczególniej schorzeń związanych z hiperproliferacjąkomórkową, taką jak w wypadku raka, schorzeń autoimmunologicznych lub alergicznych albo przeciwnie, schorzeń związanych z utratą komórek, takich jak w wypadku zespołu niedoboru odporności spowodowanego przez ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV), schorzeń prowadzących do degeneracji nerwów (choroba Alzheimera), oraz postępującego uszkodzenia wywołanego w trakcie zawału mięśnia sercowego lub uszkodzenia na skutek niedokrwienia mózgu.

W onkologii obserwuje się, w całkiem jasny sposób, że wiele leków przeciwrakowych, takich jak adriamycyna i cyklofosfamid, jest zdolnych do indukowania apoptozy.

W dziedzinie kosmetyki, oznaki starzenia się skóry są zasadniczo wynikiem dysfunkcji głównych mechanizmów biologicznych skóry związanych zwłaszcza z mechanizmem apoptozy. Można więc sądzić, że każdy produkt, który modyfikuje mechanizm apoptozy, jest produktem

182 597 zdolnym do zapobiegania i/lub zwalczania początku starzenia oraz istniejących oznak starzenia, takich jak zmarszczki i drobne bruzdy.

Jednakże, nie jest znany związek między produktami egzogenicznymi lub endogenicznymi w stosunku do komórki oraz odpowiedziąkomórkowąna nie, indukującą lub hamującąapoptozę.

Zgłaszający stwierdził, że apoptozę można indukować przez zwiększenie wewnątrzkomórkowego poziomu naturalnego metabolitu, metionalu (3-metylotiopropanalu) lub malonodiaIdehydu. Zgłaszający stwierdził także, że równowaga przemiany in vivo metionalu do malonodialdehydu może być zakłócona przez ekspresję onkogenów, takich jak gen bcl₂. Ten gen bcl₂ opisano zwłaszcza jako zdolny do hamowania apoptozy indukowanej przez reaktywne postacie tlenu, a szczególniej w komórkach nerwowych (D.J.Kane i in., 1993, Science 262, 1274-1277).

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest więc kompozycja farmaceutyczna do modyfikowania apoptozy, zawierająca czynnik aktywny w farmaceutycznie dopuszczalnym podłożu, charakteryzująca się tym, że obejmuje jako czynnik aktywny, co najmniej jedne związek wybrany spośród metionalu, malonodialdehydu i każdego czynnika, który zwiększa wewnątrzkomórkowy poziom metionalu lub dialdehydu malonowego.

Drugim przedmiotem wynalazku jest kompozycja kosmetyczna, do modyfikowania apoptozy, zawierająca czynnik aktywny w kosmetycznie dopuszczalnym podłożu, charakteryzująca się ty, że obejmuje jako czynnik aktywny, co najmniej jeden związek wybrany spośród metionalu, dialdehydu malonowego i czynnika, który zwiększa wenątrzkomórkowy poziom metionalu lub dialdehydu malonowego.

Metional, malonodialdehyd i każdy czynnik, który wpływa na wewnątrzkomórkowy poziom metionalu, może być użyty w niniejszym wynalazku pojedynczo lub korzystnie w mieszaninie. Oczywiście, produkt wybiera się w zależności od przeznaczenia, to jest zarówno w celu pobudzenia jak i zahamowania apoptozy.

W metabolizmie .metionalu wiadomo, że kwas 4-metylotio-2-oksobutanowy może być metabolizowany in vivo przez kompleks dehydrogenazy okso kwasu o rozgałęzionym łańcuchu obecnym w mitochondriach komórek wątroby, serca i mięśni szkieletowych, poprzez metional, aby dać metylotiopropionyloCoA [porównaj G. Wu & S.J. Yeaman (1989) Biochem. J. 257, 281-284; D.Hausinger, T.Stehle, & W. Gerok (1985) J.Biol.Chem.366,527-536; S.M.A.Jones & S.J.Yeaman (1986) Biochem. J. 237, 621-623]. Opisano także, że kwas 4-metylotio-2-oksobutanowy może być metabolizowany in vivo przez transaminację do metioniny [porównaj G.Ogier, J.Chantepie, C.Deshayes, B.Chantegrel, C.Charlot, A.Doutheau & G.Quash (1993) Biochem. Pharmacol. 45,1631-1644], Metional może być także ewentualnie redukowany lub utleniany odpowiednio do metionolu przez reduktazę aldehydową lub do kwasu metylotiopropionowego przez dehydrogenazę aldehydową. W połączeniu z rodnikiem HO·, metional może na koniec, dać malonodialdehyd i metanotiol przez reakcję β-hydroksylacji. Tak więc, dla lepszego umiejscowienia metionalu, malonodialdehydu i czynników, które mogą wpływać na ich poziom wewnątrzkomórkowy, fig. 1 ilustruje metabolizm metionalu, jednakże bez ograniczenia zakresu wynalazku.

W tej fig. 1:

- MTOB oznacza kwas 4-metylotio-2-oksobutanowy;

- MTPA oznacza kwas metylotiopropionowy;

- El oznacza dekarboksylazę z kompleksu dehydrogenazy oksokwasu o łańcuchu rozgałęzionym, którego kofaktorem jest pirofosforan tiaminy (TPP);

- E2 oznacza transącylazę z kompleksu dehydrogenazy oksokwasu o łańcuchu rozgałęzionym, którego kofaktorem jest kwas tioktanowy (TA);

- ALDR oznacza reduktazę aldehydową;

- ALDH oznacza dehydrogenazę aldehydową.

Zgodnie z wynalazkiem, wyrażenie „czynnik, który wpływa na wenątrzkomórkowy poziom metionalu lub malonodialdehydu” rozumie się jako związki wybrane spośród prekursorów i produktów metionalu lub malonodialdehydu oraz inhibitorów i aktywatorów enzymów związanych z metabolizmem metionalu lub malonodialdehydu. Tak więc, biorąc pod uwagę metabo

182 597 lizm metionalu lub malonodialdehydu zilustrowany na fig. 1, można łatwo zrozumieć jak te związki, metional lub malonodialdehyd, modyfikuj ąwenątrzkomórkowy poziom metionalu lub malonodialdehydu, w sposób okresowy albo długoterminowy, gdy wprowadza się je do układu komórkowego.

Prekursorami lub produktami metionalu lub malonodialdehydu mogą być prekursory lub produkty metabolizmu wewnątrzkomórkowego metionalu, takie jak kwas 4-metylotio-2-oksobutanowy, metionina, metionol, kwas metylotiopropionowy i metylotiopropionyloCoA.

Prekursorami lub produktami metionalu lub malonodialdehydu mogą być także produkty, które in situ posiadają zdolność uwalniania metionalu lub malonodialdehydu albo uwalniania czynnika, który wpływa na wenątrzkomórkowy poziom metionalu lub malonodialdehydu, takie jak estry i tioestry metionalu lub malonodialdehydu, uwalniające metional lub malonodialdehyd in situ, albo kwas 4-metylotio-2-hydroksybutanowy, który metabolizowany jest in situ do kwasu 4-metylotio-2-oksobutanowego. W dziedzinie farmacji produkty te sąznane razem jako „proleki”.

Gdy pożądane jest pobudzenie apoptozy, metional, malonodialdehyd albo prekursory lub produkty metionalu lub malonodialdehydu stosuje się korzystnie w połączeniu z inhibitorami enzymów związanych z reakcjami metabolicznymi, sprzyjającymi usuwaniu metionalu, innymi niż reakcj a β-hydroksy lacj i wspomniana powyżej (która przekształca metional w malonodialdehyd), albo w połączeniu z aktywatorami β-hydroksylazy, będącej enzymem związanym z przekształcaniem metionalu w malonodialdehyd. I tak, można wspomnieć np. o połączeniu kwasu 4-metylotio-2-oksobutanowego z inhibitorem transaminazy związanej z przemianą kwasu 4-metylotio-2-oksobutanowego w metioninę, takim jak inhibitory zaznaczone poniżej.

Można także przewidzieć połączenie metionalu lub czynnika zwiększającego wewnątrzkomórkowy poziom metionalu ze związkami zwiększającymi poziom wolnego rodnika HO·. I tak można wspomnieć o BCNU (N,N-bis(2-chloroetylo)-N-nitrozomocznik) ponieważ jest on inhibitorem reduktazy glutationowej, co pozwala na zwiększenie wewnątrzkomórkowego poziomu reaktywnych postaci tlenu, takich jak rodnik HO·, który jest jednym z substratów reakcji β-hydroksylacji, dającej w rezultacie malonodialdehyd.

Połączenie takie jest zwłaszcza korzystne w przypadku patologii, które charakteryzują się nadekspresjągenubcli. Patologiami takimi są, w szczególności, raki piersi, chłoniaki komórek B, białaczki, nerwiaki niedojrzałe, gruczolakoraki prostaty, gruczolak części przysadki odpowiadającej za uwalnianie prolaktyny i inne gruczolaki przysadkowe. Nadekspresja genu bc 12 nadaje oporność chemiczną komórkom. To połączenie może więc umożliwić częściowo lub nawet w całości, zahamowanie tej chemioopomości.

Korzystnie, do tego połączenia można dodać co najmniej jeden inhibitor transaminazy związany z przemianą kwasu 4-metylotio-2-oksobutanowego w metioninę, taki jak opisane poniżej, a szczególniej związek o wzorze 9.

Wśród inhibitorów lub aktywatorów enzymów związanych z metabolizmem metionalu należy zwłaszcza wspomnieć o inhibitorach lub aktywatorach kompleksu dehydrogenazy oksokwasu o rozgałęzionym łańcuchu związanym z przemianą kwasu 4-metylotio-2-oksobutanowego w metylotiopropionyloCoA poprzez metional, lub inhibitorach lub aktywatorach transaminazy związanych z przemianą kwasu 4-metylotio-2-oksobutanowego w metioninę, albo inhibitorach lub aktywatorach reduktazy aldehydowej odpowiedzialnej za redukcję metionalu do metionolu lub dehydrogenazy aldehydowej odpowiedzialnej za oksydację metionalu do kwasu metylotiopropionowego, lub też aktywatorach albo inhibitorach β-hydroksylazy, która jest enzymem związanym z przemianą metionalu w malonodialdehyd.

Jako inhibitory transaminazy związanej z przemianąkwasu 4-m etylotio-2-oksobutanowego w metioninę, a więc jako czynniki zwiększające wewnątrzkomórkowy poziom metionalu lub malonodialdehydu, należy także wymienić produkty opisane przez G. Ogiera, J.Chantepie, C.Deshayesa, B.Chantegrela, C.Charlota, A.Doutheau & G.Quasha (1993) Biochem.Pharmacol.,45 1631-1644.

Szczególniej, inhibitory transaminazy związanej z przemianą kwasu 4-metylotio-2-oksobutanowego w metioninę, wybiera się spośród produktów o podanych wzorach 1-9, w których X oznacza rodnik -OH lub rodnik -OPO₃H₂.

182 597

Szczególnie zaleca się związek o wzorze 9, w którym X oznacza rodnik -OH. Jako inhibitory transaminazy związanej z przemianą kwasu 4-metylotio-2-oksobutanowego w metioninę, a więc jako czynniki zwiększające wewnątrzkomórkowy poziom metionalu lub malonodialdehydu, należy także wymienić hydroksamiany amidoaminokwasów, takie jak hydroksamian D-asparaginy o wzorze CONHOHCH₂CHNH₂COOH oraz hydroksamian L-glutaminy o wzorze CONHOHCH₂CH₂CHNH₂COOH.

Gdy pożądanej est pobudzenie apoptozy, zaleca się według wynalazku użycie związku wybranego spośród metionalu, malonodialdehydu, produktów, które posiadają zdolność in situ do uwalniania metionalu lub malonodialdehydu, takich jak estry lub tioestry metionalu lub malonodialdehydu, albo aktywatorów enzymu związanego z przemianąmetionalu w malonodialdehyd.

Spośród mieszanin szczególnie korzystnych do indukowania apoptozy, można wymienić zwłaszcza połączenie metionalu z co najmniej jednym inhibitorem transaminazy związanej z przemianą kwasu 4-metylotio-2-oksobutanowego w metioninę oraz korzystnie związek o wzorze 9.

Kompozycja według wynalazku jest zwłaszcza przeznaczona do następujących zastosowań:

1) Do leczenia dolegliwości związanych z zaburzeniami keratynizacji, dotyczącymi różnicowania i hiperproliferacji, zwłaszcza do leczenia trądziku pospolitego, zaskómików, różnokształtności jąder leukocytów, trądzika różowatego, trądzika guzkowato-torbielowatego, ciężkiego trądzika torbielowatego, trądzika starczego oraz wtórnych trądzików, takich jak trądzik słoneczny, związany z lekami lub trądzik zawodowy.

2) Do leczenia innych typów zaburzeń keratynizacji, w szczególności rybiej łuski, stanów podobnych do rybiej łuski, choroby Dariera, keratodermii dłoniowo-podeszwowej, leukoplazji i stanów leukoplazjopodobnych, oraz liszajów skórnych i błon śluzowych (policzkowych).

3) Do leczenia innych dolegliwości dermatologicznych związanych z zaburzeniami keratynizacji połączonych z zapaleniem i/lub immunoalergią, oraz w szczególności wszystkich postaci łuszczycy, zarówno skórnej, błony śluzowej jak i łuszczycy paznokciowej, a nawet reumatyzmu łuszczycowego, lub też atopii skórnej, takiej jak egzema, lub atopii oddechowej lub też hipertrofii dziąsłowej;

4) Do leczenia wszystkich hiperproliferacji skórnych lub naskórkowych, zarówno łagodnych jak i złośliwych, zarówno pochodzenia wirusowego lub innego, takich jak brodawki zwykłe, brodawki płaskie młodzieńcze oraz dysplazja naskórka brodawkopodobna, ustnych lub czerwonych brodawczakowatości i heproproliferacji indukowanych przez promieniowanie ultrafioletowe, zwłaszcza w przypadku nabłoniaka podstawnokomórkowego i kolczystokomórkowego,

5) Do leczenia innych zaburzeń dermatologicznych, takich jak dermatozy z pęcherzami i choroby kolagenowe,

6) Do leczenia pewnych zaburzeń oftalmologicznych, zwłaszcza chorób rogówki (comeopathies),

7) Do zwalczania lub naprawiania skutków starzenia się skóry, spowodowanego zarówno światłem jak i upływem czasu, albo do zmniejszania rogowaceń popromiennych lubpigmentacji, albo każdej patologii związanej ze starzeniem z upływem czasu lub popromiennym,

8) Do zapobiegania lub leczenia znamion atrofii naskórkowej i/lub skórnej wywołanej przez miejscowe lub układowe kortykosteroidy, albo każdej innej postaci atrofii skórnej,

9) Do zapobiegania lub leczenia zaburzeń bliznowacenia albo do zapobiegania lub leczenia rozstępów,

10) Do zwalczania zaburzeń funkcjonowania gruczołów łojowych, takich jak nadmierny łojotok trądzikowy lub łojotok zwyczajny,

11) W leczeniu lub zapobieganiu stanów rakowych lub przedrakowych,

12) W leczeniu dolegliwości zapalnych, takich jak zapalenie stawów,

13) W leczeniu każdej ogólnej lub skórnej dolegliwości pochodzenia wirusowego, takiej jak zapalenie wątroby,

14) W zapobieganiu lub leczeniu łysienia,

182 597

15) W leczeniu dermatologicznych lub ogólnych dolegliwości, z czynnikiem immunologicznym,

16) W leczeniu dolegliwości układu sercowo-naczyniowego, takich jak miażdżyca tętnic i trombocytopenia,

17) W leczeniu chorób przebiegających z degeneracjąnerwów, takichjak choroba Alzheimera.

W dziedzinach terapeutycznych wymienionych powyżej kompozycje według wynalazku mogą korzystnie zawierać inne czynniki aktywne, takie jak retinoidy, czynniki przeciw wolnym rodnikom, pochodne witaminy D, kortykosteroidy lub estrogeny, antyoksydanty, a-hydroksylub α-ketokwasy albo ich pochodne, lub też substancje blokujące kanały potasowe.

Retinoidy mogą być pochodzenia naturalnego lub syntetycznego. Spośród retinoidów, można wymienić kwas 9-cis-retinowy i kwas całkowicie trans-retinowy.

Spośród witamin D lub ich pochodnych można zwłaszcza wymienić pochodne witaminy D₂ lub D₃, a w szczególności 1,25-dihydroksywitaminę D₃.

Spośród czynników przeciw wolnym rodnikom, można zwłaszcza wymienić a-tokoferol, dysmutazę ponadtlenkową, ubichinol i pewne czynniki chelatujące metale.

Spośród α-hydroksy- lub a-ketokwasów albo ich pochodnych można zwłaszcza wymienić ketoleucynę, ketoizoleucynę, ketowalinę, 2-oksomaślan, kwas 4-metylotio-2-oksobutanowy, kwas mlekowy, kwas jabłkowy, kwas cytrynowy, kwas glikolowy, kwas migdałowy, kwas winowy, kwas glicerynowy, kwas askorbinowy lub pochodne kwasu salicylowego, albo ich sole, amidy lub estry.

Spośród substancji blokujących kanały potasowe można zwłaszcza wymienić minoksydyl (2,4-diamino-6-piperydynopirymidyno-3-tlenek) oraz jego pochodne.

Kompozycje według wynalazku można podawać doustnie, pozajelitowe, zewnętrznie lub do oczu. Korzystnie kompozycję farmaceutyczną konfekcjonuje się w postaci odpowiedniej dla stosowania układowego (do wstrzyknięć lub wlewów).

Do podawania doustnego kompozycja, szczególniej kompozycja farmaceutyczna, występuje w postaci tabletek, kapsułek żelatynowych, drażetek, syropów, zawiesin, roztworów, proszków, granulatów, emulsji, mikrokuleczek lub nanokuleczek i polimerowych lub lipidowych pęcherzyków zdolnych do kontrolowanego uwalniania. Do podawania pozajelitowego kompozycja może występować w postaci roztworów lub zawiesin do wlewów albo do wstrzyknięć.

Produkt leczniczy według wynalazku podaje się generalnie w dziennej dawce około 0,001-100 mg/kg ciężaru ciała w 1-3 dawek.

Do podawania zewnętrznego kompozycja farmaceutyczna według wynalazku jest zwłaszcza przeznaczona do leczenia skóry oraz śluzówek i może występować w postaci maści, kremów, mleczek, balsamów, pudrów, impregnowanych tamponów, roztworów, żeli, sprayów, lotionów lub zawiesin. Może ona także występować w postaci mikrokuleczek, nanokuleczek, polimerowych lub lipidowych pęcherzyków, albo polimerowych plasterków i hydrożeli zdolnych do kontrolowanego uwalniania. Ta kompozycja do stosowania zewnętrznego może występować zarówno w postaci bezwodnej jak i wodnej.

Do podawania do oczu są to głównie krople do oczu.

Kompozycja farmaceutyczna do stosowania zewnętrznego lub do oczu zawiera metional, malonodialdehyd lub każdy inny czynnik, który wpływa na wewnątrzkomórkowy poziom metionalu lub malonodialdehydu, o stężeniu korzystnie 0,001-5% w stosunku do całkowitego ciężaru kompozycji.

Kompozycja kosmetyczna według wynalazku znajduje także zastosowanie, zwłaszcza w pielęgnacji ciała i włosów, a szczególnie do pielęgnacji skóry z tendencją do występowania trądzika, do pobudzania odrastania włosów, do zwalczania wypadania włosów, w zabezpieczaniu przed szkodliwymi skutkami działania słońca lub w pielęgnacji fizjologicznie suchej skóry, oraz w zapobieganiu i/lub zwalczaniu starzenia wywołanego światłem lub upływem czasu.

182 597

W dziedzinie kosmetyki, kompozycja według wynalazku może korzystnie zawierać retinoidy, witaminy D lub ich pochodne, kortykosteroidy, czynniki przeciw wolnym rodnikom, α-hydroksy- lub a-ketokwasy lub ich pochodne, lub też substancje blokujące kanały jonowe. Te różne produkty używane w kompozycji są takie jak określono powyżej.

Kompozycja kosmetyczna według wynalazku może w szczególności występować w postaci kremu, mleczka, lotionu, żelu, mikrokuleczek, nanokuleczek, albo polimerowych lub lipidowych pęcherzyków, mydła lub szamponu.

Stężenie metionalu, malonodialdehydu lub każdego czynnika, który wpływa na wenątrzkomórkowy poziom metionalu lub malonodialdehydu w kompozycji kosmetycznej wynosi korzystnie 0,0001-3% wagowych kompozycji.

Kompozycje farmaceutyczne i kosmetyczne według wynalazku mogą także zawierać dodatki obojętne albo nawet farmakodynamicznie lub kosmetycznie aktywne, albo połączenia tych dodatków, a zwłaszcza: środki zwilżające; środki odbarwiające, takie jak hydrochinon, kwas azelainowy, kwas kawowy lub kwas kojowy; zmiękczacze; środki nawilżające, takie jak glicerol, PEG 400, triamorfolinon i jego pochodne, lub mocznik; środki przeciwłojotokowe lub przeciwtrądzikowe, takie jak S-karboksymetylocysteina, S-benzylocysteamina, ich sole i ich pochodne, albo nadtlenek benzoilu; antybiotyki, takie jak erytromycyna i jej estry, neomycyna, klindamycyna i jej estry, oraz tetracykliny; środki grzybobójcze, takie jak ketokonazol lub 4,5-polimetyleno-3-izotiazolinony; środki pobudzające odrastanie włosów, takie jak minoksydyl (2,4-diamino-6-piperydynopirymidyno-3-tlenek) i jego pochodne, diazoksyd (7-chloro-3metylo-l,2,4-benzotiadiazyno-l,l-ditlenek) i fenytoina (5,4-difenyloimidazolidyno-2,4-dion); nie steroidowe środki przeciwzapalne; karetenoidy a zwłaszca β-karoten; środki przeciwhiszczycowe, takie jak antralina i jej pochodne, oraz na koniec kwas eikoza-5,8,11,14-tetrainowy i kwas eikoza-5,8,11-tryinowy, ich estry i amidy.

Kompozycje według wynalazku mogą także zawierać środki wzmacniające zapach, konserwanty, takie jak estry kwasu p-hydroksybenzoesowego, stabilizatory, regulatory wilgotności, regulatory pH, modyfikatory ciśnienia osmotycznego, emulgatory, filtry UV-A i UV-B oraz antyoksydanty, takie jak Ortokoferol, butylohydroksyanizol albo butylohydroksytoluen.

Podane się teraz przykłady, w celu zilustrowania i bez żadnego ograniczenia.

Przykłady

Przykła d I

Wpływ metabolitów na wzrost komórek HeLa

Komórki HeLa (0,5 χ 10⁶ na płytkę Petriego) hoduje się w 3 ml podłoża minimalnego Eagle'a, zawierającego 10% wagowych dializowanej surowicy płodu cielęcego. Po 4 godzinach do każdej z trzech płytek dodaje się metional (10 μΜ-1 mM), metionol (10 μΜ-20 mM), kwas metylotiopropionowy (MTPA) (1 μΜ-20 mM), L-metioninę (1 μΜ-20 mM) lub kwas 4-metylotio-2-oksobutanowy (MTOB) (1 μΜ-20 mM). Po trzech dniach w temperaturze 37°C, komórki przemywa się dwukrotnie w pożywce, stanowiącej roztwór soli buforowanej fosforanem (pożywka PBS) przy pH 7,5, i odzyskuje się w tym samym rodzaju buforu.

Wzrost komórek ocenia się przez pomiar zawartości białka (porównaj metoda O.H.Lowriego, N. J.Rosebrouha, A.L.Farra, i R. J.Randalla (1951) J.Biol.Chem., 193,265-275) albo zawartości DNA w lizacie, przy użyciu roztworu trichlorowodorku bisbenzoimidu (Hoechst 33258) (porównaj W.D.Jarvis, R.N.Kolesnick, F.A.Fomari, R.S.Traylor, D.A.Gewirtz i S.Grant (1994) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91,73-77) lub przez określanie aktywności dehydrogenazy mleczanowej, stosując bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ilo)-2,5-difenylotetrazoliowy (MTT) (porównaj T.Mosmann (1983), J.of Immunology.Methods 65, 55-63).

Wyniki zebrano w tabeli 1. Każda podana wartość jest średnią z 3 lub 4 doświadczeń ocenianych pod względem zawartości białka.

182 597

Tabela 1

Produkt	IC50 (mM)
L-metionina	>20
MTOB	1,6
metional	0,10
metionol	>20
MTPA	10

IC50 odpowiada stężeniu produktu koniecznego do otrzymania 50% zahamowania wzrostu komórek.

Wyniki ocenione przez mierzenie zawartości DNA lub przez określenie aktywności dehydrogenazy mleczanowej są porównywalne z otrzymanymi w tej tabeli.

Tabela ta pokazuje różnicę w IC50 metionalu w stosunku do wartości IC50 jego produktów lub jego prekursorów.,

Przykład II

Komórki HeLa (0,5 χ 10⁶ na płytkę Petriego) hoduje się w 3 ml wolnego od metioniny (Met’) podłoża minimalnego Eagle'a, zawierającego 10% wagowych dializowanej surowicy płodu cielęcego. Po 4 godzinach dodaje się 2-oksomaślan (10 μΜ-40 mM) w obecności 2 mM kwasu 4-metylotio-2-oksobutanowego (MTOB). Po trzech dniach w temperaturze 37°C komórki przemywa się dwukrotnie w pożywce, stanowiącej roztwór soli buforowanej fosforanem (pożywka PBS) przy pH 7,5, i odzyskuje się w tym samym rodzaju buforu. Wzrost komórek mierzy się tak samo jak w przykładzie powyżej.

2-Oksomaślan jest dobrze znanym substratem kompleksu dehydrogenazy oksokwasu o łańcuchu rozgałęzionym (BCOADC) (Km 18 μΜ). 2 mM samego MTOB indukuje 72%-ową inhibicję wzrostu. Wyniki pokazuj, że 2-oksomaślan posiada zdolność do znoszenia tej inhibicji wzrostu. Od stężenia 10 mM 2-oksomaślanu inhibicja maleje 2- do 3-krotnie. Tak więc obserwuje się, że aktywność BCOADC w przemianie MTOB do metionalu przenosi się na inny substrat, taki jak 2-oksomaślan, zmniejszając przez to inhibicję wzrostu.

Przykład III

Wpływ metionalu na fragmentację DNA w komórkach BAF3

Użyte komórki odpowiadają mysiej linii komórkowej limfocytamej BAF3, które wymagają interleukiny 3 (IL3) do wzrostu i które ulegają apoptozie (ponad 80% komórek) w nieobecności IL3 ponad 16 godzin [porównaj M.K.L.Collins, J.Marvel, P.Malde i A.Lopez-Rivas (1992) J.Exp.Med. 176, 1043-1052).

χ 10⁶ komórek BAF3 hoduje się w 6 ml pożywki hodowlanej, zawierającej IL3, w płytkach Petriego, w obecności różnych stężeń (200-800 μΜ) metionalu lub propanalu, który jest substratem dehydrogenazy aldehydowej. Po 8 godzinach kontaktu, komórki przemywa się trzy razy w pożywce stanowiącej roztwór soli buforowanej fosforanem (pożywka PBS) przy pH 7,5. Komórki poddaje się lizie w 2 ml 0,1% Tritonu Χ-100,20 mM EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy), 5 mM Tris pH 8 i następnie wiruje przy 30 000 g w temperaturze 4°C przez 30 minut. Supematanty dekantuje się i poddaje następującym analizom.

Dla porównania wytwarza się takie same kultury w pożywce albo wyłącznie z IL3 (+IL3), albo bez IL3 (-IL3).

- Wykonuje się analizę jakościową otrzymanych fragmentów DNA zgodnie z metodą opisaną zwłaszcza w publikacji W.D.Jarvisa, R.N.Kolesnicka, F.A.Formari, R.S.Traylora, D.A.Gawitza i S.Granta (1994) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91, 73-77. Supematanty traktuje się lybonukleazą A (20 μg/ml) przez 1 godzinę w temperaturze 37°C orazproteinaząK (100 μg/ml). DNA oczyszcza się przez ekstrakcję fenolem i wytrąca etanolem.

182 597

Końcowy ekstrakt, fragmenty DNA o niskim ciężarze cząsteczkowym, analizuje się drogą elektroforezy w 1% żelu agarozowym. Po elektroforezie (60V, 3 godziny) żele barwi się bromkiem etydium.

Wyniki pokazująjasno, że metional indukuje apoptozę; otrzymany żel przedstawia obraz skali wielokrotnych fragmentów DNA o 180-200 parach zasad, typowych dla indukcji apoptozy. W przypadku propanalu żel nie wykazuje takie charakterystyki.

- Przeprowadza się analizę spektrofluorometrycznąw celu zmierzenia ilości otrzymanych fragmentów DNA (<3 kilozasad). Do 2 ml supematantu dodaje się 1 ml trichlorowodorku bisbenzoimidu (Hoechst 33258) (lpg/ml) w 3 mM chlorku sodu, 1 mMd4 EDTA i 10 mM Tris pH 8. Otrzymane roztwory analizuje się przez fluorymetrię (λ wzbudzenia=365 nm, λ emisji = 460 nm). Ilości DNA oblicza się w stosunku do DNA wysoko oczyszczonego (0,1-1 pg w 2 ml buforu do lizy), traktowanego jak zaznaczono powyżej i wyraża się jako 10’⁹ g DNA odzyskanego z 3 χ 10⁶komórek.

Uzyskane wyniki zebrano w tabeli 2 poniżej.

Tabela 2

Przykłady	10'⁹ DNA/3 χ 10⁶ komórek
+IL3	63
+IL3 + metional	127
-IL3	150

Tak więc, wzrost ilości fragmentów DNA znalezionych w komórkach traktowanych IL3 i metionalem jest podobna do ilości znalezionej, gdy komórki umieszcza się w pożywce wolnej od IL3.

Przykład IV

Wpływ BCNU i inhibitora transaminazy związanej z przemianą kwasu 4-metylotio-2-oksobutanowego w metioninę na wytwarzanie reaktywnych form tlenu (H₂O₂ i HO)

1,5 χ 10⁵ komórek BAF3 (linia komórkowa jaką opisano powyżej), wysiewa się na 3 ml pożywki hodowlanej, zawierającej IL3 [pożywka Eagla modyfikowana przez Dulbecco, zawierająca 6% surowicy płodowej cielęcia i 5% pożywki związanej z komórkami Wehi-3B, użyto jako źródła IL3, którą to pożywkę opisano u Collinsa i in., (1992) J.Exp.Med., 176,1043-1051], traktuje się 10 μΜ dioctanu 2',7-dichlorofluoresceiny (zwanej tu poniżej DCFH-DA i otrzymanej z Molecular Probes Inc.). Po inkubacji przez 1 godzinę w temperaturze 37°C komórki przemywa się buforem PBS. 10 minut przed analiząfluorescencji dichlorofluoresceiny (DCF) drogą cytometrii przepływowej, dodaje się 3 pg/ml bromku propidium. Przeprowadza się inkubację w obecności różnych stężeń BCNU i w obecności lub nieobecności związku A w ilości 50 μΜ (który odpowiada związkowi o wzorze (9), gdzie X oznacza rodnik -OH). Metoda ta umożliwia otrzymanie zawartości procentowej fluorescencji uzyskanej przez reakcję reaktywnych form tlenu (H₂O₂ i HO) z DCFH-DA. Cytometrię przepływowąprzeprowadza się przy użyciu cytometru przepływowego FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA).

Wyniki zebrano w tabeli 3 poniżej.

Tabela 3

Stężenie BCNU (pg/ml)	Stężenie związku A (μΜ)	Fluorescencja/10⁶ komórek (%)
10	0	4
20	0	4
40	0	10
10	50	2,5
20	50	1.5
40	50	1,75

182 597

Tak więc, wyniki te pokazują, że związek A umożliwiający wzrost poziomu metionalu hamuje wzrost HO spowodowany wzrostem stężenia BCNU. Tak więc, jest całkiem prawdopodobne, że metional reaguje z obecnymi rodnikami HO·, dając malonodialdehyd, który następnie indukuje apoptozę.

Przykład V

Wpływ na apoptozę BCNU i inhibitora transaminazy związanej z przemianą kwasu 4-metylotio-2-oksobutanowego w metioninę

Rozszczepione łańcuchy DNA znakuje się dUTP biotynylowanym (wykrywanym przez awidynofluoresceinę) in situ w przepuszczalnych i utrwalonych komórkach, przy użyciu testu terminalnej transferazy nukleotydylowej DNA (TdT) jak opisano u Gorczycy i in., (1993) CancerRes.,53, 1945-1951.

1,5 x 10⁶ komórek BAF3 (linia komórkowa jak opisano powyżej) wysiewa się w 3 ml pożywki hodowlanej, zawierającej IL3 (pożywka Eagle'a modyfikowana przez Dulbecco, zawierająca 6% surowicy płodowej cielęcia i 5% pożywki związanej z komórkami Wehi-3B, użytej jako źródło IL3). Komórki inkubuje się w obecności 50 μΜ związku A, 40 pg/ml BCNU, mieszaniny tych dwóch produktów (50 μΜ związku A + 40 pg/ml BCNU) albo przy nieobecności tych dwóch związków (próba kontrolna). Po inkubacji przez 24 godziny komórki przemywa się w buforze PBS i utrwala w formaldehydzie, a następnie w etanolu i pozostawia w temperaturze -20°C przez 3 dni. Potem komórki ponownie zawiesza się w 50μ1 roztworu, zawierającego 0,1 μΜ kakodylanu sodu, pH 7,5,1 mM COC1₂,0,1 mM ditiotreitolu, 0,05 mg/ml BSA (albumina surowicy bydlęcej), 10 jednostek TdT (z grasicy cielęcej; od Boehringera), 0,5 nmola dATP, 0,5 nmola dCTP i 0,5 nmola dGTP, na 1 godzinę w temperaturze 37°C. Po przemyciu PBS, komórki zawiesza się ponownie w 100 μΐ buforu 4xSSC (0,15 M NaCl, 0,015 M cytrynianu sodu), zawierającego 2,5 pg/ml izocyjanianu awidyno-fluoresceiny (Sigma), 0,1% (ciężar/objętość) rybonukleazy A, 0,1% Tritonu Χ-100 i 5% (ciężar/objętość) odtłuszczonego mleka, na 30 minut w pokojowej temperaturze, w ciemności. Komórki te przemywa się i następnie zawiesza w 1 ml PBS, zawierającego 3 μg/ml jodku propidium. Cytometrię przepływową przeprowadza się przy użyciu cytometru przepływowego FACScan (Becton Dickinson, San Jose CA, USA).

Wyniki zebrano w tabeli 4 poniżej.

Tabela 4

Test	% obumarłych komórek
Próba kontrolna	0,2
Związek A	0,3
BCNU	2,3
Związek A + BCNU	41,1

Przy tych dawkach, produkty użyte pojedynczo, słabo indukująapoptozę, podczas gdy ich mieszanina indukuje apoptozę silnie (synergia). Ten rezultat potwierdza wyniki z tabeli 3 i wnioski, ich dotyczące.

Przykład VI

Określenie najskuteczniejszej kombinacji terapeutycznej do traktowania myszy zaszczepionych komórkami czerniaka

W dniu t=0, myszom B6D2F1 (z towarzystwa IFFA Credo, Francja), wstrzyknięto 10⁵ komórek czerniaka mysiego Β16 F1. W dniu t= 1 i potem nieprzerwanie przez 15 dni, myszom tym wstrzykiwano raz dziennie różne układy terapeutyczne wymienione w tabeli 3 poniżej. Próba kontrolna odpowiada myszom, których nie poddano układowi terapeutycznemu.

Tabela 5 jest zbiorem wyników, odpowiadających średniej z wyników 3 traktowanych myszy.

182 597

Tabela 5

Układ terapeutyczny	Średni czas przeżycia (dni)
Próba kontrolna	20,5
BCNU (0,1 mg/kg)	24,5
Związek A (25 mg/kg)	21,9
Metional (25 mg/kg)	27
BCNU + metional	26
Związek A + metional	27
BCNU + związek A	40,5
BCNU + związek A + metional	57

Dla układu wielozwiązkowego dawki każdego użytego związku są identyczne jak te z układów, w których związki są użyte pojedynczo.

Czas przeżycia liczy się od dnia t=0 zaznaczonego powyżej i odpowiada średniej ilości myszy, które nie przeżyły więcej niż 60 dni.

BCNU odpowiada N,N-bis(2-chloroetylo)-N-nitrozomocznikowi.

Związek A odpowiada związkowi o wzorze (9), gdzie X oznacza rodnik -OH.

Tak więc, widać, że ostatnie dwa układy są szczególnie skuteczne ponieważ zasadniczo zwiększają czas przeżycia tych myszy. Z tych dwóch układów ostatni układ (wzbogacony metionalem) umożliwia przeżycie jednej trzeciej ilości myszy, dłużej niż 60 dni.

P r z y kła d Vn

Postępuje się jak w poprzednim przykładzie, zmieniając układy i liczbę traktowanych myszy. Tabela 6 jest zbiorem tych danych i otrzymanych wyników.

Tabela 6

Układ terapeutyczny (mg/kg)	Liczba traktowanych myszy	Średni czas przeżycia (dni)	% osobników które przeżyły długi okres
Próba kontrolna	6	23,7	0
BCNU (0,1 mg/kg)	6	32,5	0
Związek A (25 mg/kg) + metional (50 mg/kg)	10	33,1	10
BCNU + Związek A + metional	10	36	50

Czas przeżycia liczy się od diiia t=0 zaznaczonego powyżej i odpowiada średniej ilości myszy, które nie przeżyły dłużej niż 60 dni.

Dla ostatniego układu, dawki odpowiadają tym, w których związek użyto pojedynczo.

Procentowość osobników, które przeżyły długi okres, odpowiada procentowości myszy, które przeżyły dłużej niż 60 dni.

Tak więc widać, że ostatnie dwa układy, a zwłaszcza drugi z nich, są szczególnie skuteczne.

Przykład VIII

Wpływ metionalu na indukcję apoptozy w komórkach BAF3-b0 i BAF3-bcl2

Użyte komórki odpowiadają linii komórkowej limfocytów BAF3 jak opisano powyżej. Komórki BAF3-bcl2 odpowiadają komórkom BAF3 transfekowanym genem bcl2 i komórki BAF3-b0 odpowiadają komórkom BAF3 nie transfekowanym genem bcl2. Jak ustalono powyżej, komórki BAF3-b0 ulegają apoptozie (więcej niż 80% komórek) przy nieobecności IL3 ponad 16 godzin. Z drugiej strony, komórki BAF3-bcl2, które są więc transfekowane genem bc!2, nie wykazują oznak apoptozy przy nieobecności IL3. Z tego względu, stanowią one dobry

182 597 model do określania etapu zablokowanej w tych komórkach apoptozy oraz jej możliwej korelacji z inhibicją syntezy malonodialdehydu.

Komórki B AF3-bO i BAF3-bcl2 znakuje się adaptowaną metodą opisanąprzez S. Wrighta i in., (1992) J.of Cell.Biochem. 48, 344-355, przez inkubację 2,5 χ 10⁵ komórek/ml z 0,5 gCi [3H]-tymidyny przez 40 godzin w temperaturze 37°C. Po dwukrotnym przemyciu pożywką hodowlaną, 2,5 χ 10⁶ komórek hoduje się w obecności metionalu. Po inkubacji przez 8 godzin, komórki te odzyskuje się za pomocą wirowania przy 400 g przez 5 minut i przemywa 3 razy w buforze PBS. Komórki odzyskane w osadzie poddaje się lizie w 2 ml 0,1 % Tritonu X-100,20 mM EDTA, 5 mM Tris pH 8 i wiruje się je przy 30 000 g w temperaturze 4°C przez 30 minut. Supematanty odzyskuje się i osady rozpuszcza w 0,3 ml 0,5 N NaOH. Równe ilości pożywki hodowlanej (1 ml), supematantu (0,3 ml) i rozpuszczonego osadu (0,1 ml) umieszcza się dla oznaczenia w liczniku scyntylacyjnym. Procentowość fragmentów DNA oblicza się w następujący sposób:

% fragmentów, _ dpm pożywki hodowlanej + dpm supematantu

DNA dpm pożywki hodowlanej-)- dpm supematantu+ dpm rozpuszczonego osadu

Wyniki: dodanie wzrastającego stężenia metionalu (0; 50; 100; 200; 300; 400 pm) do pożywki inkubacyjnej zwiększa udział procentowy fragmentów DNA aż do maksymalnego, dla 400 μΜ metionalu, wynoszącego 26% w porównaniu z 7% dla komórek BAF3-b0 nie traktowanych metionalem (próba kontrolna). Dla komórek B AF3-bcl2 traktowanych równoważnymi stężeniami metionalu, ilość fragmentów DNA osiągnęła maksymalnie 7% przy 400 μΜ metionalu, w porównaniu z 3% dla próby kontrolnej.

Wyniki te pokazująjasno, że dodanie metionalu nie umożliwia znoszenia inhibicji apoptozy z powodu genu bcl2 w komórkach BAF3-bcl2.

W czasie indukowania apoptozy przy niedoborze IL3, obserwuje się, źe metional przekształca się w malonodialdehyd przez reakcję β-hydroksylacji za pomocą HO·. Przeprowadziliśmy więc oznaczanie H₂O₂ i HO· w komórkach BAF3-b0 i BAF3-bcl2.

Przykład IX

Pomiar reaktywnych postaci tlenu (H₂O₂ i OH) metodą cytometrii przepływowej

Użyte komórki odpowiadają linii komórkowej limfocytów BAF3 jak opisano powyżej. Komórki BAF3-bcl2 odpowiadają komórkom BAF3 transfekowanym genem bcl2 i komórki BAF3-b0 odpowiadają komórkom BAF3 nie transfekowanym genem bcl2.

1,5 χ 10⁶ komórek BAF3-bO lub -bc!2 wysianych na 3 ml pożywki hodowlanej, zawierającej IL3, traktuje się 10 μΜ dioctanu dichlorofluoresceiny (DCFA-DA). Po inkubacji przez 1 godzinę w temperaturze 37°C komórki przemywa się buforem PBS. 10 minut przed analizą fluorescencji dichlorofluoresceiny (DCF) drogą cytometrii przepływowej, dodaje się 3 μg/ml jodku propidium, jak w przykładzie 4. Cytometrię przepływową przeprowadza się przy użyciu cytometru przepływowego FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA).

Wyniki zebrano w tabeli 7 poniżej.

Tabela 7

Typ komórki	Średnia z dowolnej jednostki fluorescencji
BAF3-b0	154 ±32
BAF3-bcl2	211 ±52

Jak z tego wynika, chociaż przy komórkach BAF3-bcl2 istnieje tendencja do posiadania większej ilości reaktywnych postaci tlenu niż u komórek B AF3-b0, różnica ta nie jest znaczna.

Jest więc możliwe, że w komórkach BAF3-bcl2 istnieje defekt w syntezie metionalu i/lub malonodialdehydu.

182 597

Przykład X

Analiza produktów znakowanych ¹⁴C, pochodnych [¹⁴C]MTOB w komórkach BAF3-bO i BAF3-bcl2

[¹⁴C]MTOB wytwarza się drogą deaminacji oksydacyjnej [¹⁴C]-metioniny jak opisano u G.Ogiera i in., (1993) Biochem.Pharmacol., 45,1631-1644. Do zawiesiny komórkowej BAF-bO lub BAF-bcl2 (2,4 x 10^s komórek/ml) w DEM, zawierającym 6% surowicy z płodu cielęcia i 5% IL3, dodaje się [^l4C]MTOB (5 χ 10⁶ dpm, odpowiadające 38,2 nmola). 39 godzin później komórki przemywa się dwukrotnie w PBS i ponownie zawiesza, przy stężeniu 9 χ 10⁵ komórek/ml. Do 10⁸ komórek dodaje się [U¹⁴C]MTOB (1,9 χ 10⁶ dpm, odpowiadające 14,5 nmola), i 8 godzin później komórki odzyskuje się drogą wirowania przy 400 g przez 5 minut. Osady komórek rozpuszcza się za pomocą 1,5 ml 0,5 N NaOH przez 30 minut w temperaturze 60°C. Całkowitą radioaktywność komórek mierzy się w równych próbkach o objętości 10 μΐ. Potem do otrzymanego alkalicznego hydrolizatu dodaje się kwas nadchlorowy, do ostatecznego stężenia 0,5 N, po czym 200 pmoli 2,4-DNPH (2,4-dinitrofenylohydrazyny, otrzymanej od Mercka). Mieszaninę ogrzewa się w temperaturze 70°C przez 30 minut i następnie odwirowuje przy 400 g przez 5 minut. Osad rozpuszcza się w 1 ml 0,5 N NaOH, oraz określa radioaktywność i zawartość białek. Do supematantu dodaje się NaOH do pH 10. Znakowane metabolity ekstrahuje się octanem etylu i fazę organiczną suszy, zakwasza i ekstrahuje dichlorometanem. Znakowane metabolity w fazie organicznej oddziela się i identyfikuje przy użyciu hptlc (wysokosprawna chromatografia cienkowarstwowa) i porównuje z pochodnymi 2,4-DNPH odnośnych związków, a następnie kwantyfikuje przez radiochromatografię z przemiataniem.

Wyniki zebrano w tabeli 8 poniżej.

Tabela 8

	BAF3-bO	BAF3-bcl2
Radio, (dpm/mg DNA)	1 252 000	1 111 000
Specyficzna aktywność białek komórkowych (pm/mg białek)	23 500	20 860
Wolna metionina (dpm/mg DNA)	36 820	51 440
2,4-DNPH metional (dpm/mg DNA)	14 050	7 650
2,4-DNPH MDA (2,4-DNPH pirazol) (dpm/mg DNA(	800	0

Radio, oznacza całkowitą radioaktywność komórek.

MDA oznacza malonodialdehyd.

Tak więc, widać, że całkowita radioaktywność związana z identyczną ilością DNA jest podobna w obu typach komórek po inkubacji przez 47 godzin. Tak samo jest w przypadku aktywności metioniny białek komórkowych. Co do wolnej metioniny, obserwuje się 40% wzrost radioaktywności w komórkach BAF3-bcl2 w porównaniu z radioaktywnością w komórkach BAF3-bO. Radioaktywność metionalu jest o 80% większa w komórkach BAF3-b0 niż w komórkach BAF-bcl2. Pozwala to wykazać, że w komórkach BAF3-bcl2 zmniejszeniu wytwarzania metionalu z MTOB towarzyszy współistniejące zwiększanie tworzenia się metioniny. Gdy mierzy się powstawanie znakowanego MDA, odpowiada to 800 dpm/mg DNA w komórkach BAF3-b0, podczas gdy nie wykrywa się radioaktywności dla MDA w ekstraktach komórkowych BAF3-bcl2. Komórki BAF3-bcl2 więc, wykazujątakże zmniejszenie tworzenia się MDA z metionalu. Przykład 8 pokazuje jasno, że to zmniejszenie nie jest spowodowane zmniejszeniem reaktywnych postaci tlenu w komórkach BAF3-bcl2 w porównaniu z komórkami BAF3-b0.

Można więc wywnioskować, że oprócz zmniejszenia przemiany MTOB w metional, gen bc!2 działa także ujemnie na reakcję β-hydroksylacji przy przemianie metionalu w malonodialdehyd. Tak więc, każdy produkt, który modyfikuje wewnątrzkomórkowy poziom metionalu lub produkt jego metabolizmu, malonodialdehyd, może być uznany za modyfikator apoptozy.

Claims

1. Kompozycja farmaceutyczna, do modyfikowania apoptozy, zawierająca czynnik aktywny w farmaceutycznie dopuszczalnym podłożu, znamienna tym, że obejmuje jako czynnik aktywny, co najmniej jeden związek wybrany spośród metionalu, malonodialdehydu i każdego czynnika, który zwiększa wewnątrzkomórkowy poziom metionalu lub dialdehydu malonowego.

2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że metional, dialdehyd malonowy i czynnik, który zwiększa wewnątrzkomórkowy poziom metionalu lub dialdehydu malonowego, stosuje się w mieszaninie.

3. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że czynniki, wpływające na wewnątrzkomórkowy poziom metionalu lub dialdehydu malonowego, wybiera się spośród prekursorów lub produktów metionalu oraz inhibitorów i aktywatorów enzymów związanych z metabolizmem metionalu.

4. Kompozycja według zastrz. 3, znamienna tym, że prekursorami albo produktami metionalu lub dialdehydu malonowego sąprekursory lub produkty wewnątrzkomórkowego metabolizmu metionalu lub dialdehydu malonowego, takie jak kwas 4-metylotio-2-oksobutanowy, metionina, metionol, kwas metylotiopropionowy i metylotiopropionyloCoA.

5. Kompozycja według zastrz. 3, znamienna tym, że prekursorami lub produktami metionalu lub dialdehydu malonowego są produkty, które in situ posiadają zdolność uwalniania metionalu lub dialdehydu malonowego, albo uwalniania czynnika, który zwiększa wenątrzkomórkowy poziom metionalu lub dialdehydu malonowego, takie jak estry i tioestry metionalu lub dialdehydu malonowego.

6. Kompozycja według zastrz. 3, znamienna tym, że inhibitory lub aktywatory enzymów związanych z metabolizmem metionalu wybiera się spośród inhibitorów lub aktywatorów kompleksu dehydrogenazy oksokwasu o rozgałęzionym łańcuchu związanej z przemianą kwasu 4-metylotio-2-oksobutanowego do metylotiopropionyloCoA poprzez metional, inhibitorów lub aktywatorów transaminazy związanej z przemianą kwasu 4-metylotio-2-oksobutanowego w metioninę, inhibitorów lub aktywatorów reduktazy aldehydowej odpowiedzialnej za redukcję metionalu do metionolu albo dehydrogenazy aldehydowej odpowiedzialnej za oksydację metionalu do kwasu metylotiopropionowego, oraz aktywatorów lub inhibitorów β-hydroksylazy.

7. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że czynnikami, które zwiększają wenwątrzkomórkowy poziom metionalu lud dialdehydu malonowego, są inhibitory transaminazy związanej z przemianą kwasu 4-metylotio-2-oksobutanowego w metioninę, które wybiera się spośród produktów o podanych wzorach 1-9, w których X oznacza -OH lub OPO₃H₂.

8. Kompozycja według zastrz. 7, znamienna tym, że inhibitorem transaminazy związanej z przemianą kwasu 4-metylotio-2-oksobutanowego w metioninę jest związek o wzorze 9, w którym X oznacza rodnik -OH.

9. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że czynnikami, które zwiększają wewnątrzkomórkowy poziom metionalu lud dialdehydu malonowego, są inhibitory transaminazy związanej z przemianą kwasu 4-metylotio-2-oksobutanowego w metioninę, które wybiera się spośród hydroksamianów amidoaminokwasów.

10. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że obejmuje połączenie związku wybranego spośród metionalu, dialdehydu malonowego, oraz prekursorów i produktów metionalu lub dialdehydu malonowego, z inhibitorami enzymów związanych z reakcjami metabolicznymi, pobudzającymi usuwanie metionalu, albo z aktywatorami β-hydroksylazy.

182 597

11. Kompozycja według zastrz. 10, znamienna tym, że połączenie odpowiada połączeniu kwasu 4-metylotio-2-oksobutanowego z inhibitorem transaminazy związanej z przemianą kwasu 4-metylotio-2-oksobutanowego w metioninę.

12. Kompozycja według zastrz. 11, znamienna tym, że połączenie odpowiada połączeniu metionalu lub czynnika, który zwiększa wenątrzkomórkowy poziom metionalu z co najmniej jednym związkiem, który zwiększa poziom wolnych rodników HO, przy czym związkiem tym korzystnie jest N,N-bis-(2-chloroetylo)-N-nitrozomocznik (BCNU).

13. Kompozycja według zastrz. 12, znamienna tym, że obejmuje co najmniej jeden inhibitor transaminazy związanej z przemianą kwasu 4-metylotio-2-oksobutahowego w metioninę.

14. Kompozycja kosmetyczna, do modyfikowania apoptozy, zawierająca czynnik aktywny w kosmetycznie dopuszczalnym podłożu, znamienna tym, że obejmuje jako czynnik aktywny, co najmniej jeden związek wybrany spośród metionalu, dialdehydu malonowego i czynnika, który zwiększa wenątrzkomórkowy poziom metionalu lub dialdehydu malonowego.

15. Kompozycja według zastrz. 14, znamienna tym, że metional, dialdehyd malonowy i czynnik, który zwiększa wewnątrzkomórkowy poziom metionalu lub dialdehydu malonowego, stosuje się w mieszaninie.

16. Kompozycja według zastrz. 14 albo 15, znamienna tym, że czynniki, wpływające na wenątrzkomórkowy poziom metionalu lub dialdehydu malonowego, wybiera się spośród prekursorów lub produktów metionalu oraz inhibitorów i aktywatorów enzymów związanych z metabolizmem metionalu.

17. Kompozycja według zastrz. 16, znamienna tym, że prekursorami albo produktami metionalu lub dialdehydu malonowego sąprekursory lub produkty wewnątrzkomórkowego metabolizmu metionalu lub dialdehydu malonowego, takie jak kwas 4-metylotio-2-oksobutanowy, metionina, metionol, kwas metylotiopropionowy i metylotiopropionyloCoA.

18. Kompozycja według zastrz. 16, znamienna tym, że prekursorami lub produktami metionalu lud dialdehydu malonowego są produkty, które in situ posiadają zdolność uwalniani metionalu łub dialdehydu malonowego, albo uwalniania czynnika, który zwiększa wenątrzkomórkowy poziom metionalu lub dialdehydu malonowego, takie jak estry i tioestry metionalu lub dialdehydu malonowego.

19. Kompozycja według zastrz. 16, znamienna tym, że inhibitory lub aktywatory enzymów związanych z metabolizmem metionalu wybiera się spośród inhibitorów lub aktywatorów kompleksu dehydrogenazy oksokwasu o rozgałęzionym łańcuchu związanej z przemianą kwasu 4-metylotio-2-oksobutanowego do metylotiopropionyloCoA poprzez metional, inhibitorów lub aktywatorów transaminazy związanej przemianą kwasu 4-metylotio-2-oksobutanowego w metioninę, inhibitorów lub aktywatorów reduktazy aldehydowej odpowiedzialnej za redukcję metionalu do metionolu albo dehydrogenazy aldehydowej odpowiedzialnej za oksydację metionalu do kwasu metylotiopropionowego, oraz aktywatorów lub inhibitorów β-hydroksylazy.

20. Kompozycja według zastrz. 14, znamienna tym, że czynnikami, które zwiększają wenwątrzkomórkowy poziom metionalu lub dialdehydu malonowego, są inhibitory transaminazy związanej z przemianąkwasu 4-metylotio-2-oksobutanowego w metioninę, które wybiera się spośród produktów o podanych wzorach 1 -9, w których X oznacza -OH lub -OPO₃H₂.

21. Kompozycja według zastrz. 20, znamienna tym, że inhibitorem transaminazy związanej przemianąkwasu 4-metylotio-2-oksobutanowego w metioninę jest związek o wzorze 9, w którym X oznacza rodnik -OH.

22. Kompozycja według zastrz. 14, znamienna tym, że czynnikami, które zwiększają wenątrzkomórkowy poziom metionalu lub dialdehydu malonowego, są inhibitory transaminazy związanej z przemianą kwasu 4-metylotio-2-oksobutanowego w metioninę, które wybiera się spośród hydroksamianów amidoaminokwasów.

23. Kompozycja według zastrz. 14, znamienna tym, że obejmuje połączenie związku wybranego spośród metionalu, dialdehydu malonowego, oraz prekursorów i produktów metionalu lub dialdehydu malonowego, z inhibitorami enzymów związanych z reakcjami metabolicznymi, pobudzającymi usuwanie metionalu, albo z aktywatorami β-hydroksylazy.

182 597

24. Kompozycja według zastrz. 23, znamienna tym, że połączenie odpowiada połączeniu kwasu 4-metylotio-2-oksabutanowego z inhibitorem transaminazy związanej z przemianą kwasu 4-metylotio-2-oksobutanowego w metioninę.

25. Kompozycja według zastrz. 24, znamienna tym, że połączenie odpowiada połączeniu metionalu lub czynnika, który zwiększa wenątrzkomórkowy poziom metionalu z co najmniej jednym związkiem, który zwiększa poziom wolnych rodników HO, przy czym związkiem tym korzystnie jest N,N-bis-(2-chloroetylo)-N-nitrozomocznik (BCNU).

26. Kompozycja według zastrz. 25, znamienna tym, że obejmuje co najmniej jeden inhibitor transaminazy związanej z przemianą kwasu 4-metylotio-2-oksobutanowego w metioninę.